CN108680418B - 一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种十字花科作物花粉的快速荧光染色方法，包括如下步骤：S1染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液PBS，配成Hoechst33258浓度20‑40μg/L、蔗糖浓度8‑10wt％的溶液一，然后配制含乙醇60‑70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油30‑20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀得到染色液，并低温避光保存；S2染色：取步骤S1中制得的染色液于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵或花蕾，用镊子摘取花药直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出花粉，取出杂物，涂抹使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。本发明可以解决目前花粉荧光染色法所存在的繁琐、费时及耗工的问题，同时提高荧光染色法的稳定性和重现性。
Description
技术领域
本发明涉及一种花粉荧光染色方法，具体涉及一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法。
背景技术
植物花粉壁是一层主要由孢粉素和纤维素组成的特殊细胞壁，由外壁和内壁两层组成。其中，外壁又分为内外两层，外壁外层呈蜂窝状或网状，外壁内层则为平坦结构，外壁的主要成分是孢粉素类物质。而内壁结构相对简单，主要含有纤维素、果胶和蛋白质等。由于植物花粉壁在结构上比一般的植物细胞壁复杂，且紧密厚实，尤其是成熟花粉粒，其通透性及光透性极差，因此多数植物花粉染色后不结合透明技术在显微镜下难于观察到清晰细胞核。
目前，植物花粉染色常用的方法有醋酸洋红染色法、苯酚品红法、铁矾苏木精染色法及荧光染色法等，一般采用“固定(卡诺氏固定液)→洗涤→染色→脱色→镜检”的操作步骤，但对于绝大多数的植物成熟花粉，还需要经过乙醇分级脱水和冬青油透明后才能观察，其操作步骤繁琐、耗时，完成整个操作过程需要数个小时以上，甚至长达2-3天。
从染色剂的特异性看，醋酸洋红染色法、苯酚品红法和铁矾苏木精染色法所使用的染色剂与荧光染色所使用的荧光染料(如Hoechst33258、DAPI等)相比，其特异性相对较差，对质核均可染色，只是染色程度有所不同，因此染色时间及脱色对染色结果影响极大，另外其染色效果还因作物种类、花粉发育时期以及染色时的温度条件等的不同有很大差异，因此这些方法在实际操作中往往会因染色时间过长过短或者脱色不当而得不到清晰、且质核染色反差鲜明的结果。荧光染色法使用的是与DNA特异结合的荧光染料，其与DNA链结合速度极快，十几分钟内即可达到饱和，不会出现因染色时间过长而导致细胞质染色过深影响结果观察的问题，而且染色结果稳定，因此荧光染色法在具备有荧光显微镜的试验条件下已成为植物花粉染色观察的首选方法。
近年，十字花科作物游离花粉(小孢子)培养在育种中得到了广泛应用，在进行花粉培养时需要对其花粉发育时期进行准确断定，由于荧光染色剂对DNA的特异性和稳定性，利用荧光剂染色观察确定花粉发育时期的研究者趋于增加，但是均采用上述繁琐、耗时的操作步骤，难于做到短时间内完成花粉发育时期的判定，而且成熟花粉粒采用常规的冬青油透明技术会使花粉壁轮廓与背景的分界变得不清，营养核的荧光染色强度也会因脱水步骤而有所降低，从而使荧光染色法的效果大打折扣。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液及方法，解决目前花粉荧光染色法所存在的繁琐、费时及耗工的问题，同时提高荧光染色法的稳定性和重现性。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液，包括如下步骤：
S1染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液PBS，配成Hoechst33258浓度20-40μg/L、蔗糖浓度8-10wt％的溶液一，然后配制含乙醇60-70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油30-20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀得到染色液，并低温避光保存；
S2染色：取步骤S1中制得的染色液于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵或花蕾，摘取花药直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出花粉，取出杂物，涂抹使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。
进一步地，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4。
进一步地，步骤S1中，染色液在4℃的温度下避光保存。
进一步地，步骤S2具体过程为：
取15-20μL步骤S1中制得的染色液于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵或花蕾，用镊子摘取花药1-2个直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出花粉，取出杂物，涂抹5-10秒使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片，等待0-5分钟，染色完成。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的十字花科作物花粉的快速荧光染色方法仅需一步即可完成传统的花粉染色法的一系列操作步骤，不仅简便、快捷，整个染色操作过程2-5分钟即可完成，而且染色效果稳定，在室温黑暗条件下至少2周不变，质核染色反差明显，花粉轮廓清晰可见，重复性好。
2、本发明可以实现一次只使用染色液15-20μL，对样品数的需要量也极少，可大大节省试验研究成本和减少环境污染。
本发明可用于十字花科作物花粉育性研究、游离小孢子培养时花粉发育时期的实时确定以及花粉培养过程中小孢子核***及胚状体发育的细胞学观察等。
附图说明
图1为采用本发明方法进行油菜开放花朵成熟花粉的荧光染色镜检结果示意图(400x)；
图2为采用本发明方法进行大白菜花蕾花粉的荧光染色镜检结果示意图(400x)
图3为采用本发明方法进行菜心花蕾花粉的荧光染色镜检结果示意图(400x)；
图4为采用本发明方法进行芥蓝游离花粉培养过程中小孢子***的荧光染色镜检结果示意图(400x)；
图5为采用传统方法进行油菜花蕾花粉的荧光染色镜检结果示意图(400x)。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明作进一步的描述，需要说明的是，以下实施例以本技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不限于本实施例。
实施例1：油菜开放花朵成熟花粉的荧光染色方法
1、染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，配成Hoechst33258浓度20μg/L、蔗糖浓度10wt％的溶液一，然后配制含乙醇60％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油30％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀后得到染色液，并置于4℃冰箱避光保存。
2、染色：用微量移液器吸取15μL步骤1得到的染色液滴于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵，用镊子摘取花药1个直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出适量花粉，取出破碎花药壁等杂物，涂抹片刻(5-10秒)使花粉与所述染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。
3、观察和拍照记录：盖上盖玻片后，置于荧光显微镜(Olympus BX51)下观察，物镜放大倍数40倍,目镜放大倍数10倍。使用MicroPublisher 5.0RTV相机拍照记录。
结果如图1所示，成熟花粉粒轮廓清晰，其营养核及两个精核被染色后，在紫外线照射下发出蓝色荧光，质核反差明显，清晰可见。
实施例2：大白菜花蕾花粉的荧光染色方法
1、染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，配成Hoechst33258浓度30μg/L、蔗糖浓度8wt％的溶液一，然后配制含乙醇70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀后得到染色液，置于4℃冰箱避光保存。
2、染色：用微量移液器吸取17μL步骤1中制得的染色液滴于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的花蕾，用镊子剥取花药1个直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出适量花粉，取出破碎花药壁等杂物，涂抹片刻(5-10秒)使花粉与所述染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。
3、观察和拍照记录：盖上盖玻片2分钟后，置于荧光显微镜(Olympus BX51)下观察，物镜放大倍数40倍,目镜放大倍数10倍。使用MicroPublisher 5.0RTV相机拍照记录。
结果如图2所示，花粉粒轮廓清晰，其营养核及两个精核被染色后，在紫外线照射下发出蓝色荧光，质核反差明显，清晰可见。
实施例3：菜心花蕾花粉的荧光染色方法
1、染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，配成Hoechst33258浓度40μg/L、蔗糖浓度9wt％的溶液一，然后配制含乙醇65％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油25％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀后得到染色液，并置于4℃冰箱避光保存。
2、染色：用微量移液器吸取20μL步骤1中得到的染色液滴于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的花蕾，用镊子摘取花药2个直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出适量花粉，取出破碎花药壁等杂物，涂抹片刻(5-10秒)使花粉与所述染色液混合均匀，然后盖上盖玻片。
3、观察和拍照记录：盖上盖玻片3分钟后，置于荧光显微镜(Olympus BX51)下观察，物镜放大倍数40倍,目镜放大倍数10倍。使用MicroPublisher 5.0RTV相机拍照记录。
结果如图3所示，成熟花粉粒轮廓清晰，其营养核及两个精核被染色后，在紫外线照射下发出蓝色荧光，质核反差明显，清晰可见。
实施例4：芥蓝游离花粉培养过程中小孢子***的荧光染色方法
1、染色液配制：首先将Hoechst33258荧光染料和蔗糖溶于磷酸盐缓冲液(PBS，pH＝7.4)，配成Hoechst33258浓度40μg/L、蔗糖浓度10wt％的溶液一，然后配制含乙醇70％(v/v)、乙酯乙酸10％(v/v)、甘油20％(v/v)的溶液二，将溶液一和溶液二按体积比1:1混合摇匀得到染色液，并置于4℃冰箱避光保存。
2、染色：用微量移液器吸取20μL步骤1制得的染色液滴于载玻片上，再吸取经离心沉淀的培养花粉(32℃热激培养48小时)1μL滴于所述染色液中，用镊子轻轻涂抹片刻(5-10秒)，然后盖上盖玻片。
3、观察和拍照记录：盖上盖玻片5分钟后，置于荧光显微镜(Olympus BX51)下观察，物镜放大倍数40倍,目镜放大倍数10倍。使用MicroPublisher 5.0RTV相机拍照记录。
结果如图4所示，单核靠边期花粉在32℃中热激培养48小时后，花粉粒明显膨大，可见营养核均等***1次成2核的花粉，以及经过4次***形成8核的花粉，质核反差明显，清晰可见。
对比例：传统的荧光染色方法
从次日开放的油菜花蕾中剥取花药10个置于25X25mm称量瓶中，用卡诺氏固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3：1，v/v)固定48小时，然后用95％、70％、50％、25％的乙醇及蒸馏水过渡洗涤，时间各30分钟，之后用浓度为20μg/L的Hoechst33258磷酸缓冲液(PBS，pH＝7.4)在室温黑暗条件下染色3小时，然后用30％、50％、70％、95％乙醇梯度脱水，各级30分钟，最后用无水乙醇浸泡1小时以上，然后用无水乙醇与冬青油混合液(1∶1，v/v)置换后，再用冬青油换液3次，每次1-2小时。以上步骤使用的试剂和蒸馏水均为2mL，冬青油透明后，取1个花药及小量冬青油于载玻片上，用镊子轻轻捏挤花药，让花粉游离出，然后盖上盖玻片在荧光显微镜(Olympus BX51)下观察，物镜放大倍数40倍,目镜放大倍数10倍，拍照记录使用MicroPublisher 5.0RTV相机。
结果如图5所示，花粉精核染色清晰，但营养核荧光强度不及实施例1-4的方法，而且花粉壁与背景的分界不清，影响结果判断。
对于本领域的技术人员来说，可以根据以上的技术方案和构思，给出各种相应的改变和变形，而所有的这些改变和变形，都应该包括在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种用于十字花科作物花粉快速染色的染色液，其特征在于，所述染色液为溶液一与溶液二的混合液，其中
所述溶液一包括Hoechst33258荧光染料、蔗糖与磷酸盐缓冲液PBS的混合溶液，其中，所述Hoechst33258浓度为20-40μg/mL、所述蔗糖浓度为8-10wt％；
所述溶液二包括体积百分比含乙醇60-70％、乙酸乙酯10％与甘油20-30％的混合溶液；
其中，所述染色液为溶液一与溶液二按体积比1:1混合摇匀所得，并在4℃低温避光保存备用。
2.根据权利要求1所述的用于十字花科作物花粉快速染色的染色液，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液PBS的pH为7.4。
3.一种利用权利要求1所述的染色液对十字花科作物花粉进行快速荧光染色的方法，其特征在于，具有配制好的低温避光保存备用染色液，所述染色方法包括：
取15-20μL配置好的染色液于载玻片上，然后从花序上摘取需要染色观察的开放花朵或花蕾，用镊子摘取花药1-2个直接放入载玻片上的染色液中，轻轻捏挤花药，散出花粉，取出杂物，涂抹5-10秒使花粉与染色液混合均匀，然后盖上盖玻片，等待0-5分钟，染色完成。
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