CN110982839A - 对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法 - Google Patents

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王卓智
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Abstract

本发明公开一种对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法，包括以下步骤：1)构建生物素连接酶质粒和具有AVI‑tag的靶蛋白质粒；2)取细胞密度达到1.2×106cells/mL以上且活率≥95％的细胞，经离心后，用新鲜培养基将密度调节至1.2×106cells/mL；再向其中加入生物素至终浓度为50μM；3)利用所述步骤1)构建的两种质粒共转染步骤2)获得的细胞；4)经2～5天之后收集细胞或蛋白，检测细胞的标记情况。通过本发明的方法，细胞的标记效率达到90％以上；在表达蛋白的同时进行生物素标记，节省了体外标记环节，流程上缩短了约1周时间。

Description

对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法
技术领域
本发明涉及蛋白的表达和纯化的技术领域，特别是涉及对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法。
背景技术
生物素，是一种生物体内天然存在的小分子，其与亲和素形成的生物素-亲和素***(Biotin-Avidin System，BAS)具有高亲和力的牢固结合以及多级放大效应，越来越多被应用于生物医学等领域。生物素经活化后可对蛋白质(抗原、抗体)等生物大分子进行标记，既保持了大分子的生物活性，又使大分子具有了BAS的高亲和力、灵敏度高、特异性强和稳定性好等优点。在细胞和抗原的定位、检测，抗体亲和力筛选等研究中扮演者不可替代的角色，高质量的生物素标记蛋白的生产目前是一个重大的挑战。
生物素连接酶(Biotin Ligase)由birA基因编码所得，能活化生物素形成生物素酰-5'-腺苷酸，将生物素特异地转移到生物素受体标签蛋白(如AviTag融合蛋白)上，使标签蛋白生物素化，Avi-tag是一个由15个氨基酸残基组成的短肽标签，在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化。
目前，市场上标记生物素的方法一般是使用商业化的试剂盒对体外纯化的蛋白质进行随机标记或者定点标记。然而，这种标记方法往往存在可重复性低，标记效率低，反应条件苛刻，成本较高，和及有可能对蛋白质性质产生不可预见性的影响等缺陷。因此，开发一种在细胞水平对生物大分子进行生物素定点标记的方法，对生物医药开发具有非常重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法，实现在细胞水平对蛋白进行高效的定点生物素标记。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法，包括以下步骤：
1)构建生物素连接酶质粒和具有AVI-tag的靶蛋白质粒；
2)取细胞密度达到1.2×106cells/mL以上且活率≥95％的细胞，经离心后，用新鲜培养基将密度调节至1.2×106cells/mL；再向其中加入生物素至终浓度为50μM；
3)利用所述步骤1)构建的两种质粒共转染步骤2)获得的细胞；
4)经2～5天之后收集细胞或蛋白，检测细胞的标记情况。通过这种方法细胞的标记效率达到90％以上。
具体的，所述步骤2)中，所述细胞包括293F细胞或CHO细胞。
具体的，所述步骤2)中，在转染的前一天，将细胞密度调节到0.6～0.8×106cells/mL；在转染当天，F细胞密度达到1.2×106cells/mL左右，活率≥95％。
具体的，所述步骤2)中，所述离心方式为以800rpm离心5min。
具体的，所述步骤3)中，靶蛋白质粒与生物素连接酶质粒的质量比例为(8～10):1。
优选的，所述步骤3)中，靶蛋白质粒与生物素连接酶质粒的质量比例为9:1。
具体的，所述蛋白包括细胞表面膜蛋白和分泌蛋白。
在一种具体实施方式中，所述蛋白为细胞表面膜蛋白。该细胞表面膜蛋白在所述步骤4)中，经48小时之后收集细胞或蛋白，通过FACS检测细胞的标记情况。
在一种具体实施方式中，所述蛋白为分泌蛋白。该分泌蛋白在所述步骤4)中，瞬时表达5天之后收集细胞上清进行纯化，用SDS-PAGE的方法进行生物素标记检测。
本发明提供了一种细胞表面膜蛋白和分泌蛋白的生物素标记的方法，实现了在细胞水平对细胞表面膜蛋白和分泌蛋白进行高效的定点生物素标记。
与现有技术相比较，本发明具有以下优点：
1、本发明的方法使细胞在表达蛋白的同时进行生物素标记，节省了体外标记环节，流程上缩短了约1周时间。
2、本发明中的生物素化是在细胞内通过酶和底物的反应来实现，反应条件温和，不仅可以维持蛋白构象，而且大大提升了标记效率和标记的专一性。
3、本发明的方法节约了使用标记试剂盒的成本。
附图说明
图1为本发明的细胞表面膜蛋白的生物素标记流程图。
图2为本发明的分泌蛋白的生物素标记流程图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
1.材料准备
1.1 Biotin配置
将Biotin粉末溶解在DMSO中，浓度为100mM，-20℃保存。
1.2质粒准备
构建表达BirA的质粒和表达带有AVI-tag的目的蛋白的质粒。
1.3细胞准备
1)转染前一天，将293F细胞密度调节到0.6-0.8x106cells/mL。
2)转染当天，293F细胞密度达到1.2x106cells/mL左右，活率≥95％，此时将细胞以800rpm，5min离心后，用新鲜培养基将密度调节至1.2x106cells/mL，体积为终体积的90％。向其中加入Biotin stock，使终浓度为50M。
2.转染(以20ml转染体系为例)
2.1标记细胞表面膜蛋白
1)用1ml Opti-MEM稀释20mg质粒(目的基因质粒：18mg，BirA质粒：2mg，质量比9:1)。
2)用950μl Opti-MEM稀释50μl lipofectamine 2000。
3)分别静置5min后，将两者混合，再静置20min，使其形成脂质体-DNA复合物。
4)将脂质体-DNA复合物逐滴加入调好密度的细胞中，并将细胞放置在摇床中培养。
5)48h后FACS检测Biotin标记效率：目的蛋白表达水平检测使用其特异性的一抗，二抗选择PE；Biotinylation的水平检测使用Alexa647-SA，稀释比例为1:1000；最后以双阳性的比例作为Biotin的标记效率。
6)结果：通过这种方法细胞的标记效率达到90％以上。
2.2分泌型蛋白标记
1)用1ml Opti-MEM稀释20mg质粒(目的基因：18mg，BirA：2mg，质量比9:1)；
2)用950l Opti-MEM稀释50l lipofectamine 2000；
3)分别静置5min后，将两者混合，再静置20min，使其形成脂质体-DNA复合物；
4)将脂质体-DNA复合物逐滴加入调好密度的细胞中，并将细胞放置在摇床中培养
5)5天之后收集上清进行纯化，SDS-PAGE检测标记效率。
6)结果：通过这种方法细胞的标记效率达到90％以上。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种对蛋白在细胞水平进行生物素标记的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)构建生物素连接酶质粒和具有AVI-tag的靶蛋白质粒；
2)取细胞密度达到1.2×106cells/mL以上且活率≥95％的细胞，经离心后，用新鲜培养基将密度调节至1.2×106cells/mL；再向其中加入生物素至终浓度为50μM；
3)利用所述步骤1)构建的两种质粒共转染步骤2)获得的细胞；
4)经2～5天之后收集细胞或蛋白，检测细胞的标记情况。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述细胞为293F细胞或CHO细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，在转染的前一天，将细胞密度调节到0.6～0.8×106cells/mL；在转染当天，F细胞密度达到1.2×106cells/mL左右，活率≥95％。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离心方式为以800rpm离心5min。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，靶蛋白质粒与生物素连接酶质粒的质量比例为(8～10):1。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，靶蛋白质粒与生物素连接酶质粒的质量比例为9:1。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白包括细胞表面膜蛋白和分泌蛋白。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白为细胞表面膜蛋白。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述细胞表面膜蛋白在所述步骤4)中，经48小时之后收集细胞或蛋白，通过FACS检测细胞的标记情况。
10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白为分泌蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述分泌蛋白在所述步骤4)中，瞬时表达5天之后收集细胞上清进行纯化，用SDS-PAGE的方法进行生物素标记检测。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN103374068A (zh) * 2012-04-27 2013-10-30 中国科学院上海生命科学研究院 一种新的单克隆抗体的制备方法及用途
CN107207609A (zh) * 2014-11-20 2017-09-26 豪夫迈·罗氏有限公司 共同轻链和使用方法

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