CN110981965B - 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用 - Google Patents

一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110981965B
CN110981965B CN201911074372.8A CN201911074372A CN110981965B CN 110981965 B CN110981965 B CN 110981965B CN 201911074372 A CN201911074372 A CN 201911074372A CN 110981965 B CN110981965 B CN 110981965B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ppic9k
fusion protein
gene
swoi
recombinant
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201911074372.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110981965A (zh
Inventor
马立娟
杜丽平
肖冬光
张安琪
崔馨予
李弘轩
于爱群
陈叶福
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin University of Science and Technology
Original Assignee
Tianjin University of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin University of Science and Technology filed Critical Tianjin University of Science and Technology
Priority to CN201911074372.8A priority Critical patent/CN110981965B/zh
Publication of CN110981965A publication Critical patent/CN110981965A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110981965B publication Critical patent/CN110981965B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白，所述融合蛋白同时包含：(1)内切纤维素酶EGⅡ，和(2)辅助蛋白SwoⅠ及其结构域；所述融合蛋白是将内切纤维素酶EGⅡ与辅助蛋白SwoI及其结构域通过(GGGGS)2柔性连接肽构建而成。本发明利用重叠延伸PCR技术，将EgⅡ与SwoI及其结构域编码基因进行融合，并在毕赤酵母内表达、纯化获得融合蛋白。融合蛋白比融合前可使木质纤维素水解产生还原糖的活性提高约15‑35％，因此该融合蛋白能够应用于木质纤维素的降解，对开发新型纤维素酶提供了理论依据，在生物炼制领域有广泛的应用前景。

Description

一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用。
背景技术
木质纤维素是地球上含量最丰富，最有潜力的可再生资源之一，但其复杂的网状结构阻碍了它的高效酶解与利用，目前研究主要集中在对纤维素降解酶系进行表达优化、理性改造等，以提高纤维素酶的表达量和酶活。此外挖掘新型纤维素酶、辅助蛋白以及构建高效纤维素降解酶系能有效解决木质纤维素高效酶解和利用的问题。
一个构建成功的双功能融合蛋白会比原蛋白活性有较大程度的提高，实现蛋白功能的多样化。有研究者将来自于牛瘤胃中细菌的一种纤维素酶(Cel9E)和木聚糖酶(Xyn10A)融合获得融合酶Cel9E-Xyn10A，融合酶Cel9E-Xyn10A对纤维素和木聚糖的催化活性较原酶Cel9E和Xyn10A分别提高47％和121％。正是这种优势，人工构建的融合蛋白得到了广泛的应用。
蛋白swollenin是一种首次在里氏木霉(Trichoderma reesei)中发现的与植物β-expansin蛋白同源的真菌蛋白，命名为SWOI。辅助蛋白SWOI通过非水解方式弱化氢键来促进纤维素生物质的破坏。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用，该融合蛋白能够应用于木质纤维素的降解，对开发新型纤维素酶提供了理论依据，在生物炼制领域有广泛的应用前景。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白，所述融合蛋白同时包含：
(1)内切纤维素酶EGⅡ，和
(2)辅助蛋白SwoⅠ及其结构域；
所述融合蛋白是将内切纤维素酶EGⅡ与辅助蛋白SwoI及其结构域通过(GGGGS)2柔性连接肽构建而成。
而且，所述融合蛋白为E-B、E-BC、E-S。
而且，所述内切纤维素酶EGⅡ来源于里氏木霉QM9414；
或者，所述辅助蛋白SwoⅠ及其结构域来源于里氏木霉，其NCBI基因ID为AJ245918.1，其结构域基因序列分别是：Swob为Expansin-like EG45编码基因，Swobc为SwoI去除CBM与Linker区域的编码基因，SwoI为SwoI去除信号肽的编码基因。
如上所述的融合蛋白的编码基因，所述编码基因的获取方法的步骤如下：
S1.以里氏木霉QM9414的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，所述上游引物和下游引物为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQNO.6，进行PCR扩增，得到Swob、Swobc、SwoI编码基因片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的基因；
S2.通过重叠PCR将进行密码子优化后的内切纤维素酶通过柔性连接肽(GGGGS)2与密码子优化后的基因，构成融合基因e-b、e-bc、e-s，即为编码基因。
包含如上所述的融合蛋白的编码基因的重组载体，所述重组载体为pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES。
如上所述的重组载体的制备方法，步骤如下：
用EcoRⅠ和NotⅠ分别对pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切后的pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。
包含如上所述的重组载体的重组毕赤酵母工程菌株，所述工程菌株为GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
如上所述的重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤如下：
S1：用BglⅡ酶对重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES进行线性化得到线性酶切产物；
S2：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
利用如上所述的重组毕赤酵母工程菌株制备提高木质纤维素水解率的融合蛋白的方法，步骤如下：
S1：将重组毕赤酵母工程菌株接种培养，并诱导其表达；
S2：收获步骤S1的表达产物，并进行纯化得到融合蛋白。
如上所述的融合蛋白在降解木质纤维素方面中的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明融合蛋白是将内切纤维素酶(EGⅡ)与辅助蛋白Swollenin(SwoI)及其结构域通过(GGGGS)2柔性连接肽构建而成。本发明利用重叠延伸PCR技术，将EgⅡ与SwoI及其结构域编码基因进行融合，并在毕赤酵母内表达、纯化获得融合蛋白。融合蛋白比融合前可使木质纤维素水解产生还原糖的活性提高约15-35％，因此该融合蛋白能够应用于木质纤维素的降解，对开发新型纤维素酶提供了理论依据，在生物炼制领域有广泛的应用前景。
2、本发明将里氏木霉来源的SwoI及其结构域的编码基因，经密码子优化后，与纤维素酶进行连接构建得到融合蛋白，进而分析其水解效率.，通过水解底物羧甲基纤维素钠CMC实验，发现融合蛋白E-B、E-BC、E-S产生的水解活性相对于融合前分别提高了13％、18％和25％；通过水解底物预处理后的玉米芯实验，发现融合蛋白E-B、E-BC、E-S产生的水解活性相对于融合前分别提高了15％、25％和33％。
附图说明
图1为本发明中融合蛋白E-B的SDS-PAGE分析图；
图2为本发明中融合蛋白E-BC、E-S的SDS-PAGE分析图；
图3为发明中融合蛋白水解CMC活性分析图；
图4为发明中融合蛋白水解预处理后的玉米芯活性分析图。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白，所述融合蛋白同时包含：
(1)内切纤维素酶EGⅡ，和
(2)辅助蛋白SwoⅠ及其结构域；
所述融合蛋白是将内切纤维素酶EGⅡ与辅助蛋白SwoI及其结构域通过(GGGGS)2柔性连接肽构建而成。
较优地，所述融合蛋白为E-B、E-BC、E-S。
较优地，所述内切纤维素酶EGⅡ来源于里氏木霉QM9414；
或者，所述辅助蛋白SwoⅠ及其结构域来源于里氏木霉，其NCBI基因ID为AJ245918.1，其结构域基因序列分别是：Swob为Expansin-like EG45编码基因，Swobc为SwoI去除CBM与Linker区域的编码基因，SwoI为SwoI去除信号肽的编码基因。
如上所述的融合蛋白的编码基因，所述编码基因的获取方法的步骤如下：
S1.以里氏木霉QM9414的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，所述上游引物和下游引物为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQNO.6，进行PCR扩增，得到Swob、Swobc、SwoI编码基因片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的基因；
S2.通过重叠PCR将进行密码子优化后的内切纤维素酶通过柔性连接肽(GGGGS)2与密码子优化后的基因，构成融合基因e-b、e-bc、e-s，即为编码基因。
包含如上所述的融合蛋白的编码基因的重组载体，所述重组载体为pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES。
如上所述的重组载体的制备方法，步骤如下：
用EcoRⅠ和NotⅠ分别对pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段进行双酶切，用T4DNA连接酶将酶切后的pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。
包含如上所述的重组载体的重组毕赤酵母工程菌株，所述工程菌株为GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
如上所述的重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，步骤如下：
S1：用BglⅡ酶对重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES进行线性化得到线性酶切产物；
S2：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
利用如上所述的重组毕赤酵母工程菌株制备提高木质纤维素水解率的融合蛋白的方法，步骤如下：
S1：将重组毕赤酵母工程菌株接种培养，并诱导其表达；
S2：收获步骤S1的表达产物，并进行纯化得到融合蛋白。
如上所述的融合蛋白能够应用在降解木质纤维素方面中。
更为具体地，相关制备步骤如下：
一、融合蛋白的编码基因的获取
(1)采用平板划线法将甘油管保存的里氏木霉QM9414孢子接种到PDA平板上进行活化，封口。在30℃培养箱内培养一周左右，即培养基表面长满绿色孢子，然后接种于菌丝体培养基中，摇床培养2-3天，获得所需的菌丝，在超净台上用滤纸把水吸干，放入预冷的研钵，液氮研磨，并用宝生物的总RNA提取试剂盒对存于冰箱且处理过的里氏木霉菌丝进行RNA提取。
(2)按5×gDNAEraser Buffer,4μL；gDNAEraser，2μL；RNA，4μL；RNase Free dH2O，10μL配制20μL反应体系，在42℃水浴锅中放置2min，立即置于冰上，进行RNA纯化。
按RNA纯化产物，10μL；反转录酶混合液1，1μL；RT Primer Mix，1μL；5×PrimerScript Buffer2，4μL；不含RNA酶的dH2O，4μL配制20μL反应体系，37℃水浴15min，转移到85℃水浴5s，将得到的cDNA保存于-20℃冰箱。
(3)通过PCR方法扩增出目的基因，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，获得密码子优化后的SwoI及其结构域的基因序列Swob、Swobc、SwoI，所用到的引物如下：(上游引物F、下游引物R、连接引物L)
Figure BDA0002261935390000051
根据毕赤酵母的密码子偏好性，对里氏木霉来源的内切纤维素酶(EgⅡ)进行密码子优化，获得基因序列egⅡ,所用到的引物如下：
Figure BDA0002261935390000061
按照cDNA，2.5μL；上游引物，1.25μL；下游引物，1.25μL；2×PrimeSTAR HS(Premix)，25μL；ddH2O，20μL配制50μL反应体系，进行PCR扩增目的基因，PCR程序：预热95℃，3min；95℃，15s，55℃，15s，72℃，15s/kb，30-35个循环；后延伸72℃，5min。
PCR扩增结束后退出程序，进行核酸电泳，结束后，在含有溴化乙锭(EB)的水中浸泡6-10min，取出核酸胶经漂洗后轻放至凝胶仪中，观察、拍照留存。验证正确后，存于-20℃冰箱备用。
(4)通过重叠PCR方法制备融合蛋白基因
以引物对egⅡ-F/swob-R、egⅡ-F/swobc-R、egⅡ-F/swoI-R进行PCR以获得融合基因e-b、e-bc、e-s。按照PrimeSTAR HS(Premix)，25μL；PCR产物，2.5μL；5′端引物(10μM)，1.25μL；3′端引物(10μM)，1.25μL；ddH2O，20μL配制50μL反应体系，离心后，置于PCR仪内，PCR程序：预热95℃，3min；95℃，30s，60℃，30s，72℃，30-60s/kb，15个循环；后延伸72℃，7min。
所用到的引物如下：
Figure BDA0002261935390000062
Figure BDA0002261935390000071
PCR扩增结束后退出程序，进行核酸电泳，结束后，在含有溴化乙锭(EB)的水中浸泡6-10min，取出核酸胶经漂洗后轻放至凝胶仪中，观察、拍照留存。验证正确后，使用纯化回收试剂盒回收融合基因PCR产物。
二、包含融合蛋白E-B、E-BC、E-S核苷酸序列的重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES的构建
(1)对目的基因e-b、e-bc、e-s与pPIC9k质粒按照基因/质粒，20μL；EcoR I，2.5μL；NotⅠ，2.5μL；Buffer H，5μL；ddH2O，20μL配制EcoR I/NotⅠ双酶切50μL体系，37℃水浴2.5h，用索莱宝公司的纯化回收试剂盒回收双酶切产物。
(2)使用宝生物的DNALigation Kit Ver.2.1对酶切质粒与基因片段进行连接，连接体系按照基因，4μL；pPic9k，1μL；SolutionⅠ，5μL配制10μL体系，放于16℃水浴锅内过夜连接。
(3)用连接后的质粒转化大肠杆菌感受态。取10μL上一步的连接产物加入到100μL的大肠杆菌DH5α感受态中，轻柔混匀后置于冰上静置30min。将上一步的混合物在42℃水浴锅中热击90秒，立即置于冰上放置3-5min。向离心管中加入1mL不含氨苄的LB培养基。在37℃恒温摇床中120rpm震荡培养1h，取100μL涂布到含有氨苄(1％)的LB平板上，在37℃培养箱中倒置培养过夜，挑取阳性克隆用通用引物AOX1进行PCR验证，将验证正确的新鲜菌液送去金唯智公司进行测序，测序结果正确，即成功构建了质粒。用索莱宝质粒小提试剂盒提取质粒。通用引物如下：
AOX1-F 5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
AOX1-R 5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
三、包含重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES的重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES的构建及诱导表达
(1)用BglⅡ酶对重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES进行线性化，按照质粒，25μL；BglⅡ，2μL；Buffer H，5μL；ddH2O，18μL配制50μL线性化体系，37℃水浴2.5h，核酸电泳验证正确后，用索莱宝公司的纯化回收试剂盒进行纯化。
(2)转化毕赤酵母感受态。取10μL上一步获得的线性质粒加入80μL感受态，混匀后转入提前预冷的0.2cm的电转杯中，将电转杯置于冰上静置5min。将电转仪设置为电压1500V，电阻200Ω，电容20μF，电击时间5毫秒。电击后立即向杯中加入1mL预冷的山梨醇，混匀后将菌液转移至灭菌的1.5mL离心管中，封口后于30℃培养箱中静置培养1h。将沉淀的菌体重悬后取200μL涂布在MD平板上，30℃恒温培养箱中倒置2-3天至克隆产生。挑取阳性克隆至加入不同浓度G418的YPD平板上，培养2-3天，挑取生长较大的菌落进行菌落PCR验证，保存验证正确的菌株。
(3)挑取菌落验证正确的阳性克隆接种至5mL的BMGY液体培养基中，30℃，220rpm，震荡培养过夜。取过夜培养物以1％的接种量接种至25mLBMGY培养基中，30℃，200rpm震荡培养至OD600为2-6(对数期，大约12-16h)。将培养物转移至50mL离心管中，5000rpm离心5min，弃上清，用50mLBMMY液体培养基重悬细胞至OD600为1.0，加入甲醇至浓度为0.5％。将菌液转移到250mL摇瓶中，30℃，250rpm震荡培养。每24h取样，测OD600，12000rpm离心1min收集上清。每24h补加甲醇至终浓度为0.5％，达到最佳诱导时间后，将培养物7500rpm离心10min，收集上清。对上清液进行Ni柱纯化并用pH5.0，50mM的柠檬酸缓冲液做透析液透析并回收蛋白，对回收的蛋白进行SDS-PAGE分析，如图1所示，E-B的电泳结果，约为63.8KD；如图2所示为E-BC和E-S的电泳结果，分别约为77KD和97KD，验证结果正确。
四、融合蛋白E-B、E-BC、E-S水解CMC活性分析
SwoI结构域体系含有0.01g的CMC，100μL SwoI结构域，并取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。纤维素酶体系含有0.01g的CMC，100μL的EGⅡ，并取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。添加SwoI结构域的纤维素酶体系含有0.01g的CMC，50μL的EGⅡ和50μL SwoI结构域，并取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。融合蛋白体系含有0.01g的CMC，100μL的融合蛋白，并取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。将以上不同体系置于55℃，水浴12h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用DNS法测定还原糖产量。如图3所示，融合蛋白E-B、E-BC、E-S产生的水解活性相对于融合前分别提高了13％、18％和25％。
五、融合蛋白E-B、E-BC、E-S水解玉米芯活性分析
取1％预处理后的玉米芯为水解底物。预处理方法：将玉米芯置于80℃烘箱，烘干至恒重；精确称取50g烘干后的玉米芯，置于1L螺口瓶中，加入600mL 1％NaOH溶液，室温静置30min；待玉米芯充分膨胀后，在50℃水浴锅内预处理4h；待冷却至室温后，6层纱布过滤玉米芯并用去离子水冲洗至中性；90℃烘干至恒重，干燥处留存备用。
SwoI结构域体系含有0.01g的玉米芯，100μL的SwoI结构域，并用移液枪取900μL50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。纤维素酶体系含有0.01g的玉米芯，100μL的EGⅡ，并用移液枪取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。添加SwoI结构域的纤维素酶体系含有0.01g的玉米芯，50μL的EGⅡ和50μL SwoI结构域，并用移液枪取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。融合蛋白体系含有0.01g的玉米芯，100μL的融合蛋白，并取900μL 50mM，pH 5.0的柠檬酸缓冲溶液，使得终体积为1mL。将以上不同体系置于55℃，水浴12h，沸水浴加热5min终止反应，12000rpm离心1min，取上清，用DNS法测定还原糖产量。如图4所示，融合蛋白E-B、E-BC、E-S产生的水解活性相对于融合前分别提高了15％、25％和33％。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> swob-F(Unknown)
<400> 1
cggaattcat gcaccaccac caccaccacg gaggagcttg tggtt 45
<210> 2
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> swob-R(Unknown)
<400> 2
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttaccgac ctttgggca 49
<210> 3
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> swobc-F(Unknown)
<400> 3
cggaattcat gcaccaccac caccaccacg gaggagcttg tggtttc 47
<210> 4
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> swobc-R(Unknown)
<400> 4
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttttgaga aaattgaact ccaata 56
<210> 5
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> swoI-F(Unknown)
<400> 5
cggaattcat gcaccaccac caccaccact tgtttggaca atgcggagg 49
<210> 6
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> swoI-R(Unknown)
<400> 6
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttttgaga aaattgaact ccaatatc 58
<210> 7
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> egⅡ-F(Unknown)
<400> 7
cggaattcat gcaccaccac caccaccacc aacaaactgt ctgggga 47
<210> 8
<211> 48
<212> DNA/RNA
<213> egⅡ-R(Unknown)
<400> 8
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt gctttctggc caagcaac 48
<210> 9
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> egⅡ-L(Unknown)
<400> 9
gccacctcca gaacctccgc caccctttct ggccaagcaa c 41
<210> 10
<211> 40
<212> DNA/RNA
<213> swob-L(Unknown)
<400> 10
ggaggttctg gaggtggcgg ttccggagga gcttgtggtt 40
<210> 11
<211> 49
<212> DNA/RNA
<213> swob-R(Unknown)
<400> 11
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttaccgac ctttgggca 49
<210> 12
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> swobc-L(Unknown)
<400> 12
ggaggttctg gaggtggcgg ttccggagga gcttgtggtt tc 42
<210> 13
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> swobc-R(Unknown)
<400> 13
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttttgaga aaattgaact ccaata 56
<210> 14
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> swoI-L(Unknown)
<400> 14
ggaggttctg gaggtggcgg ttccttgttt ggacaatgcg gagg 44
<210> 15
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> swoI-R(Unknown)
<400> 15
ttgcggccgc ttagtggtgg tggtggtggt ggttttgaga aaattgaact ccaatatc 58
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> AOX1-F(Unknown)
<400> 16
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> AOX1-R(Unknown)
<400> 17
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (9)

1.一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白是将内切纤维素酶EGⅡ与辅助蛋白SwoI或其结构域通过（GGGGS）2柔性连接肽构建而成，所述内切纤维素酶EGⅡ在N端，辅助蛋白SwoI在C端;
结构域基因序列分别是：Swob，为Expansin-like EG45编码基因；或Swobc，为SwoI去除CBM与Linker区域的编码基因，所述SwoI为去除信号肽后的编码基因序列。
2.根据权利要求1所述的提高木质纤维素水解率的融合蛋白，其特征在于：所述内切纤维素酶EGⅡ来源于里氏木霉QM9414；
或者，所述辅助蛋白SwoⅠ及其结构域来源于里氏木霉，其NCBI基因ID为AJ245918.1。
3.如权利要求1或2所述的融合蛋白的编码基因，其特征在于：所述编码基因的获取方法的步骤如下：
S1. 以里氏木霉QM9414的基因组DNA为模板，以上游引物和下游引物作为扩增引物，所述上游引物和下游引物为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6，进行PCR扩增，得到Swob、Swobc、SwoI编码基因片段，根据毕赤酵母密码子偏好性进行密码子优化，得到优化后的基因；
S2. 通过重叠PCR将进行密码子优化后的内切纤维素酶通过柔性连接肽（GGGGS）2与密码子优化后的基因，构成融合基因e-b、e-bc、e-s，即为编码基因。
4.包含如权利要求3所述的融合蛋白的编码基因的重组载体，其特征在于：所述重组载体为pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES。
5.如权利要求4所述的重组载体的制备方法，其特征在于：步骤如下：
用EcoRⅠ和NotⅠ分别对pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段进行双酶切，用T4 DNA连接酶将酶切后的pPIC9k载体和e-b、e-bc、e-s基因片段连接，转化，提取质粒，得到重组载体。
6.包含如权利要求4所述的重组载体的重组毕赤酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株为GS115-pPic9k-EB 、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
7.如权利要求6所述的重组毕赤酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：步骤如下：
S1：用BglⅡ酶对重组载体pPic9k-EB、pPic9k-EBC、pPic9k-ES进行线性化得到线性酶切产物；
S2：以毕赤酵母为宿主菌，将步骤S1得到的线性酶切产物转入，经过抗性筛选阳性克隆子，获得重组毕赤酵母工程菌株GS115-pPic9k-EB、GS115-pPic9k-EBC、GS115-pPic9k-ES。
8.利用如权利要求6所述的重组毕赤酵母工程菌株制备提高木质纤维素水解率的融合蛋白的方法，其特征在于：步骤如下：
S1：将重组毕赤酵母工程菌株接种培养，并诱导其表达；
S2：收获步骤S1的表达产物，并进行纯化得到融合蛋白。
9.如权利要求1或2所述的融合蛋白在降解木质纤维素中的应用。
CN201911074372.8A 2019-11-06 2019-11-06 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用 Active CN110981965B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911074372.8A CN110981965B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911074372.8A CN110981965B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110981965A CN110981965A (zh) 2020-04-10
CN110981965B true CN110981965B (zh) 2022-11-15

Family

ID=70083499

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911074372.8A Active CN110981965B (zh) 2019-11-06 2019-11-06 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110981965B (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101171333A (zh) * 2005-04-29 2008-04-30 生化酶股份有限公司 改善的纤维素酶
CN101827939A (zh) * 2007-08-30 2010-09-08 埃欧金能源公司 使用副酶对木质纤维素原料的酶水解
CN102300986A (zh) * 2008-12-04 2011-12-28 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102311960A (zh) * 2011-07-13 2012-01-11 深圳大学 一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用
CN102459582A (zh) * 2009-05-29 2012-05-16 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
CN103930438A (zh) * 2011-09-30 2014-07-16 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸
CN105296451A (zh) * 2015-12-08 2016-02-03 中国农业科学院饲料研究所 一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法及重组菌株
CN108866112A (zh) * 2018-08-17 2018-11-23 青岛中科潮生生物技术有限公司 采用木质纤维素制备角鲨烯的方法
CN111019924A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 山东大学 一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9994835B2 (en) * 2008-05-11 2018-06-12 Lallemand Hungary Liquidity Management Llc Construction of protrophic/celluloytic yeast strains expressing tethered and secreted cellulases

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101171333A (zh) * 2005-04-29 2008-04-30 生化酶股份有限公司 改善的纤维素酶
CN101827939A (zh) * 2007-08-30 2010-09-08 埃欧金能源公司 使用副酶对木质纤维素原料的酶水解
CN102300986A (zh) * 2008-12-04 2011-12-28 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
CN102459582A (zh) * 2009-05-29 2012-05-16 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
CN102311960A (zh) * 2011-07-13 2012-01-11 深圳大学 一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用
CN103930438A (zh) * 2011-09-30 2014-07-16 诺维信股份有限公司 具有β-葡糖苷酶活性的嵌合多肽和对其进行编码的多核苷酸
CN105296451A (zh) * 2015-12-08 2016-02-03 中国农业科学院饲料研究所 一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法及重组菌株
CN108866112A (zh) * 2018-08-17 2018-11-23 青岛中科潮生生物技术有限公司 采用木质纤维素制备角鲨烯的方法
CN111019924A (zh) * 2020-01-10 2020-04-17 山东大学 一种适于制备纤维素纳米晶体的纤维素酶及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Enhancing the enzymatic hydrolysis efficiency of lignocellulose assisted by artificial fusion enzyme of swollenin-xylanase;LipingDu等;《Industrial Crops and Products》;20211019;第173卷;1-8 *
Production of a chimeric enzyme tool associating the Trichoderma reesei swollenin with the Aspergillus niger feruloyl esterase A for release of ferulic acid;Anthony Levasseur等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20061201;第73卷;872-880 *
SWOI/XYNΠ融合蛋白的构建及其降解木质纤维素的研究;姜风超;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》;20190415(第4期);A006-227 *
来源于嗜热真菌Talaromyces leycettanus JCM12802的类膨胀素基因鉴定及功能;顾源等;《生物技术通报》;20180409;第34卷(第1期);172-181 *
纤维水解辅助蛋白SwoⅠ的结构域功能及应用;郭高杰;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 基础科学辑》;20200715(第7期);A006-127 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110981965A (zh) 2020-04-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101591648B (zh) 一种耐热角质酶-cbd的制备及其在棉纤维精练中的应用
CN109971784A (zh) 一种毕赤酵母中异源表达内切葡聚糖酶egⅱ，egⅳ，egⅴ的构建方法
CN105238704A (zh) 一种快速提高里氏木霉纤维素酶酶活的方法
CN113980141B (zh) 基于大肠杆菌素e家族dna酶的蛋白质复合物及其在人工蛋白支架中的应用
CN112553227B (zh) 一种耐热多功能糖苷水解酶及其编码基因和应用
US9890371B2 (en) Thermophilic ethanol-resistant β-glucosidase and encoding gene and application thereof
CN112708589A (zh) 一种基因工程菌及其构建方法与在发酵产5-羟基色氨酸上的应用
CN104975039A (zh) 一种重组质粒及其在降解纤维素原料中的应用
CN109797160A (zh) 一种毕赤酵母中异源表达外切葡聚糖酶Cel6A,Cel7A的构建方法
CN113684198B (zh) 一种提高纤维素酶催化效率的方法及突变体5i77-m2
CN108753741B (zh) 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶AnLPMO15g及其应用
CN105296451B (zh) 一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法及重组菌株
CN110981965B (zh) 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用
CN106967701B (zh) 酸性耐高温纤维素酶Cel5及其基因和应用
JP6357702B2 (ja) 耐熱性セロビオハイドロラーゼ及びそのアミノ酸置換変異体
CN102899339B (zh) 一种碱性木聚糖酶xynHBs核苷酸优化序列及其高效表达方法
CN110093326B (zh) 一种胞外AA9家族多糖单加氧酶EpLPMOa及其应用
Bhiri et al. Molecular cloning, gene expression analysis and structural modelling of the cellobiohydrolase I from Penicillium occitanis
CN111961690A (zh) 一种蒸汽***狼尾草批式补料同步糖化发酵生产乙醇的方法
CN103614354A (zh) 一种糖化酶及其重组表达菌株
CN107488221B (zh) 真菌来源的膨胀素蛋白及其基因和应用
CN114410505B (zh) 热纤梭菌及其在木质纤维素水解中的应用
CN101250509A (zh) 一种高温角质酶及其基因序列
CN114561303A (zh) 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用
CN112359025B (zh) 一种突变蛋白AnLPMO15g-Ep3及其构建方法、表达和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant