CN110981945B

CN110981945B - 一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的表达制备及应用

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Publication number: CN110981945B
Application number: CN201911246097.3A
Authority: CN
Inventors: 张文亮; 李鹏宇; 刘新月; 栗利芳; 侯旭; 张彤; 肖进; 齐鹏
Original assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Current assignee: China Animal Husbandry Industry Co Ltd
Priority date: 2019-12-08
Filing date: 2019-12-08
Publication date: 2021-10-19
Anticipated expiration: 2039-12-08
Also published as: CN110981945A

Abstract

本发明公开了一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的表达制备及应用。猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，其序列为序列表中序列2。其编码基因为序列表中序列1。猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的制备方法，包括下述步骤：1)表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的重组菌；2)重组菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体；3)包涵体溶解复性获得组装的猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子。本发明采用大肠杆菌表达***表达猪圆环病毒2型Cap蛋白，蛋白表达量大，纯化方法简单，极大降低了生产成本，有利于推进之后的大批量生产。

Description

一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的表达制备及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的包涵体表达、纯化、复性及应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科、圆环病毒属，具有PCV1，PCV2和PCV3三个血清型。PCV病毒粒子为正二十面体对称结构，直径约17nm，是目前已知的最小的动物病毒，病毒表面无囊膜。猪圆环病毒病是由猪圆环病毒2型引起的一种传染病，临床上主要表现为生长发育不良、消瘦、母猪繁殖障碍、呼吸困难，皮下***高度肿大、出血、坏死等，分为断奶仔猪多***衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎和肾病综合征(PNDS)、增生坏死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia，PNP)、繁殖障碍(Reproductivefailure)、围产期心肌炎(Perinatal myocarditis)、仔猪先天性震颤(Congenitaltremors)等临床类型。研究表明PCV2在猪的淋巴***增殖，可引起免疫细胞的凋亡，造成免疫抑制，导致机体抵抗力下降，从而诱发多种细菌病毒的混合感染和继发感染，给养殖业造成巨大的经济损失。

猪圆环病毒为单股负链环状DNA病毒，病毒基因组至少含有11个开放阅读框，即ORF1-ORF11。其中ORF1是PCV最大的开放阅读框，编码病毒复制相关蛋白Rep蛋白(314aa，约36kDa)，该蛋白是引起PCV1和PCV2抗原交叉反应的主要原因，ORF1相对比较保守，在两个血清型之间的同源性约为85％；ORF2编码病毒衣壳蛋白Cap蛋白(233aa，约27kDa)，该蛋白是型特异性抗原，具有较好的免疫原性，在两个血清型之间不发生抗原交叉反应，两血清型之间的同源性仅为67％。PCV3是近些年才发现的新血清型，其ORF2编码的Cap蛋白与PCV2的Cap蛋白氨基酸同源性约为34％，目前对PCV3的研究相对较少。

目前，在我国已报道的PCV2基因亚型有PCV2a、PCV2b、PCV2c，PCV2d和PCV2e五种。血清学调查发现国内猪群阳性率高达52.8％～100％，发病率高达50％，死亡率因猪场条件、继发感染等情况不同，一般在5％～70％，给养猪业造成巨大经济损失。疫苗免疫对PCV2的预防控制起到关键性作用。目前猪圆环病毒疫苗主要有灭活疫苗、弱毒活疫苗和亚单位疫苗，其中国内多为灭活疫苗，但由于PCV2病毒不易在细胞上繁殖，生产病毒滴度普遍偏低，免疫效果不够理想，此外灭活苗还存在灭活效果难检测、免疫期短等问题，相较其他病毒的灭活疫苗增加了生产成本；亚单位疫苗的安全性受到行业认可，但国内生产亚单位疫苗水平参差不齐，而进口亚单位疫苗，虽然免疫效果良好，但价格较高。

发明内容

本发明的目的是提供一种通过大肠杆菌表达***制备猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的方法，并使蛋白具有良好的生物活性和免疫原性。

基于上述目的，本发明提供一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，其序列为序列表中序列2。

本发明还提供所述的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因；优选的，所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因如序列表中序列2所示。

本发明还提供表达所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的重组载体，是将序列1所示的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因***到出发载体中获得的。

所述出发载体优选为pET-30a(+)。

本发明的另一个目的是提供一种猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的制备方法，包括下述步骤：

1)将所述的重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，得到表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的重组菌；

2)将步骤1)获得的重组菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体；

3)将步骤2)获得的包涵体溶解复性获得组装的猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子。

具体的，所述方法包括下述步骤：

(1)目的基因合成：序列1所示的优化后的Cap基因序列***到pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶识别位点之间，得到表达重组后的Cap蛋白的重组载体，将其命名为pET-CapR；

(2)重组菌株筛选：将步骤(1)获得的质粒pET-CapR转化入大肠杆菌感受态BL21(DE3)；获得表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的工程菌株，将其命名为E.coli-PCV2-FJ-Cap；(3)包涵体诱导表达：将步骤(2)获得的菌株E.coli-PCV2-FJ-Cap进行培养，利用IPTG诱导表达蛋白；

(4)包涵体纯化：离心收集步骤(3)获得的重组菌，超声破碎菌体，离心弃上清，刮去沉淀上层的菌泥，收集包涵体；

(5)包涵体变性及复性：用包涵体溶解液溶解包涵体，将溶解后的包涵体缓慢加入包涵体复性液进行稀释复性，4℃搅拌48h；复性液的配方为：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0；

(6)浓缩纯化：将置换液缓慢加入复性液中，4℃浓缩，最后得到浓缩的Cap蛋白；置换液的配方为：20mM Tris-HCL，50mM NaCl，pH调至8.0。

上述表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的工程菌株，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，菌株名称为E.coli-PCV2-FJ-Cap；已于2019年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.18235。

本发明的一个目的是所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白或权利要求2所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因在制备猪圆环病毒2型重组Cap蛋白病毒粒子中的应用。

所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白或权利要求2所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因在制备预防或治疗圆环病毒2型疫苗中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的积极有益效果：

本发明采用大肠杆菌表达***表达猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，蛋白表达量大，纯化方法简单，极大降低了生产成本，有利于推进之后的大批量生产；

本发明利用大肠杆菌原核表达***，以包涵体的形式表达了PCV2的重组Cap蛋白，并解决了技术难题，使包涵体经处理后得到的重组Cap蛋白具有较高的VLP组装率、较好的生物活性和免疫原性，极大降低了生产成本，为亚单位疫苗的研制奠定了基础。

本发明优化了猪圆环2型重组Cap蛋白的编码序列，提高了蛋白表达量，并通过特定配方的蛋白复性液、置换液处理包涵体，使最终得到的重组Cap蛋白具有较好的生物活性、VLP组装率较高、蛋白稳定性较好；

经动物实验验证，用本发明制备的重组Cap蛋白免疫小鼠和猪，均可产生高水平抗体，为疫苗的制备、检测方法的建立奠定了基础。

附图说明

图1为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白CGMCC No.18235菌落PCR鉴定图片；

图2为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白CGMCC No.18235SDS-PAGE胶染色图片及其组装VLP电镜图片；

图3为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白DLS检测结果；

图4为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白序列优化前后SDS-PAGE胶染色图片。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的制备

1、实验材料

引物合成自上海捷瑞生物工程有限公司，大肠杆菌BL21(DE3)感受态为实验室保存；

主要试剂DNA质粒小提取试剂盒；蛋白胨、酵母浸出物购自Oxoid；IPTG、L-盐酸精氨酸、Tris-HCL购自Amresco；BSA蛋白标准品购自Thermo Fisher Scientific；

2、猪圆环病毒2型重组Cap蛋白表达质粒的构建

重组Cap基因序列来自本实验室分离的PCV2流行毒株，重组Cap基因序列经序列分析比较，将其Cap蛋白序列去掉N端41个碱性氨基酸后进行结构预测，并与已经解析的PCV2Cap蛋白结构(PDB:3R0R)进行结构比对，使用CCP4软件包对subunits间Contacts范德华力进行计算分析。保留病毒颗粒表面B折叠、C折叠、BC环、C末端等主要抗原区氨基酸不变的前提下，对3次轴和5次轴subunits间主要Contacts进行氨基酸替换，如DE环和EF环参与疏水相互作用的氨基酸残基，经数轮结构模拟和氨基酸替换后，目的基因进行密码子优化后由南京捷瑞生物有限公司合成，合成的基因构建在pET-30a(+)载体中(该载体由本实验室保存)，重组Cap基因的5’和3’分别***NdeⅠ和XhoⅠ两个酶切位点，优化后的重组Cap基因序列如序列表中序列1所示，优化后的重组Cap基因表达的蛋白序列如序列表中序列2所示。

3、猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的诱导表达

序列1所示的优化后的重组Cap基因序列***到pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶识别位点之间，得到表达重组后的Cap蛋白的重组载体，将其命名为pET-CapR。

将表达质粒pET-CapR分别转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态，将1μL表达质粒加入100μL感受态中，轻轻震荡混匀后，冰浴30min，在42℃水浴锅中热激90s，继续冰浴3min，加入800μL无抗LB培养基，37℃，200rpm培养1h，6000rpm离心5min，弃750μL上清，用剩下的培养基重悬菌体后，均匀涂布于具有卡那抗性的LB平板上，37℃培养过夜。

挑取单菌落进行PCR鉴定，PCR扩增总反应体系25μl，其中含上游引物PCV2-F-1(CATATGAATGGCATCTTCAACACCCG，下划线部分为NdeⅠ酶切位点序列)1μl，下游引物PCV2-R-1(CTCGAGCTTAGGGTTAAGTGGGGG，下划线部分为XhoⅠ酶切位点序列)1μl，PCR酶MIX 12.5μl，无菌蒸馏水9.5μl，模板DNA 1μl。循环反应参数：94℃预变性3分钟；94℃变性45秒，56℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共32个循环；最后72℃延伸10分钟。

PCR产物于1％琼脂糖凝胶上电泳检测(结果见图1)。由图1可见，扩增出一条约600bp的条带，与预期扩增片段大小相符。

上述检测阳性的重组工程菌株即为表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的工程菌株，分类命名：大肠埃希氏菌Escherichia coli，菌株名称为E.coli-PCV2-FJ-Cap；已于2019年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCCNo.18235。

将E.coli-PCV2-FJ-Cap阳性单菌落37℃下200rpm过夜培养作为种子液，第二天将种子按照1:100的比例接种具有卡那抗性的LB培养基，37℃下200rpm培养2～3h，当菌液OD600达0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃继续诱导培养5h。

4、菌体收集及破碎

将菌体5000rpm离心10min，收集菌体，用PBS重悬菌体，将重组大肠杆菌进行10倍浓缩，即50mL菌液离心后用5mL PBS进行重悬，超声破碎细菌，超声破碎仪参数设置为：功率190W，工作5s，关闭10s，超声10min，保证菌体完全破碎。

5、包涵体的纯化

将上步超声后菌液以12000rpm低温离心10min，弃上清，用细胞刮子刮去上层灰色菌泥，再用包涵体洗涤液充分重悬包涵体，12000rpm低温离心10min，弃上清，再次刮去菌泥，获得初步纯化的包涵体；

包涵体洗涤液配方如下：0.5％Triton X-100，50mM Tris-HCl，300mM NaCl，pH调至8.0。

6、包涵体的变性及复性

将包涵体称重，并用溶解液以30mg/mL的比例溶解包涵体，过夜充分搅拌，使包涵体完全溶解。取2mL包涵体溶液，缓慢加入200mL复性液中，4℃搅拌复性48h，用浓缩杯浓缩至50mL。

包涵体溶解液配方如下：8M尿素，50mM Tris-HCl，100mM NaCl，10％甘油，10mMEDTA，pH调至8.0。

复性液配方如下：50mM Tris-HCl，400mM L-精氨酸，pH调至8.0。

7、复性液浓缩置换

向复性液中缓慢加入置换液至1L，4℃搅拌并浓缩至50mL，即可获得复性的Cap蛋白。

置换液配方如下：20mM Tris-HCL，50mM NaCl，pH调至8.0。

8、蛋白定性及电镜检测

通过SDS-PAGE检测重组Cap蛋白的纯度，并通过电镜检测VLP的组装(结果见图2)。

9、DSL(动态光散射)检测

通过DSL(动态光散射)检测已形成的VLP的组装，结果见图3，结果显示粒子的半径为8.87nm，所占比例超过90％(结果见图3)。

实施例2猪圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗的制备

1、蛋白制备

挑取pET-CapR转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得表达重组Cap蛋白的重组菌单菌落E.coli-PCV2-FJ-Cap按照实施例1中步骤3-7的方法制备重组Cap蛋白，即：将大肠埃希氏菌Escherichia coli E.coli-PCV2-FJ-Cap CGMCCNo.18235接种于20ml LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养作为种子液，第二天将种子按照1:100的比例接种5L含卡那抗性的LB培养基，37℃，200rpm培养2～3h，当菌液OD600达0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃继续诱导培养5h。菌体5000rpm离心10min，收集菌体，用500mL PBS重悬菌体，超声破碎细菌，超声破碎仪参数设置为：功率190W，工作5s，关闭10s，超声1h。超声后12000rpm离心10min，弃上清，刮去灰色菌泥，并用包涵体洗涤液重悬包涵体，12000rpm离心10min，弃上清，再次刮去菌泥，获得初步纯化的包涵体。以30mg/mL的比例溶解包涵体，过夜充分搅拌。取2mL包涵体溶液，缓慢加入200mL复性液中，4℃搅拌复性48h。向复性液中缓慢加入置换液至1L，4℃搅拌并浓缩至50mL，即可获得复性的重组Cap蛋白。最后，用SDS-PAGE胶灰度法检测重组Cap蛋白的浓度。

同时，将野生型猪圆环病毒2型Cap基因(序列表中序列3)***到pET-30a(+)的NdeⅠ和XhoⅠ酶识别位点之间，得到表达野生Cap蛋白的重组载体，并将其命名为pET-Cap。

挑取pET-Cap转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态获得表达重组野生Cap蛋白的重组菌单菌落接种于20ml LB培养基中，37℃，200rpm过夜培养作为种子液，第二天将种子按照1:100的比例接种5L含卡那抗性的LB培养基，37℃，200rpm培养2～3h，当菌液OD600达0.6～0.8时，加入终浓度为1mmol/L的IPTG，37℃继续诱导培养5h。菌体5000rpm离心10min，收集菌体，用500mL PBS重悬菌体，超声破碎细菌，超声破碎仪参数设置为：功率190W，工作5s，关闭10s，超声1h。超声后12000rpm离心10min，弃上清，刮去灰色菌泥，并用包涵体洗涤液重悬包涵体，12000rpm离心10min，弃上清，再次刮去菌泥，获得初步纯化的包涵体。以30mg/mL的比例溶解包涵体，过夜充分搅拌。取2mL包涵体溶液，缓慢加入200mL复性液中，4℃搅拌复性48h。向复性液中缓慢加入置换液至1L，4℃搅拌并浓缩至50mL，即可获得复性的重组Cap蛋白。最后，用SDS-PAGE胶灰度法检测重组Cap蛋白的浓度。

结果表明，本发明优化了猪圆环病毒2型Cap蛋白的编码序列，提高了蛋白表达量，通过SDS-PAGE法比较包涵体中Cap基因序列优化前后的表达量，结果表明序列优化的Cap蛋白包涵体表达量比优化前约提高35％(如图4)，经包涵体洗涤变性复性后，序列优化的Cap蛋白终利率约为160mg/L培养液，而优化前的Cap蛋白终利率约为50mg/L培养液。

2圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗配制

将过滤除菌的重组Cap蛋白与SEPPIC公司的206佐剂按照质量比1:1混合配制疫苗，使疫苗中Cap蛋白的终浓度分别为0，5，10，20，50，100μg/ml，乳化条件为佐剂和水相分别温浴至31℃，将水相缓慢加入佐剂中，350rpm搅拌5min，在20℃冷浴1小时，避免移动和搅拌。待混合完全后，即得疫苗组合物，疫苗乳化质量能够达到国家规定的质量标准。

实施例3：猪圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗的免疫原性研究

1、仔猪安全性试验

筛选35头2～3周龄圆环抗原抗体双阴性仔猪进行圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗的安全性试验。分组情况：随机选取30头仔猪均分成5组，5头/组，作为疫苗免疫组，免疫组1每头猪免疫含5μg/ml重组Cap蛋白的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗4ml，免疫组2每头猪免疫含10μg/ml重组Cap蛋白的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗4ml；免疫组3每头猪免疫含20μg/ml重组Cap蛋白的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗4ml，免疫组4每头猪免疫含50μg/ml重组Cap蛋白的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗4ml，免疫组5每头猪免疫含100μg/ml重组Cap蛋白的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗4ml；免疫组6每头猪免疫100μg/ml野生Cap蛋白的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗4ml；剩余5头作为对照组，每头颈部肌肉注射PBS 4ml。免疫后第0～7d每天测定体温；连续14d观察猪群食欲、精神状态；观察、触摸注射部位局部是否存在肿块。

圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗免疫各组仔猪后没有出现明显的体温升高现象，且猪群采食正常、精神状态良好；疫苗注射部位在免疫后5d触摸无痛感，无肿块(表1)。说明该疫苗对免疫仔猪安全性良好。

表1为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白疫苗免疫仔猪后临床症状监测结果

组别

体温

食欲

精神状态

注射部位

健康情况

存活率

免疫组1

正常

良好

无异常

良好

100％

免疫组2

正常

良好

无异常

良好

100％

免疫组3

正常

良好

无异常

良好

100％

免疫组4

正常

良好

无异常

良好

100％

免疫组5

正常

良好

无异常

良好

100％

免疫组6

正常

良好

无异常

良好

100％

对照组

正常

良好

无异常

良好

100％

2、小鼠免疫试验

2.1小鼠免疫程序

35只5～6周龄圆环抗原抗体双阴性健康清洁级雌性BALB/c小鼠进行圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗的抗体水平产生试验。分组情况：随机选取30只小鼠均分成6组，5只/组，作为疫苗免疫组，免疫组①每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环重组Cap蛋白5μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml，免疫组②每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环重组Cap蛋白10μg/ml的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml，免疫组③每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环重组Cap蛋白20μg/ml的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml，免疫组④每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环重组Cap蛋白50μg/ml的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml，免疫组⑤每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环重组Cap蛋白100μg/ml的圆环病毒2型重组Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml；免疫组⑥每只小鼠背部皮下多点免疫含圆环野生Cap蛋白100μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗0.2ml；剩余5只作为对照组，每只背部皮下多点免疫PBS 0.2ml。首免后3周、5周分别采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体和中和抗体。

2.2小鼠抗体检测方法

ELISA抗体检测方法如下：用pH9.6碳酸盐缓冲液包被圆环Cap蛋白，浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，洗涤后加入300μl的0.5％酪蛋白封闭液封闭板子，37℃，2h；用样品稀释液倍比稀释待检血清后加入包被板，同时设置阴阳性血清对照组，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤；加入羊抗鼠二抗(1:10000稀释)，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤；加入底物显色液TMB显色，100μl/孔，37℃作用15min，用2M H₂SO₄终止反应。结果判定：阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效；阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效；临界值的计算：临界值＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。

2.3小鼠抗体检测结果

小鼠ELISA抗体结果见表2，结果表明：免疫组在21天已经产生ELISA抗体，35天抗体效价进一步增高，且随着重组Cap蛋白浓度的增高，抗体效价亦有所增加，阴性对照组未见ELISA抗体。

表2为猪圆环病毒2型Cap蛋白CGMCC No.18235疫苗免疫小鼠后抗体检测结果

3、仔猪免疫试验

3.1仔猪免疫效力验证程序

35头2～3周龄圆环抗原抗体双阴性健康仔猪进行圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗的抗体水平产生试验。分组情况：随机选取30头仔猪平均分成5组，5头/组，作为疫苗免疫组，免疫组Ⅰ每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环Cap蛋白5μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml，免疫组Ⅱ每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环Cap蛋白10μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml，免疫组Ⅲ每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环Cap蛋白20μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml，免疫组Ⅳ每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环Cap蛋白50μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml，免疫组V每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环Cap蛋白100μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml，免疫组VI每头仔猪颈部肌肉注射免疫含圆环野生Cap蛋白100μg/ml的圆环病毒2型Cap蛋白亚单位疫苗2ml；最后选取5头作为空白对照组，不免疫。首免后2周、3周、5周分别采血，分离血清，测定血清中PCV2ELISA抗体和中和抗体。

3.2仔猪抗体检测方法

3.2.1ELISA抗体检测方法

用pH9.6碳酸盐缓冲液包被圆环重组Cap蛋白，浓度为1μg/ml，100μl/孔，4℃包被过夜，洗涤后加入300μl的0.5％酪蛋白封闭液封闭板子，37℃，2h；用样品稀释液倍比稀释待检血清后加入包被板，同时设置阴阳性血清对照组，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤；加入兔抗猪二抗(1:10000稀释)，100μl/孔，37℃作用1h，洗涤；加入底物显色液TMB显色，100μl/孔，37℃作用15min，用2M H₂SO₄终止反应。结果判定：阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效；阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效；临界值的计算：临界值＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。

3.2.2中和抗体检测方法

待检血清56℃水浴灭活30min后过滤除菌，用维持液进行2倍比稀释至1:1024倍，同时将增殖的PCV2用维持液稀释至1×10⁶TCID50/ml，然后与不同梯度稀释的血清等体积混合，37℃水浴1h。弃掉长满PK15细胞的96孔细胞板中的营养液，用纯DMEM洗涤后将血清病毒混合物加入孔中，每个血清稀释度设置3个重复，100μl/孔，37℃培养72h。同时设置阴阳性血清对照和空白对照，最后用IFA法测定血清中和抗体效价，以抑制50％PCV2感染的血清最大稀释度作为待检血清的中和抗体效价。

3.3仔猪抗体检测结果

3.3.1ELISA抗体检测结果

仔猪ELISA抗体检测结果见表3，结果表明，仔猪免疫后14天即可产生抗体，同时随着Cap蛋白浓度的增加，ELISA抗体亦有所增加，且随着免疫周期的增加，抗体效价也在增加。

表3为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白疫苗免疫仔猪后抗体检测结果

3.3.2仔猪中和抗体检测结果

仔猪中和抗体检测结果见表4，结果表明，仔猪免疫后14天即可产生中和抗体，同时随着重组Cap蛋白浓度的增加，中和抗体亦有所增加，且随着免疫周期的增加，抗体效价也在增加。

表4为猪圆环病毒2型重组Cap蛋白疫苗免疫仔猪后中和抗体检测结果

序列表

<110> 中牧实业股份有限公司

<120> 一种猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达制备及应用

<130> WHOI190107

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aatggcatct tcaacacccg cctctcccgc accatcggtt atactgtcaa gaaaaccaca 60

gtcagaacgc cctcctggaa tgtggacatg atgagattta atattaatga ttttcttccc 120

ccaggagggg gctcaaaccc cctcactgtg ccctttgaat actacagaat aaggaaggtt 180

aaggttgaat tctggccctg ctccccaatc acccagaatg gtaggggagt gggctccact 240

gctgttattc tagatattaa ctttgtaaca aaggccaatg ccctaatcta tgacccctat 300

gtaaactact cctcccgcca taccataacc cagcccttct cctaccactc ccggtacttt 360

accccgaaac ctgtccttga taggacaatc gattacttcc aacccaataa caaaagaaat 420

caactctggc tgagactaca aactactgga aatgtagacc atgtaggcct cggcactgcg 480

ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac aatatccgta taaccatgta tgtacaattc 540

agagaattta atcttaaaga ccccccactt aaccctaag 579

<210> 2

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val

1 5 10 15

Lys Lys Thr Thr Val Arg Thr Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg

20 25 30

Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu

35 40 45

Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe

50 55 60

Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr Gln Asn Gly Arg Gly Val Gly Ser Thr

65 70 75 80

Ala Val Ile Leu Asp Ile Asn Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Ile

85 90 95

Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro

100 105 110

Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg

115 120 125

Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu

130 135 140

Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala

145 150 155 160

Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met

165 170 175

Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro

180 185 190

Lys

<210> 3

<211> 552

<212> DNA

<213> 猪圆环病毒（porcine circovirus）

<400> 3

accatcggtt atactgtcaa gaaaaccaca gtcagaacgc cctcctggaa tgtggacatg 60

atgagattta atattaatga ttttcttccc ccaggagggg gctcaaaccc cctcactgtg 120

ccctttgaat actacagaat aaggaaggtt aaggttgaat tctggccctg ctccccaatc 180

acccagggtg acaggggagt gggctccact gctgttattc tagatgataa ctttgtaaca 240

aaggccaatg ccctaaccta tgacccctat gtaaactact cctcccgcca taccataacc 300

cagcccttct cctaccactc ccggtacttt accccgaaac ctgtcctgga tcggactatg 360

gattacttcc aacccaataa caaaagaaat caactctggc tgagactaca aactactgga 420

aatgtagacc atgtaggcct cggcactgcg ttcgaaaaca gtatatacga ccaggactac 480

aatatccgta taaccatgta tgtacaattc agagaattta atcttaaaga ccccccactt 540

aaccctaagt ga 552

Claims

1.一种猪圆环病毒2型重组Cap蛋白，其序列为序列表中序列2。

2.权利要求1所述的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列如序列表中序列1所示。

4.表达权利要求1所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的重组载体，是将序列1所示的猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因***到出发载体中获得的。

5.根据权利要求4所述的重组载体，所述出发载体为pET-30a(+)。

6.表达猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的工程菌，其特征在于，所述工程菌是将权利要求4或5所述重组载体导入大肠杆菌BL21（DE3）感受态，筛选得到的表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的重组菌。

7.根据权利要求6所述的表达猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的工程菌，其特征在于，所述工程菌，名称为大肠埃希氏菌Escherichia coli E.coli-PCV2-FJ-Cap，于2019 年7 月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.18235。

8.一种猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的制备方法，包括下述步骤：

1）将权利要求4或5所述的重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态，得到表达猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子的重组菌；

2）将步骤1）获得的重组菌诱导表达，收集菌体并破碎，收集包涵体；

3）将步骤2）获得的包涵体溶解复性获得组装的猪圆环病毒2型Cap重组蛋白病毒粒子。

9.权利要求1所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白或权利要求2所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因在制备猪圆环病毒2型重组Cap蛋白病毒粒子中的应用。

10.权利要求1所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白或权利要求2所述猪圆环病毒2型重组Cap蛋白的编码基因在制备预防或治疗猪圆环病毒2型的疫苗中的应用。