CN110954631A

CN110954631A - 一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法

Info

Publication number: CN110954631A
Application number: CN201911373377.0A
Authority: CN
Inventors: 任超; 陈熠; 潘诚成
Original assignee: Hunan Jiudian Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiudian Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2019-12-28
Filing date: 2019-12-28
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本申请公开了一种测定枸橼酸根和乌头酸含量的方法，包括了供试品溶液的制备，对照品溶液的制备以及***适用性溶液的制备，利用了特定的色谱条件，不仅仅采用直接法测定得到了枸橼酸根的含量，还测出了里面杂质乌头酸的含量。本测定方法准确、精密、重现性好及重复性好，使用的仪器应用广泛，耗材成本低。

Description

一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及同时测定枸橼酸根和乌头酸含量的方法。

背景技术

枸橼酸氢钾钠（Potassium Sodium Hydrogen Citrate），又名柠檬酸氢钾钠，商品名叫友来特（Uralyt-U），是由德国马博士大药厂（Madaus GmbH）公司1977年研究开发的一类治疗尿道结石的药物，其为颗粒剂，属于有机无机复盐体系，在临床上用于溶解尿酸结石和防止新结石的形成，作为胱氨酸结石和胱氨酸尿的维持治疗且已经得到广泛应用，其结构是一定晶型存在的复盐形式，而不是简单的混合物。

枸橼酸氢钾钠既符合生理性离子配比，又能碱化尿液，减少尿中钙离子浓度，提高尿液中结晶抑制因子（枸橼酸盐）的浓度。枸橼酸氢钾钠作为复盐形式存在，有着独特的离子配比，即其中的钾离子K⁺：钠离子Na⁺：氢离子H⁺：枸橼酸根离子C₆O₇H₅ ^-3的摩尔比为6：6：3：5，整体呈现电中性。符合人体的生理离子配比，安全性高，不会引起电解质紊乱；同时也有着人性化的设计，可根据pH值调整用药量，服用更科学；生物利用度高、药效稳定，有效期长达5年。经过多个国家、几十年临床验证：安全、快速、无毒副作用、可长期服用。枸橼酸氢钾钠除用于溶解尿酸结石和防止新结石的形成，作为胱氨酸结石的胱氨酸尿的维持治疗外，还可以协同体外碎石，提高碎石效果，促进残石溶解和排净，用于各种代谢性疾病（痛风、肾小管性酸中毒等）的辅助治疗。随着尿石症患者和痛风、高尿酸血症等代谢性疾病患者逐年增加，其市场潜力巨大。

枸橼酸氢钾钠在制备的过程中因为暴露在高温条件下，枸橼酸极容易脱去一分子的水，产生杂质失水枸橼酸，也叫做乌头酸，两者化学结构式如下式所示：

枸橼酸，

乌头酸。

过往的专利报告或者文献中，都只是单单对枸橼酸根的含量进行测定，而没有讲乌头酸的含量计算在内，而在制备的过程中，不可避免的会产生较大量的乌头酸，从而使得忽视乌头酸含量的测定对后续的精确实验影响较大。

在进口注册标准JX20040251中，枸橼酸根含量测定方法为酶法-紫外分光光度法。其原理如下所示：

第一步：枸橼酸盐在枸橼酸裂解酶的作用下，生成草酰乙酸盐和乙酸盐。

第二步：草酰乙酸盐+NADH+H⁺在苹果酸脱氢酶的作用下，生成了苹果酸及NAD^-。

然后在通过紫外分光光度计测量340nm下,吸光度的变化来计算枸橼酸盐的量。因为NADH在340nm条件下有吸收峰。空白溶液中不含枸橼酸盐，NADH不发生反应。供试品溶液中，含有枸橼酸盐，通过两步酶参与的反应，消耗一定量的NADH，从而导致吸光度变化。通过测量NADH在340nm下吸光度的变化来计算NADH的量的变化，从而计算枸橼酸盐的量。此方法的优点是酶参与的化学反应，专属性强，适用于生物样品中枸橼酸盐的测定。但是其缺点为操作太复杂，准确性、重复性稍差；价格昂贵，且并非直接对枸橼酸含量进行测定，通过间接的变化完成测定，导致实验结果与真实值有一定的误差。

在国家药品标准YBH00762010中，枸橼酸根含量测定方法为非水溶液滴定法。其方法为取本品90mg，精密称定，加冰醋酸10ml，加热溶解后，放冷，加醋酐5ml与结晶紫指示液1滴，用高氯酸滴定液（0.1mol/L）滴定至溶液显蓝色，并将滴定液的结果用空白试验校正。此方法的优点是无需对照品，价格低廉，过程简单。但是其缺点为涉及到显色，准确度与重现性稍差。

以上两种方法均存在优缺点，综合成本、方法难易程度、准确性及重现性考虑，我们需要建立一种操作简便、准确度高、重复性及重现性好，并且成本不高的枸橼酸根含量检测方法。并且进口注册标准JX20040251和国家药品标准YBH00762010中，均无关于乌头酸含量检测的方法。

因此，在现有技术测定枸橼酸根存在较多问题的情况下，研发出一种可以精确测量枸橼酸根含量的方法，并同时可以测定出其中的杂质乌头酸的含量且符合操作简单，条件简单，环境污染小的方法非常有意义。

发明内容

本申请的主要目的是提供一种测定枸橼酸根含量的方法，在测定枸橼酸根含量的同时也将其中的杂质乌头酸一并进行测定。此测定方法是直接测定枸橼酸根的含量，避免了在先技术采用间接测定所导致的误差。

为了实现上述目的及解决枸橼酸根测定当中存在的问题，本申请采用了以下技术方案：

一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法，采用了高效液相色谱法，包括以下步骤：

（1）供试品溶液的制备：取枸橼酸氢钾钠细粉，精密称定，置于量瓶中，加稀释剂溶解并稀释，摇匀并滤过得到供试品溶液；

（2）对照品溶液的制备：取枸橼酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为枸橼酸对照品溶液；

取反乌头酸对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释，作为反乌头酸对照品溶液；

（3）测定：采用C18色谱柱，以磷酸调节pH值为2.2～3.2的18.2mmol/L磷酸二氢钠水溶液-异丙醇为流动相，精密量取空白溶液、***适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液，注入色谱仪，记录色谱图。

枸橼酸根计算公式如下：

响应因子（f）=Ar*192.12/Cr*189.1

枸橼酸根含量（%）=A*V/f_平均值*m*（1-干燥失重）*100%

其中：Cr—枸橼酸对照品溶液浓度（mg/ml）；

Ar—枸橼酸对照品溶液主峰面积；

A—供试品溶液中主峰面积；

m—供试品称样量（mg）；

V—供试品稀释体积（ml）

乌头酸计算公式如下：

响应因子(f) =Ar/Cr

乌头酸(%) =[(A1+A2)*v]/[f平均值*w*m*(1-干燥失重)]*100%

其中：Cr—反乌头酸对照品溶液浓度（mg/ml）；

Ar—反乌头酸对照品溶液峰面积；

A1、A2—供试品溶液中顺、反乌头酸峰面积；

w—供试品溶液中枸橼酸根含量；

m—供试品称样量（mg）

V—供试品溶液体积（ml）。

***适用性溶液由枸橼酸对照品、顺乌头酸对照品、反乌头酸对照品，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸根3.2mg、顺乌头酸4.8µg、反乌头酸4.8µg的混合溶液。用以确定当次分析使用的色谱***是有效的、适用的。

优选的，磷酸二氢钠与异丙醇的体积比为1000:1。

优选的，精密量取并注入色谱仪的空白溶液、***适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液为各20µl。

对于色谱条件的限定，我方技术方案的液相色谱的分析条件包括以下（ⅰ）至（ⅶ）中的一项或者多项：

（ⅰ）色谱柱的规格为4.6*250mm，5um；

（ⅱ）色谱柱的型号选自Agilent ZORBAX SB C18、CAPCELL PAK C18、Apollo C18、Ultimate AQ C18当中的一种；

（ⅲ）色谱柱温度为35±5℃；

（ⅳ）流速为0.9～1.1ml/min；

（ⅴ）进样量为5～30μl；

（ⅵ）检测波长为210～240nm。

我方的技术方案还包括了此测定方法在药物分析检测当中的应用。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

（1）在有效的测定出了枸橼酸根的情况下，一并将乌头酸的含量测定了出来，使用了同一色谱条件，完成了两项指标的测定。

（2）我方所用的测定方法准确、精密、重现性好及重复性好。

（3）我方所使用的仪器应用广泛，耗材成本低。

附图说明

图1是实施例3枸橼酸根含量测定线性试验结果图；

图2是实施例5的自制制剂乌头酸含量测定色谱图；

图3是实施例5的参比制剂乌头酸含量测定色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例1 乌头酸及有关物质专属性验证

色谱条件：

色谱柱：Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm）；

柱温：40℃；

检测波长：210nm；

流速：1.0ml/min；

流动相：18.2mmol/L 磷酸二氢钾水溶液-异丙醇（1000:1，用磷酸调节pH 至2.5）。

溶液配制

稀释剂：称取磷酸二氢钾2.475g，加1000ml 水溶解，量取1.0ml 异丙醇加入其中，摇匀，用磷酸调节pH 至1.9。

空白辅料溶液：精密称取空白辅料(含日落黄，桔子香精)11.77mg，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并定容,摇匀。精密量取上述溶液1ml，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀，过滤后待用。

顺乌头酸对照品溶液：精密称取顺乌头酸对照品（纯度：95.1%）12.31mg，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为顺乌头酸母液。量取该液0.5ml，置于50ml 量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度并摇匀。

反乌头酸对照品溶液：精密称取反乌头酸对照品12.55mg，置于25ml 量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，作为反乌头酸母液。量取该液0.5ml，置于50ml 量瓶中，加稀释剂稀释定容至刻度并摇匀。

***适用性溶液：精密称取枸橼酸对照品33.95mg，置于10ml 量瓶中，加顺乌头酸母液、反乌头酸母液各0.1ml，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀待用。

枸橼酸对照品溶液：精密称取枸橼酸对照品33.54mg，置于10ml 量瓶中，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀待用。

供试品溶液：精密称取中试样品，研细后的粉末228.70mg，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀后取续滤液待用。

供试品+顺、反乌头酸溶液：精密称取中试样品，研细后的粉末227.40mg，置于50ml量瓶中，分别加入顺乌头酸母液、反乌头酸母液各0.5ml，用稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀后取续滤液待用。

枸橼酸（原料）溶液：精密称取无水枸橼酸原料164.36mg，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并定容，摇匀待用。

枸橼酸钾（原料）溶液：精密称取枸橼酸钾原料278.70mg，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并定容，摇匀待用。

枸橼酸钠（原料）溶液：精密称取枸橼酸钠原料250.19mg，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解并定容，摇匀待用。

精密量取上述溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，按照前述色谱条件进行检测，记录色谱图。

表1专属性验证结果表

检测结果如表1所示，主峰理论板数不低于3000，与相邻峰的分离度不低于2.0；供试品溶液中主峰最小峰纯度相似度为1.000000，高于最小峰纯度阈值（0.999998）；空白辅料对有关物质的检测无影响；顺、反乌头酸、枸橼酸最大吸收波长均与210nm 相近，在210nm 处均有较大吸收。专属性良好。

实施例2 乌头酸及有关物质进样精密度试验

精密称取枸橼酸对照品（105℃干燥2h）1.65mg，置于100ml 量瓶中，加稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀。即得浓度为16.5μg/ml的枸橼酸对照品。

精密称取枸橼酸对照品（105℃干燥2h）2.40mg，置于500ml 量瓶中，加稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀。即得浓度为4.8μg/ml的枸橼酸对照品。

精密称取顺乌头酸对照品2.40mg，置于500ml 量瓶中，加稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀。即得浓度为4.8μg/ml的枸橼酸对照品。

精密称取反乌头酸对照品2.30mg，置于500ml 量瓶中，加稀释剂溶解并稀释定容至刻度，摇匀。即得浓度为4.6μg/ml的枸橼酸对照品。

精密量取上述溶液各20μl，注入高效液相色谱仪中，按照实施例1中所述色谱条件进行检测，记录色谱图。结果如表2所示。

表2 进样精密度结果表

由表可知，由以上数据可知，枸橼酸对照品溶液（枸橼酸根浓度为16.5μg/ml、4.8μg/ml ）、顺乌头酸对照品溶液（ 4.8μg/ml ）、反乌头酸对照品溶液（4.6μg/ml）连续6 次进样峰面积RSD 分别为1.3%、0.4%、1.2%、0.1%，均不高于10%，进样精密度良好。

实施例3 枸橼酸根含量测定线性试验

精密称取枸橼酸对照品（105℃干燥2h）201.09mg，置于20ml 量瓶中，用稀释剂溶解并定容，摇匀，作为枸橼酸对照品母液。取该溶液适量，按照以下方法配制成系列线性溶液：

精密量取线性溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照实施例1所述色谱条件进行检测，记录色谱图。并以枸橼酸根浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。线性实验结果如图1所示，由图可知，在0.98964mg/ml~4.94822mg/ml（22%~110%）范围内，枸橼酸根峰面积与检测浓度成线性关系，且相关系数r＞0.998，纵坐标截距＜目标浓度对应峰面积×2.0%，线性关系良好。

实施例4 枸橼酸根含量测定准确度试验

枸橼酸对照品溶液：精密称取枸橼酸对照品（105℃干燥2h）32.28mg、33.16mg，分别置于10ml 量瓶中，加稀释剂溶解，定容并摇匀。

供试品母液：精密称取枸橼酸氢钾钠颗粒剂研细后的粉末449.99mg，置于100ml量瓶中，用稀释剂溶解并定容，摇匀。

加标供试品溶液：精密称取已干燥（105℃干燥2h）的枸橼酸对照品适量及供试品母液适量，置于10ml 量瓶中，按照表3 配制成加标供试品溶液：

表3加标供试品溶液的配制

精密量取上述对照品溶液、加标供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照实施例1所述色谱条件进行检测，记录色谱图。并计算其回收率及回收率的RSD 值，回收率试验表如表4所示：

表4 回收率试验表

结果分析：由以上数据可知，加标浓度为80%~120%时，回收率在99.19%~101.67%范围内，回收率平均值为100.6%，RSD（n=9）为0.8%，准确度良好。

实施例5

参比试剂选自马博士大药厂生产的枸橼酸氢钾钠颗粒，自制试剂选自湖南九典制药股份有限公司生产的枸橼酸氢钾钠颗粒。

色谱条件

色谱柱：Ultimate AQ-C18（4.6×250mm，5μm）；

柱温：40℃；

检测波长：210nm；

流速：1.0ml/min；

按照上述的色谱条件对参比制剂及我方自制的枸橼酸氢钾钠颗粒样品进行检测：

溶液配制：

供试品溶液的制备：取参比制剂的枸橼酸氢钾钠细粉225mg，精密称定，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，取续滤液待用。

取自制制剂的枸橼酸氢钾钠细粉225mg，精密称定，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解，并稀释定容至刻度，摇匀，取续滤液待用。

枸橼酸对照品溶液：精密量取枸橼酸根含量测定项下对照品溶液5ml 置于20ml量瓶中，用稀释剂定容，稀释至刻度，摇匀。精密量取上述溶液1ml 置于50ml 量瓶中，用稀释剂定容至刻度，摇匀即得。

反乌头酸对照品溶液：取反乌头酸对照品12mg，精密称定，置于50ml 量瓶中，用稀释剂溶解，稀释至刻度，摇匀。精密量取该溶液1ml 置于50ml 量瓶中，用稀释剂定容，摇匀即得。

***适用性溶液：取顺乌头酸对照品、反乌头酸对照品各12mg，精密称定，置于50ml 量瓶中，加稀释剂溶解，定容并摇匀，作为乌头酸母液。取枸橼酸对照品33mg，精密称定，置于10ml 量瓶中，取乌头酸母液0.2ml，用稀释剂溶解，并稀释定容至刻度，摇匀。

测定：精密量取空白溶液（稀释剂）、***适用性溶液、对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入色谱仪，照上述色谱条件分别进样检测，记录色谱图至主峰保留时间的3倍。

结果分析：

自制制剂的实验结果如表5和图2所示，

表5自制制剂的色谱参数

参比制剂的实验结果如表6和图3所示。

表6参比制剂的色谱参数

综上可知，自制制剂和参比制剂中均含有一定量的乌头酸。

套入枸橼酸根的计算公式，以及顺、反乌头酸的计算公式，计算可得，自制制剂的枸橼酸根的含量为71.4%，顺乌头酸的含量为0.003%，反乌头酸的含量为0.002%。

参比制剂的枸橼酸根的含量为71.1%，顺乌头酸的含量为0.014%，反乌头酸的含量为0.015%。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.一种测定枸橼酸根及乌头酸含量的方法，采用了高效液相色谱法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述***适用性溶液由枸橼酸对照品、顺乌头酸对照品、反乌头酸对照品，用稀释剂溶解并稀释制成每1ml中约含枸橼酸根3.2mg、顺乌头酸4.8µg、反乌头酸4.8µg的混合溶液。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钠与异丙醇的体积比为1000:1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述精密量取并注入色谱仪的空白溶液、***适用性溶液、反乌头酸对照品溶液和供试品溶液为各20µl。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中液相色谱的分析条件包括以下（ⅰ）至（ⅵ）中的一项或者多项：

（ⅰ）色谱柱的规格为4.6*250mm，5um；

（ⅱ）色谱柱的型号选自Agilent ZORBAX SB-C18、CAPCELL PAK C18、Apollo C18、Ultimate AQ C18当中的一种；

（ⅲ）色谱柱温度为35±5℃；

（ⅳ）流速为0.9～1.1ml/min；

（ⅴ）进样量为5～30μl；

（ⅵ）检测波长为210～240nm。

6.如权利要求1～5任一项所述的方法在药物分析检测当中的应用。