CN110951912A

CN110951912A - 一种基于dna条形码鉴定霍山石斛的方法

Info

Publication number: CN110951912A
Application number: CN201911421305.9A
Authority: CN
Inventors: 王晖; 时玲玲; 李暮淋; 张梦函; 陆颖; 周珏
Original assignee: Anhui Normal University
Current assignee: Anhui Normal University
Priority date: 2019-12-31
Filing date: 2019-12-31
Publication date: 2020-04-03

Abstract

本发明提供了一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，与现有技术相比，本发明利用ITS序列作为DNA条形码，ITS序列是核基因组中编码核糖体RNA(nr DNA)的基因序列，其包含较多的变异位点为多种物种鉴定提供依据。本发明还提供了能够用于霍山石斛和河南石斛品种鉴定的引物，具有扩增片段清晰、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够将霍山石斛及其近缘种河南石斛进行鉴定，实现了高效，低成本，操作方便的霍山石斛种质资源的鉴定，保证了霍山石斛产业中霍山石斛种源的质量。

Description

一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法

技术领域

本发明属于物种鉴定领域，具体涉及一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法。

背景技术

霍山石斛(Dendrobium huoshanense CZ.Tang et S.J.Chen)属兰科石斛属多年生草本植物，又名霍斛，米斛。霍山石斛是常用名贵中药材，主要分布于我国霍山大别山及邻近地区，具有极高的观赏和药用价值，自古以来被认为是药用石斛中的珍品，享有“中华仙草之最”的美誉。

现代药理研究表明：霍山石斛具有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等功效，在治疗白内障和降糖保肝方面有很好的作用，但由于其对生活环境的要求极为苛刻，且自身生长缓慢，加之遭到过度采挖，霍山石斛野生资源濒临灭绝。

在霍山石斛的道地产区，采用组培快繁技术快速获得试管苗或人工诱导种子萌发产生实生苗大规模野外栽培的组培霍山石斛，已逐渐替代野生资源成为药用霍山石斛的主要来源。目前，石斛类药材市场主要以深加工的枫斗或饮片形式进行流通。

然而枫斗类石斛的基源复杂种类繁多。河南石斛(Dendrobium henanenseJ.L.Liu et L.X.Gao)与霍山石斛地理分布基本一致，且河南石斛与霍山石斛在外形上极为相似，因此河南石斛成为当前市场上霍山石斛伪品的主要来源。

现有的鉴定方法以花瓣中唇瓣是否具有一紫色斑块作为区分霍山石斛和河南石斛的主要依据，但是对于不在花期的植株或以茎入药的霍山石斛药材，很难将其与河南石斛区分开来。到目前为止，尚没有一套完善的鉴定体系用于霍山石斛和河南石斛真伪的鉴定,因此亟需建立霍山石斛的真伪鉴别方法，保证霍山石斛产业中霍山石斛的种源质量。

DNA分子标记技术具有遗传稳定、不受环境影响和检测迅速准确的优点，可以快速准确地鉴定一些外形很难区分的植物种群。近年来DNA条形码技术在物种鉴定方面使用较为广泛，DNA条形码(DNA barcoding))是利用基因中一段相对较短、标准的、公认的DNA片段对物种快速鉴定的分子技术，DNA条形码使标本鉴定过程实现自动化和标准化，其鉴定成功率很高，基本可以实现对任何能够获得合格DNA样品的鉴定，例如有形态的原植物叶片、花、种子、标本和无形态的粉末等。

随着二代测序技术的发展，DNA条形码结合二代测序技术可以实现了对中成药成分的鉴定。国际生物条形码联盟提出叶绿体基因mat K+rbc L作为植物的通用DNA条形码。

但是，由于霍山石斛及其近缘种河南石斛，利用现有的技术无法将霍山石斛与河南石斛进行区分。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，所述DNA条形码为ITS序列，本发明方法尤其适用于鉴定霍山石斛及其近缘种河南石斛。

本发明具体技术方案如下：

本发明提供的一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，DNA条形码为ITS序列，用来鉴定霍山石斛。

进一步的，鉴定霍山石斛和河南石斛。

所述基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法包括以下步骤：

1)样品的DNA提取；

2)PCR扩增；

3)对PCR扩增产物进行测序；

4)构建***进化树，鉴定霍山石斛。

进一步的，步骤1)所述样品的DNA提取的方法为：将样品用硅胶干燥，干燥后使用CTAB法提取基因组DNA。

具体DNA提取的方法如下：

1-1)称取干燥的石斛叶片0.020g,放入标记好的EP管内，加入已经灭菌好的钢珠，使用核酸提取仪震荡研磨60s，取出钢珠；

1-2)加入1.4ml CTABfree液，37℃恒温摇床摇匀30min,10000rpm条件下离心15min，去除上清液；

1-3)再向EP管中加入经65℃预热的2％CTAB液700μl，混合均匀，65℃水浴1h,每10min手动摇匀一次；

1-4)水浴结束待溶液冷却至室温，进行离心，10000rpm离心15min，吸取上清液700μl,转移到另一个1.5ml离心管中，再加入70μl提前预热的10％CTAB液，摇匀；

1-5)向1-4)离心管中加入700μl体积比24:1的氯仿/异戊醇混匀，放入恒温摇床中37℃摇匀10min,12000rpm离心15min，取上清液至另一离心管；

1-6)重复1-5)操作两次；

1-7)向获得的上清液中加入200μl NaCl溶液以及-20℃预冷的异戊醇400μl，混匀，放置于-20℃冰箱内冷冻2h；取出离心管，12000rpm,15min离心，弃上清液；

1-8)步骤1-7)所得沉淀物用1000μl 75％无水乙醇清洗两次，再用1000μl无水乙醇清洗一次，自然风干；

1-9)再加入100μl的TE缓冲液，室温静置2h,将获得的DNA原液在1.0％琼脂糖凝胶电泳中检测是否具有明亮、清晰的条带，再用分光光度计检测DNA浓度，并稀释至20-30ng/μl,放置于-20℃冰箱内备用。

提取过程中，传统方法使用液氮将叶片迅速研磨成粉末，本发明使用FastprepFP120快速核酸提取仪处理叶片，此样品处理***与目前已有的其它样品制备方法相比，此方法可同时处理24个样品，而且，采用快速8字形振荡方式，配合钢珠，可以高效充分地破碎样品，具有通用性广、高效灵活的优点。另外，本发明先加入CTABfree液，提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏，同时抑制DNA酶的活性。还有，本发明加入预热的10％CTAB溶液，能够使DNA在高盐溶液中与CTAB结合形成复合物并且溶解于高盐溶液中，为下一步DNA的完全洗脱做准备。

步骤2)PCR扩增具体为：利用引物进行PCR扩增，PCR扩增采用30μL反应体系：15μl2×TSINGKE Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司),1.5μl的上下游引物(10μmol/L)，2μlDNA模板，ddH₂O补足至30μl；

进一步的，采用的引物为：ITS序列上游引物F：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’；

ITS序列下游引物R：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’；

目标条带长度：605-715bp，退火温度56℃。

进一步的，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，56℃退火35s，72℃延伸30s，35个循环；72℃8min；4℃保存。

步骤3)对PCR扩增测序；

将PCR扩增产物送至通用生物***(安徽)有限公司进行测序，ITS序列进行正向测序，ITS序列目的条带长度在605-715bp区间。

步骤4)构建***进化树，鉴定霍山石斛具体为：

测序后使用软件Contig Express进行校对拼接，使用MEGA7软件进行序列比对并构建***发育树，用于鉴定霍山石斛。

与现有技术相比，本发明利用ITS序列作为DNA条形码，ITS序列是核基因组中编码核糖体RNA(nr DNA)的基因序列，其包含较多的变异位点为多种物种鉴定提供依据。本发明还提供了能够用于霍山石斛和河南石斛品种鉴定的引物，具有扩增片段清晰、分辨力高、灵敏度好、结果可靠准确、高效快速等优点，能够将霍山石斛及其近缘种河南石斛进行鉴定，实现了高效，低成本，操作方便的霍山石斛种质资源的鉴定，保证了霍山石斛产业中霍山石斛种源的质量。

附图说明

图1为19个霍山石斛基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳；

图2为10个河南石斛和1个霍山石斛基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳；

图3为ITS2序列PCR扩增产物凝胶电泳图；

图4为MatK序列PCR扩增产物凝胶电泳图；

图5为rbcL序列PCR扩增产物凝胶电泳图；

图6为ITS序列PCR扩增产物凝胶电泳图；

图7为本发明方法ITS序列构建***进化NJ树；

图8为ITS2序列构建***进化NJ树；

图9为MatK序列构建***进化NJ树；

图10为rbcL序列构建***进化NJ树。

具体实施方式

本发明所需材料分别为霍山石斛和河南石斛，主要采自安徽大别山一带，由于霍山石斛野生种质资源匮乏，使用的霍山石斛样品有5株野生霍山石斛资源，其余均为霍山石斛栽培资源。

本发明所用核酸提取仪型号FastprepFP120。

本发明DNA提取所用试剂制备方法：

Tris-HCL溶液(pH8.0):Tris(12.11g),浓盐酸(4.2ml),添加，添加蒸馏水定容至100ml。

NaCl溶液:NaCl(23.376),用蒸馏水定容至100ml。

EDTA(pH8.0):EDTA(18.61g)NaOH(约2g),蒸馏水定容至100ml。

CTAB free溶液：β-巯基乙醇(2ml),100μmol/L Tris-HCL溶液(10ml),20mmol/LEDTA(10ml),NaCl(1.46g),PVP(2g),蒸馏水定容至100ml。

2％CTAB溶液：CTAB(2g),Tris-HCL溶液(10ml),EDTA(4ml),NaCL(8.19g),PVP(2g),β-巯基乙醇(2ml),蒸馏水定容至100ml。

10％CTAB溶液：CTAB(10g),NaCl(4.10g)，蒸馏水定容至100ml。

TE缓冲液：Tris-HCL溶液(1ml)，EDTA(0.2ml)，蒸馏水定容至100ml。

以上溶液混匀灭菌后使用，其中CTAB free溶液和2％CTAB溶液，制备过程中都是其他原料混匀灭菌后再加入巯基乙醇。

氯仿/异戊醇：氯仿、异戊醇按照体积比24：1的比例混合，存储于棕色瓶中。

实施例1

一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法：

本发明鉴定的样品为霍山石斛和河南石斛，霍山石斛野生资源为5个，栽培资源为15个，河南石斛样品为10个，具体信息见表1。

鉴定方法如下：

1)样品的DNA提取：

1-1)称取干燥的石斛叶片0.020g,放入标记好的EP管内，加入已经灭菌好的钢珠，使用核酸提取仪震荡研磨60s,取出钢珠；

1-2)加入1.4ml CTAB free液，恒温37℃摇床摇匀30min,10000rpm条件下离心15min，去除上清液；

1-4)水浴结束待溶液冷却至室温，进行常温离心，条件10000rpm分离15min,吸取上清液700μl,转移到另一个1.5ml离心管中，再加入70μl提前预热的10％CTAB液，摇匀；

1-6)重复步骤1-5)操作两次；

1-7)获得的上清液加入200μl NaCl溶液以及-20℃预冷的异戊醇400μl，混匀，放置于-20℃冰箱内冷冻2h；取出离心管，12000rpm,15min离心，弃上清液；

1-9)再加入100μl的TE缓冲液，室温静置2h,将获得的DNA原液在1.0％琼脂糖凝胶电泳中检测是否具有明亮、清晰的条带，结果表明，提取的基因组DNA条带清晰，明亮，没有弥散，可用于后续的PCR实验。再用分光光度计检测DNA浓度，并稀释至20-30ng/μl,放置于-20℃冰箱内备用。霍山石斛基因组电泳检测结果见图1，图1中1-3编号分别为HS-WJD1、HS-WJD2、HS-WJD4，4-6编号分别为HS-KS5，HS-KS6，HS-KS7，编号7为HS-HSZ3，编号8-9为HS-FK5，HS-FK7，编号10-12分别为HS-PYT1，HS-PYT2，HS-PYT3，编号13、14分别为HS-TPF3，HS-TPF4，编号15、16分别为HS-JZ-1-7，HS-JZ-1-8，编号17、18分别为HS-JXZ-1-3，HS-JXZ-1-5，编号19为HS-SKJ3。图2中的编号11为霍山石斛HS-YK1，图2中编号1-10为河南石斛基因组HN1-HN10，其中M为MarKerⅢ(天根生化科技(北京)有限公司)。

表1 本发明鉴定的样品信息

2)核基因ITS序列引物对上述样品进行种质资源扩增。具体操作步骤如下：使用ITS序列上游引物F：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’；ITS序列下游引物R：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’。对霍山石斛和河南石斛进行PCR扩增，PCR扩增采用30μL反应体系：15μl 2×TSINGKE Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司),1.5μl的上下游引物(10μmol/L)，2μlDNA模板，ddH₂O补足至30μl,PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性45s，56℃退火35s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸8min；4℃保存。

将PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像***下观察扩增结果，ITS序列扩增的目的片段长度约为700bp,无非特异性条带，目的条带清晰明亮。ITS PCR扩增琼脂糖凝胶电泳检测结果如图6，其中，编号1-8为霍山石斛样本，其中1-3编号为HS-WJD1、HS-WJD2、HS-WJD4，编号4，5分别为HS-TPF3，HS-TPF4，编号6,7，8分别为HS-KS5，HS-KS6，HS-KS7。编号9-12为河南石斛样本，编号9-12分别为HN1，HN2，HN3，HN4，M为MarkerⅡ(天根生化科技(北京)有限公司)。

3)将PCR扩增产物送至通用生物***(安徽)有限公司进行测序，ITS序列进行正向测序，ITS序列目的条带长度在605-715bp区间。

4)测序后使用软件ContigExpress进行校对拼接，使用Assemble”栏下的“Assemble Selected Fragments”命令，得到一个Assemble1下的contig1的结果，若两条序列的测序结果有误差，在拼接图片框中的绿色竖杠就表示了这些不同的地方，最终通过峰形判断具体碱基，同时，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上下载ITS的霍山石斛、河南石斛相应序列。使用MEGA7软件进行序列比对并构建***发育树，采用neighbor-joining算法构建***进化树，No.of Bootstrap Replications为1000，Model采用Kimura2-parameter model,所构建的***发树如图7，使用ITS序列所构建的***树可见河南石斛与霍山石斛明显分为两大支，所以，使用DNA条形码ITS序列可将河南石斛与霍山石斛高效地进行区分。

对比例1

DNA条形码分别为ITS2，MatK、rbcL序列进行鉴定,鉴定样品和方法同实施例1，具体如下：

1)样品DNA的提取同实施例1；

2)PCR扩增，方法同实施例1，具体区别在于引物序列和退火温度，如下表2所示。

表2 DNA条形码通用引物序列及相关信息

将对比例1获得的PCR产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像***下观察扩增结果，如图3-图5所示。其中图3为ITS2 PCR扩增电泳检测结果，编号1-8为霍山石斛样本，其中1-3编号为HS-WJD1、HS-WJD2、HS-WJD4，编号4，5分别为HS-TPF3，HS-TPF4，编号6,7，8分别为HS-KS5，HS-KS6，HS-KS7；编号9-12为河南石斛样本，编号9-12为河南石斛样本，分别为HN1，HN2，HN3，HN4。图4为MatK PCR扩增电泳检测结果，编号1-14为霍山石斛样本，其中1-3编号为HS-WJD1，HS-WJD2，HS-WJD4，编号4，5分别为HS-TPF3，HS-TPF4，编号6,7，8分别为HS-KS5，HS-KS6，HS-KS7，编号9为HS-HSZ3，编号10，11分别为HS-FK5，HS-FK7，编号12,13,14分别为HS-PYT1，HS-PYT2，HS-PYT3。编号15-24为河南石斛样本，分别为HN1，HN2，HN3，HN4，HN5，HN6，HN7，HN8，HN9，HN10。图5为rbcL PCR扩增电泳检测结果，编号1-8为霍山石斛样本，其中1-3编号为HS-WJD1，HS-WJD2，HS-WJD4，编号4，5分别为HS-TPF3，HS-TPF4，编号6,7，8分别为HS-KS5，HS-KS6，HS-KS7，编号9-10为河南石斛样本，分别为HN1，HN2。其中图3，图4的M为MarkerⅡ(天根生化科技(北京)有限公司)，图5的M为DL2000 DNA Marker(天根生化科技(北京)有限公司)。

ITS2序列扩增的目的片段长度在400-500bp之间，叶绿体基因MatK、rbcL扩增的目的片段长度分别在700-900bp之间，1000-1200bp之间，均无非特异性条带，目的条带清晰明亮。

3)将PCR扩增产物送至通用生物***(安徽)有限公司进行测序，ITS2、MatK序列进行正向测序，rbcL扩增产物进行双向测序，ITS2序列目的条带长度在446-462bp之间，MatK序列目的条带长度在771-834bp区间，rbcL序列目的条带长度在1241-1291bp区间。

4)测序后的DNA条形码序列使用软件ContigExpress进行校对拼接，获得的序列：其中，编号HS-TPF4的霍山石斛的ITS序列如SEQUENCE LISTING NO.1所示。编号HN5的河南石斛ITS序列如SEQUENCE LISTING NO.2所示。同时，从NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上下载ITS2、MatK、rbcL的霍山石斛，河南石斛相应序列。使用MEGA7软件进行序列比对并构建***发育树。采用neighbor-joining算法构建***进化树，No.of Bootstrap Replications为1000，Model采用Kimura 2-parameter model,所构建的***发树如图8-图10所示。

由于ITS2、MatK、rbcL扩增产物测序时存在双峰，因此构建NJ树时去除了测序存在双峰的样本，ITS2序列测序时，HS-WJD4，HS-TPF3,HS-TPF4，HS-PYT1，HS-PYT2，HN4，HN6存在测序双峰，MatK序列测序时，HS-KS7存在测序双峰，rbcL序列测序时，HS-WJD4,HS-FK5,HS-JZ-1-7,HS-JXZ-1-3,HS-YK1,HS-PYT1,HN5,HN7存在测序双峰。

对比可以发现，使用ITS序列所构建的***树可见河南石斛与霍山石斛明显分为两大支，而使用ITS2、MatK、rbcL序列所构建的***进化树呈现出霍山石斛与河南石斛相互重叠的现象，种间差异较小，无法很好的将霍山石斛与河南石斛进行区分，所以，本发明使用DNA条形码ITS序列可将河南石斛与霍山石斛高效地进行区分。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽师范大学

<120> 一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法

<130> 1

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 694

<212> DNA

<213> 霍山石斛 ITS序列

<400> 1

tattgtcgag accgaacaca acgagcgatt ttgtgaacct gtaaaaataa gcggtggctc 60

ttgctgctgc gataaaatcc acccgagtca tcgcctcatc ccctctttgg ggtggggacg 120

tgatgaagga tggatgaacc ctcaaatcgg cgcagcgttg cgccaaggga atcttgaagc 180

acaagcccat aaatgggttt cgtgggatgg ggtgctgtcg cacgccatat tgattgacac 240

gactctcggc aatggatatc tcggctctcg catcgatgaa gagcgcagcg aaatgcgata 300

tgtggtgcga attgcagaat cccgcgaacc atcgagtctt tgaacgcaag ttgcgcctga 360

ggccaaccgg ctgagggcac gtccgcctgg gcgtcaagca ttttatcact ccgtgcctac 420

tctcccatcc atggatgtgt tgctaaggct cggatgtgca cggtggctcg tcgtgcccct 480

tggtgcggcg ggctgaaggg cgggtcatct tctcgttggc tgccaacaat aaggggtgga 540

ttaaataagg cctatgctat tgtgtcaagc gcgcccgaga gatggtcata ctttttaggt 600

gatcccaatt catgcgttga tccatggatg gcgtatcgaa tgtgacccca ggatgggcga 660

ggccacccgc tgagtttaag aataaatcat aaaa 694

<210> 2

<211> 737

<212> DNA

<213> 河南石斛 ITS序列

<400> 2

ggtaagggat ccgtaggtga cctgcggaag gatcattgtc gagaccgaaa cacaacgagc 60

gattttgtga acctgtaaaa ataagcggtg gctcttgctg ctgcgataaa atccacccga 120

gtcatcgcct catcccctct ttggggtggg gacgtgatga aggatggatg aaccctcaaa 180

tcggcgcagc gtagcgccaa gggaatcttg aaacacaagc ctataaatgg gttttgtggg 240

atggggtgtt gtcgcacgcc atattgattg acacgactct cggcaatgga tatctcggct 300

ctcgcatcga tgaagagcgc agcgaaatgc gatatgtggt gcgaattgca gaatcccgcg 360

aaccatcgag tctttgaacg caagttgcgc ctgaggccaa ctggctgagg gcacgtccgc 420

ctgggcgtca agcattttat cactctgtgc ctagtctccc atccatggat gtgttgccaa 480

ggctcggatg tgcacggtgg ctcgtcgtgc cccttggtgc ggcgggctga agggcgggtc 540

atcttctcgt tggctgccaa caataagggg tggattaaat aaggcctatg ctattgtgtc 600

aagcgcgcct gagagatggt catacttttc tatgtgatcc caattcatgc gttgatccat 660

ggatggcgta tcgaatgtga ccccaggatg ggcgaggcca cccgccgagt ttaagcatat 720

caaaaggggg gagagaa 737

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> ITS上游引物

<400> 3

5'-cgtaacaagg tttccgtagg tgaac-3' 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> ITS下游引物

<400> 4

5'-ttattgatat gcttaaactc agcggg-3' 26

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> ITS2上游引物

<400> 5

5'-gcgatacttg gtgtgaat-3' 18

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> ITS2下游引物

<400> 6

5'-gacgcttctc cagactacaa t-3' 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> MatK上游引物

<400> 7

5'-cctatatccg ctactccttc-3' 20

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> MatK下游引物

<400> 8

5'-ctcagtgaat ttcaccacg-3' 19

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> rbcL上游引物

<400> 9

5'-gagagactaa agcaagtgtt gga-3' 23

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> rbcL下游引物

<400> 10

5'-atgatctcca ccagacatac ga-3' 22

Claims

1.一种基于DNA条形码鉴定霍山石斛的方法，其特征在于，所述DNA条形码为ITS序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，霍山石斛的ITS序列如SEQUENCE LISTINGNO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)样品的DNA提取；

2)PCR扩增；

3)对PCR扩增产物进行测序；

4)构建***进化树，鉴定霍山石斛。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述样品的DNA提取的方法为：将样品用硅胶干燥，干燥后使用CTAB法提取基因组DNA。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)PCR扩增具体为：利用引物进行PCR扩增，PCR扩增采用30μL反应体系：15μl 2×TSINGKE Master Mix(北京擎科新业生物技术有限公司),1.5μl的上下游引物(10μmol/L)，2μlDNA模板，ddH₂O补足至30μl。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，采用的引物为：ITS序列上游引物F：5’-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’；

ITS序列下游引物R：5’-TTATTGATATGCTTAAACTCAGCGGG-3’。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性45s，56℃退火35s，72℃延伸30s，35个循环；72℃8min。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述样品包括霍山石斛和河南石斛。