CN114182034B - 薄壳山核桃品种McMillian的SSR分子标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及薄壳山核桃品种鉴定技术领域，具体涉及薄壳山核桃品种McMillian的SSR分子标记及其应用。本发明提供的用于鉴定薄壳山核桃品种McMillan的SSR分子标记由SEQ ID NO.1‑2所示的引物扩增得到。该SSR分子标记能够实现薄壳山核桃品种McMillan的鉴定，利用该SSR分子标记进行McMillan的鉴定，能够有效降低鉴定成本、提高效率、而且操作简便、鉴定结果准确，该SSR分子标记和鉴定方法具有广阔的应用前景。

Description

薄壳山核桃品种McMillian的SSR分子标记及其应用

技术领域

本发明涉及薄壳山核桃品种鉴定技术领域，具体涉及薄壳山核桃品种McMillian的SSR分子标记及其应用。

背景技术

薄壳山核桃(Carya illinoinensis)，属于胡桃科(Juglandaceae)山核桃属(Carya)的植物，是重要的干果和木本油料树种。薄壳山核桃在中国又称碧根果，其坚果含油率高，其中不饱和脂肪酸占总脂肪含量的90％以上，同时含有丰富的酚类物质、矿物质元素、氨基酸、维生素等，营养丰富、经济价值高。近年来，薄壳山核桃种植得到不断推广，同时，对良种苗木的需求迅速增加，而如何确保苗木品种的真实性成为亟待解决的问题。

薄壳山核桃品种‘McMillan’，单果重8克左右，雄蕊先熟型品种，实生选育，抗黑斑病。薄壳山核桃雌雄同株异花，雌雄花期不遇，需对不同品种进行配置才能充分授粉，实现优质丰产。不同品种之间也存在区域适应性和栽培管理的差异。但是，在苗期，不同薄壳山核桃品种之间的表型差异不明显，难以实现有效区分。如果种植的品种与目标不符，往往需要4～6年开花结实之后才能发现，为育种单位和种植户造成较大的人力、时间和经济上的损失。因此，在薄壳山核桃建园初期，确定品种的真实性就显得尤为重要。在生产实践中，通常依靠有经验的专家通过叶片、果实、花、树姿等表型特征实现品种的辨别，但是同一品种在不同气候区域条件、不同生长发育阶段、不同栽培条件下表型性状具有较大差异，造成依赖经验的品种鉴别方法成功率不高。

分子标记能够直接检测DNA水平的差异，不依赖于表型性状，稳定性强、可重复性好，已广泛应用于动植物的品种鉴定和亲缘关系研究。在薄壳山核桃中已有基于分子标记手段的亲缘关系研究，但存在品种覆盖度低、难以区分有血缘关系的品种、操作复杂等问题。因此亟需建立一种准确率高、操作简便、鉴别结果稳定的薄壳山核桃品种的鉴定方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种薄壳山核桃品种‘McMillan’的SSR分子标记及其应用。

为实现上述目的，本发明使用生物信息学的方法，从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个SSR位点，批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选，主要筛选标准如下：1)SSR位点的类型为2～4个碱基重复；2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；3)引物中不包含未知碱基；4)目标产物在100bp～300bp。初步筛选并合成300对引物。采集在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种的嫩叶，提取基因组DNA，对PCR反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种进行扩增并检测，筛选得到一个扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种‘McMillan’中有特异性条带的SSR引物，从而实现使用1个SSR标记准确鉴别‘McMillan’。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’的SSR(SimpleSequence Repeat，SSR)分子标记，所述SSR分子标记由SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到。

以上所述的引物序列具体如下：

SEQ ID NO.1(5’-3’)：CTTAAGTGGAACGGCATCGT；

SEQ ID NO.2(5’-3’)：ATGTCTGTTAAACCGCGACC。

第二方面，本发明提供用于鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示。

第三方面，本发明提供包含如SEQ ID NO.1-2所示的引物的试剂盒。

优选地，所述试剂盒还包括用于PCR扩增的其他成分，包括但不限于PCR反应缓冲液、dNTP、DNA聚合酶、阴性对照、阳性对照等。

第四方面，本发明提供的包含如SEQ ID NO.1-2所示的引物的DNA芯片。

第五方面，本发明提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’中的应用。

本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在构建薄壳山核桃品种‘McMillan’的DNA指纹数据库中的应用。

本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘McMillan’的分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘McMillan’的种质资源鉴定中的应用。

本发明还提供所述SSR分子标记或所述引物或所述试剂盒或所述DNA芯片在薄壳山核桃品种‘McMillan’的种苗质量检测中的应用。

第六方面，本发明提供一种鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’的方法，该方法包括以下步骤：以待鉴定薄壳山核桃的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增，若得到的扩增产物的长度为112bp，则判断待鉴定薄壳山核桃为‘McMillan’。

具体地，所述鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’的方法包括如下步骤：

(1)提取待鉴定薄壳山核桃的基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增；

(3)根据PCR扩增产物的条带类型，判断待鉴定薄壳山核桃是否为薄壳山核桃品种‘McMillan’。

本发明的有益效果在于：本发明提供的SSR分子标记能够实现薄壳山核桃品种‘McMillan’的鉴定，利用该SSR分子标记进行‘McMillan’的鉴定，能够有效降低鉴定成本、提高效率、而且操作简便、鉴定结果准确，该SSR分子标记和鉴定方法具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例2中利用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对36个薄壳山核桃品种的45个样品进行PCR扩增得到的扩增产物的电泳图，其中，M泳道为DNA Marker，从下到上的条带大小分别为：100、150、200、250、300、400、500bp；其他1～45泳道每一个泳道为一个样品，第1～45泳道的样品依次为：‘Kanza’、‘Mohawk’、‘Shawnee’、‘Mahan’、‘Mahan’(生物学重复)、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Mcmillan’、‘Lakota’、‘Silver back’、‘Carter’、‘Colby’、‘Stuart’、‘Greenriver’、‘Waco’、‘Major’、‘Oconee’、‘Oconee’(生物学重复)、‘Navaho’、‘Gloria Grande’、‘Forkert’、‘Choctaw’、‘Creek’、‘Mohawk’(生物学重复)、‘Elliott’、‘Barton’、‘Creek’(生物学重复)、‘Desirable’、‘Graking’、‘Greenriver’(生物学重复)、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Lakota’(生物学重复)、‘Maramec’、‘Mohawk’(生物学重复)、‘Nacono’、‘Navaho’(生物学重复)、‘Oconee’(生物学重复)、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。

图2为本发明实施例2中利用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)扩增得到的薄壳山核桃‘McMillan’、‘Pawnee’和‘Mahan’的PCR扩增产物的毛细管电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中使用的36个薄壳山核桃品种可通过市售购买途径获得，或者从中国林业科学研究院亚热带林业研究所种质资源库获得，其中，‘McMillan’、‘Mahan’、‘Pawnee’、‘Greenriver’、‘Mohawk’、‘Osage’、‘Lakota’、‘Carter’、‘Colby’、‘Stuart’等品种已在文献(Zhang C.C.,Yao X.H.,Ren H.D.,Chang J.,Wu J.,Shao W.Z.,FangQ.Characterization and Development of Genomic SSRs in Pecan(Caryaillinoinensis).Forests.2020,11(1),61.)中公开。

实施例1SSR分子标记的开发

从薄壳山核桃全基因组序列中发掘超过14万个SSR位点，批量设计特异性引物超过6万对。进一步对这些引物进行筛选，主要筛选标准如下：1)SSR位点的类型为2～4个碱基重复；2)上下游引物的退火温度相差不超过1℃；3)引物中不包含未知碱基；4)目标产物在100bp～300bp。初步筛选并合成300对引物。

选取在中国应用较多的36个薄壳山核桃品种，分别采集嫩叶，每个品种至少采用3个样品，分别提取各样品的基因组DNA，对PCR反应条件、扩增产物检测条件进行优化。使用优化后的程序对36个品种的各样品进行扩增并检测，筛选得到一个扩增效果好、稳定性强、在薄壳山核桃常用品种‘McMillan’中有特异性条带的SSR引物，可实现使用1个SSR标记准确鉴别‘McMillan’。该SSR引物的序列如下：

P1：SEQ ID NO.1(5’-3’)：CTTAAGTGGAACGGCATCGT；

P2：SEQ ID NO.2(5’-3’)：ATGTCTGTTAAACCGCGACC。

利用上述SSR引物进行PCR扩增，薄壳山核桃品种‘McMillan’在112bp处有单一的特异性条带。

实施例2利用SSR分子标记鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’

利用实施例1获得的SSR分子标记及其扩增引物进行薄壳山核桃品种的鉴定，具体方法如下：

1、基因组DNA的提取和检测

采集待鉴定薄壳山核桃的幼嫩叶片，使用TSINGKE植物DNA提取试剂盒(通用型)提取待鉴定薄壳山核桃的叶片DNA，，具体步骤如下：

(1)将Spin Column置于Collection Tube中，加入250μl Buffer BL，12000rpm/min离心1min活化硅胶膜；

(2)取样本组织(不大于100mg)，加入液氮充分研磨。研磨后置于1.5ml离心管中，加入400μl Buffer gP1，涡旋振荡1min，65℃水浴10～30min，期间可取出颠倒混匀以充***解；

(3)加入150μl Buffer gP2，涡旋振荡1min，冰浴5min；

(4)12000rpm/min离心5min，将上清转移至新的离心管中；

(5)加入上清等体积的无水乙醇，立即充分振荡混匀，液体全部转入Spin Column中，12,000rpm/min离心30s，弃废液；

(6)向Spin Column中加入500μl Buffer Pw(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；

(7)向Spin Column中加入500μl Wash Buffer(使用前已加入无水乙醇)，12000rpm/min离心30s，弃废液；

(8)重复操作步骤7；

(9)将Spin Column放回Collection Tube中，12,000rpm/min离心2min，开盖晾干1min；

(10)取出Spin Column，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中央处加50～100μl TE Buffer(65℃预热TE Buffer)，20～25℃放置2min，12,000rpm/min离心2min。

(11)使用1％琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA质量，使用紫外分光光度计检测基因组DNA浓度。

2、SSR分子标记的PCR扩增

以提取的不同样本基因组DNA为模板，使用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对不同样本进行PCR扩增，PCR反应体系如表1所示。

表1 PCR扩增的反应体系

PCR反应条件如表2所示。

表2 PCR扩增的反应条件

3、PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物，非变性聚丙烯酰胺凝胶配方如表3所示。

表3非变性聚丙烯酰胺凝胶配方

电泳方法如下：

电泳缓冲液为0.5×TBE，左右端空格避免边缘效应，电泳上样量1μl，两端各设置一个泳道上样50bp Marker。电泳条件为：180V，400mA，电泳180min。

电泳结束后取出胶，用枪尖进行打孔标记，AgNO₃溶液(1.0gAgNO₃溶于1L水中)银染10-15min；显色液(20gNaOH溶于1L水中，加入10ml甲醛)显色5-8min；水漂洗2次后置于灯箱上拍照。人工判定各个样本的条带大小。

当扩增产物仅在112bp处有单一条带时确定该样本为‘McMillan’。

利用上述鉴定方法对薄壳山核桃种质资源库采集的36个薄壳山核桃品种的样品进行鉴定，部分样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图1所示，图1中包含了36个品种的样品以及‘Mahan’、‘Oconee’、‘Greenriver’、‘Navaho’、‘Creek’、‘Mohawk’等部分品种的生物学重复，共计45个样品，其它各生物学重复之间均具有相同的检测结果，未全部列出。

4、PCR扩增产物的毛细管电泳检测

以提取的不同样本的基因组DNA为模板，使用引物P1和P2(SEQ ID NO.1-2)对不同样本进行PCR扩增，PCR反应体系如表4所示。

表4 PCR扩增的反应体系

PCR反应条件如表5所示。

表5 PCR扩增的反应条件

ABI 3730毛细管电泳检测方法如下：

根据琼脂糖凝胶电泳检测结果估计PCR产物浓度，并将产物稀释10倍后，与ROX500内标(大小分别为70,80,100,120,140,160,180,200,240,280,320,360,400,450,490,500base)混匀，反应体系见表6，于95℃反应5min后迅速冰浴3min，然后置于ABI3730测序仪样本架上进行毛细管电泳检测，各品种的检测结果见表7，其中，‘Mahan’、‘Pawnee’和‘Mcmillan’品种的PCR扩增产物的检测结果如图2所示。

表6毛细管电泳反应体系

表7 36个薄壳山核桃品种PCR扩增产物的条带大小

结果表明，36个品种的各生物学重复之间的带型一致，表明该SSR分子标记在同一品种不同个体间可重复性较好。‘McMillan’的扩增产物仅在112bp处有单一条带。

以上结果表明，本发明提供的SSR分子标记能够实现‘McMillan’与其他35个薄壳山核桃品种的准确区分，从36个薄壳山核桃品种中鉴别出常用品种‘McMillan’。本发明的SSR分子标记实现了使用单一SSR分子标记即可进行‘McMillan’的鉴定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所

<120> 薄壳山核桃品种McMillian的SSR分子标记及其应用

<130> KHP211121076.1

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cttaagtgga acggcatcgt 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgtctgtta aaccgcgacc 20

Claims (2)

1.SSR分子标记或引物或试剂盒在从36个薄壳山核桃品种中鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’中的应用；

所述SSR分子标记由SEQ ID NO.1-2所示的引物扩增得到；

所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示；

所述试剂盒包含所述引物；

所述36个薄壳山核桃品种为‘Carter’、‘Choctaw’、‘Colby’、‘Creek’、‘Desirable’、‘Elliott’、‘Forkert’、‘Gloria Grande’、‘Greenriver’、‘Kanza’、‘Lakota’、‘Mahan’、‘Major’、‘McMillan’、‘Mohawk’、‘Navaho’、‘Oconee’、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Shawnee’、‘Stuart’、‘Waco’、‘Silver back’、‘Barton’、‘Graking’、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Maramec’、‘Nacono’、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。

2.一种从36个薄壳山核桃品种中鉴定薄壳山核桃品种‘McMillan’的方法，其特征在于，包括：以待鉴定薄壳山核桃的DNA为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示的引物进行PCR扩增，若得到的扩增产物的长度为112bp，则判断待鉴定薄壳山核桃为‘McMillan’；

所述36个薄壳山核桃品种为‘Carter’、‘Choctaw’、‘Colby’、‘Creek’、‘Desirable’、‘Elliott’、‘Forkert’、‘Gloria Grande’、‘Greenriver’、‘Kanza’、‘Lakota’、‘Mahan’、‘Major’、‘McMillan’、‘Mohawk’、‘Navaho’、‘Oconee’、‘Osage’、‘Pawnee’、‘Shawnee’、‘Stuart’、‘Waco’、‘Silver back’、‘Barton’、‘Graking’、‘Hopi’、‘Jayhawk’、‘Kiowa’、‘Maramec’、‘Nacono’、‘Posey’、‘Houma’、‘Yates68’、‘Shepherd’、‘Deerstand’、‘Chetopa’。