CN110951673A - 一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达,实现体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞。本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白;为体外研究乳腺生物反应器、乳腺发育分化、乳腺癌以及成纤维细胞转分化为其他类型的功能性细胞的研究提供研究平台。
Description
技术领域
本发明属于细胞转分化技术领域,尤其是涉及一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法。
背景技术
乳腺上皮细胞是研究乳腺生长发育、泌乳机制以及验证乳腺组织特异性表达载体有效性的体外模型。目前原代乳腺上皮细胞培养大都采用胶原酶消化法和组织块培养法。利用胶原酶消化乳腺组织,再经过密度梯度离心可以得到较纯净的上皮细胞。组织块培养法操作过程简单,节约组织样品,而且避免了消化和离心对细胞造成的不良影响。但是细胞从组织块中长出所需的时间较长,成纤维细胞等***细胞最先长出,上皮细胞大量出现较为滞后。无论是采用胶原酶消化法还是组织块培养法,原代乳腺上皮细胞的培养均得到上皮细胞和成纤维细胞的混合物。
但是不管是用胶原酶消化法,还是组织块培养法,都存在乳腺上皮细胞体外增值能力有限以及泌乳功能缺失的问题。
近几年,利用小分子化合物组合在人,鼠等多个物种实现了神经细胞、心肌细胞、胰腺细胞和肝细胞等多种细胞的转化。但是目前还没有使用任何方法在任何物种上将终末分化的体细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞的报道。
发明内容
有鉴于此,本发明旨在提出一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白,用体细胞进行诱导,源源不断的持续获得低代数有功能的乳腺上皮细胞。
为达到上述目的,本发明的技术方案是这样实现的:
体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达。
优选的,使用小分子化合物或基因干扰抑制TGFbeta R1及其相关位点,所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上。
本发明还提供一种用于体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的诱导培养基,包括基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇以及小分子化合物;优选的,小分子化合物为VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上;且在最终培养基中,VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189的浓度分别为0~4mM、0~80μM、0~80μM、0~8μM、0~80μM、0~80μM、0~80μM、0~80μM,以上各物质浓度不同时为0。
优选的,小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox,且在最终培养基中,各自的浓度依次分别为0.0625~4mM、1.25~80μM、1.25~80μM、0.125~8μM、1.25~80μM;优选的,浓度依次为0.25~2mM、5~40μM、5~40μM、0.5~4μM、5~40μM;更优选的,以上组分中的Repsox用SB431542、SB525334、LDN193189中的一种替代。
优选的,基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇的体积比为78:20:1:1;更优选的,所述基础液为N2B27,包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、Glutamine(100×);且几者的体积比为99:1:97:2:1。
本发明同时提供如上所述的诱导培养基在体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞中的应用。
本发明也提供如上一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,包括如下步骤,
1)将体细胞接种于培养皿中,接种后加入高糖DMEM+10%FBS培养基,置于5%二氧化碳,湿度95%,37℃的培养箱中;
2)培养8~24h后,更换如权利要求3~5任一项所述的诱导培养基;再继续诱导培养8天,其中每间隔两天更换一次新的诱导培养基;获得转分化的乳腺上皮细胞。
优选的,还包括步骤3),将步骤2)转分化的乳腺上皮细胞用胰酶消化后传代至使用Matrix基质预处理的培养板上;更换乳腺上皮培养基继续培养,培养后进行传代或冻存;其中Matrix基质中Matrix与明胶体积百分比为1:50-100。
如上所述的方法或如上所述诱导培养基或如上所述的应用或如上所述的使用诱导培养进行转分化的方法中,所述体细胞来源于人、小鼠、大鼠、兔、猪、羊、山羊、牛或水牛;所述体细胞为耳部成纤维细胞或表皮细胞。
相对于现有技术,本发明所述的一种利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,具有以下优势:
(1)本发明填补了利用小分子化合物诱导成纤维细胞向乳腺上皮细胞转分化技术的一个空白。因为目前还没有使用任何方法在任何物种上将终末分化的体细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞的报道。
(2)本发明为体外研究乳腺发育分化以及乳腺癌的研究提供研究平台。
(3)本发明为体外研究成纤维细胞转分化为其他类型的功能性细胞提供研究平台。
(4)本发明为转基因乳腺生物反应器的生产提供新的方法。可以在体细胞中过表达一个药用蛋白的外源基因然后再进行诱导,诱导后的乳腺上皮细胞就可以表达这个药用蛋白,比获得转基因动物去生产药用蛋白需要的时间更快。
(5)本发明还可以避免了乳腺上皮细胞体外增殖能力有限以及泌乳功能缺失的问题。因为个体的成纤维细胞是普遍存在的,即使乳腺上皮细胞在体外培养时没有功能了或者是失去了增殖能力,可以用成纤维细胞进行诱导,源源不断的持续获得低代数有功能的乳腺上皮细胞。
附图说明
图1为小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的时间途径。
图2为小分子化合物诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的形态变化过程。
图3为转分化山羊乳腺上皮细胞(CiMECs,左)和乳汁分离培养的山羊乳腺上皮细胞(GMECs,右)具有相似的细胞形态特征。
图4为免疫荧光结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转分化获得的乳腺上皮细胞(CiMECs)表达乳腺上皮细胞特异性抗原E-cadherin、KRT8、KRT18、CD49f、EpCAM、SOX9。
图5为定量PCR的结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转分化获得的乳腺上皮细胞(CiMECs)显著表达乳腺上皮细胞标记基因。同时成纤维细胞标记基因的表达显著下调。
图6为WB结果显示BFRTV诱导成纤维细胞转化得到的乳腺上皮细胞(CiMECs)表达beta酪蛋白(CSN2)和乳铁蛋白(LTF)。
图7为整体调整BFRTV浓度诱导成纤维细胞获得的CiMECs的细胞形态图。
图8为不同浓度下单独使用Repsox(R诱导培养基)都可以将成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞的形态图。
图9为其他抑制剂(SB431542,SB525334,LDN193189)诱导成纤维细胞8天后的细胞形态图。不管小分子化合物组合(BFTV4/BFTV5/BFTVL)还是单独使用小分子化合物SB431542(4),SB525334(5),LDN193189(L)都可以将成纤维细胞诱导为乳腺上皮细胞。
图10为干扰TGFbeta R1的表达诱导成纤维细胞八天形成与BFRTV诱导类似的细胞形态图。
具体实施方式
除有定义外,以下实施例中所用的技术术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平,技术人员将理解下列仅用于示例,可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。以下实施例中所用的试验试剂,如无特殊说明,均为常规生化试剂;所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。其中所涉及的技术,除非特别说明,均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
下面结合实施例来详细说明本发明。
下述方法中,使用的培养基如下所示:
1、诱导培养基(BFRTV)成分:
基础液(N2B27):200mL体系:
诱导培养基(BFRTV):100mL体系
其中,BFTV诱导培养基为上述BFRTV培养基去掉小分子化合物R;
R诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+Repsox(R);
BFTV4诱导培养基为用10μM SB431542(4)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R;
BFTV5诱导培养基为用5μM SB525334(5)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R;
BFTVL诱导培养基为用1μM LDN193189(L)代替BFRTV培养基中的小分子化合物R;
SB431542(4)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+10μMSB431542(4);
SB525334(5)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+5μM SB525334(5);
LDN193189(L)诱导培养基为N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇+1μMLDN193189(L)。
以上各诱导培养基中,N2B27+KSR+非必须氨基酸+β-巯基乙醇的体积比例不变,仅仅调整小分子化合物的浓度。
2、乳腺上皮培养基成分(以100mL示例)
88.38mL DMEM/F12+10mL FBS+0.5mL氢化可的松(200X)+0.1mL肝素(1000X)+0.01mL EGF(10000X)+0.01mL IGF-1(10000X)+1mL青链霉素(100X)
实施例1
利用小分子化合物体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法以及进行检测的实验,具体操作如下:
1、采用组织贴壁法分离培养黑山羊的耳缘成纤维细胞(GEFs),为后续诱导使用提供细胞材料。
选择日龄30-60天的山羊,进行耳缘皮肤消毒,然后用手术刀剪取边缘组织块,放入含有双抗的PBS缓冲液中冲洗2-3遍,高糖DMEM+10%FBS(体积百分比)培养基中保存。在实验室中进行组织块处理,首先进行酒精消毒,PBS缓冲液中去除毛发和软骨,去除干净后PBS缓冲液清洗三次。将处理后的组织块置于1.5mL离心管中,用眼科剪剪切至合适大小,并均匀铺至60mm的细胞培养皿中,倒置放于培养箱。待组织块贴壁状态良好时,加入DMEM培养液进行贴壁培养,每2d更换一次培养基。待原代培养的单层细胞在培养皿中汇合度达80-90%即可进行传代,弃去旧培养液,0.25%胰蛋白酶(质量百分比)进行消化,然后高糖DMEM+10%FBS(体积百分比)培养基进行中和。收集细胞悬液,离心(1200r/min,3min)后弃上清,细胞重悬后均匀接种。
2、将成纤维细胞以5×105的密度接种至60mm的培养皿中,高糖DMEM+10%FBS(体积百分比)培养8-24h后,更换诱导培养基BFRTV,然后置于37℃,5%CO2培养箱继续培养8天,其中每间隔两天更换一次培养基。诱导过程中细胞的形态变化如图2所示,诱导8天后获得诱导转分化的乳腺上皮细胞(CiMECs)。
3、待培养至第8天时,可以将CiMECs进行传代,接种至用Matrix(Matrix与明胶的体积比为1:50)预处理的板上,然后使用乳腺上皮细胞培养基进行培养,待细胞汇合度到90%左右,方可传代或冻存,用于后续检测。诱导8天及传代后的CiMECs的细胞形态跟GMECs类似(图3)。
4、对诱导培养基BFRTV诱导4天(BFRTV-4d)、8天(BFRTV-8d)细胞以及转分化的乳腺上皮细胞(CiMECs)进行了乳腺上皮细胞的特异性抗原的检测。
具体步骤如下:质量百分比4%多聚甲醛(PFA)室温固定培养板中BFRTV-4d,BFRTV-8d,CiMECs的细胞30min;阻断液清洗三次,每次清洗5min;然后加1%TritonX-100(体积百分比)透化细胞,室温15min;阻断液再次清洗三次;随后加入5%驴血清封闭非特异性位点,室温条件下封闭2h;用TBP(Tritonx-BSA-PBS)清洗三次,每次5min;加入一抗,置于4℃孵育过夜;次日,将培养板置于室温条件下,复温20min,随后用TBP清洗3次,每次5min,避光加入二抗和Hoechst混合液,室温孵育1h;TBP溶液洗3次,即可进行荧光显微镜观察拍照实验。免疫荧光染色结果显示(图4),BFRTV-4d,BFRTV-8d,CiMECs和GMECs一样均表达乳腺上皮细胞的标记性抗原,E-cadherin、细胞角蛋白8(KRT8)、细胞角蛋白18(KRT18)、整合素-α6(CD49f)、EpCAM和SOX9,而山羊耳部成纤维细胞(GEFs)不表达。
5、定量PCR(qPCR)检测乳腺上皮细胞标志基因的表达。
具体操作步骤如下:(1)总RNA提取。弃培养基,PBS洗三次,加入1ml预冷的TRIZOL冰上裂解5min;加入200μL的氯仿,剧烈震荡15s,置于冰上5min;12000r/min,4℃离心15min;取上层水相转移到预冷的异丙醇中,颠倒混匀后冰上放置5min;12000r/min,4℃离心10min;弃上清,加入1mL预冷的75%乙醇(体积百分比),指尖轻弹管底使RNA悬浮,充分洗涤RNA和管壁,7500r/min,4℃离心8min;弃上清液,待沉淀呈半透明状时,加入适量DEPC水完全溶解RNA,取1μL进行纯度和完整性检测,其余进行反转录或者冻于-80℃冰箱。(2)cDNA模板制备。使用Vazyme R223-01合成试剂盒,按说明书进行。(3)荧光定量PCR。使用VazymeQ711-02/03试剂,按说明书进行。qPCR结果显示(图5),与BFRTV-0d相比,BFRTV-4d、BFRTV-8d、CiMECs和GMECs高表达乳腺上皮细胞相关标记基因CDH1、EPCAM、KRT19、ITGA6、INSR、PRLR、ELF5、LTF,而成纤维细胞标记基因COL6A2和FBN1的表达水平显著下调。
6、WB检测泌乳相关蛋白的表达。结果显示(如图6),BFRTV-4d、BFRTV-8d、CiMECs和GMECs明显表达乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白,包括乳铁蛋白(LTF)和beta酪蛋白(CSN2)。
具体操作步骤如下:细胞在含有蛋白酶抑制剂的变性裂解缓冲液中溶解30分钟,12,000rpm/min,4℃离心10min;用BCA蛋白检测试剂盒测定裂解液中的蛋白浓度;用12%蛋白胶(质量百分比)进行SDS-PAGE电泳分离蛋白,然后将蛋白转移到硝化纤维素滤膜,脱脂奶粉室温封闭1小时;孵育一抗,4℃过夜;次日,孵育二抗,室温1h;进行显影。
综上所述,通过上述形态学观察比较,标记基因和特异性抗原的检测以及泌乳能力的鉴定,可以证明利用五种小分子化合物(BFRTV)诱导转分化得到的细胞是具有泌乳功能的乳腺上皮细胞。
实施例2
以关中奶山羊的耳缘成纤维细胞为实验对象,对现使用的五种小分子化合物进行了浓度调整,在基础液不变的情况下,整体调整了BFRTV的浓度。结果表明(如图7),其余实验步骤以及实验参数与实施例1相同;诱导后细胞仍然可以出现类似BFRTV的细胞形态,也就是说0.5倍到4倍之内的BFRTV浓度都可以将其诱导为乳腺上皮细胞。
通过筛选发现单独使用TGFbeta R1的抑制剂Repsox(R诱导培养基)就可以获得类似BFRTV诱导培养基诱导获得的乳腺上皮细胞(CiMECs),然后又对R进行浓度筛选,结果显示(如图8)1-8倍浓度范围内均可以产生乳腺上皮细胞。同时还使用了TGFbeta R1以及其相关位点抑制剂SB431542(4),SB525334(5),LDN193189(L)代替BFRTV里面的小分子化合物R,分别组成了BFTV4,BFTV5,BFTVL诱导培养基,也可以将成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞。另外单独使用SB431542(4),SB525334(5),LDN193189(L)诱导培养基也仍然可以将成纤维细胞诱导转分化为乳腺上皮细胞(如图9)。说明抑制TGFbeta R1及其相关位点的小分子化合物是获得转分化乳腺上皮细胞(CiMECs)的关键。
实施例3
利用基因干扰技术来下调TGFbeta R1在成纤维细胞上的表达也可以诱导成纤维细胞转分化为乳腺上皮细胞。
首先我们构建慢病毒重组质粒pSicoR-Ef1a-mCh TGFBR1 shRNA,然后使用Lipofectamine 3000将其和VSVG,NRF一起共转染293T细胞进行慢病毒包装,最后使用包装好的慢病毒感染成纤维细胞。再将慢病毒感染后的细胞培养在BFTV诱导培养基,37℃,95%饱和湿度,5%CO2培养箱。结果发现,培养8天后可以形成类似BFRTV培养基诱导获得的乳腺上皮细胞(图10)。说明抑制TGFbeta R1的表达是体外诱导获得转分化乳腺上皮细胞(CiMECs)的关键。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,其特征在于:抑制TGFbeta R1及其相关位点的表达。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:使用小分子化合物或基因干扰抑制TGFbeta R1及其相关位点,所述小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上。
3.一种用于体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的诱导培养基,其特征在于:包括基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇以及小分子化合物;优选的,小分子化合物为VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189中的一种或两种以上;且在最终培养基中,VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox、SB431542、SB525334、LDN193189的浓度分别为0~4mM、0~80μM、0~80μM、0~8μM、0~80μM、0~80μM、0~80μM、0~80μM,以上各物质浓度不同时为0。
4.根据权利要求3所述诱导培养基,其特征在于:小分子化合物包括VPA、Forskolin、Tranylcypromine、TTNPB、Repsox,且在最终培养基中,各自的浓度依次分别为0.0625~4mM、1.25~80μM、1.25~80μM、0.125~8μM、1.25~80μM;优选的,浓度依次为0.25~2mM、5~40μM、5~40μM、0.5~4μM、5~40μM;更优选的,以上组分中的Repsox用SB431542、SB525334、LDN193189中的一种替代。
5.根据权利要求3所述的诱导培养基,其特征在于:基础液、KSR、非必需氨基酸、β-巯基乙醇的体积比为78:20:1:1;更优选的,所述基础液为N2B27,包括Knockout DMEM/F12、N2(100×)、Neurobasal、B27(50×)、Glutamine(100×);且几者的体积比为99:1:97:2:1。
6.如权利要求3~5任一项所述的诱导培养基在体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞中的应用。
7.一种使用诱导培养基进行体外诱导体细胞转分化为乳腺上皮细胞的方法,其特征在于:包括如下步骤,
1)将体细胞接种于培养皿中,接种后加入高糖DMEM+10%FBS培养基,置于5%二氧化碳,湿度95%,37℃的培养箱中;
2)培养8~24h后,更换如权利要求3~5任一项所述的诱导培养基;再继续诱导培养8天,其中每间隔两天更换一次新的诱导培养基;获得转分化的乳腺上皮细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:还包括步骤3),将步骤2)转分化的乳腺上皮细胞用胰酶消化后传代至使用Matrix基质预处理的培养板上;更换乳腺上皮培养基继续培养,培养后进行传代或冻存;其中Matrix基质中Matrix与明胶体积百分比为1:50-100。
9.权利要求1~2任一项所述方法或权利要求3~5任一项所述诱导培养基或权利要求6所述的应用或权利要求7~8任一项所述的方法中,所述体细胞来源于人、小鼠、大鼠、兔、猪、羊、山羊、牛或水牛;所述体细胞为耳部成纤维细胞或表皮细胞。
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