CN110951667B - 一株丰原素高产菌株lpb-18n及其选育和应用 - Google Patents

一株丰原素高产菌株lpb-18n及其选育和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株丰原素高产菌株LPB‑18N及其选育和应用，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。本发明的一株丰原素高产菌株LPB‑18N可以有效地大量生产丰原素，而且节约了成本，提高了工业化生产和商业潜力，生产的丰原素具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品领域广泛应用，具有巨大的经济效益和开发成为新型食品防腐剂的潜力。

Description

一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用。
背景技术
Fengycin(丰原素)是一种由解淀粉芽孢杆菌代谢产生的，由10个氨基酸和含14～18个C的β-羟基脂肪酸构成的一种非核糖体合成的抗菌环状脂肽。Fengycin作为一种新型生物源抗菌物质，已被证实具有强烈抑制丝状真菌的作用，可应用于植物病害生物防治等方面；另外fengycin具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品病原菌防治、食品加工、医药等方面具有较好的效果。作为一种次生代谢产物，由于fengycin是一种细胞内酶催化的合成过程，存在多种因素和因子的调控影响，其调控机理比较复杂。
近年来，随着对RNA的深入研究，研究者发现sRNA在原核生物代谢过程、环境胁迫应答以及群体感应等生命活动中具有重要的调控作用。在细胞逆境胁迫应答过程中，sRNA通过与mRNA分子互补配对作用调控细胞生理功能，同时sRNA还可以调控转录水平来影响细胞内mRNA翻译，应对环境变化，影响细菌的生长和繁殖。
随着对fengycin合成途径的认识和合成酶基因的定位、克隆和表达的成功，使用基因工程的手段改变菌株的遗传结构，阐明sRNA对fengycin合成的信号分子调控机理，从分子水平改良从而提高fengycin的产量成为可能。
由于缺乏对现有的野生菌株分子水平的改造，导致fengycin产量较低，其成本较高，价格昂贵，大大限制了fengycin的工业化生产和大规模应用。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明提供一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，本发明的一株丰原素高产菌株LPB-18N可以有效地大量生产丰原素，丰原素具有抑菌谱广、不易产生耐药性、安全可降解等特点，在食品领域广泛应用，具有巨大的经济效益和开发成为新型食品防腐剂的潜力。
本发明还提供一株丰原素高产菌株LPB-18N的选育和应用。
技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述的一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。
本发明所述的菌株LPB-18N在促进丰原素增产中的应用。
利用本发明所述菌株LPB-18N生产的含丰原素发酵液。
本发明所述的含丰原素发酵液的制备方法，通过以下步骤所制成：
将菌株LPB-18N接种于种子培养基，摇床振荡培养至对数生长期，获得种子液，将种子液接入发酵培养基中，摇床震荡培养，得发酵液；将发酵液4℃离心，收集上清液，4℃静置过夜，将溶液及沉淀4℃离心，收集菌体，于4℃下用甲醇充分溶解，最后将溶液4℃离心，得到的上清液即为丰原素的粗提取物。
本发明所述的菌株LPB-18N的选育方法，包括如下步骤：
采集土样，选育到一株菌株代号为LPB-18的解淀粉芽孢杆菌，保藏编号CGMCCNo.18719，保藏日期2019年10月22日，通过生物信息学分析，对菌株LPB-18转录组数据进行靶基因分析，获得一段长度为355bp与解淀粉芽孢杆菌丰原素合成酶存在碱基互补关系的非编码RNA(sRNA)片段，该片段被命名为FenSr3，核苷酸序列为SEQ ID NO.1；通过DNA同源重组将重组片段与线性化载体连接，构建FenSr3基因敲除载体，通过电转化体系将基因敲除载体转化解淀粉芽孢杆菌LPB-18感受态中，构建基因敲除突变株，即为丰原素高产菌株LPB-18N。
其中，所述FenSr3基因敲除载体的引物由序列为SEQ ID NO.2-5所示。
为了解决野生菌株丰原素fengycin产量低、无法适应工业化生产等技术问题，本发明还提供一种从分子水平改造解淀粉芽孢杆菌，提高fengycin产量的方法。本发明中构建了一种敲除FenSr3基因的重组解淀粉芽孢杆菌，通过同源重组技术被敲除解淀粉芽孢杆菌的FenSr3基因。具体的：(1)通过DNA重叠延伸构建重组片段，与线性化载体连接，构建FenSr3缺失突变，得到FenSr3基因敲除质粒；(2)通过电转化体系将该质粒转化原始解淀粉芽孢杆菌感受态中，得到fengycin高产菌株。
本发明丰原素合成代谢调控基因FenSr3是调控和生产抗菌脂肽丰原素的关键基因，是在解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LPB-18中克隆得到，所用菌株Bacillus amyloliquefaciens LPB-18为发明人自行选育得到，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.18719，保藏日期2019年10月22日，该菌株Bacillus amyloliquefaciens LPB-18可以将一定程度上生产fengycin，国际上被公认为解淀粉芽孢杆菌是一种食品安全菌株，在食品领域广泛应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明从一株解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LPB-18中成功克隆到一种丰原素合成代谢基因FenSr3，该基因为一个与丰原素合成代谢相关的非编码RNA基因(FenSr3)，是一个全新的丰原素合成代谢相关基因。本发明利用丰原素合成代谢基因FenSr3构建的重组表达载体FenSr3基因敲除载体，通过电转化体系将该质粒转化解淀粉芽孢杆菌LPB-18感受态中，该利用基因的缺失，构建基因敲除突变株，获得丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCCNO.18720。该丰原素高产菌株LPB-18N丰原素fengycin产量高、效率高，发酵72h后发酵液中fengycin含量高达327.598mg/L，为原始野生菌株产量的1.72倍；本发明获得的菌株LPB-18N不仅fengycin产量高，而且节约了成本，提高了工业化生产和商业潜力。
附图说明
图1为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N菌体形态图(65×)；
图2为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N菌落观察图；
图3为敲除质粒PCR产物凝胶成像图(LaneM：DNAMaker，Lane1：单菌落PCR扩增产物)；
图4为电转化单菌落PCR产物凝胶成像图(LaneM：DNAMaker，Lane1-4：单菌落PCR扩增产物)；
图5为原始解淀粉芽孢杆菌LPB-18丰原素样品HPLC图谱；
图6为解淀粉芽孢杆菌LPB-18N丰原素样品HPLC图谱。
具体实施方式
以下结合附图和实施例作进一步说明。
实施例中使用的微生物和试剂来源如下：
KpnⅠ、BglⅡ、BamHⅠ购自Fermentas公司；
大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pCBS为南京农业大学提供；合成方法(Knockoutof rapC Improves the Bacillomycin D Yield Based on De Novo Genome Sequencingof Bacillus amyloliquefaciens fmbJ,J.Agric.Food Chem.2018,66,4422-4430.)
大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞、Trans110感受态细胞购自全式金生物科技公司。
实施例1
在江苏淮安的大学城蚯蚓养殖土壤分离筛选到一株菌株代号为LPB-18的微生物，具有良好生物防治功能的益生菌，该菌株为革兰氏阳性菌、好氧，长约1.7μm～2.6μm、宽约0.6～0.9μm；在固体LB平板上生长良好，菌落呈现圆形、乳白色、不透明。
利用分子生物学方法扩增该菌株LPB-18的16S rDNA测序序列并进行测序，PCR扩增得到的LPB-18 16S rDNA测序，如SEQ ID No.6所示，通过在genebank上进行比对发现，结果表明菌株LPB-18与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens B10和Bacillusamyloliquefaciens HYM32)菌株的同源性最近达到了98.41％。结合形态和生理生化特征，将菌株LPB-18初步鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LPB-18。将该菌株解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens LPB-18送交位于中国北京，中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC No.18719，保藏日期2019年10月22日。
实施例2
通过生物信息学分析，对获得的Bacillus amyloliquefaciens LPB-18转录组数据进行靶基因分析，获得一段长度为355bp与解淀粉芽孢杆菌fengycin合成酶存在碱基互补关系的非编码RNA(sRNA)片段，该片段被命名为FenSr3，基因FenSr3的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。
SEQ ID NO.1
GGAGCTGTGTACGCGGTTTGAAGCGCGAGCTCCGGTTCGGGCAGATTTTTCCGATCCAATTTACCGTTCGGCGTAAGCGGCAGCTTCTCAAGTTCCATCATATAGGCCGGGACCATGTAATTCGGCAGTTGCTTAGAAAGTGATGAACGCACTTTTTCTGTATCCATGTCCGTCTGCAGACTCATATATGCGATCAGTTCTTTATTGCCGGACTGCCCGGTTCTGACTGACACGGCAGCTTCTTTCACGCCGTCCAGGCTCCTTAGTGCGGCTTCAATCTCTCCCAGCTCGACCCGATAACCGCGGATTTTCACTTGATCATCCATCCGTCCGGCATATTCGATCGTTCCGTCCG
实施例3
1、sRNA基因敲除载体的构建
FenSr3基因上下游各520bp序列设计敲除载体构建的引物：
L-FenSr3-F：(SEQ ID NO.2)
atcgatgcatgccatggtaccCCAAGTATCTGTCTCAGAC(Kpn Ⅰ)
L-FenSr3-R：(SEQ ID NO.3)
GTTCTTCAAGCTCATTGCGGGCAGCCAGCGGGCTA
R-FenSr3-F：(SEQ ID NO.4)
GATTTAGCCCGCTGGCTGCCCGCAATGAGCTTGAA
R-FenSr3-R：(SEQ ID NO.5)
gcgtcgggcgatatcagatctTTATATGTAAGTGACCAGG(Bgl Ⅱ)
(1)sRNA基因上下游序列的扩增
以LPB-18基因组DNA为模板，采用引物L-FenSr3-F/R和R-FenSr3-F/R分别扩增sRNA上下游基因间同源臂序列。
PCR反应体系(50μL)：2×Phanta Master Mix 25μL，上游引物2μL，下游引物2μL，模板DNA 1μL，ddH2O 20μL；PCR扩增条件：95℃预变性5min，95℃变性30s，55～65℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，72℃延伸10min。将PCR产物分别纯化回收目的产物。采用重叠延伸引物L-FenSr3-F和R-FenSr3-R扩增目的产物，电泳检测结果如图3，获得重组目的片段。
(2)重组片段与线性化载体连接
将大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pCBS用限制性内切酶KpnⅠ和BamHⅠ双酶切3h，利用BglⅡ和BamHⅠ为同尾酶的特性，消除BamHⅠ酶切位点，回收线性化载体。
重组反应体系：5×CEⅡBuffer 4μL，线性化载体150ng，目的片段160ng，ExnaseⅡ2μL，ddH2O Up to 20μL。37℃水浴锅反应30min，冰水浴冷却5min。将反应产物转化E.coliDH5α感受态细胞，LB抗性平板蓝白斑筛选(IPTG、X-gaL、Amp)，挑取阳性单菌落PCR检测目的片段。提取质粒，用限制性内切酶KpnⅠ和BglⅡ双酶切验证。将验证正确的敲除质粒转化Trans110感受态细胞，LB抗性平板(Amp)，提取质粒，通过PCR和双酶切验证，获得去甲基化敲除质粒pCBS-ΔsRNA。
2、解淀粉芽孢杆菌LPB-18敲除sRNA菌株的构建
(1)解淀粉芽孢杆菌LPB-18感受态的制备
将过夜培养的LBS培养基按1：25(v/v)稀释(250mL摇瓶，装液量100mL)，摇床(37℃，180r/min)振荡培养2h，期间用紫外分光光度计检测，当OD600＝0.5左右时，向摇瓶中添加甘氨酸溶液，使最终体系浓度为10mg/mL，继续振荡培养，当OD600＝1.0左右时，将摇瓶置于冰上静置30min，预冷的低温离心机4℃，8000rpm离心5min，弃去上清，收集菌体细胞，并用预冷的电转化液反复清洗菌体细胞3次，按1:100(v/v)用预冷的重悬液重悬感受态细胞得到LPB-18感受态细胞，于预冷的离心管中，放置于-80℃保存备用。注：全程无菌及低温预冷操作。电转化液组成：0.5M海藻糖，0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，以及10％的甘油，115℃灭菌30min。重悬液组成：电转化液添加14％PEG6000聚乙二醇。
(2)电转化
取约500ng待转化质粒pCBS-ΔsRNA于100μL LPB-18感受态细胞中，轻弹管壁混匀，将感受态细胞及质粒转移至冰上预冷的电转杯(2mm)中，冰上放置5min。设置好电转化参数，2800v，4.5ms电压电击后，立即向电转杯中加入1mL LBS培养基，轻柔混匀后，缓慢吸取至2mL离心管中，摇床(30℃，120r/min)温和振荡培养3h，室温下2500×g离心3min，弃去900μL上清液，用剩下的培养基将离心管中菌体重悬，均匀涂布在LB抗性平板(Amp、红霉素)，30℃培养72h。采用PCR扩增以及电泳检测验证单菌落，扩增引物L-FenSr3-F和R-FenSr3-R，PCR反应体系同上，电泳检测结果如图4，同图3电泳检测结果一致。验证成功的即为敲除正确的菌株，即为菌株丰原素高产菌株LPB-18N，该菌株为革兰氏阳性菌、好氧，长约1.7μm～2.6μm、宽约0.6～0.9μm，如图1所示；在固体LB平板上生长良好，菌落呈现圆形、乳白色、不透明，如图2所示。经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens LPB-18N，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。
挑取原始野生菌株LPB-18和菌株LPB-18N各一环，分别接种于种子培养基(250mL摇瓶，装液量100mL)，摇床(37℃，180r/min)振荡培养24h至对数生长期。将种子液按3％(v/v)的接种量分别接入发酵培养基中(1L摇瓶，装液量400mL)，摇床(33℃，180r/min)震荡培养72h，得发酵液；将发酵液于4℃温5000×g离心20min，收集上清液，用6M HCL调节pH值至2.0，4℃静置过夜。将溶液及沉淀4℃5000×g离心20min，收集菌体，于4℃下用5mL甲醇充分溶解，调节pH值至7.0。最后将溶液4℃1000×g离心20min，得到的上清液即为fengycin的粗提取物。种子培养基组成：牛肉浸膏5g，蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl5g，葡萄糖10g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，115℃灭菌15min；发酵培养基组成：酵母浸膏1g，谷氨酸钠14g，KCL 0.5g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，MnSO4 5mg，CuSO4 0.16mg，FeSO4·7H2O 0.15g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，115℃灭菌30min。
采用Waters 600制备型反向高效液相色谱仪，C18反向色谱柱对粗提物样品进行纯化，每次进样2-3mL，流动相为添加有0.1％三氟乙酸的去离子水和乙腈。对纯化后的产物利用HPLC进行鉴定，色谱柱为Agilent C18柱，以乙腈和去离子水为流动相进行梯度洗脱，205nm紫外检测，液相图如图5为野生菌株，丰原素目标峰为1-6，浓度190.908mg/L，图6为菌株LPB-18N，丰原素目标峰为1-6，浓度327.598mg/L，敲除菌株丰原素产量是原始野生菌株丰原素产量的1.72倍。
序列表
<110> 淮阴工学院
<120> 一株丰原素高产菌株LPB-18N及其选育和应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca 960
ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca 1020
ggtggtgcat ggattgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt ccccgcaacg 1080
agcgcacctt gatcttagtt gccagcattc agtgggcacc tctaggtgac tgccggtgac 1140
caatcggagt aagggtgggg atgacgtcat cattcatgcc ctaatgaact ggccatacac 1200
accacgtgcc ttacacaaat g 1221

Claims (3)

1.一株丰原素高产菌株LPB-18N，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2019年10月22日，保藏编号为CGMCC NO.18720。
2.一种权利要求1所述的菌株LPB-18N在促进丰原素生产中的应用。
3.一种含丰原素发酵液的制备方法，其特征在于，通过以下步骤所制成：
将权利要求1所述的菌株LPB-18N接种于种子培养基，摇床振荡培养至对数生长期，获得种子液，将种子液接入发酵培养基中，摇床震荡培养，得发酵液；将发酵液4℃离心，收集上清液，4℃静置过夜，将溶液及沉淀4℃离心，收集菌体，于4℃下用甲醇充分溶解，最后将溶液4℃离心，得到的上清液即为丰原素的粗提取物。
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