CN110950938B - 一种双组分调控***及其在制备维生素b12中的应用 - Google Patents

一种双组分调控***及其在制备维生素b12中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种双组分调控***的突变体、突变基因及其在制备维生素B12中的应用。在苜蓿中华根瘤菌中过表达的双组分调控***基因和突变基因的基因工程菌，其生产维生素B12的能力得到了大幅提高，具有较大的应用推广价值。

Description

一种双组分调控***及其在制备维生素B12中的应用
技术领域：本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种双组分调控***及其在制备维生素B12中的应用。
背景技术：
维生素B12(VB12)又叫钴胺素，属于咕啉类化合物，是唯一含金属元素的维生素类化合物，是B族维生素发现最晚的大分子有机化合物。根据咕啉环上方的配基(R基团)种类不同，维生素B12可分为：羟基钴胺素，脱氧腺苷钴胺素和甲基钴胺素。维生素B12参与了大量的生化反应过程包括DNA的合成和调控、脂肪酸的合成、氨基酸的代谢及能力的产生。
微生物发酵法目前是生产维生素B12的最廉价的方法，能够大量生产并推广其使用。目前，国内外针对维生素B12生产菌生物合成维生素B12的研究主要集中在发酵过程优化，主要涉及培养基包括碳氮源和金属离子的优化、甜菜碱的添加、鱼藤酮的添加，工艺条件包括pH 和供氧的控制等(程立芳等,不同来源的尿卟啉原III转甲基酶在脱氮假单胞菌中的表达及其对生产维生素B12的影响.工业微生物，2017，第47卷第3期)。
双组分***(two-component system)普遍存在于细菌中，是细胞感应各种各样的环境刺激和做出相应反馈的重要机制。典型的双组分***通常包括两个部分，组氨酸蛋白激酶(sensor kinase)和反应调节蛋白(response regulator)。其中组氨酸蛋白激酶感应不同类型的信号(环境变化)，并通过磷酸转移反应调控反应调节蛋白的功能。通常，磷酸化后的反应调节蛋白可以做为转录增强子或抑制子直接结合至受其调节的基因的启动子区域，影响这些被调节基因的表达水平，进而使细胞对外界的信号做出正确的生理反应。该***可以调节各种各样的细胞过程，是允许细胞的基因网络对于不同的外界环境做出适应和维持细胞生存能力的重要机制。
目前，在产维生素B12菌种中哪个双组分***影响维生素B12的产量尚未见到报道。
发明内容：
本发明人对前期筛选出的高产维生素B12的苜蓿中华根瘤菌CGMCC NO.9638菌株(CN104342390A)，通过对其进行诱变，获得一株产维生素B12能力提高的诱变菌株。本发明作了进一步研究以发现对产维生素B12能力有影响的基因。经过研究发现一种双组分调控***编码基因和突变基因，其导入苜蓿中华根瘤菌中过表达，能够提高所述菌的产维生素B12的能力。该发明对于研究产维生素B12菌种的基因调控有重要意义。
首先，本发明提供一种双组分调控***的响应调控子的突变体，其特征在于，其多肽氨基酸序列在SEQ ID No.4所示原始序列的基础上具有下述突变：第418位氨基酸替换为A。
优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
其次，本发明提供如述的双组分调控***的响应调控子的突变体的编码基因。
优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
第三方面，本发明提供双组分调控***编码基因在制备维生素B12中的应用。
具体地，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。
优选地，所述苜蓿中华根瘤菌具有CGMCC NO.9638保藏号的菌株。
进一步地，所述双组分调控***编码基因编码具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽或SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。
更优选地，所述双组分调控***的编码基因具有SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。
经研究证实，本发明双组分调控***基因和突变基因的基因工程菌生物安全(菌内过表达未对菌体的生长造成影响)，可以有效的提高苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力，实验数据表明其中对于原始基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达，可以提高产维生素B12的能力达 22.6％，而突变基因在苜蓿中华根瘤菌中过表达能进一步提高产维生素B12的能力即提高 26.9％。
附图说明
图1：质粒载体pBBR-dctBD的图谱。
图2：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的VB12产量。
图3：不同苜蓿中华根瘤菌菌株发酵144h后的生物量。
图4：维生素B12的标准曲线图。
具体实施方式
本发明的以下实施例和附图仅说明实现本发明的具体实施方案，这些方案和附图不可以理解为对本发明的限制，任何在不脱离本发明的原理和实质的情况下所做的任何改变，均落在本发明的保护范围之内。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
培养基配方：
LB培养基(g/L)：氯化钠10，胰蛋白胨10，酵母提取物5，固体培养基加琼脂粉15。
种子培养基(g/L)：蔗糖40，玉米浆20，甜菜碱5，(NH4)2SO4 1，(NH4)2HPO4 2，MnSO4·H2O 0.8，CoCl2·6H2O 0.02，MgO 0.3，DMBI 0.01，ZnSO4·7H2O 0.01，CaCO3 1.5,pH通过NaOH 控制在7.0～7.4。
发酵培养基(g/L)：蔗糖80，玉米浆30，甜菜碱15，(NH4)2SO4 2，MgSO4 1.5,K2HPO40.75， CoCl2·6H2O 0.14,DMBI 0.075，ZnSO4·7H2O 0.08，CaCO3 1，pH通过NaOH控制在7.0～7.4。
维生素B12的检测方法
(1)样品预处理
取1mL发酵液，加入8％的亚硝酸钠溶液和冰醋酸各0.25mL摇匀，置于95～100℃水浴中30-40min；待冷却至室温，在10000转离心1分钟，上层清液通过0.22μm膜
Figure BDA0002330900390000031
过滤器过滤至上样瓶中，再加20μl 2％的NaCN(w/v)至1mL的上清液中。亚硝酸钠溶液和冰醋酸的加入量可随发酵液的量进行相应调整。
(2)标准品的制备
配置梯度维生素B12标准品(20mg/L，50mg/L，100mg/L，150mg/L)。
(3)HPLC检测条件
C18-250A柱(Agilent，4.6mmid 9×250mm，5μm)。流动相为70％有机相(乙腈)和30％无机相(乙酸钠水溶液)，吸收波长为361nm，柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量20μL。
(4)维生素B12标准曲线的绘制
将不同浓度的标准品按上述条件进行HPLC检测，绘制峰面积A-VB12浓度标准曲线。以测得的峰面积A为纵坐标，维生素B12质量浓度C(mg/L)记为横坐标，绘制维生素B12标准曲线。见图4，得回归方程y＝19.846x-80.857，R2＝0.999，吸收度与质量浓度呈良好的线性关系。液相结束后根据维生素B12标准曲线计算样品产量。
实施例1：常压室温等离子体(ARTP)诱变时间的确定、突变体库的构建及高产菌种的获得 (1)致死率的测定
为了获得一个比较广的突变体库，对底盘细胞苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638进行了常压室温等离子体(ARTP)诱变。首先，对等离子诱变条件下CGMCCNO.9638的致死率进行测定。将种子用LB培养基培养至对数中期的CGMCCNO.9638细胞(OD600＝1)用0.85％ NaCl溶液冲洗两遍，然后用0.85％NaCl溶液稀释成108个细胞/mL的悬液。取10uL悬液均匀的涂布在铁片上，进行ARTP诱变，诱变时间分别为0s、5s、10s、15s、20s、25s，每个诱变时间点2个重复，每个时间点的涂板3个重复。诱变后将带有细胞的铁片置于1mL 无菌水中漩涡震荡洗下细胞，将细胞悬液10倍梯度稀释至10-3，取稀释后的细胞悬液100μL 涂LB培养基平板，30℃培养72h后统计菌落数。根据下列公式计算不同诱变时间下的致死率，以诱变时间为横坐标，不同诱变时间下的致死率为纵坐标，绘制致死率曲线。致死率的计算公式为：致死率(％)＝[(诱变0s菌落数－诱变Ns菌落数)/诱变0s菌落数]×100％，其中 N＝5、10、15、20、25。
从表1中可知，诱变10s时的致死率为82.2％，诱变15s时的致死率达到95％以上，致死率为80％-90％时，诱变后发生正突变的概率最高，因此选择10s作为最终构建突变体库的诱变时间。
Figure BDA0002330900390000041
(2)突变体库的构建及筛选
取浓度为108个/mL的细胞悬液10uL涂布于铁片上进行ARTP诱变，诱变时间为10s，共对3个铁片上的细胞进行诱变处理，诱变结束后，将这3个铁片上的细胞在含有1mL LB 培养基的1.5mL离心管中涡旋振荡重悬。将细胞悬液10倍梯度稀释至10-3，取稀释后的细胞悬液100μL涂LB培养基平板，30℃培养72h，长出270个单菌落。
(3)突变株96深孔板发酵初筛
分别挑取平板上的所有单菌落接种于含有500uL的种子培养基的96深孔板中(每个孔板上包含6株对照菌株CGMCC NO.9638)，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％ (v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B12产量。
(4)突变株96深孔板发酵复筛
将步骤(3)中产量排前30的株菌的单菌落(包含一个对照菌株CGMCC NO.9638)接种于含有500uL种子培养基的96深孔板中，30℃、800rpm、80％湿度振荡培养36h后，按10％(v/v)接种量转接含有450uL发酵培养基的96深孔板中(每株菌3个平行)，30℃、800rpm、80％湿度条件下振荡培养120h后检测维生素B12产量。
重复步骤(3)和(4)三次，最后获得一株高产维生素B12的菌种SM*，96孔板中产量从50mg/L提高到80mg/L，是底盘菌株产量的1.6倍。
实施例2：突变菌株与出发菌株进行比较基因组分析
将菌种SM*和出发菌株CGMCC NO.9638送金唯智生物科技有限公司进行全基因组测序。通过比较两个菌株的全基因组序列发现双组分调控***的响应调控子的编码基因dctD发生了点突变，其第1253位核苷酸由C置换了T。为了验证突变位点对维生素B12产量的影响，我们将突变前和突变后的双组分调控***的dctBD基因在出发菌种CGMCC NO.9638中进行了过量表达。
实施例3：质粒载体的构建
pBBR-dctBD的构建：
分别利用表2的引物对P21-XbaI-F和P21-R，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XbaI酶切位点，得到启动子P21片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21片段。P21启动子序列如SEQ ID No.7所示，并且记载在专利申请号为201910929398.X的专利文件中。
分别利用表2的引物对dctB-F和dctB-HindIII-R，以Ensifer adhaerens CasidaA(黏着剑菌)基因组为模板，通过PCR扩增，引入HindIII酶切位点，得到dctB片段，经电泳验证， DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的dctB片段。dctB基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
然后，利用引物对P21-XbaI-F和dctB-HindIII-R，以纯化的P21片段和dctB片段为模板，通过融合PCR，得到P21-dctB片段(含XbaI和HindIII酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-dctB片段。
将上述纯化的P21-dctB片段和pBBR1MCS2质粒分别用XbaI和HindIII进行双酶切，将 P21-dctB片段的双酶切产物与pBBR1MCS2质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-P21-dctB。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-P21-dctB备用。
分别利用表2的引物对P21-HindIII-F和P21-R2，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌)基因组为模板，通过PCR扩增，引入HindIII酶切位点，得到启动子P21-2片段，经电泳验证，用限制性内切酶DpnI(NEB公司)在37℃处理30min，核酸电泳胶回收后，得到纯化的P21-2片段。
分别利用表2的引物对dctD-F和dctD-XhoI-R，以Ensifer adhaerens Casida A(黏着剑菌) 基因组为模板，通过PCR扩增，引入XhoI酶切位点，得到dctD片段，经电泳验证，DpnI 酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的dctD片段。dctD基因序列如SEQ ID No.3所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。
然后，利用引物对P21-HindIII-F和dctD-XhoI-R，以纯化的P21片段和dctD片段为模板，通过融合PCR，得到P21-dctD片段(含HindIII和XhoI酶切位点)，经电泳验证，电泳胶回收后，得到纯化的P21-dctD片段。
将上述纯化的P21-dctD片段和pBBR-P21-dctB质粒分别用XbaI和XhoI进行双酶切，将 P21-dctD片段的双酶切产物与pBBR-P21-dctB质粒双酶切的产物经过T4连接酶4℃过夜连接。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为E.coli/pBBR-dctBD。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-dctBD备用。
pBBR-dctBD(T1253C)
以质粒pBBR-dctBD为模板，用引物对dctD(T1253C)-F/dctD(T1253C)-R进行反向PCR 扩增，得到大小约10kb的片段DpnI酶法处理，电泳胶回收后，得到纯化的产物。取30ng纯化后的产物加入2μl 10*T4连接酶缓冲液(NEB公司)、1μl T4多核苷酸激酶(NEB公司)，补充蒸馏水至20μl，37℃反应30min，加入1μl T4连接酶(NEB公司)，室温反应2h得到连接产物。将连接产物转化入大肠杆菌DH5α中，涂布于含有50mg/L卡那霉素的LB固体平板上，培养16h后进行菌落PCR检测，送金唯智测序，测序正确后，将得到的阳性菌命名为 E.coli/pBBR-dctBD(T1253C)。用质粒试剂盒提取质粒pBBR-dctBD(T1253C)备用。其中，突变的dctD基因序列如SEQ ID No.5所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
Figure BDA0002330900390000061
Figure BDA0002330900390000071
实施例4：含质粒载体菌株的构建
将实施例1中的3个质粒pBBR1MCS2、pBBR-dctBD、和pBBR-dctBD(T1253C)按照如下方法转入苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638中：
(1)接种新活化的苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638、大肠杆菌(含有相应的质粒)以及辅助载体MT616，并分别在30℃和37℃的培养箱中振荡培养到OD值为1.0左右；
(2)无菌条件下分别将苜蓿中华根瘤菌CGMCCNO.9638的菌液、MT616和大肠杆菌的菌液各500μL转移至1.5mL无菌EP管中并在4℃，12,000rpm条件下离心1min。
(3)在无菌条件下弃掉上清液，并用1mL 0.85％的无菌生理盐水对沉淀进行悬浮。
(4)再次在4℃，12,000rpm条件下离心1min，并在无菌条件下去除上清。
(5)分别采用500μL新鲜的LB液体培养基对受体细胞、大肠杆菌和MT616的沉淀进行悬浮。
(6)分别取各2μL的三种菌液，滴在不添加抗性的LB固体培养基的同一位置，并小心将其混匀。分别将单一组分的菌液以及两两之间混合的菌液进行点样，用来作为试验对照组。
(7)待菌液自然风干后，在37℃培养箱中倒置培养约1天，至单菌落长出。
(8)挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线，将平板倒置于30℃培养箱中进行培养，直到菌落长出。同时对照组也需挑取不同的单菌落在含有相应抗生素的平板上进行划线。
(9)从抗性平板上挑取长出的克隆，进行菌落PCR验证。得到阳性苜蓿中华根瘤菌:SM/pBBR(对照菌)、SM/pBBR-dctBD(简写为SM1)、SM/pBBR-dctBD(T1253C)(简写为SM2)。
实施例5：不同菌株评价
苜蓿中华根瘤菌的培养条件：
将对照菌、SM1和SM2菌株在无菌条件下用接种针在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，30℃恒温静置48h培养，获得单菌落。用接种针挑取单菌落于装有5mL含有100mg/L卡那霉素的LB液体培养基的试管中，30℃，200rpm培养36h。将种子培养基按照10％比例接种至含有100mg/L卡那霉素的30mL发酵培养基中(250ml摇瓶)。30℃震荡(220r/min)培养144h后收集菌体并检测产量。摇瓶发酵每个实验做3个平行。
不同苜蓿中华根瘤菌菌株产VB12能力的比较
SM1和SM2菌株与对照菌相比生产维生素B12的能力均得到提高(参见表3和图2)。其中SM1提高22.6％，SM2提高26.9％。结果说明本发明中的过量表达双组分***的苜蓿中华根瘤菌生产维生素B12的能力得到了增强。三个菌株生物量变化不大，说明双组分***基因的过表达未对菌体的生长造成影响(见表3和图3)。
Figure BDA0002330900390000081
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一种双组分调控***及其在制备维生素B12中的应用
<130> 2019.11.17
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1827
<212> DNA
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 1
gtgaaacatc gcttggtcct tgcgttcctg ctgttgccgc tgcttgcagc catgctggca 60
tggaaaggct atgcggtcac gaccgacagc tatttgcgcg aggcaggtgc tcaggcgacc 120
acggcgctgc gcctcgccgt caccgcgctc gacggccacc tcaaccgcta ccaggcgttg 180
ccggcactga tcgcggatca tgacgatgtc cgcgagctcg tcacccgccc acgggaccgg 240
cgactgcggg aggccgtcga cagctacctc aaggacatca acggcctgtt gcagtcctcg 300
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agcaatgccc gggaggccgc cgaatga 1827
<210> 2
<211> 608
<212> PRT
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 2
Val Lys His Arg Leu Val Leu Ala Phe Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Met Leu Ala Trp Lys Gly Tyr Ala Val Thr Thr Asp Ser Tyr Leu
20 25 30
Arg Glu Ala Gly Ala Gln Ala Thr Thr Ala Leu Arg Leu Ala Val Thr
35 40 45
Ala Leu Asp Gly His Leu Asn Arg Tyr Gln Ala Leu Pro Ala Leu Ile
50 55 60
Ala Asp His Asp Asp Val Arg Glu Leu Val Thr Arg Pro Arg Asp Arg
65 70 75 80
Arg Leu Arg Glu Ala Val Asp Ser Tyr Leu Lys Asp Ile Asn Gly Leu
85 90 95
Leu Gln Ser Ser Asp Ile Tyr Val Ile Thr Pro Asp Gly Asn Thr Ile
100 105 110
Ala Ala Ser Asn Tyr Asp Gly Pro Thr Ser Phe Val Gly Gln Asn Phe
115 120 125
Ser Tyr Arg Pro Tyr Phe Gln Glu Ala Leu Arg Gly Glu Gln Ser Arg
130 135 140
Phe Tyr Ala Leu Gly Thr Thr Ser Leu Lys Arg Gly Tyr Phe Phe Gly
145 150 155 160
Ser Pro Ile Arg Val Gly Asn Glu Ile Arg Gly Val Met Val Phe Lys
165 170 175
Val Asp Val Glu Arg Ile Glu Ala Ser Trp Gln Gly Gly Glu Tyr Lys
180 185 190
Ile Phe Val Ser Asp Pro Glu Gly Ile Val Phe Met Ser Gly Asp Pro
195 200 205
Glu Trp Arg Tyr Ala Ser Ile Leu Pro Leu Thr Ser Asp Arg Leu Ala
210 215 220
Arg Thr Glu Ala Ser Arg Arg Tyr Ala Asp Ala Thr Val His Ala Leu
225 230 235 240
Pro Val Ser Glu Arg Val Ser Ser Asp Arg His Phe Leu Thr Val Ser
245 250 255
Ala Glu Asn Ser Ser Arg Glu Tyr Leu Met Leu Ser Gln Arg Met Pro
260 265 270
Asp Ala Asp Trp Thr Val Asn Val Leu Val Asp Thr Ala Ser Val Arg
275 280 285
Thr Gln Ala Leu Thr Thr Val Ile Ala Ala Leu Leu Leu Leu Cys Leu
290 295 300
Ala Gly Leu Gly Val Ala Ile Ile Leu Gln Arg Arg Ala Arg Leu Asn
305 310 315 320
Glu Arg Leu Ser Met Gln Ala Glu Ala Gln Ala Glu Leu Glu Arg Arg
325 330 335
Val Asp Glu Arg Thr Ala Asp Leu Ala Arg Val Asn Gly Gln Ile Glu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Glu Arg Arg Leu Thr Glu Lys Gln Leu Arg Arg Thr
355 360 365
Gln Ala Asp Leu Ile Gln Ala Gly Lys Leu Ala Gly Leu Gly Gln Met
370 375 380
Ser Ala Ala Leu Ser His Glu Phe Asn Gln Pro Leu Ala Ala Ala Lys
385 390 395 400
Thr Tyr Ala Asp Ser Ala Ala Leu Leu Ile Glu Arg Gly Arg Ser Asp
405 410 415
Glu Ala Thr Asp Asn Ile Arg Arg Ile Ser Gly Leu Val Asp Arg Met
420 425 430
Ala Ala Ile Ser Lys His Leu Arg Asn Phe Ala Arg Lys Pro Asn Glu
435 440 445
Lys Leu Gly Pro Val Pro Val Glu Glu Val Val Arg Asp Thr Met Glu
450 455 460
Ile Val Ser Val Arg Leu Lys Ala Ala Ala Ala Thr Ile Asp Ile Asp
465 470 475 480
Leu Gly Asn Glu Pro Leu Val Val Arg Ala Gly Ser Val Arg Leu Gln
485 490 495
Gln Val Leu Val Asn Ile Ile Ser Asn Ala Ala Asp Ala Val Glu Gly
500 505 510
Leu Asp Asp Arg Thr Ile Arg Leu Arg Ala Lys Gln Glu Asp Gly Lys
515 520 525
Val Val Leu Thr Val Ser Asp Arg Gly Pro Gly Ile Ala Pro Ala Ile
530 535 540
Ala Glu Arg Ile Phe Asp Pro Phe Phe Ser Thr Lys Gly Val Gly Lys
545 550 555 560
Gly Leu Gly Leu Gly Leu Ser Ile Ser Tyr Asn Ile Ile Lys Asp Phe
565 570 575
Gly Gly Ser Leu Val Ala Thr Asn Leu Ala Glu Gly Gly Ala Glu Phe
580 585 590
Arg Ile Glu Leu Ala Ala Glu Asn Ser Asn Ala Arg Glu Ala Ala Glu
595 600 605
<210> 3
<211> 1362
<212> DNA
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 3
atgatcgaga gccggatcct gctcgtcgat gacgaagagg atgtgcgcca ttcgagcgcc 60
caggcgctcg agctggccgg tttccgcgtc gatgccttct cggccgccga acacgcgctc 120
gaattcatca gctacagttt tcctggcgtg gtgatcagcg atatccgcat gccgggcatg 180
gacggcatga ccctcctgca gcgcatccgc gaaatcgatg cggaggtacc ggtcatcctc 240
gtcaccggcc atggcgatgt gcaactcgcg gtccgggcca tgcgcgaagg cgcctatgac 300
ttcgtcgaga agcccttcgc agcgcagatg ctcgccggca cgatccgccg ggcactggac 360
tggcgcgcgc tcgttcttga aaaccgccgg ctgaaggcgg ttgccggcaa gcgcgacgac 420
atcgaacagc ggctgcccgg tcgaagccag gtcatggtcg atctgcgcta ccgcatccgc 480
gcgctcggcg cggccgatgc cgataccttg atcatcggcg ataccggcgt cggcaaggag 540
gtgctggccc gcacgctgca tgatctgagc acccgcgcca acagcccgtt catcgctatc 600
aactgcgccg cactgcccga aaacctgatc gaaagcgagc tcttcggcca tgagcccggc 660
gcctttcccg gcgccatccg tccgcgctac ggcaagttcg aacatggtcg cggcggtacg 720
atcctgctcg acgagattgg ctcgatgccc ttcgacctcc aggcaaagtt tctgcgggtg 780
ctgcaggaac gcgtcatcac ccggctcgga tcgaacgagc aggtcccgct cgacgtccgt 840
ttcatcgcca ccagcaaggt cgatctcgaa aaggaagtcg ccgccgggcg cttccgggcg 900
gacctcctct atcgcctcaa cgtcgcgacg ctccgcgtcc cctcgcttgc ccagcggcgc 960
gccgacattc cgctgctctt tctgcaactg gtcagggagt cggccgctcg ctacggccgg 1020
gatgaggtgg agatctccca atcgatgctg gccgaaatcg ccgagcgcga ctggccgggc 1080
aacgtgcgcg agttgcgcaa tgccgccgag cggctggtgc tcgggctcga tgcggctccc 1140
gacgacagcg cgcgatcgga aaacggcaac cgccttgccg acaaggtggc ggcctatgaa 1200
aaaggcctca tcgccagcgc aatcgccgcc catggcggcg cgctgaagcc ggtctacgag 1260
accctcggca tctcgcgcaa gacgctctac gaaaagatgc agaagttcgg gctcgacaag 1320
aaactcgtcg cttccgattt ctccgcagag aacgagacct ga 1362
<210> 4
<211> 453
<212> PRT
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 4
Met Ile Glu Ser Arg Ile Leu Leu Val Asp Asp Glu Glu Asp Val Arg
1 5 10 15
His Ser Ser Ala Gln Ala Leu Glu Leu Ala Gly Phe Arg Val Asp Ala
20 25 30
Phe Ser Ala Ala Glu His Ala Leu Glu Phe Ile Ser Tyr Ser Phe Pro
35 40 45
Gly Val Val Ile Ser Asp Ile Arg Met Pro Gly Met Asp Gly Met Thr
50 55 60
Leu Leu Gln Arg Ile Arg Glu Ile Asp Ala Glu Val Pro Val Ile Leu
65 70 75 80
Val Thr Gly His Gly Asp Val Gln Leu Ala Val Arg Ala Met Arg Glu
85 90 95
Gly Ala Tyr Asp Phe Val Glu Lys Pro Phe Ala Ala Gln Met Leu Ala
100 105 110
Gly Thr Ile Arg Arg Ala Leu Asp Trp Arg Ala Leu Val Leu Glu Asn
115 120 125
Arg Arg Leu Lys Ala Val Ala Gly Lys Arg Asp Asp Ile Glu Gln Arg
130 135 140
Leu Pro Gly Arg Ser Gln Val Met Val Asp Leu Arg Tyr Arg Ile Arg
145 150 155 160
Ala Leu Gly Ala Ala Asp Ala Asp Thr Leu Ile Ile Gly Asp Thr Gly
165 170 175
Val Gly Lys Glu Val Leu Ala Arg Thr Leu His Asp Leu Ser Thr Arg
180 185 190
Ala Asn Ser Pro Phe Ile Ala Ile Asn Cys Ala Ala Leu Pro Glu Asn
195 200 205
Leu Ile Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Glu Pro Gly Ala Phe Pro Gly
210 215 220
Ala Ile Arg Pro Arg Tyr Gly Lys Phe Glu His Gly Arg Gly Gly Thr
225 230 235 240
Ile Leu Leu Asp Glu Ile Gly Ser Met Pro Phe Asp Leu Gln Ala Lys
245 250 255
Phe Leu Arg Val Leu Gln Glu Arg Val Ile Thr Arg Leu Gly Ser Asn
260 265 270
Glu Gln Val Pro Leu Asp Val Arg Phe Ile Ala Thr Ser Lys Val Asp
275 280 285
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Gly Arg Phe Arg Ala Asp Leu Leu Tyr
290 295 300
Arg Leu Asn Val Ala Thr Leu Arg Val Pro Ser Leu Ala Gln Arg Arg
305 310 315 320
Ala Asp Ile Pro Leu Leu Phe Leu Gln Leu Val Arg Glu Ser Ala Ala
325 330 335
Arg Tyr Gly Arg Asp Glu Val Glu Ile Ser Gln Ser Met Leu Ala Glu
340 345 350
Ile Ala Glu Arg Asp Trp Pro Gly Asn Val Arg Glu Leu Arg Asn Ala
355 360 365
Ala Glu Arg Leu Val Leu Gly Leu Asp Ala Ala Pro Asp Asp Ser Ala
370 375 380
Arg Ser Glu Asn Gly Asn Arg Leu Ala Asp Lys Val Ala Ala Tyr Glu
385 390 395 400
Lys Gly Leu Ile Ala Ser Ala Ile Ala Ala His Gly Gly Ala Leu Lys
405 410 415
Pro Val Tyr Glu Thr Leu Gly Ile Ser Arg Lys Thr Leu Tyr Glu Lys
420 425 430
Met Gln Lys Phe Gly Leu Asp Lys Lys Leu Val Ala Ser Asp Phe Ser
435 440 445
Ala Glu Asn Glu Thr
450
<210> 5
<211> 1362
<212> DNA
<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 5
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caggcgctcg agctggccgg tttccgcgtc gatgccttct cggccgccga acacgcgctc 120
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ttcgtcgaga agcccttcgc agcgcagatg ctcgccggca cgatccgccg ggcactggac 360
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aactgcgccg cactgcccga aaacctgatc gaaagcgagc tcttcggcca tgagcccggc 660
gcctttcccg gcgccatccg tccgcgctac ggcaagttcg aacatggtcg cggcggtacg 720
atcctgctcg acgagattgg ctcgatgccc ttcgacctcc aggcaaagtt tctgcgggtg 780
ctgcaggaac gcgtcatcac ccggctcgga tcgaacgagc aggtcccgct cgacgtccgt 840
ttcatcgcca ccagcaaggt cgatctcgaa aaggaagtcg ccgccgggcg cttccgggcg 900
gacctcctct atcgcctcaa cgtcgcgacg ctccgcgtcc cctcgcttgc ccagcggcgc 960
gccgacattc cgctgctctt tctgcaactg gtcagggagt cggccgctcg ctacggccgg 1020
gatgaggtgg agatctccca atcgatgctg gccgaaatcg ccgagcgcga ctggccgggc 1080
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<211> 453
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<213> Sinorhizobium meliloti
<400> 6
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1 5 10 15
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Leu Pro Gly Arg Ser Gln Val Met Val Asp Leu Arg Tyr Arg Ile Arg
145 150 155 160
Ala Leu Gly Ala Ala Asp Ala Asp Thr Leu Ile Ile Gly Asp Thr Gly
165 170 175
Val Gly Lys Glu Val Leu Ala Arg Thr Leu His Asp Leu Ser Thr Arg
180 185 190
Ala Asn Ser Pro Phe Ile Ala Ile Asn Cys Ala Ala Leu Pro Glu Asn
195 200 205
Leu Ile Glu Ser Glu Leu Phe Gly His Glu Pro Gly Ala Phe Pro Gly
210 215 220
Ala Ile Arg Pro Arg Tyr Gly Lys Phe Glu His Gly Arg Gly Gly Thr
225 230 235 240
Ile Leu Leu Asp Glu Ile Gly Ser Met Pro Phe Asp Leu Gln Ala Lys
245 250 255
Phe Leu Arg Val Leu Gln Glu Arg Val Ile Thr Arg Leu Gly Ser Asn
260 265 270
Glu Gln Val Pro Leu Asp Val Arg Phe Ile Ala Thr Ser Lys Val Asp
275 280 285
Leu Glu Lys Glu Val Ala Ala Gly Arg Phe Arg Ala Asp Leu Leu Tyr
290 295 300
Arg Leu Asn Val Ala Thr Leu Arg Val Pro Ser Leu Ala Gln Arg Arg
305 310 315 320
Ala Asp Ile Pro Leu Leu Phe Leu Gln Leu Val Arg Glu Ser Ala Ala
325 330 335
Arg Tyr Gly Arg Asp Glu Val Glu Ile Ser Gln Ser Met Leu Ala Glu
340 345 350
Ile Ala Glu Arg Asp Trp Pro Gly Asn Val Arg Glu Leu Arg Asn Ala
355 360 365
Ala Glu Arg Leu Val Leu Gly Leu Asp Ala Ala Pro Asp Asp Ser Ala
370 375 380
Arg Ser Glu Asn Gly Asn Arg Leu Ala Asp Lys Val Ala Ala Tyr Glu
385 390 395 400
Lys Gly Leu Ile Ala Ser Ala Ile Ala Ala His Gly Gly Ala Leu Lys
405 410 415
Pro Ala Tyr Glu Thr Leu Gly Ile Ser Arg Lys Thr Leu Tyr Glu Lys
420 425 430
Met Gln Lys Phe Gly Leu Asp Lys Lys Leu Val Ala Ser Asp Phe Ser
435 440 445
Ala Glu Asn Glu Thr
450
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> Ensifer adhaerens
<400> 7
caaacagacc gggatatgcg ggtattcttc cgccgcgccg aggatgaggt ggcgcaggaa 60
cgcgtcaccg gcataggagc gggcgccacg gcttgcctga aggatgaccg ggctgtcggt 120
cgcatcggcg gcgcgcatga cggcctgaat gtattccaga ttgttcacat tgaacgccgg 180
cagcgcgtaa tcgttctccg ccgcatggtc gagcagttgc cgcaatgtga tcaatgccat 240
tcgctatctc cctttggata ctcggtgcaa cctatgcggc gcaccacaaa aacaatccgg 300
ccgttgaacc gcacgaaatg catcgatggc aaagtcgatg gccggctttt tcgtgcggcg 360
tgacggcgcg cgcgaattgg tcgcgcccac cgaagtcagg cgcacaatag ttcatcgaag 420
tggtttgaca accgggcaaa aggcaggttg ccagaggtcg aaactcgctt caatcgattt 480
tactgtggac tggatgcaac accttcagtg tgaagtgttt tcactttctg gtggtgcctg 540
agaggagggg gagtcgaggg cagtggatgc aaccattggg cgctgatttt gtctgttaca 600
ccatcgtggt ggatgccctg tcggaaacag tctgtcgaca ggaggtgaac gtcccgcaag 660
aagattgcgg caacgcccct ctttctttgc gcagattacg taaactgccg ctaaaattca 720
caaactttgc atcgcggatg attcgaggct caatccggcc gacaaaaagc gcggacctaa 780
aacgttgcag tagatttcgc aaaaatgccc tgttcacgtc atatgcccgt cgcaaaggcg 840
acgaaaagaa tcgcaaacaa aatacaacct atgggatagg ccgattcccc tcctatagat 900
aaagatgcag acagccgcag aatccgcctt gcgttcgcga acgatttgcg cttctctcct 960
gcgatcacaa acccaaaaca aggggaagga gagaaacaaa 1000

Claims (5)

1.一种双组分调控***编码基因在制备维生素B12中的应用，其特征在于，所述双组分调控***编码基因编码具有SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的多肽或SEQ IDNO：2和SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的多肽。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述双组分调控***编码基因具有SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：3所示核苷酸序列或SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，通过含有所述编码基因的表达载体导入苜蓿中华根瘤菌中进行过表达。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，苜蓿中华根瘤菌的保藏号为CGMCC NO.9638。
5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述导入的编码基因位于质粒或染色体中。
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