CN110923284A

CN110923284A - 一种核桃坚果香风味肽及其制备方法

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Publication number: CN110923284A
Application number: CN201911154287.2A
Authority: CN
Inventors: 荣瑞芬; 李汉洋
Original assignee: Beijing Union University
Current assignee: Beijing Union University
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-03-27
Anticipated expiration: 2039-11-22
Also published as: CN110923284B

Abstract

本发明涉及一种核桃坚果香风味肽及其制备方法。该方法以核桃粕为原料，经过核桃蛋白提取、酶解制备核桃多肽、超滤和凝胶层析分离纯化和冷冻干燥，得到所述核桃坚果香风味肽。此核桃坚果香风味肽氨基酸序列为SKHEETTPR、QQRPGEHGQQ、EEAVILPSPK、SVETWLPLPR、LAGNPDDEFRQE。利用本发明方法制备的核桃坚果香风味肽量效关系显著，以0.04％的比例添加到核桃乳中即产生明显的坚果香风味，且本发明补足了现有技术中关于核桃坚果香风味肽的研究空白。

Description

一种核桃坚果香风味肽及其制备方法

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，涉及一种食品风味肽及其制备方法，具体涉及一种核桃坚果香风味肽及其制备方法与应用。

背景技术

核桃为四大坚果之一，在我国广泛分布，目前干果产量已达到384.55万吨。核桃的营养价值不仅体现在富含优质的核桃油脂、抗氧化的多酚，而且蛋白质氨基酸组成18种氨基酸齐全，具有保健作用的谷氨酸、天冬氨酸、精氨酸含量丰富。核桃粕是核桃榨油后的副产物，通常作为饲料或低价值材料处理，造成营养价值极大浪费。核桃粕蛋白质含量在50％以上，是良好的核桃蛋白粉和制备核桃蛋白多肽的良好原料，生物活性肽和风味肽是近年来蛋白肽的研究热点，在核桃蛋白肽研究中，多以活性研究为主，核桃坚果香风味肽鲜有报道。研究表明核桃蛋白与多肽均表现出一定降糖、抗疲劳、降血压，抗肿瘤、提高运动和认知能力等功能作用。目前在核桃蛋白肽研究中，多以活性研究为主，核桃风味肽研究鲜有报道。

风味肽是一类分子量小于5000Da的多肽，风味肽根据呈味作用差异分为气味肽和滋味肽。气味肽是嗅闻到的风味肽，滋味肽是品尝到的风味肽，风味肽能使食品产生特有的风味，提升产品感官品质，增加消费者的购买欲望。核桃乳产品虽然营养价值高，但其口感风味平淡，不受消费者青睐。

因此，如何提升核桃乳产品的感官品质，通过增加核桃乳的风味使更多人能享受到核桃产品的营养，成为生产企业亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种核桃坚果香风味肽的制备方法，该制备方法以核桃粕为原料制备出核桃坚果香风味肽，一方面能充分利用核桃粕，使核桃粕的开发利用价值最优和最大化，另一方面能改善核桃乳产品的风味，提升消费者的消费信心。

本发明的另一目的在于提供一种上述核桃坚果香风味肽。

本发明的第三个目的在于提供一种添加上述核桃坚果香风味肽的核桃乳的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供一种带有坚果风味的核桃乳。

为了实现上述目的，本发明提供一种核桃坚果香风味肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)核桃蛋白提取

a.一次碱提：将提油后的核桃粕粉按1:6-10的质量体积比g/mL加水配成混悬液I，用质量百分比10％的碳酸钠溶液调pH至8.0-8.5，水浴温度50-60℃，搅拌浸提100-150min，4000r/min离心10-15min分离沉淀和上清液I；

b.二次碱提：沉淀按1:4的质量体积比g/mL加水配成混悬液II，用质量百分比10％的碳酸钠溶液调pH至8.0-8.5，水浴温度50-60℃搅拌浸提20-60min，4000r/min离心10-15min取上清液II；

一次碱提将多数蛋白溶解在上清液中，但核桃粕粉沉淀中仍有少量残余，因此进行第二次碱提，残余的蛋白量少，所以二次碱提时间少于一次碱提，通过两次碱提将核桃粕中的蛋白质尽可能全部提取出来。

c.合并上清液I和上清液II，加入质量浓度10％的盐酸溶液调pH至5.0-5.5，50-60℃水浴下静置90-150min，4000r/min离心10-15min，收集沉淀，水洗至中性，沉淀即为核桃蛋白，放于-20℃保存。

通过调整pH值使达到核桃蛋白等电点，核桃蛋白溶解度较小，可通过离心沉淀得到。

(2)核桃坚果香风味肽的制备

称取核桃蛋白，制成质量体积浓度(g/mL)为12％的水溶液，加入核桃蛋白质量0.67％的复合蛋白酶，用10％碳酸钠溶液调pH至8.2，酶解5.3h(5.30h＝318min)，酶解结束后升温至100℃灭酶20min，得到核桃蛋白多肽酶解液，冷藏备用。

(3)核桃坚果香风味肽的分离纯化

采用截留分子量5KDa和1KDa的超滤膜对核桃蛋白多肽酶解液进行分子截留，得到分子量在1-5KDa的组分，将该分子量在1-5KDa的组分采用凝胶层析进行分离，收集洗脱时间在135-163min时间段的组分，用高效液相质谱联用测试得到含有SKHEETTPR、QQRPGEHGQQ、EEAVILPSPK、SVETWLPLPR、LAGNPDDEFRQE的核桃坚果香风味肽。

更进一步地，步骤(2)所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1：1的质量比配制而成。

更进一步地，步骤(3)中所述分子截留的方法为：将核桃蛋白多肽酶解液用5KDa的超滤膜分离得到>5KDa和<5KDa两个组分，再用1KDa的超滤膜将<5KDa的组分进行超滤，截留分子量为1-5KDa的组分。

本发明还提供一种采用上述制备方法制备的核桃坚果香风味肽，所述肽的氨基酸序列为SKHEETTPR、QQRPGEHGQQ、EEAVILPSPK、SVETWLPLPR、LAGNPDDEFRQE。

本发明还提供一种带有坚果风味的核桃乳的制备方法，包括，将上述核桃坚果香风味肽以0.04％的质量体积比添加到核桃乳原浆中，并同时添加1.3％质量体积比的葡萄糖和2.7％质量体积比的蔗糖，在30MPa下均质10min，用高压杀菌锅通过升温至121℃，保持1min，然后自然冷却至室温即得到具有坚果香风味核桃乳。

更进一步地，所述核桃乳原浆的制备方法为：将核桃仁浸泡6h，去皮；将去皮的核桃仁和水按质量比1:25打浆至无残渣。

本发明还提供一种带有坚果风味的核桃乳，为采用上述制备方法制成。

本发明的特点在于：

本发明提供的桃坚果香风味肽通过对核桃蛋白浓度、加酶量、酶解温度、酶解pH、酶解时间等各个酶解条件进行单因素筛选，在这基础上经过响应面设计和优化酶解工艺参数，得到上述关键酶解工艺参数。由于不同的酶解条件得到的肽段是不一样的，采用本发明的特定制备方法可以得到特定的桃坚果香风味肽。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种核桃坚果香风味肽及其制备方法，该制备方法通过碱提酸沉法提取核桃蛋白，蛋白提取率高。使用复合蛋白酶制备核桃坚果香风味肽，以制备的核桃肽乳风味感官评分为响应值，确定最佳酶解工艺，获得的酶解条件能更精准的用于核桃坚果香风味肽的制备。采用截留分子量5KDa和1KDa的超滤膜制备核桃坚果香风味肽，为下一步色谱分离获得更纯的核桃坚果香风味肽提供了方便条件。

附图说明

图1为本发明提供的核桃坚果香风味肽的制备方法制备的核桃坚果香风味肽超滤分离组分感官评价结果图。

图2为本发明提供的核桃坚果香风味肽的制备方法制备的核桃坚果香风味肽的分子量1-5KDa组分的Sephadex G-25凝胶层析分离纯化图。

图3为本发明提供的核桃坚果香风味肽的制备方法制备的核桃坚果香风味肽的分子量1-5KDa组分的Sephadex G-25分离组分F1、F2、F3和F4的感官评价结果图。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例1核桃坚果香风味肽的制备

(1)核桃蛋白的提取：核桃蛋白质的提取采用碱溶酸沉法。

a.一次碱提：将提油后的核桃粕粉按1:8的料液比g/mL配成混悬液I，用质量百分比10％的碳酸钠溶液调pH至pH至8.0，水浴温度55℃，搅拌浸提120min，4000r/min离心10min分离沉淀和上清液I。

b.二次碱提：沉淀按1:4的料液比g/mL配成混悬液II，用质量百分比10％的碳酸钠溶液调pH至pH至8.0，水浴温度55℃搅拌浸提30min，4000r/min离心10min取上清。

c.合并上清液I和上清液II，加入质量浓度10％的盐酸溶液调pH至5.2，55℃水浴下静置120min，4000r/min离心10min，收集沉淀，水洗至中性，沉淀即为核桃蛋白，放于-20℃保存；

(2)核桃坚果香风味肽的制备

称取核桃蛋白，制成质量浓度为12％的水溶液，加入核桃蛋白质量0.67％的复合蛋白酶，用10％碳酸钠溶液调pH至8.2，酶解5.3h，酶解结束后升温至100℃灭酶20min，得到核桃蛋白多肽酶解液，冷藏备用；

其中，复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1：1的质量比配制而成。

(3)核桃坚果香风味肽的分离纯化

采用截留分子量5KDa和1KDa的超滤膜制备核桃坚果香风味肽，在25℃、0.3MPa条件下将核桃蛋白多肽酶解液用5KDa的超滤膜分离得到>5KDa和<5KDa两个组分，再用1KDa的超滤膜将<5KDa的组分进行超滤，截留分子量为1-5KDa和<1KDa的组分，最终将核桃蛋白多肽酶解液分为<1KDa、1-5KDa和>5KDa三个组分。

将各组分冷冻干燥成肽粉，放于-20℃保存。

(4)核桃坚果香风味肽感官评价

为评价核桃蛋白多肽酶解液不同组分的风味特性，将制成的不同组分肽粉添加到核桃乳中，对核桃乳进行感官评价。

核桃乳工艺：将核桃仁浸泡6h，去皮；将去皮的核桃仁和水按质量比1:25打浆至无残渣制得核桃乳原浆。

由于风味肽是核桃蛋白经植物蛋白水解酶酶解得到的肽段，而核桃仁中直接打浆的蛋白没有经过酶解，不含有核桃核桃坚果香风味肽。只有将酶解获得的风味肽添加到核桃乳中，按照表1配方添加甜味剂，在30MPa下均质10min，121℃下加热处理1min，再自然冷却至室温，进行感官评价。添加所述风味肽的核桃乳才会有坚果香，不添加风味肽的核桃乳无坚果香。

表1核桃乳配方

注：添加量(％)是以100mL核桃乳为100％来计算。

采用评分法进行感官评定，对添加有不同大小肽组分的坚果香风味的核桃乳的色泽、风味、组织状态、滋味为评价指标。请10位具有相关专业知识和经验且经过感官评价培训的食品专业人员组成感官评定小组(男女比例1:1)，按照感官评分细则打分，取平均值作为最后的感官评分(百分制)。

表2核桃乳坚果风味感官评价方法

最终感官评价结果如图1所示，可以看出，1-5KDa组分的感官评价得分最高，说明坚果香风味最浓郁的组分为1-5KDa组分。

(5)将分子量1-5KDa的组分进行凝胶层析分离：

方法为：将分子量为1-5KDa组分的肽粉用纯净水配制成浓度为40mg/mL的样品，用SephadexG-25进行凝胶层析分离，玻璃层析柱26mm×50cm，层析填料Sephadex G-25，流动相纯水，上样量2.0mL，洗脱液去离子水流速1.0mL/min。经过洗脱得到F1、F2、F3、F4四个组分，结果如图2所示。

将上述四个组分进行纯化，冷冻干燥制成肽粉，按照表1的配比和步骤(4)中核桃乳的制备方法制备成分别含有F1、F2、F3、F4组分的核桃乳，并按表2的感官评价标准进行感官评价，评价结果如图3所示。从图3可以看出，在F1、F2、F3、F4四个组分中，洗脱时间在135-163min时间段的F3组分评分最高，说明其带有最浓郁坚果风味的组分为F3组分。

(6)将F3组分进行高效液相质谱联用测定序列。

多肽结构采用美国Thermo公司的液高效液相质谱联用(LC-MS/MS)仪进行测定。采用甲醇和水作为体系的流动相，将F3组分多肽粉样品根据设备说明书要求浓度溶解于超纯水中，过0.22μm微孔滤膜后上样2.0μL。流动相A：含0.1％甲酸的水溶液，流动相B：80％乙腈和0.1％甲酸；流速：0.3uL/min。梯度洗脱条件如表3所示。

表3梯度洗脱条件

质谱条件：Q Exactive质谱仪使用Xcalibur 2.1.2软件在数据依赖性采集技术模式下操作，质谱全扫描范围：300～1800m/z，分辨率70000，全扫描后采集20次MS/MS相关数据，标准化碰撞能量(HCD)为27％。

通过高效液相质谱联用测定序列，可以得到F3组分中，氨基酸序列匹配度高的一组肽，其多肽序列结构分别为：SKHEETTPR(Seq ID No.1)、QQRPGEHGQQ(Seq ID No.1)、EEAVILPSPK(Seq ID No.3)、SVETWLPLPR(Seq ID No.4)、LAGNPDDEFRQE(Seq ID No.5)。上述5个7-12个氨基酸组成的小分子肽为核桃乳带来最浓郁的坚果风味，组成核桃坚果香风味肽。

当将上述核桃坚果香风味肽以0.04％的比例添加到核桃乳中，即可产生明显的坚果香风味，用于提升核桃乳的风味口感。

从上述实施例可以看出，本发明提供一种核桃坚果香风味肽及其制备方法，采用该方法制备的核桃坚果香风味肽，一方面可以利用榨油后的核桃粕的营养价值，提高了核桃粕的开发利用价值，另一方面提升了核桃乳产品的口感，丰富了产品的口味，提升了消费者的消费欲望。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京联合大学

<120> 一种核桃坚果香风味肽及其制备方法

<130> DEMO

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Ser Lys His Glu Glu Thr Thr Pro Arg

1 5

<210> 2

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gln Gln Arg Pro Gly Glu His Gly Gln Gln

1 5 10

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Glu Glu Ala Val Ile Leu Pro Ser Pro Lys

1 5 10

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Ser Val Glu Thr Trp Leu Pro Leu Pro Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Leu Ala Gly Asn Pro Asp Asp Glu Phe Arg Gln Glu

1 5 10

Claims

1.一种核桃坚果香风味肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)核桃蛋白提取

a.一次碱提：将提油后的核桃粕粉按1:6-10的质量体积比g/mL加水配成混悬液I，用10％碳酸钠溶液调pH至8.0-8.5，水浴温度50-60℃，搅拌浸提100-150min，4000r/min离心10-15min，得沉淀和上清液I；

b.二次碱提：将上述沉淀按1:4的质量体积比g/mL加水配成混悬液II，用10％碳酸钠溶液调pH至8.0-8.5，水浴温度50-60℃搅拌浸提20-60min，4000r/min离心10-15min取上清液II；

c.合并上清液I和上清液II，用质量浓度10％的盐酸溶液调pH至5.0-5.5，50-60℃水浴下静置90-150min，4000r/min离心10-15min，收集沉淀，水洗至中性，沉淀即为核桃蛋白，放于-20℃保存；

(2)核桃坚果香风味肽的制备

称取核桃蛋白，制成质量浓度为12％的水溶液，加入核桃蛋白质量0.67％的复合蛋白酶，用10％碳酸钠溶液调pH至8.0-8.5，酶解5.3h，酶解结束后升温至100℃灭酶20min，得到核桃蛋白多肽酶解液，冷藏备用；

(3)核桃坚果香风味肽的分离纯化

采用截留分子量5KDa和1KDa的超滤膜对核桃蛋白多肽酶解液进行分子截留，得到分子量在1-5KDa的组分，将该分子量在1-5KDa的组分采用凝胶层析进行分离，收集洗脱时间在135-163min时间段的组分，用高效液相质谱联用测试得到含有SKHEETTPR、QQRPGEHGQQ、EEAVILPSPK、SVETWLPLPR、LAGNPDDEFRQE的核桃坚果香风味肽，用60℃真空浓缩后冷冻干燥成肽粉。

2.如权利要求1所述的核桃坚果香风味肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述的复合蛋白酶为木瓜蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶按照木瓜蛋白酶：中性蛋白酶：碱性蛋白酶＝1：1：1的质量比配制而成。

3.如权利要求1所述的核桃坚果香风味肽的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述分子截留的方法为：将核桃蛋白多肽酶解液用5KDa的超滤膜分离得到>5KDa和<5KDa两个组分，再用1KDa的超滤膜将<5KDa的组分进行超滤，截留分子量为1-5KDa的组分。

4.一种采用如权利要求1-3任一项所述制备方法制备的核桃坚果香风味肽，其特征在于：所述肽的氨基酸序列为SKHEETTPR、QQRPGEHGQQ、EEAVILPSPK、SVETWLPLPR、LAGNPDDEFRQE。

5.一种带有坚果风味的核桃乳的制备方法，其特征在于，将权利要求1-4任一项所述核桃坚果香风味肽以0.04％的质量体积比添加到核桃乳原浆中，并同时添加1.3％质量体积比的葡萄糖和2.7％质量体积比的蔗糖，在30MPa下均质10min，用高压杀菌锅通过升温至121℃，保持1min，然后自然冷却至室温即得到具有坚果香风味核桃乳。

6.如权利要求5所述的带有坚果风味的核桃乳，其特征在于，所述核桃乳原浆的制备方法为：将核桃仁浸泡6h，去皮；将去皮的核桃仁和水按质量比1:25打浆至无残渣。

7.一种带有坚果风味的核桃乳，其特征在于，采用如权利要求5或6所述制备方法制成。