CN110923252A - 一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用 - Google Patents

一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用 Download PDF

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杜婷
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Abstract

本发明涉及一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。本发明优化的乙酰胆碱酯酶基因对低浓度的有机磷和氨基己酸酯类农药有显著的敏感性，可用于果蔬的农残检测，且操作简单、生产成本低，为研制农残检测产品提供了稳定灵敏的蛋白酶材料。该序列有利于通过基因工程大批量表达家蝇乙酰胆碱酯酶，且其编码的氨基酸序列不变，因而其酶学性质更加稳定并且接近生物提取的乙酰胆碱酯酶，对于降低成本及广泛应用提供了便利，具有很大的应用价值。

Description

一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用
技术领域
本发明属于基因生物工程技术领域，尤其是一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用。
背景技术
乙酰胆碱酯酶是生物神经传导的一种关键性酶，能降解乙酰胆碱，终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内的正常传递。
研究表明，多种化合物都可以抑制乙酰胆碱酯酶活性，其中有机磷和氨基甲酸酯类农药对其抑制效果明显。有机磷农药是我国使用广泛、用量最大的杀虫剂，果蔬中农药残留超标极易引起急性有机磷农药中毒，进一步引起心脏损害，甚至导致心源性猝死。我国作为果蔬生产和消费大国，农药残留问题不容忽视。因而不仅要严格控制农药使用量，还应当在预防和检测阶段做好工作，监督食用农产品安全。
目前农药残留检测主要有色谱检测法和快速检测法。色谱检测法测定结果的可靠性高，但是要求有较好的仪器设备，价格昂贵，测定步骤繁琐，要求检测人员具有专业水平，因此不便于对样品进行大批量粗检。快速检测法主要包括活体生物测定法、生物酶法、免疫检测法和速测灵法，其中生物酶法检测中的比色法，其灵敏度高，操作简便，检测快，可以检测多种残留农药，但是用于检测的乙酰胆碱酯酶易失活，不易生产和纯化。市售家蝇来源的乙酰胆碱酯酶纯度较低，电鳗鱼来源的乙酰胆碱酯酶酶活高但价格昂贵，如何制备性质稳定的乙酰胆碱酯酶同时降低生产成本是目前应当解决的一项问题。重组表达技术为这一问题的解决提供了一种有效的途径。但是目前利用原核***表达无法获得活性重组酶，利用真核***表达效率低。
通过检索，发现如下两篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
1、一种突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达(CN101712963A)，所述基因是在现有的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的氨基酸序列SEQ ID NO.1的第180、327和374三个位点发生氨基酸定点突变而得。所述基因编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，该基因能在酵母表达***中快速高效地获得表达。本发明的突变的乙酰胆碱酯酶基因对低浓度的有机磷及氨基甲酸酯农药具有显著的敏感性，可以用于农产品中农药残留的检测，为研制农药生物学检测产品提供更为灵敏的蛋白酶材料，具有很大的应用价值。
2、突变的家蝇乙酰胆碱酯酶基因及其表达载体(CN101709304A)，所述的突变的家蝇乙酰胆碱酯酶表达的蛋白与现有的SEQ IDNO.1氨基酸序列相比，发生第262、327和374三个位点的氨基酸取代。本发明得到的突变后的乙酰胆碱酯酶对低浓度的有机磷及氨基甲酸酯农药具有显著的敏感性，可以用于农产品中农药残留的检测，为研制农药生物学检测产品提供更为灵敏的蛋白酶材料，具有很大的应用价值。
通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术环境胁迫问题的不足之处，提供一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用，该家蝇乙酰胆碱酯酶灵敏度高且稳定，可以作为快速检测方法所需的酶源，其编码的蛋白质具有稳定的酶学性质。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
而且，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在现有家蝇乙酰胆碱酯酶基因基础上进行了密码子优化，其能够编码具有乙酰胆碱酯酶活性的蛋白质。
而且，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在原始基因序列SEQ ID NO.1基础上进行了29个密码子的优化得到的，即ccg→cca cgc、cgg→cga gcg→gct tgc→tgt ata→atc。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因编码的氨基酸，所述氨基酸的序列为SEQ ID NO.2。
包含如上所述的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的表达载体。
包含如上所述的表达载体的真核表达细胞。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的制备方法。
而且，步骤如下：
⑴通过基因合成获得优化后基因序列；
⑵将编码具有乙酰胆碱酯酶基因的片段连接到质粒pPIC9K-His中，构建目的基因表达载体；
⑶将构建成功的质粒用SalⅠ进行酶切，电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，获得表达菌株；
⑷将验证正确的酵母菌株进行目的蛋白诱导表达；
⑸筛选表达量高的一菌株进行诱导时间、诱导剂浓度、培养基初始pH的诱导表达；
⑹根据上述优化条件进行目的蛋白诱导表达和分离。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白在农药检测中的应用。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的应用。
本发明取得的优点和积极效果为：
1、本发明重组家蝇乙酰胆碱酯酶灵敏度高且稳定，可以作为快速检测方法所需的酶源，其编码的蛋白质具有稳定的酶学性质。
2、本发明家蝇乙酰胆碱酯酶基因的序列来源于家蝇，其核苷酸序列包含1737个碱基，编码579个氨基酸。家蝇的核苷酸序列与SEQ ID NO.1相同，氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同；对SEQ ID NO.1序列进行了密码子优化，优化后的核苷酸序列与SEQ ID NO.3相同，即为本发明基因的序列，其编码和氨基酸序列同SEQ ID NO.2。本发明通过部分密码子优化，该序列能在巴斯德毕赤酵母表达***中快速高效地获得表达，且表达量提高1.3倍。本发明优化的乙酰胆碱酯酶基因对低浓度的有机磷和氨基己酸酯类农药有显著的敏感性，可用于果蔬的农残检测，且操作简单、生产成本低，为研制农残检测产品提供了稳定灵敏的蛋白酶材料。该序列有利于通过基因工程大批量表达家蝇乙酰胆碱酯酶，且其编码的氨基酸序列不变，因而其酶学性质更加稳定并且接近生物提取的乙酰胆碱酯酶，对于降低成本及广泛应用提供了便利，具有很大的应用价值。
3、本发明要解决的另一技术问题在于，优化蛋白诱导表达条件，包括诱导时间、诱导剂浓度及初始培养基浓度，以提高真核***中乙酰胆碱酯酶的表达量，为工业化生产提供可靠的技术支持，最大限度节约成本。
附图说明
图1为本发明中构建的4个重组质粒的验证结果图，其中(a)为菌落PCR结果图，(b)为质粒PCR结果图，(c)为双酶切验证结果图；
图2为本发明中酵母转化株基因组PCR的验证结果图，其中(a)为9个重组质粒酵母转化株图，(b)为2个空质粒酵母转化株图；
图3为本发明中高表达酵母转化子筛选结果图，其中，M：marker，1-9：实验株，10：空质粒转化株；
图4为本发明中优化诱导剂浓度时的蛋白表达量趋势图；
图5为本发明中优化诱导培养基初始pH时的蛋白表达量趋势图；
图6为本发明中目的蛋白纯化结果图，其中，M：marker，1：粗蛋白，2：纯化后。
具体实施方式
下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。
一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
较优地，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在现有家蝇乙酰胆碱酯酶基因基础上进行了密码子优化，其能够编码具有乙酰胆碱酯酶活性的蛋白质。
较优地，所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在原始基因序列SEQ ID NO.1基础上进行了29个密码子的优化得到的，即ccg→cca cgc、cgg→cga gcg→gct tgc→tgt ata→atc。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因编码的氨基酸，所述氨基酸的序列为SEQ ID NO.2。
包含如上所述的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的表达载体。
包含如上所述的表达载体的真核表达细胞。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的制备方法。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白在有机磷、氨基甲酸酯类农药检测中的应用。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白在农药检测中的应用。
如上所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的应用。
乙酰胆碱酯酶基因表达的蛋白一共有579个氨基酸，具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列，对应SEQ ID NO.1的核苷酸序列，即家蝇乙酰胆碱酯酶原始基因序列。
在SEQ ID NO.1核苷酸序列基础上，通过分析酵母偏好密码子，对SEQ ID NO.1核苷酸序列进行密码子优化获得适合酵母表达的家蝇乙酰胆碱酯酶优化基因，对应SEQ IDNO.3核苷酸序列。共进行了29个密码子的优化，分别为：ccg→cca cgc、cgg→cga gcg→gcttgc→tgt ata→atc。
上述优化密码子的家蝇乙酰胆碱酯酶基因表达蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)通过基因合成获得优化后基因序列；
2)将编码具有乙酰胆碱酯酶基因的片段连接到质粒pPIC9K-His中，构建目的基因表达载体；
3)将构建成功的质粒用SalⅠ进行酶切，电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，获得表达菌株；
4)将验证正确的酵母菌株进行目的蛋白诱导表达；
5)筛选表达量较高的一菌株进行诱导时间、诱导剂浓度、培养基初始pH的诱导表达；
6)根据上述优化条件进行目的蛋白诱导表达和分离。
具体地，相关制备如下：
一、家蝇乙酰胆碱酯酶基因序列的获得
以家蝇乙酰胆碱酯酶基因序列为基础，对29个稀有密码子进行优化，ccg→ccacgc、cgg→cga gcg→gct tgc→tgt ata→atc，
设计pPIC9K-His质粒引物：S2：5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’
A2：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’
将优化后的基因序列前后分别添加EcoRⅠ和NotⅠ酶切位点，与设计的引物序列送基因公司合成。
二、家蝇乙酰胆碱酯酶基因重组质粒AchE-pPIC9K-His的构建
提取含有家蝇乙酰胆碱酯酶基因的质粒和pPIC9K-His质粒，利用EcoRⅠ和NotⅠ对质粒进行双酶切，回收目标片段，用T4DNAligase进行连接，热击转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布在LB-kana平板上37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行PCR验证、双酶切验证并测序，PCR结果如图1，1％琼脂糖凝胶电泳结果显示均出现预期大小的条带，测序结果同样证明重组质粒构建成功。
三、重组表达菌株的构建
将重组质粒用SalⅠ进行单酶切，将80μL感受态细胞和20μL线性化质粒混匀，转入0.2cm预冷的电击杯中，电击转化后加入1mL预冷的山梨醇，混匀后转入1.5mL离心管中，每250μL涂布MD-G418平板上，28℃倒置培养3-5天。
挑取平板上单菌落，接种至5mLYPD液体培养基中，28℃、200rpm过夜培养，提取酵母基因组，利用质粒引物S2/A2进行PCR验证，酵母基因组PCR结果如图2，1％琼脂糖凝胶电泳显示均出现预期大小的条带。
四、家蝇乙酰胆碱酯酶基因的诱导表达
挑选10株阳性酵母转化子，接种于5mLBMGY培养基中，28℃、220rpm过夜培养；将过夜菌液以1％接种量转接至50mL BMGY培养基中，28℃、220rpm摇至OD600＝2-6，离心收集菌体转移至100mLBMMY培养基中，28℃、220rpm振荡培养6天，每24h添加1％甲醇，并分离1mL培养基，用等体积丙酮沉淀蛋白，SDS-PAGE检测。电泳显示，重组酵母在68kDa左右出现特异性条带，与目的蛋白大小相符(见图3)。
五、表达条件优化
挑选表达量较高的一株菌，进行表达条件的优化以提高蛋白表达量。
(1)首先优化诱导剂浓度。分别设置诱导剂浓度为0.5％、1％、1.5％、2％，按照上述诱导步骤进行诱导表达，诱导时间为96h时，蛋白表达量趋于平稳略有下降，停止表达(蛋白表达量趋势图如图4)。
(2)优化诱导培养基初始pH。分别设置培养基初始pH＝5、6、7，按照上述诱导步骤进行诱导表达，诱导时间为96h时，蛋白表达量趋于平稳略有下降，停止表达(蛋白表达量趋势图如图5)。
根据以上条件优化，得出：28℃、220rpm、诱导剂浓度2％、诱导培养基初始pH＝7、诱导时间72h为最佳诱导表达条件。
六、家蝇乙酰胆碱酯酶的纯化和活性测定
通过Ni-NTAHis Bind Resin对目的蛋白进行纯化，纯化效果如图6。利用乙酰胆碱酯酶活性检测试剂盒对表达的家蝇乙酰胆碱酯酶进行活性测定，纯化后酶活可到173.3U/mg。相关测定结果表明，重组家蝇乙酰胆碱酯酶对蔬菜样品中低浓度有机磷农药和氨基甲酸酯类农药均可以达到灵敏检测，检测结果见表1和表2。
表1小白菜样品在1μg/mL和5μg/mL农药浓度下测得的抑制率
Figure BDA0002281003700000071
表2青辣椒样品在1μg/mL和5μg/mL农药浓度下测得的抑制率
Figure BDA0002281003700000072
附：本发明中涉及的核苷酸序列和氨基酸序列如下：
SEQ ID NO.1
Figure BDA0002281003700000073
Figure BDA0002281003700000081
SEQ ID NO.2
Figure BDA0002281003700000082
Figure BDA0002281003700000091
Figure BDA0002281003700000101
SEQ ID NO.3
Figure BDA0002281003700000102
Figure BDA0002281003700000111
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因、蛋白和应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1737
<212> DNA/RNA
<213> 家蝇的核苷酸序列(Unknown)
<400> 1
cgcggtctct ttgccacact cgttatactg ttgcgcatgt cagcgctaac gtcagccatg 60
acagatcatc taacggttca aacgaccagc gggccagtac gcggacgttc ggttacagtt 120
cagggtcgcg atgtacacgt ctttaccggc attccgtatg ccaagccgcc cgttgatgat 180
ttgcgttttc gcaaacctgt acctgcagaa ccgtggcatg gtgtcctaga tgcaacacga 240
ctgccagcaa catgcgtaca ggagaggtat gagtacttcc ctggcttttc cggtgaggag 300
atgtggaatc ctaacacaaa tgtatctgaa gattgtttgt ttatgaatat atgggctccg 360
gcgaaggcaa gattacgaca tggtcgtgga accaatggtg gtgagtattc atctaaaacc 420
gatcaggacc atttaataca tagcgcaacg ccacagaaca ccacaaatgg tttgcctata 480
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gcagagatta tgtcggccgt gggcaatgtg atcgttgcct cgttccagta tcgactcggt 600
gcatttgggt ttctacatct ttcaccggtt atgccaggtt ttgaagaaga agctcccggc 660
aacgtgggcc tttgggatca ggccatggcc ttgcgttggc ttaaggagaa tgcccgtgca 720
tttggcggca atccggaatg gatgacgctg tttggtgaat cggctggttc gagttccgtg 780
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gccacaatga atgctccctg gagccacatg acatcagaga aggcggttga aattggtaaa 900
gctttggtaa atgactgtaa ctgtaatgcc tcattgttac cggaaaatcc acgagctgtc 960
atggcttgca tgcgacaggt tgatgcgaaa acaatttctg tccaacaatg gaacccatat 1020
tctggaattt taagttatcc ctcggcccca actatagatg gagcattctt gcccgcagat 1080
ccaatgacac tgttgaaaac agcagatctt agcggttacg atattctgat tggaaatgtt 1140
aaagatgaag gcacatattt tctgctctat gactttattg attatttcga taaggatgat 1200
gcgacatcat tgccacgcga taaatacctg gaaataatga ataatatttt ccaaaaagcc 1260
agtcaagcag aacgagaagc aattatcttc cagtacacaa gttgggaggg taatccaggc 1320
taccagaatc agcaacaaat tggacgagct gtgggtgatc actttttcac ctgtcccaca 1380
aatgaatatg cccaggcatt ggccgaacga ggtgcttcag tgcattatta ttatttcaca 1440
catcgtacca gcacctcatt gtggggcgaa tggatgggtg tcttgcacgg cgatgaaatt 1500
gaatatttct tcggtcagcc attgaacaat tcactgcaat atcgacctgt ggaacgagaa 1560
ttaggcaaac gtatgctcaa ttctgtgatt gaatttgcca aatctggcaa ccctgccgtt 1620
ggtggcgaag aatggcccaa tttctccaag gaagatcccg tttactatgt cttcagtaca 1680
gatgaaaaaa ttgaaaagct acaaagaggt ccattggcca aacgatgctc attctgg 1737
<210> 2
<211> 579
<212> PRT
<213> 家蝇乙酰胆碱酯酶基因编码的氨基酸(Unknown)
<400> 2
Ala Gly Leu Pro Ala Thr Leu Val Ile Leu Leu Ala Met Ser Ala Leu
1 5 10 15
Thr Ser Ala Met Thr Ala His Leu Thr Val Gly Thr Thr Ser Gly Pro
20 25 30
Val Ala Gly Ala Ser Val Thr Val Gly Gly Ala Ala Val His Val Pro
35 40 45
Thr Gly Ile Pro Thr Ala Leu Pro Pro Val Ala Ala Leu Ala Pro Ala
50 55 60
Leu Pro Val Pro Ala Gly Pro Thr His Gly Val Leu Ala Ala Thr Ala
65 70 75 80
Leu Pro Ala Thr Cys Val Gly Gly Ala Thr Gly Thr Pro Pro Gly Pro
85 90 95
Ser Gly Gly Gly Met Thr Ala Pro Ala Thr Ala Val Ser Gly Ala Cys
100 105 110
Leu Pro Met Ala Ile Thr Ala Pro Ala Leu Ala Ala Leu Ala His Gly
115 120 125
Ala Gly Thr Ala Gly Gly Gly Thr Ser Ser Leu Thr Ala Gly Ala His
130 135 140
Leu Ile His Ser Ala Thr Pro Gly Ala Thr Thr Ala Gly Leu Pro Ile
145 150 155 160
Leu Ile Thr Ile Thr Gly Gly Gly Pro Met Thr Gly Ser Ala Thr Leu
165 170 175
Ala Ile Thr Ala Ala Gly Ile Met Ser Ala Val Gly Ala Val Ile Val
180 185 190
Ala Ser Pro Gly Thr Ala Leu Gly Ala Pro Gly Pro Leu His Leu Ser
195 200 205
Pro Val Met Pro Gly Pro Gly Gly Gly Ala Pro Gly Ala Val Gly Leu
210 215 220
Thr Ala Gly Ala Met Ala Leu Ala Thr Leu Leu Gly Ala Ala Ala Ala
225 230 235 240
Pro Gly Gly Ala Pro Gly Thr Met Thr Leu Pro Gly Gly Ser Ala Gly
245 250 255
Ser Ser Ser Val Ala Ala Gly Leu Met Ser Pro Val Thr Ala Gly Leu
260 265 270
Val Leu Ala Gly Met Met Gly Ser Ala Thr Met Ala Ala Pro Thr Ser
275 280 285
His Met Thr Ser Gly Leu Ala Val Gly Ile Gly Leu Ala Leu Val Ala
290 295 300
Ala Cys Ala Cys Ala Ala Ser Leu Leu Pro Gly Ala Pro Ala Ala Val
305 310 315 320
Met Ala Cys Met Ala Gly Val Ala Ala Leu Thr Ile Ser Val Gly Gly
325 330 335
Thr Ala Pro Thr Ser Gly Ile Leu Ser Thr Pro Ser Ala Pro Thr Ile
340 345 350
Ala Gly Ala Pro Leu Pro Ala Ala Pro Met Thr Leu Leu Leu Thr Ala
355 360 365
Ala Leu Ser Gly Thr Ala Ile Leu Ile Gly Ala Val Leu Ala Gly Gly
370 375 380
Thr Thr Pro Leu Leu Thr Ala Thr Ile Ala Thr Pro Ala Leu Ala Ala
385 390 395 400
Ala Thr Ser Leu Pro Ala Ala Leu Thr Leu Gly Ile Met Ala Ala Ile
405 410 415
Pro Gly Leu Ala Ser Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ile Ile Pro Gly Thr
420 425 430
Thr Ser Thr Gly Gly Ala Pro Gly Thr Gly Ala Gly Gly Gly Ile Gly
435 440 445
Ala Ala Val Gly Ala His Pro Pro Thr Cys Pro Thr Ala Gly Thr Ala
450 455 460
Gly Ala Leu Ala Gly Ala Gly Ala Ser Val His Thr Thr Thr Pro Thr
465 470 475 480
His Ala Thr Ser Thr Ser Leu Thr Gly Gly Thr Met Gly Val Leu His
485 490 495
Gly Ala Gly Ile Gly Thr Pro Pro Gly Gly Pro Leu Ala Ala Ser Leu
500 505 510
Gly Thr Ala Pro Val Gly Ala Gly Leu Gly Leu Ala Met Leu Ala Ser
515 520 525
Val Ile Gly Pro Ala Leu Ser Gly Ala Pro Ala Val Gly Gly Gly Gly
530 535 540
Thr Pro Ala Pro Ser Leu Gly Ala Pro Val Thr Thr Val Pro Ser Thr
545 550 555 560
Ala Gly Leu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Pro Leu Ala Leu Ala Cys
565 570 575
Ser Pro Thr
<210> 3
<211> 1737
<212> DNA/RNA
<213> 家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列(Unknown)
<400> 3
cgaggtctct ttgccacact cgttatcctg ttgcgaatgt cagctctaac gtcagccatg 60
acagatcatc taacggttca aacgaccagc gggccagtac gaggacgttc ggttacagtt 120
cagggtcgag atgtacacgt ctttaccggc attccatatg ccaagccacc cgttgatgat 180
ttgcgttttc gaaaacctgt acctgcagaa ccatggcatg gtgtcctaga tgcaacacga 240
ctgccagcaa catgtgtaca ggagaggtat gagtacttcc ctggcttttc cggtgaggag 300
atgtggaatc ctaacacaaa tgtatctgaa gattgtttgt ttatgaatat ctgggctcca 360
gctaaggcaa gattacgaca tggtcgtgga accaatggtg gtgagtattc atctaaaacc 420
gatcaggacc atttaatcca tagcgcaacg ccacagaaca ccacaaatgg tttgcctatc 480
ttaatctgga tttatggcgg tggctttatg actggctcag ccacattgga catttacaac 540
gcagagatta tgtcggccgt gggcaatgtg atcgttgcct cgttccagta tcgactcggt 600
gcatttgggt ttctacatct ttcaccagtt atgccaggtt ttgaagaaga agctcccggc 660
aacgtgggcc tttgggatca ggccatggcc ttgcgttggc ttaaggagaa tgcccgtgca 720
tttggcggca atccagaatg gatgacgctg tttggtgaat cggctggttc gagttccgtg 780
aatgctcaac tgatgtcgcc agtaacgcgt ggcctggtca aacgtggcat gatgcagtcg 840
gccacaatga atgctccctg gagccacatg acatcagaga aggctgttga aattggtaaa 900
gctttggtaa atgactgtaa ctgtaatgcc tcattgttac cagaaaatcc acgagctgtc 960
atggcttgta tgcgacaggt tgatgctaaa acaatttctg tccaacaatg gaacccatat 1020
tctggaattt taagttatcc ctcggcccca actatcgatg gagcattctt gcccgcagat 1080
ccaatgacac tgttgaaaac agcagatctt agcggttacg atattctgat tggaaatgtt 1140
aaagatgaag gcacatattt tctgctctat gactttattg attatttcga taaggatgat 1200
gctacatcat tgccacgaga taaatacctg gaaatcatga ataatatttt ccaaaaagcc 1260
agtcaagcag aacgagaagc aattatcttc cagtacacaa gttgggaggg taatccaggc 1320
taccagaatc agcaacaaat tggacgagct gtgggtgatc actttttcac ctgtcccaca 1380
aatgaatatg cccaggcatt ggccgaacga ggtgcttcag tgcattatta ttatttcaca 1440
catcgtacca gcacctcatt gtggggcgaa tggatgggtg tcttgcacgg cgatgaaatt 1500
gaatatttct tcggtcagcc attgaacaat tcactgcaat atcgacctgt ggaacgagaa 1560
ttaggcaaac gtatgctcaa ttctgtgatt gaatttgcca aatctggcaa ccctgccgtt 1620
ggtggcgaag aatggcccaa tttctccaag gaagatcccg tttactatgt cttcagtaca 1680
gatgaaaaaa ttgaaaagct acaaagaggt ccattggcca aacgatgttc attctgg 1737
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> pPIC9K-His质粒引物：S2(Unknown)
<400> 4
gactggttcc aattgacaag c 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> pPIC9K-His质粒引物：A2(Unknown)
<400> 5
gcaaatggca ttctgacatc c 21

Claims (10)

1.一种经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于：所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
2.根据权利要求1所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于：所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在现有家蝇乙酰胆碱酯酶基因基础上进行了密码子优化，其能够编码具有乙酰胆碱酯酶活性的蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因，其特征在于：所述家蝇乙酰胆碱酯酶基因是在原始基因序列SEQ ID NO.1基础上进行了29个密码子的优化得到的，即ccg→cca cgc、cgg→cga gcg→gct tgc→tgt ata→atc。
4.如权利要求1至3任一项所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因编码的氨基酸，其特征在于：所述氨基酸的序列为SEQ ID NO.2。
5.包含如权利要求1至3任一项所述的家蝇乙酰胆碱酯酶基因的表达载体。
6.包含如权利要求5所述的表达载体的真核表达细胞。
7.如权利要求1至3任一项所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的制备方法。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：步骤如下：
⑴通过基因合成获得优化后基因序列；
⑵将编码具有乙酰胆碱酯酶基因的片段连接到质粒pPIC9K-His中，构建目的基因表达载体；
⑶将构建成功的质粒用SalⅠ进行酶切，电击转入毕赤酵母GS115感受态细胞中，获得表达菌株；
⑷将验证正确的酵母菌株进行目的蛋白诱导表达；
⑸筛选表达量高的一菌株进行诱导时间、诱导剂浓度、培养基初始pH的诱导表达；
⑹根据上述优化条件进行目的蛋白诱导表达和分离。
9.如权利要求1至3任一项所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白在农药检测中的应用。
10.如权利要求1至3任一项所述的经过密码子优化的家蝇乙酰胆碱酯酶基因所表达的蛋白的应用。
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