CN110892082A

CN110892082A - 丙型肝炎病毒(hcv)的测定

Info

Publication number: CN110892082A
Application number: CN201880043313.1A
Authority: CN
Inventors: D·吐尔西; S·黄; H·苏; D·德拉普; W·卡米尼蒂; K·诺丁; S·阿尔斯兰; S·琼斯
Original assignee: Abbott Molecular Inc
Current assignee: Abbott Molecular Inc
Priority date: 2017-10-03
Filing date: 2018-10-03
Publication date: 2020-03-17
Also published as: US11021763B2; US20190100813A1; CA3068482A1; WO2019070854A1; EP3628060A1

Abstract

本公开涉及用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的方法、试剂盒和组合物，其包含正向寡核苷酸引物、反向寡核苷酸引物和寡核苷酸探针的多种组合。本公开采用双探针方法，并且该引物和探针结合至5′‑非编码区(UTR)的保守区。

Description

丙型肝炎病毒(HCV)的测定

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年10月3日提交的美国临时专利申请No.62/567,630的权益，其通过引用并入本文。

电子提交材料通过引用的合并

通过引用整体并入本文的是计算机可读的核苷酸/氨基酸序列表，其与本文同时提交并且标识如下：一份4,968字节ASCII(文本)文件，命名为“36071WO1ORD_ST25.txt”，其于2018年10月3日创建。

背景技术

如今，丙型肝炎病毒(HCV)被认为是与输血相关的非甲型、非乙型(NANB)肝炎的主要原因。HCV是一种单链阳性RNA病毒，与黄病毒和瘟病毒相似(Miller R.H.和PurcellR.H.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87：2057(1991)；和WeinerA.J.等，Virology，180：842(1990))。在全球范围内，估计有7100万人患有慢性丙型肝炎(世界卫生组织，丙型肝炎情况说明书，2017年7月)。

尽管HCV的急性表现一般较轻，只有25％的患者出现黄疸病，但仍有很大一部分(＞50％)的感染者继续发展为慢性肝炎，并伴有严重且可能危及生命的后遗症，例如肝硬化和肝细胞癌(Jove等，Liver，8：42(1990)；和Hopf等，Hepatology，10：69(1990))。每年约有399,000人死于丙型肝炎，其中大部分死于肝硬化和肝细胞癌(世界卫生组织，丙型肝炎情况说明书，2017年7月)。

当前，通过检测抗HCV抗体(通常针对HCV结构核心蛋白或非结构NS3蛋白质)然后通过PCR直接检测病毒RNA来诊断HCV感染。HCV的许多现有核酸测试(NAT)都使用单个探针来检测和定量HCV RNA。由于探针区域内的突变，这种单探针检测方法可能导致定量不足或检测不到一些罕见的HCV变体和新出现的变体。核酸测试通常也使用液体形式提供的PCR试剂进行，需要冷冻保存和分批测试，并且样品制备的周转时间和某些测试的实时PCR可能超过几个小时。NAT也易于出现诸如污染之类的错误，并且当病毒的初始峰值消失时，RNA的水平可能降至检测极限以下。

因此，仍然需要HCV检测方法和***，其(i)可靠地检测所有六种HCV基因型，(ii)以消除或减少储存需求和PCR试剂浪费的形式提供，以及(iii)可以快速进行。本公开提供了这样的方法和***。

发明内容

本公开提供了用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列的寡核苷酸序列的组，其包括：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；以及(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14，其中第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。还提供了一种使用上述寡核苷酸的组检测样品中人HCV的方法。

本公开还提供了用于检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的试剂盒，其包含：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ IDNO：2；(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3；(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4；(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；以及(f)使用说明，其中第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。

本公开进一步提供了一种组合物，其包含用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的寡核苷酸序列，其包含：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQID NO：5；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQID NO：8或SEQ ID NO：9；(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；以及(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4，SEQID NO：13或SEQ ID NO：14，其中第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。

具体实施方式

本公开提供了一组用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的寡核苷酸。如本文所用，术语“寡核苷酸”是指包含约2至约100个核苷酸的短核酸序列(例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99或100个核苷酸或任何上述值定义的范围)。本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)。这些术语指分子的一级结构，因此包括双链和单链DNA以及双链和单链RNA。该术语包括等价的由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸(例如甲基化和/或加帽的多核苷酸)制备的RNA或DNA的类似物。核酸通常通过磷酸酯键连接形成核酸序列或多核苷酸，尽管在本领域中许多其他键是已知的(例如硫代磷酸酯、硼酸磷酸酯等)。

寡核苷酸可以是单链或双链，或可以包含双链和单链序列的一部分。寡核苷酸可以是基因组和互补DNA(cDNA)的DNA、RNA或杂合体，其中的核酸可以包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合，以及包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶，鸟嘌呤，肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤的碱基的组合。寡核苷酸可通过化学合成方法或重组方法获得。特定的寡核苷酸序列可以包括其保守修饰的变体(例如，密码子取代)、等位基因、直向同源物、单核苷酸多态性(SNP)和互补序列以及明确指出的序列。

引物和探针寡核苷酸

寡核苷酸在生物技术中有多种应用，例如人工基因合成、聚合酶链反应(PCR)引物、DNA测序以及分子探针。在一个实施方案中，本文所述的寡核苷酸可用作核酸扩增的引物或核酸杂交和检测的探针。如本文所用，术语“引物”、“引物序列”和“引物寡核苷酸”是指当在核苷酸和核酸聚合试剂(例如，DNA依赖性或RNA依赖性聚合酶)的存在下置于合适的扩增条件(例如缓冲液、盐、温度和pH下)时能够充当作为核酸的互补链的引物延伸产物的合成的起始点的寡核苷酸(所有类型的DNA或RNA)。引物可以是单链或双链的。如果是双链的，则可以在用于制备延伸产物之前首先对引物进行处理(例如变性)以使其链分离。这种变性步骤通常使用加热进行，但也可以使用碱进行，然后进行中和。本公开的引物可以具有任何合适的大小，并且理想地包含、基本由或由约15至50个核苷酸、优选地约20至40个核苷酸、更优选地约22至30个核苷酸组成。除了本文所述的那些之外，本公开的引物还可包含其他核苷酸。例如，取决于所采用的扩增过程的类型，引物可包括例如靶结合序列的5′限制性核酸内切酶识别位点(参见，例如，美国专利5,270,184和5,455,166)，或与引物的靶结合序列连接的RNA聚合酶启动子。“正向引物”是与靶核酸序列(例如模板链)杂交(或退火)以进行扩增的引物。“反向引物”是在扩增过程中与靶序列的互补链杂交(或退火)的引物。正向引物相对于反向引物与靶序列5′杂交。

术语“探针”、“探针序列”和“探针寡核苷酸”是指可以在适当的扩增条件下选择性地与靶序列的至少一部分选择性杂交的寡核苷酸(例如，已被扩增的靶序列的一部分)。通常，探针序列被识别为“互补”(即与编码或有义链(+)互补)或“反向互补”(即，与反义链(-)互补)。本公开的探针可以具有任何合适的大小，并且理想地包含、基本由或由约10-50个核苷酸、优选约12-35个核苷酸、更优选约14-25个核苷酸组成。

如本文所用，术语“组”、“引物组”、“探针组”和“引物和探针组”是指两种或更多种寡核苷酸引物，它们一起能够引发靶序列或靶核酸的扩增。感兴趣的核酸(例如，带有HCV的靶序列)和/或至少一种可以检测靶序列或靶核酸的探针。在某些实施方案中，术语“引物组”是指一对引物，其包括与要扩增的靶序列或靶核酸的5′-端杂交的正向引物(或5′(上游)引物)或与要扩增的靶序列或靶核酸的互补序列杂交的反向引物(或3′(下游)引物)。这样的引物组或引物对在PCR扩增反应中特别有用。

本文所述的寡核苷酸组可用于扩增和检测样品中的靶标HCV核酸序列。术语“靶序列”和“靶核酸”在本文可互换使用，并且是指特定核酸序列，其存在或不存在将通过所公开的方法检测，在本公开的上下文中，靶标序列优选包括一种或多种引物将与之杂交并从其开始扩增的核酸序列。靶序列还可以包括探针杂交区域，探针可以在适当的扩增条件下与之形成稳定的杂交体。靶序列可以是单链或双链的。本文所述的引物和探针序列可以靶向HCV基因组中存在的任何合适的核酸序列或序列的组合。HCV基因组是长度约9.5kb的单链正向RNA分子，编码单个多蛋白，在其5′和3′末端均带有非翻译区(UTR)(Clarke，B.，J.Gen.Virol.，78：2397-410(1997))。5′和3′UTR不会翻译成蛋白质，但对于病毒RNA的翻译和复制很重要。特别地，5′UTR包含启动HCV多蛋白翻译的核糖体结合位点。HCV的核心、E1和E2基因编码结构蛋白，而HCV的NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B基因编码非结构蛋白。HCV多蛋白被细胞和病毒蛋白酶切割成10个较小的蛋白，从而允许病毒在宿主细胞内复制并组装成成熟的病毒颗粒(Dubuisson，J.，WorldJ.Gastroenterol，13(17)：2406-15(2007))。全球已鉴定出HCV的至少六种基因型和67种以上亚型，它们通常在编码区域彼此相差至少约15％(Echeverria等，WorldJ.Hepatol.，7(6)：931-845(2015))。

本文描述的寡核苷酸组可包含、基本上由或由任何数目的引物和探针寡核苷酸组成，以便扩增和检测任何合适数目的HCV核酸序列。在一个实施方案中，本文所述的一组寡核苷酸包含、基本上由或由两个或更多个引物组成，所述引物扩增HCV基因组的5′UTR的至少一部分以产生单个HCV扩增子，以及两个或更多个探针，其与单个HCV扩增子的两个不同区域杂交。核酸序列的“部分”包含至少十个核苷酸(例如，约10至约5000个核苷酸)。优选地，核酸序列的“部分”包含10或更多(例如15或更多、20或更多、25或更多、30或更多、35或更多、40或更多、45或更多、50或更多、或100或更多)的核苷酸，但少于5,000(例如4900或更少、4000或更少、3000或更少、2000或更少、1000或更少、800或更少、500或更少、300或更少或100或更少)的核苷酸。如本文所用，术语“扩增子”是指天然或人工扩增反应的产物。换句话说，与使用单个探针检测和定量HCV RNA的其他可商业获得的HCV核酸测试剂(例如，REALTIME^TM HCV(Abbott Molecular，Inc.，Des Plaines，IL)；

HCV Quant Dx(Hologic，Inc.，Marlborough，MA)；

HCV Assay(Beckman Coulter，Inc.，BreaCA)；以及

HCV Viral Load Assay(Cepheid，Sunnyvale，CA))相反，本文所述的寡核苷酸的组包括“双探针”的设计。在一个实施方案中，例如，第一靶标HCV核酸序列在HCV的5′UTR内包含高度保守的核酸序列。

在一个实施方案中，本文所述的一组寡核苷酸包含、基本上由以下组成或由以下组成：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9；(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；以及(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14。例如，该组寡核苷酸可包含：包含SEQ ID NO：1的正向引物寡核苷酸序列；包含SEQ ID NO：2的反向引物寡核苷酸序列；包含SEQ ID NO：3的第一探针寡核苷酸序列；和包含SEQ ID NO：4的第二探针寡核苷酸序列(也称为ALINITY m^TM HCV)。

可以以任何合适的方式修饰本文描述的寡核苷酸的任何一种或组合，以稳定或增强引物或探针寡核苷酸与其靶标的结合亲和力(也称为“解链温度”或“T_m”)。在这方面，本文所述的寡核苷酸序列可包含一个或多个修饰的寡核苷酸碱基。例如，寡核苷酸序列可以包含一个或多个丙炔修饰的碱基，其中寡核苷酸包含化学式为CH₃C三CH的炔烃。一种或多种丙炔基修饰的碱可以包括例如5-(1-丙炔基)-2′-脱氧尿苷(pdU)和/或5-(1-丙炔基)-2′-脱氧胞苷(pdC)。在一个实施方案中，例如，包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列的第一寡核苷酸探针可以包含pdC-pdC-pdU-pdU-G-pdU-G-G-pdU-A-pdC-pdU-G-pdC-pdC-pdU-G(SEQID NO：22)的丙炔修饰序列。

本文描述的任何寡核苷酸序列可包含、基本上由或由本文公开的任何序列的互补物组成。本文所用的术语“互补”或“互补序列”是指通过Watson-Crick碱基配对规则与本文描述的寡核苷酸形成稳定双链体的核酸序列，并且通常与公开的寡核苷酸序列共享高于约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的同一性。核酸序列同一性可以使用本领域已知的任何合适的数学算法或计算机软件来确定，例如，CLUSTAL-W、T-Coffee和ALIGN(用于核酸和氨基酸序列的比对)、BLAST程序(例如BLAST 2.1、BL2SEQ及其更高版本)和FASTA程序(例如FASTA3×、FASTM和SSEARCH)(用于序列比对和序列相似性检索)。序列比对算法还公开于例如Altschul等，J.Molecular Biol.，215(3)：403-410(1990)；Beigert等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，106(10)：3770-3775(2009)，Durbin等编著，Biological Sequence Analysis：Probalistic Models of Proteins and NucleicAcids，Cambridge University Press，Cambridge，UK(2009)；Soding，Bioinformatics，21(7)：951-960(2005)；Altschul等，Nucleic Acids Res.，25(17)：3389-3402(1997)；以及Gusfield，Algorithms onStrings，Trees and Sequences，Cambridge University Press，Cambridge UK(1997))。

可以使用任何合适的方法来制备本文所述的寡核苷酸，多种所述方法在本领域中是已知的(例如，参见Sambrook等，Molecular Cloning.A Laboratory Manual，1989，2.Supp.Ed.，Cold Spring Harbour Laboratory Press：New York，N.Y.；M.A.Innis(Ed.)，PCR Protocols.A Guide to Methods and Applications，Academic Press：New York，N.Y.(1990)；P.Tijssen，Hybridization with Nucleic Acid Probes-LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology(第I和II部分)，ElsevierScience(1993)；M.A.Innis(Ed.)，PCR Strategies，Academic Press：New York，N.Y.(1995)；以及F. M.Ausubel(Ed.)，Short Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons：Secaucus，N.J.(2002)；Narang等，Meth.Enzymol.，68：90-98(1979)；Brown等，Meth.Enzymol.，68：109-151(1979)；以及Belousov等，Nucleic Acids Res.，25：3440-3444(1997))。引物对也可以使用多种工具进行设计，例如由美国国家生物技术信息中心(NCBI)提供的Primer-BLAST工具。寡核苷酸合成可以在寡核苷酸合成仪上进行，例如可从PerkinElmer/Applied Biosystems，Inc.(Foster City，CA)、DuPont(Wilmington，DE)、或Milligen(Bedford，MA)商购获得的寡核苷酸合成仪。可选地，可以定制寡核苷酸并从本领域众所周知的多种商业来源获得，包括例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX)、Eurofins Scientific(Louisville，KY)、BioSearch Technologies，Inc.(Novato，CA)等。寡核苷酸可以使用本领域已知的任何合适方法来纯化，例如天然丙烯酰胺凝胶电泳、阴离子交换HPLC(参见例如Pearson等，J.Chrom.，255：137-149(1983))和反相HPLC(参见例如McFarland等，Nucleic Acids Res.，7：1067-1080(1979))。

可以使用本领域已知的任何合适的测序方法来验证引物和探针的序列，包括但不限于化学降解(参见例如Maxam等，Methods of Enzymology，65：499-560(1980))、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALD1-TOF)质谱法(参见例如Pieles等，Nucleic Acids Res.，21：3191-3196(1993))、碱性磷酸酶和核酸外切酶消化的组合后进行质谱分析(Wu等，Anal.Biochem.，290：347-352(2001))等。

本文所述的引物和探针寡核苷酸理想地包含在45℃至80℃范围内的解链温度(TM)。根据本公开，寡核苷酸与靶标HCV核酸序列特异性杂交而不显示与非HCV核酸的显著杂交。另外，选择寡核苷酸以使其与HCV基因组中的保守区杂交，从而使与靶序列的错配最小化。这种选择确保了寡核苷酸能够与来自所有基因型和亚型的HCV核酸杂交。此外，选择寡核苷酸以使得它们显示出二聚体形成的可能性最小并且包含最少的序列重复。这样的性质可以通过本领域已知的方法来确定，例如使用计算机建模程序

PrimerAnalysis Software(由National Biosciences，Inc.，Plymouth，Minn.发行)。

可检测标记

本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个可以包含可检测标记，使得在结合到另一实体(例如，扩增产物或扩增子)之后可以使引物和/或探针可视化。如本文所用，术语“可检测标记”是指产生信号的部分或化合物，该信号可以被测量并且其强度与结合于其上的实体的量有关(例如，成比例)。可以使用可以缀合或连接至寡核苷酸以检测寡核苷酸与靶序列的结合的任何合适的可检测标记，其中许多是本领域已知的。在一个实施例中，可检测标记可以被间接检测。间接可检测标记通常是与“缀合物”结合使用的特异性结合成员，所述“缀合物”附着或偶联至可直接检测的标记。用于合成此类缀合物的偶联化学在本领域中是众所周知的，并且被设计为使得特异性结合成员的特异性结合特性和标记物的可检测特性保持完整。如本文所用，“特异性结合成员”和“缀合物”是指结合对的两个成员，即两个不同的分子，其中特异性结合成员特异性地与本发明的多核苷酸结合，并且“缀合物”特异性地结合至特定的结合成员。该对的两个成员之间的结合通常本质上是化学或物理的。此类结合对的实例包括但不限于抗原和抗体、抗生物素蛋白/抗生蛋白链菌素和生物素、半抗原和对半抗原特异的抗体、互补核苷酸序列、酶辅因子/底物和酶等。

在另一个实施方案中，可直接检测可检测标记。这样的可直接检测的标记包括，例如，放射性同位素、荧光团、化学发光团、酶、胶体颗粒、荧光微粒、嵌入染料(例如SYBRGreen或溴化乙锭)等。在一个实施方案中，可检测标记可以是荧光团，例如荧光素族染料、多卤代荧光素族染料、六氯荧光素族染料、香豆素族染料、罗丹明族染料、花菁族染料、噁嗪族染料、噻嗪族染料、方酸族染料、螯合镧系族染料、偶氮族染料、三苯基甲烷族染料或

族染料。荧光团的实例包括但不限于FAM^TM、HEX^TM、JOE^TM、NED^TM、

ROX^TM、TAMRA^TM、TET^TM、TEXAS

和

本领域的技术人员将理解，可直接检测的标记可能需要其他成分，例如底物、触发试剂、光等，以能够检测标记。标记寡核苷酸如探针的方法是本领域众所周知的，并描述于例如L.J.Kricka，Ann.Clin.Biochem.，39：114-129(2002)；van Gijlswijk等，Expert Rev.Mol.Diagn.，1：81-91(2001)；Joos等，J.Biotechnol.，35：135-153(1994)；Smith等，Nucl.Acids Res.，13：2399-2412(1985)；Connoly等，Nucl.Acids.Res.，13：4485-4502(1985)；Broker等，Nucl.Acids Res.，5：363-384(1978)；Bayer等，Methods of Biochem.Analysis，26：1-45(1980)；Langer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，78：6633-6637(1981)；Richardson等，Nucl.Acids Res.，11：6167-6184(1983)；Brigati等，Virol.，126：32-50(1983)；Tchen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81：3466-3470(1984)；Landegent等，Exp.Cell Res.，15：61-72(1984)；A.H.Hopman等，Exp.Cell Res.，169：357-368(1987)；以及Temsamani等，Mol.Biotechnol.，5：223-232(1996)。

在另一个实施方案中，本文所述的引物和探针寡核苷酸序列中的任何一个或多个也可以包含猝灭剂部分。当可检测标记(例如，荧光团)和猝灭剂部分紧密靠近时，例如在探针的末端，猝灭剂部分阻止了来自可检测标记的信号(例如，荧光)的检测。当两个部分物理分离时，例如在被DNA聚合酶切割后，该信号变得可检测。淬灭剂可选自本领域已知的任何合适的淬灭剂，例如，BLACKHOLE

1(BHQ-

)、BLACK HOLE

2(BHQ-

)、IOWA

FQ以及IOWA

RQ。例如，寡核苷酸探针可以包含FAM荧光团和BHQ-1淬灭剂。

期望第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列均包含可检测标记。每个探针可以用相同的可检测标记物或不同的可检测标记物标记。当两个探针均包含相同的可检测标记物(例如FAM)时，在实时PCR过程中，HCV靶标序列的扩增被检测为单个信号。当每个探针包含不同的可检测标记时，HCV靶标序列的扩增被检测为两个单独的信号。

具体标记技术的选择取决于多个因素，例如标记方法的简便性和成本、所使用的不同可检测标记之间的光谱间隔、所需样品标记的质量、可检测部分对杂交反应的影响(例如，涉及杂交过程的速率和/或效率)、所用扩增方法的性质、检测***的性质、由可检测标记物产生的信号的性质和强度等。

内置对照

上述用于检测HCV的寡核苷酸组可以进一步包含用于扩增和检测内置对照(IC)序列的引物和探针寡核苷酸序列。在一个实施方案中，将内置对照序列添加到每个样品制备反应中。然后通过整个样品制备和扩增程序以及测试样品和校准品(如果有)对内置对照进行处理，以证明样品处理正确和测定的有效性。内置对照可以是任何合适的非HCV核酸序列，包括例如编码GAPDH、β2-乳球蛋白、β-肌动蛋白、R18或16S RNA的核酸序列。在一些实施方案中，内置对照理想地包含装甲RNA靶序列、基本上由装甲RNA靶序列组成或由装甲RNA靶序列组成。如本文所用，术语“装甲RNA”指耐RNase的RNA，它是MS2噬菌体外壳蛋白与大肠埃希氏菌通过诱导编码外壳蛋白和RNA标准序列的表达质粒而产生的RA的复合物(参见例如Pasloske等，J.Clin.Microbiol.，36(12)：3590-359(1998)；和美国专利5,677,124、5,919,625和5,939,262)。在一个实施方案中，例如，内置对照可以包含衍生自或获得自南瓜植物(西葫芦属)的羟基丙酮酸还原酶基因的RNA序列。在这方面，本文描述的寡核苷酸组可以进一步含有包含SEQ ID NO：15的内置对照正向引物寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：16的内置对照反向引物寡核苷酸序列和包含SEQ ID NO：17的内置对照探针寡核苷酸序列。内置对照探针理想地包含可检测标记，例如本文所述的那些。在一个实施方案中，内置对照探针可包含与用于检测HCV的探针不同的标记，其允许在同一反应中同时检测和区分内置对照和HCV扩增产物。内置对照探针还可包含淬灭剂部分，例如本文所述的那些。

扩增和检测人丙型肝炎病毒的方法

本公开提供了一种用于检测疑似含有HCV的样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的方法。该方法包括：(a)将从人获得的样品与本文所述的一组寡核苷酸序列和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，(b)扩增样品中存在的第一靶标HCV核酸序列，(c)使第一和第二寡核苷酸探针与第一靶标HCV核酸序列杂交，(d)通过评估来自每个可检测标记的信号来检测第一和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HCV核酸序列的杂交，由此(i)存在信号表示第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HCV核酸序列的杂交以及样品中HCV的存在，并且(ii)缺少信号表示在样品中不存在HCV。关于前述寡核苷酸组的本文所述引物和探针寡核苷酸的描述也适用于本公开的方法的那些相同方面。

如果样品是从疑似患有HCV感染的受试者(优选是人)获得的，则“疑似”本文所定义的样品含有HCV。如果受试者的HCV风险增加，则怀疑该受试者感染了HCV。在美国，HCV传播的最常见方式是通过注射毒品使用。其他感染HCV的风险较高的人群包括，例如过去的注射吸毒者、捐赠的血液、血液制品和器官的接受者、因1987年以前的凝血问题而接受血液制品治疗的人、血液透析患者或进行多年肾衰竭透析的人、使用非无菌器械刺穿身体或纹身的人、已知感染丙型肝炎病毒的人(例如，被***的医护人员以及接受丙型肝炎病毒检测呈阳性的供血者的血液或器官的接受者)、艾滋病毒感染者以及感染HCV的母亲所生的孩子。

样品可以是从任何合适的受试者获得的任何合适的样品，受试者通常是哺乳动物(例如，狗、猫、兔、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛、猪、马、非人灵长类动物或人)。优选地，受试者是人。样品可以从任何生物来源获得，例如宫颈、***或***拭子或刷子，或生理液，包括但不限于全血、血清、血浆、组织液、唾液、眼晶状体液、脑脊液、汗液、尿液、牛奶、腹水、粘液、鼻液、痰、滑液、腹膜液、***液、月经、羊水、***等。可以使用本领域技术人员已知的常规技术从受试者获得样品，并且可以直接使用从生物学来源获得的样品或在进行预处理以改变样品的特性后使用样品。此类预处理可包括例如从血液中制备血浆、稀释粘性液体、过滤、沉淀、稀释、蒸馏、混合、浓缩、干扰组分失活、添加试剂、裂解等。

从受试者获得样品后，可以使样品与如本文所述的包含正向和反向引物以及第一和第二探针的寡核苷酸的组接触以形成反应混合物。然后将反应混合物置于扩增条件下。如果样品中存在靶标HCV核酸序列，则引物与第一靶标HCV核酸序列(例如，HCV基因组的5′UTR的区域)杂交，并且扩增样品中存在的第一靶标HCV核酸序列。

可以使用本领域已知的任何合适的核酸序列扩增方法来进行样品中HCV核酸序列的扩增，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶PCR(RT-PCR)、实时PCR、转录介导扩增(TMA)、滚环扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和连接酶链反应(LCR)。

因为HCV包含RNA基因组，所以HCV病毒核酸序列的扩增理想地使用RT-PCR，优选实时RT-PCR进行。如本文所用，“RT-PCR”是指其中从底物RNA模板合成互补DNA(eDNA)片段的酶促反应。该反应通常涉及使用合成的寡核苷酸引物，该引物与底物RNA中的核苷酸序列互补，并使用逆转录酶。该反应由一个循环组成，其中大量存在的寡核苷酸引物与底物RNA杂交，沿着互补核苷酸序列形成双链结构。然后，引物-底物DNA：RNA复合物将充当逆转录酶催化的cDNA合成反应的起始位点，从而合成与RNA链互补的eDNA链。RNA可以是本领域已熟知和可从多个来源商业获得的信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、基因组RNA(gRNA)、核糖体RNA(rRNA)或小核RNA(snRNA)、RT-PCR(参见，例如Freeman等，Biotechniques，26(1)：112-122，142-125(1999)；Joyce，C.，Methods Mol.Biol.，193：83-92(2002)；以及O’Connell，J.(编著)，RT-PCR Protocols，第1版，Springer-Verlag，New York，NY(2010))。可以使用本领域中已知的一步或两步技术来进行逆转录，例如，通过使用购自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)、Qiagen(Hilden，Germany)以及Promega Corp.(Madison，WI)的逆转录试剂盒。

本文所用的“实时PCR”是指一种PCR方法，其与常规PCR相比，在每次循环后，随着反应的进行实时测量扩增产物的积累，并对产物进行定量。在终点分析中检测到扩增的DNA产物。实时PCR在“定量PCR(qPCR)”的领域也是众所周知的。PCR产品的实时检测通常涉及使用非特异性荧光染料，该染料可***任何双链DNA和序列特异性荧光标记的DNA探针中。实时PCR技术和***在本领域中是已知的(参见例如Dorak，M.Tevfik编著.Real-timePCR.Taylor&Francis(2007)；以及Fraga等，“Real-time PCR，”Current protocolsessential laboratory techniques：10-3(2008))，并且可以从各种来源(例如m2000rtREALTIME^TM PCR***(Abbott Molecular，Inc.，Des Plaines，IL)；CFX Real-TimePCR Detection Systems(Bio-Rad Laboratories，Inc.，Hercules，CA)；以及TAQMAN^TMReal-Time PCR System(ThermoFisher Scientific，Waltham，MA))商购获得，可以在本文描述的方法中使用其中任选其一。

在扩增样品中存在的HCV病毒核酸序列(例如，HCV 5′UTR的区域)之后，所公开的方法还包括将第一和第二探针寡核苷酸与第一靶标HCV核酸序列杂交。在一个实施方案中，可以在严格的杂交和洗涤条件下，使包含HCV扩增子的反应混合物与如本文所述的优先与扩增子的靶核酸序列或其互补序列杂交的第一和第二寡核苷酸探针接触，从而形成对检测稳定的杂交双链体。

如本文所用，“杂交”是指由于互补碱基配对，由两个单链核酸形成双链体结构。杂交可以发生在完全互补的核酸链之间或包含不匹配的次要区域的“基本上互补”的核酸链之间。本文所用的“严格杂交条件”是指强烈优选完全互补的核酸链杂交的条件。在严格的杂交条件下，第一核酸序列(例如引物)将与第二核酸序列(例如靶序列)杂交，例如在复杂的核酸混合物中。严格条件取决于序列，并且在不同情况下会有所不同。严格条件可以选择为比特定序列在定义的离子强度pH下的热熔点(T_m)低约5-10℃。T_m可以是50％的寡核苷酸(在规定的离子强度、pH和核酸浓度下)与靶标互补的序列在平衡时与靶标序列杂交(由于靶标序列过量存在，在Tm，50％的探针在平衡时被占据)所处的温度。严格条件可以是其中盐浓度小于约1.0M钠离子的条件，例如pH 7.0至8.3下约0.01-1.0M钠离子浓度(或其他盐)，并且针对短探针(例如，约10-50个核苷酸)温度至少为30℃，且针对长探针(例如，大于约50个核苷酸)至少约60℃。通过添加去稳定剂如甲酰胺也可以达到严格的条件。对于选择性或特异性杂交，阳性信号可以是背景杂交的至少2到10倍。示例性的严格杂交条件包括：50％甲酰胺，5x SSC和1％SDS，在42℃下孵育，或5x SSC，1％SDS，在65℃孵育，在0.2x SSC和0.1洗涤下洗涤65℃下的％SDS。在公开的方法中可以使用本领域已知的用于使第一和第二寡核苷酸探针与第一靶标HCV核酸序列杂交的任何合适的方法和条件。

在第一和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HCV核酸序列杂交之后，该方法包括通过评估来自每个可检测标记的信号来检测第一和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HCV核酸序列的杂交，由此(i)存在信号表示第一探针寡核苷酸序列和第二探针寡核苷酸序列与第一靶标HCV核酸序列的杂交并且样品中存在HCV，并且(ii)缺失信号表示样品中不存在HCV。来自第一探针和第二探针的信号的检测可以使用多种众所周知的方法来进行，包括例如均相或异质技术。

均相检测(Homogeneous detection)方法包括检测扩增反应产物的形成，即以实时的方式。结果，当反应混合物处于扩增条件下时，会形成并检测到扩增产物/探针杂合物。均相检测方法包括但不限于使用FRET标记，该标记附着在探针上并在存在靶序列分子信标的情况下发出信号(参见Tyagi等，Nature Biotechnol.，14：303-308(1996)；Tyagi等，Nature Biotechnol.，16：49-53(1998)；Kostrikis等，Science，279：1228-1229(1998)；Sokol等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95：11538-11543(1998)；Marras等，Genet.Anal.，14：151-156(1999)；以及U.S.专利5,846,726，5,925,517，6,277,581和6,235,504)，

分析(参见，例如，美国专利5,210,015、5,804,375、5,487,792和6,214,979和国际专利申请公开WO 01/86001)，以及利用了用吖啶酯(AE)标记的探针的杂交保护分析(HPA)(参见例如Weeks等，Clin.Chem.，29：1474-1479(1983)；Berry et al.，Clin.Chem.，34：2087-2090(1988))。

异相检测(Heterogeneous detection)***通常使用捕获剂将扩增的序列与反应混合物中的其他材料分离。捕获剂通常包含涂覆有一种或多种特异性结合序列的固体支持材料(例如，微量滴定孔、珠子、芯片等)。结合序列可以与添加至本发明的寡核苷酸探针的尾部序列互补。或者，结合序列可以与捕获寡核苷酸的序列互补，捕获寡核苷酸本身包含与探针的尾部序列互补的序列。从剩余的反应混合物中分离出与捕获剂结合的扩增产物/探针杂种后，可以使用本领域已知或本文所述的任何合适的检测方法来检测扩增产物的探针杂种。

在另一个实施方案中，检测样品中HCV的方法可以进一步包括使样品与扩增和检测样品中第二靶标HCV核酸序列的引物和探针组接触。第二靶标HCV核酸序列可以是本文所述的任何HCV蛋白编码序列或其一部分。在一个实施方案中，第二靶标HCV核酸序列位于HCV基因组的3′UTR内。如上所述，HCV3′UTR不翻译成蛋白质，但是对于病毒RNA的翻译和复制很重要。特别是，已证明3′UTR在翻译终止过程中保留了核糖体复合物，以促进随后几轮翻译的有效启动(参见例如Bai等，Nucleic Acids Res.，41(16)：7861-7874(2013))，并且可能涉及病毒衣壳化(参见例如Shi等，PLoSPathog.，12(2)：e1005441(2016))。第二靶标HCV核酸序列理想地包含HCV基因组的3′非翻译区(UTR)的至少一部分。在一个实施方案中，扩增和检测样品中的第二靶标HCV核酸序列的引物和探针组包括：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：18；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：19；(c)探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21和可检测标记。

用于扩增和检测丙型肝炎病毒核酸序列的试剂盒和组合物

本公开还提供了用于扩增和检测样品中的人HCV的试剂盒。该试剂盒包含正向引物寡核苷酸、反向引物寡核苷酸、包含可检测标记的第一探针寡核苷酸、包含可检测标记的第二探针寡核苷酸以及用于扩增和检测HCV的试剂和说明书。关于上述方法中本文所述的引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述试剂盒的那些相同方面。试剂盒中包含的合适试剂的例子(除本文所述的寡核苷酸引物和探针外)包括用于核酸扩增反应的常规试剂，例如一种或多种具有聚合酶活性的酶、酶辅因子(例如镁或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、盐、缓冲液、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸三磷酸(dNTP/rNTP；例如，脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸和脱氧胸苷三磷酸)阻断剂、标记剂等。本文描述了许多这样的试剂，或者本领域以其他方式已知并且可商购。

在一个实施方案中，试剂盒可以包含、基本上由以下组成或由以下组成：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1；(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2；(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3；(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQID NO：4；(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；(f)使用说明，其中第一探针和第二探针各自包含可检测标记。在另一个实施方案中，试剂盒可包含：(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：5，(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ IDNO：8、或SEQ ID NO：9，(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12；(d)第二探针寡核苷酸序列，包含SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14，(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；(f)使用说明，其中第一探针和第二探针各自包含可检测标记。

试剂盒可包含用于本文所述的扩增试剂以及引物和探针寡核苷酸的使用说明，例如用于处理测试样品、提取核酸分子和/或进行测试的说明；以及解释所获得的结果以及政府机构规定的形式的通知。此类说明可以选择以印刷形式或在CD、DVD或其他录制媒体格式上使用。

本公开还提供了用于扩增和检测样品中的HCV的组合物。该组合物包含、基本上由以下组成或由以下组成：正向引物寡核苷酸、反向引物寡核苷酸、包含可检测标记的第一探针寡核苷酸和包含可检测标记的第二探针寡核苷酸。关于上述方法和试剂盒的本文所述引物寡核苷酸和探针寡核苷酸的描述也适用于本文所述组合物的那些相同方面。在一些实施方案中，组合物包含载体，优选药学(例如，生理上可接受的)载体。在本公开的上下文中可以使用任何合适的载体，并且这种载体在本领域中是众所周知的。组合物可以任选地是无菌的或除了本文所述的寡核苷酸以外是无菌的。

如本文所述，前述试剂盒和组合物还可包含扩增和检测内部对照核酸序列的引物和探针寡核苷酸。在这方面，试剂盒和/或组合物可含有包含SEQ ID NO：15的内置对照正向引物寡核苷酸序列、包含SEQ ID NO：16的内置对照反向引物寡核苷酸序列和包含SEQ IDNO：17的内置对照探针寡核苷酸序列。在另一个实施方案中，上述试剂盒和组合物可包含另外的引物和探针组，其扩增和检测HCV基因组的3′UTR的至少一部分。特别地，例如，试剂盒和/或组合物可包含：正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：18；反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：19；探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21和可检测标记。

试剂盒和/或组合物可以以固体(例如冻干)或液体形式提供。在一个实施方案中，将引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和其他试剂冻干(即，冷冻干燥)。对于每个单独的组分(例如引物寡核苷酸、探针寡核苷酸或缓冲液)，本公开内容的试剂盒的各种组分和组合物可任选地包含在不同的容器(例如小瓶、安瓿、试管、烧瓶或瓶)中。每种成分通常适合以等分试样的形式放在其各自的容器中或以浓缩形式提供。还可以提供适合于进行扩增/检测测定的某些步骤的其他容器。优选将各个容器密闭保存以用于商业销售。

以下示例进一步说明了本发明，但是，当然，不应以任何方式将其解释为限制本发明的范围。

实施例

该实施例说明了根据本公开的用于扩增和检测样品中的人HCV的方法。

Abbott Molecular，Inc.(Des Plaines，IL)开发了一种利用实时RT-PCR扩增和检测从人血浆或血清标本中提取的HCV RNA基因组序列的HCV检测方法，商标名为ALINITY m^TMHCV。该测定旨在(1)通过测量基线HCV水平评估疾病预后，并通过测量血清或血浆中HCVRNA水平的变化评估对抗逆转录病毒治疗的病毒反应；(2)有助于诊断HCV感染并确认血浆或血清中HCV感染，这些患者在HCV免疫分析中有反应结果。

ALINITY m^TM HCV测定包括样品制备、RT-PCR组装、扩增/检测以及结果计算和报告。ALINITY m^TMHCV测定程序的所有阶段均由ALINITY m^TM仪器自动执行。Abbott ALINITYm^TM仪器使用ALINITY m^TM HCV样品制备试剂盒(Sample Prep Kit)、ALINITY m^TM裂解液和ALINITY m^TM稀释液自动提取人血浆或血清中的HCV RNA，这些成分均采用磁性微粒技术来促进核酸酸捕获、洗涤和洗脱。

在ALINITY m^TM HCV样品制备过程的开始，内部对照的冻干单位剂量(包含装甲RNA序列)通过ALINITY m^TM***自动重新水化，并输送到每个样品制备反应中。然后通过整个样品制备和RT-PCR程序以及样品、校准物和对照物对内部对照进行处理，以证明适当的样品处理和测定的有效性。通过混合赋形剂(海藻糖和分子生物学级水)和内置对照体(由在过滤的、去纤维化的人血浆中稀释的内置对照装甲RNA(Basematrix，SeraCare LifeScience，Inc.，Milford，MA)组成)来制备内置对照靶标。内置对照的配方在下表1中列出。内置对照的装甲RNA靶序列来源于南瓜植物西葫芦(Cucurbita pepo)的羟基丙酮酸还原酶基因，该基因与HCV不相关。内部对照以单位剂量形式填充到多孔板中并冻干。然后将冻干的板密封并装袋。

表1.内置对照配方

组分	组分浓度(冻干前)
		内置对照装甲RNA	Ct靶标＝20.6
具有内置对照的装甲RNA的基础基质	50％
		含7.50％海藻糖的分子生物学级水	50％

然后将25μL纯化的RNA样品与5μL的液体活化剂合并，然后将其用于使冻干的单位剂量ALINITY m^TM HCV RT-PCR预混试剂再水化。通过混合分子生物学级的水、氯化镁和四甲基氯化铵(TMAC)来制备活化剂溶液。活化剂溶液以液体形式在密封和袋装多孔板中提供，并为RT-PCR反应提供必要的盐，以激活RT-PCR酶并建立最佳的离子强度环境。活化剂溶液的配方示于表2。

表2.活化剂配方

组分	组分浓度(按30μL PCR)
		氯化镁(MgCl<sub>2</sub>)	6mM
四甲基氯化铵(TMAC)	90mM
		ProClin 950	0.025％
分子生物学级水	N/A

然后将生成的材料转移到覆盖有15μL的ALINITY m^TM Vapor Barrier Solution(矿物油)的反应容器中，并转移到扩增/检测模块，用于HCV的逆转录、PCR扩增和实时荧光检测。

RT-PCR预混合(master mix)试剂配方与冻干相容，可在不到一小时的时间内完成RT-PCR循环。通过将KAPA 2G DNA聚合酶、Superscript III反转录酶、尿嘧啶-DNA糖酵素(UDG)、赋形剂(Ficoll 400、Ficoll 70、海藻糖、松三糖和分子生物学级水)、PCR缓冲液成分(Tris-HCl、Tween 20和明胶)、dNTP、正向和反向寡核苷酸引物(如本文所述)、两个寡核苷酸探针(如本文所述)、Cal610被动参照染料和ProClin 950混合来制备预混试剂。

Superscript III逆转录酶是莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的工程版本，具有降低的RNase H活性和更高的热稳定性，可用于在高达55℃的温度下合成第一链cDNA，从而提供增加的特异性。KAPA2G聚合酶是一种经过工程改造的酶，可通过定向进化实现更高的生产力和速度，其延伸速率比野生型

DNA聚合酶快得多。KAPA2G具有高度合成性的5′-3′DNA聚合酶，但缺乏3′-5′核酸外切酶活性。尿嘧啶-DNA糖酵解酶(UDG)催化从含尿嘧啶的DNA中释放游离尿嘧啶，并提供了一种控制外部含有尿嘧啶的扩增子的方法。

将预混合(master mix)试剂以单位剂量的形式填充到多孔板中并冻干。然后将冻干的板密封并装袋。预混合配方列于表3。

表3.预混合配方

预混合组分	组分浓度(按30μL PCR)
		HCVPCR正向引物	0.1μM
HCVPCR反向引物	1.0μM
		HCVmC探针	0.3μM
HCV Cb探针	0.03μM
		IC正向引物196	0.1μM
IC反向引物310	0.2μM
		HCVGTIC探针	0.1μM
Cal610	0.025μM
		dNTP	0.7mM
Tris-HCl	50mM
		Tween20	0.010％(V/V)
明胶	0.010％(W/V)
		快速酶(KAPA 2G)	1.8单位/反应
Superscript III逆转录酶	9单位/反应
		尿嘧啶-DNA糖基化酶	0.25单位/反应
Ficoll 400	1.81％(W/V)
		Ficoll 70	1.81％(W/V)
松三糖	0.60％(w/v)
		海藻糖	1.81％(W/V)
分子生物学级水	N/A

表4列出了ALINITYm^TM HCV测定所使用的RT-PCR循环条件。

表4.RT-PCR循环条件

可以进一步修改上述PCR配方和循环条件以优化测定。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均以引用的方式并入本文，其程度如同每个参考文献被单独地且具体地指示为通过引用并入本文并在此完整阐述。

在描述本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)术语“一个”和“一种”、“该”和“至少一个”的使用和类似指代应被解释为涵盖单数和复数两个方面，除非在此另有说明或与上下文明显矛盾。术语“至少一个”后面是一个或多个项目(例如“A和B中的至少一个”)的术语的使用应解释为是指从所列项目(A或B)中选择的一个项目或所列项目(A和B)中两个或多个的任意组合，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。除非另有说明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。短语“基本上由……组成”也被解释为开放式短语，意在包括不实质上影响所描述的产品或方法的基本和新颖特性的步骤或材料。短语“由…组成”被解释为是封闭的短语，其排除了说明书或权利要求中未明确指定的任何要素、步骤或成分。除非在此另外指出，否则本文数值范围的列举仅旨在用作分别指代该范围内的每个单独数值的简略表示方法，并且每个单独数值都被并入说明书中，就如同其在本文中被单独叙述一样。除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文描述的所有方法可以以任何合适的顺序执行。除非另外要求，否则本文提供的任何和所有示例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应解释为指示任何未要求保护的要素对于实施本发明必不可少。

本文描述了本发明的优选实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。在阅读前述说明之后，那些优选实施例的变型对于本领域普通技术人员而言将变得显而易见。发明人期望熟练的技术人员适当地采用这样的变型，并且发明人希望以不同于本文具体描述的方式来实践本发明。因此，本发明包括适用法律所允许的所附权利要求中记载的主题的所有修改和等同物。而且，除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本发明涵盖上述元素在其所有可能的变化中的任何组合。

序列表

<110> 雅培分子公司

<120> 丙型肝炎病毒（HCV）的测定

<130> ABBTT-36071/WO-1/ORD

<150> US 62/567,630

<151> 2017-10-03

<160> 26

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 1

atttgggcgt gcccccgcaa ga 22

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 2

cccggggcac tcgcaagcac cctatc 26

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 3

ccuuguggua cugccug 17

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 4

ctagccgagt agtgttgg 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 5

atttgggcgt gcccccgcga ga 22

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 6

cccggggcac tcgtaagcac cctatc 26

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 7

cccgaggcac tcgcaagcac cctatc 26

<210> 8

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 8

cccgaggcac tcgtaagcac cctatc 26

<210> 9

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 9

cccggggcac tcgaaagcac cctatc 26

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 10

ccttgtggta ctgcctga 18

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 11

ccuugtggta cugccug 17

<210> 12

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 12

ccuugtggua cugccug 17

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 13

ctagccgagt agtgttgg 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 14

cuagccgagu agtguugg 18

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 15

ctacagcaga gttggcagct tcactttc 28

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 16

gtctggcctt tcagcaagtt tc 22

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 17

acgagttcat gagggcaggc cgct 24

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 18

gctccatctt agccctagtc 20

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 19

agcactctct gcagtcatgc ggctca 26

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 20

cggctagctg tgaaaggtc 19

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 21

cggctagctg tgaaaggtcc g 21

<210> 22

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 22

ccuuguggua cugccug 17

<210> 23

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 23

ccuugtggta cugccug 17

<210> 24

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 24

ccuugtggua cugccug 17

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 25

ctagccgagt agtgttgg 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 26

cuagccgagu agtguugg 18

Claims

1.用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)核酸序列的寡核苷酸序列的组，其包含：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5；

(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8或SEQ ID NO：9；

(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQID NO：12；以及

(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14，其中所述第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。

2.根据权利要求1所述的组，进一步包括：

(e)内置对照正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：15，

(f)内置对照反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：16，以及

(g)内置对照探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：17和可检测标记。

3.根据权利要求1或2所述的组，其中：

(a)所述正向引物寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：1；

(b)所述反向引物寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：2；

(c)所述第一探针寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：3；并且

(d)所述第二探针寡核苷酸序列包含SEQ ID NO：4。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的组，其中所述可检测标记是荧光团。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的组，其中每个探针寡核苷酸还包含淬灭剂部分。

6.一种在疑似含有丙型肝炎病毒的样品中检测人丙型肝炎病毒的方法，所述方法包括：

(a)使从人获得的样品与根据权利要求1-5中任一项所述的寡核苷酸序列的组和用于扩增和检测核酸序列的试剂接触，

(b)扩增所述样品中存在的第一靶标HCV核酸序列，

(c)使第一和第二寡核苷酸探针与所述第一靶标HCV核酸序列杂交，

(d)通过评估来自每个所述可检测标记的信号，检测所述第一和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HCV核酸序列的杂交，由此

(i)存在所述信号表示所述第一和第二探针寡核苷酸序列与所述第一靶标HCV核酸序列的杂交以及在所述样品中存在HCV，并且

(ii)缺少所述信号表示在所述样品中不存在HCV。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述第一靶标HCV核酸序列包含HCV基因组的5′非翻译区(UTR)的至少一部分。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其进一步包括使所述样品与扩增和检测第二靶标HCV核酸序列的引物和探针组接触。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第二靶标HCV核酸序列包含HCV基因组的3′非翻译区(UTR)的至少一部分。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述引物和探针组包括：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：18；

(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：19；以及

(c)探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21以及可检测标记。

11.根据权利要求6-10中任一项所述的方法，其中所述样品包括血液、血清、血浆、唾液、尿液、***液或***。

12.用于检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的试剂盒，其包含：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1；

(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：2；

(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3；

(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4；

(e)用于扩增和检测核酸序列的试剂；以及

(f)使用说明，

其中所述第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。

13.根据权利要求12所述的试剂盒，其进一步包括：

(g)内置对照正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：15；

(h)内置对照反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：16；以及

(i)内置对照探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：17和可检测标记。

14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其进一步包括引物和探针组，所述引物和探针组扩增和检测HCV基因组的3′非翻译区(UTR)的至少一部分。

15.根据权利要求14所述的试剂盒，其中，所述引物和探针组包含：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：18；

(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：19；以及

(c)探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：21和可检测标记。

16.根据权利要求12-15中任一项所述的试剂盒，其中，所述引物、探针和试剂被冻干。

17.一种用于扩增和检测样品中的人丙型肝炎病毒(HCV)的组合物，其包含：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：5；

(c)第一探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11或SEQID NO：12；

(d)第二探针寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14，其中第一和第二探针寡核苷酸序列各自包含可检测标记。

18.根据权利要求17所述的组合物，其进一步包含：

(a)正向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：18；

(b)反向引物寡核苷酸序列，其包含SEQ ID NO：19；以及

19.根据权利要求17或权利要求18所述的组合物，其中所述引物寡核苷酸、探针寡核苷酸和试剂被冻干。