JP2023518983A - コロナウイルス感染症2019(covid-19)を検出するためのアッセイ - Google Patents
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Abstract
本開示は、試料中の2019-Covを増幅及び検出するための材料及び方法であって、増幅オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドプローブの種々の組合せを含む、材料及び方法に関する。本開示はまた、オリゴヌクレオチド配列、キット及びCOVID-19を検出するための方法に関する。
Description
本出願は、2020年3月26日に出願された米国仮出願第63/000,304号、2020年3月27日に出願された米国仮出願第63/000,971号、2020年4月3日に出願された米国仮出願第63/004,773号、2020年7月8日に出願された米国仮出願第63/049、237号、及び2021年3月2日に出願された米国仮出願第63/155,599号の利益を請求し、前記出願のそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願と同時に提出され、以下のように識別される、コンピューター可読ヌクレオチド/アミノ酸配列リストは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる:2021年3月24日に作成された、「2021-03-24_38391-601_SQL_ST25.txt」という名称の、1つの5,136バイトのASCII(テキスト)ファイル。
本出願と同時に提出され、以下のように識別される、コンピューター可読ヌクレオチド/アミノ酸配列リストは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる:2021年3月24日に作成された、「2021-03-24_38391-601_SQL_ST25.txt」という名称の、1つの5,136バイトのASCII(テキスト)ファイル。
本開示は、SARS-CoV-2からの標的核酸配列を増幅して、COVID-19を検出するための方法に関する。
新規コロナウイルス(SARS-CoV-2(2019-nCoV))は、2019年後半に中国湖北省で、発熱、重症呼吸器疾患及び肺炎を引き起こすヒト病原体として出現した。SARS-CoV-2と関連するこの疾患は、COVID-19と命名された。この新規コロナウイルスは、ベータコロナウイルス属のメンバーであり、いくつかのコウモリコロナウイルス及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)と密接に関連する。しかし、SARS-CoVとは異なり、SARS-CoV-2はヒトの間で急速に伝播される。
2021年2月末の時点で、200を超える国で1億例を超えるCOVID-19が確認され、COVID-19の合併症が250万人を超える個人において死亡原因として挙げられている。
(発明の要旨)
本開示は、試料中のコロナウイルスSARS-CoV-2を増幅及び検出するための、オリゴヌクレオチドを含む試薬を提供する。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドのセットは、少なくとも1種の第1の増幅オリゴヌクレオチド、少なくとも1種の第2の増幅オリゴヌクレオチド及び少なくとも1種のプローブオリゴヌクレオチドを含む。プローブオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)を含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドのセットは、試料中のSARS-CoV-2のリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅及び検出を目的とする。一部の実施形態において、試薬は、オリゴヌクレオチドの1つ以上のセットを含むオリゴヌクレオチドの群を含む。
本開示は、試料中のコロナウイルスSARS-CoV-2を増幅及び検出するための、オリゴヌクレオチドを含む試薬を提供する。一部の実施態様において、オリゴヌクレオチドのセットは、少なくとも1種の第1の増幅オリゴヌクレオチド、少なくとも1種の第2の増幅オリゴヌクレオチド及び少なくとも1種のプローブオリゴヌクレオチドを含む。プローブオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)を含み得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドのセットは、試料中のSARS-CoV-2のリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅及び検出を目的とする。一部の実施形態において、試薬は、オリゴヌクレオチドの1つ以上のセットを含むオリゴヌクレオチドの群を含む。
一部の実施形態において、試料中のSARS-CoV-2のリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号17と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号19と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号18と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;若しくは配列番号20若しくは21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25若しくは26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22~24のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;又はそれらの組合せを含み、各プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む。一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号20と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号22又は23と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25又は26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号24と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態において、試料中のSARS-CoV-2を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群は、配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第1のセットを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドの群は、配列番号11及び15のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第2のセットをさらに含む。
本開示はまた、試料中のSARS-CoV-2を検出するための方法を提供する。試料は、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含み得る。
一部の実施形態において、方法は、試料を、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのセット又は群及び増幅用試薬と接触させるステップ;リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅(RPA)を使用して、試料中に存在する1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列を増幅するステップ;1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2核酸配列にハイブリダイズするステップ;並びに検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。一部の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチドのセットからの第1及び第2の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む。検出可能な標識からの1つ以上のシグナルの存在は、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への、1種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示し得る。
増幅用試薬は、ポリメラーゼ;リコンビナーゼ剤;リコンビナーゼローディングタンパク質;一本鎖結合タンパク質;ニッキング酵素;ヘリカーゼ;レゾルバーゼ;酵素補因子;バッファー;デオキシリボヌクレオチド;若しくはリボヌクレオチド三リン酸;クラウディング剤;ATP、ATP類似体若しくはATP産生系;又はそれらの組合せを含み得る。
本開示はさらに、試料中のSARS-CoV-2を検出するためのキットであって、オリゴヌクレオチドの少なくとも1つのセット、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのいずれか、核酸配列を増幅及び検出するための試薬、並びに/又は使用説明書を含む、キットを提供する。
本開示の他の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付図を考慮すれば、明らかになる。
本特許又は出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を含む本特許又は特許出願公報の副本は、請求時及び必要な料金の納付時に、特許庁によって提供される。
本開示は、少なくとも一部は、COVID-19の迅速な検出を容易にするオリゴヌクレオチド配列のコレクションの開発に基づく。
本明細書中で使用される用語「含む(comprise(s))」、「含む(include(s))」、「有する(having)」、「有する(has)」、「含む(contain(s)」及びそれらの変形体は、追加の行為又は構造の可能性を排除しない、オープンエンドの移行句、用語、単語であることが意図される。単数形「1つ(種)の(one)」、「及び(and)」及び「その(the)」は、文脈がそうでないことを明白に指示しない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に示されているか否かに関わらず、本明細書中に提示された実施形態又は要素「を含む」、「からなる」及び「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
本明細書中における数値範囲の列挙については、同じ精度を有する、その間の各介在数値も明示的に企図される。例えば、6~9の範囲では、6及び9に加えて、7及び8の数値も企図され、6.0~7.0の範囲では、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及び7.0が明示的に企図される。
「第1の」及び「第2の」という用語は、本開示中ではそれらの相対的意味でのみ使用される。特に断りのない限り、それらの用語は、1つ以上の実施形態の記載において単に便宜上使用されることが理解される。「第1の」及び「第2の」という用語は、1つの要素を別の要素から識別するためにのみ使用され、開示される技術の権利範囲は、これらの用語によって限定されるべきでない。例えば、第1の要素が第2の要素として指定されてもよいし、同様に、第2の要素が第1の要素として指定されてもよい。
本明細書中で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、約2~約100個のヌクレオチド(例えば、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99若しくは100個のヌクレオチド、又は前記値のいずれかによって規定される範囲)を含む短い核酸配列を指す。本明細書中で使用される「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ポリマー形態の任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチド(RNA)又はデオキシリボヌクレオチド(DNA)のいずれかを指す。これらの用語は、分子の一次構造を指し、したがって、二本鎖及び一本鎖DNA並びに二本鎖及び一本鎖RNAを含む。これらの用語は、均等物として、ヌクレオチド類似体から作製されたRNA若しくはDNAのいずれかの類似体、並びに修飾されたポリヌクレオチド、例えば、メチル化及び/又はキャップされたポリヌクレオチドなどを含む。核酸は典型的には、リン酸結合を介して連結されて、核酸配列又はポリヌクレオチドを形成するが、他の多くの結合も当技術分野において公知である(例えば、ホスホロチオエート、ボラノホスフェートなど)。
オリゴヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖であることができ、又は二本鎖配列と一本鎖配列の両方の部分を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、DNA、ゲノムDNAと相補的DNA(cDNA)の両方、RNA、又はハイブリッドであることができ、核酸は、デオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドとの組合せ、並びにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン(xanthine hypoxanthine)、イソシトシン及びイソグアニンを含む塩基の組合せを含み得る。オリゴヌクレオチドは、化学的合成法によって又は組換え法によって得ることができる。
本明細書中で使用する「配列同一性パーセント」という用語は、核酸配列中のヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体又はアミノ酸配列中のアミノ酸の、2つの配列を整列させかつ必要ならば、最大同一性パーセントを達成するようにギャップを導入した後に参照配列中の対応するヌクレオチド又はアミノ酸と同一である、百分率を指す。したがって、本技術による核酸が参照配列よりも長い場合、参照配列と整列しない核酸中の余分のヌクレオチドは、配列同一性の決定のために考慮されない。アラインメントのための方法及びコンピュータープログラムは、BLAST、Align 2及びFASTAを含めて、当技術分野において周知である。
本明細書中で特に定義しない限り、本開示に関連して使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。用語の意味及び範囲は明白であるはずであるが、潜在的な曖昧さがある場合、本明細書中に示された定義が、あらゆる辞書的定義又は外部定義に優先する。さらに、文脈によって特に要求がない限り、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
好ましい方法及び材料が以下に記載されるが、本明細書中に記載されるのと同様な又は同等な方法及び材料を、本開示の実施又は試験において使用してもよい。本明細書中で言及される全ての公表文献、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によってそれら全体が組み込まれる。本明細書中に開示される材料、方法及び例は例示に過ぎず、限定的であることを意図するものではない。本明細書中で使用されるセクションの表題は、構成のみを目的とするものであり、記載される主題を限定するものと決して解釈されるべきではない。
1.増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチド
一実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、核酸増幅のために使用してもよいし(例えば、プライマー)、又は核酸ハイブリダイゼーション及び検出のためのプローブとして使用してもよい。本明細書中で使用される「プライマー」、「プライマー配列」、「プライマーオリゴヌクレオチド」及び「増幅オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び核酸重合剤(例えば、DNA依存性又はRNA依存性ポリメラーゼ)の存在下で好適な増幅条件(例えば、バッファー、塩、温度及びpH)に置かれた場合に、核酸(全ての種類のDNA又はRNA)の相補鎖である伸長産物の合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。本開示の増幅オリゴヌクレオチドは、任意の好適なサイズであることができ、望ましくは、約15~50個のヌクレオチド、好ましくは約20~40個のヌクレオチドを含む、それから本質的なる、又はそれからなることができる。本開示のオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるものに加えて、追加のヌクレオチドを含むことができる。使用される増幅プロセスの種類に応じて、増幅オリゴヌクレオチドは、例えば、ニッキング酵素部位及び上流の安定化領域を含むことができる(例えば、米国特許第9,689,031号明細書、米国特許第9,617,586号明細書、米国特許第9,562,264号明細書及び米国特許第9,562,263号明細書を参照のこと;これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。
一実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、核酸増幅のために使用してもよいし(例えば、プライマー)、又は核酸ハイブリダイゼーション及び検出のためのプローブとして使用してもよい。本明細書中で使用される「プライマー」、「プライマー配列」、「プライマーオリゴヌクレオチド」及び「増幅オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及び核酸重合剤(例えば、DNA依存性又はRNA依存性ポリメラーゼ)の存在下で好適な増幅条件(例えば、バッファー、塩、温度及びpH)に置かれた場合に、核酸(全ての種類のDNA又はRNA)の相補鎖である伸長産物の合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。本開示の増幅オリゴヌクレオチドは、任意の好適なサイズであることができ、望ましくは、約15~50個のヌクレオチド、好ましくは約20~40個のヌクレオチドを含む、それから本質的なる、又はそれからなることができる。本開示のオリゴヌクレオチドは、本明細書中に記載されるものに加えて、追加のヌクレオチドを含むことができる。使用される増幅プロセスの種類に応じて、増幅オリゴヌクレオチドは、例えば、ニッキング酵素部位及び上流の安定化領域を含むことができる(例えば、米国特許第9,689,031号明細書、米国特許第9,617,586号明細書、米国特許第9,562,264号明細書及び米国特許第9,562,263号明細書を参照のこと;これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。
「プローブ」、「プローブ配列」及び「プローブオリゴヌクレオチド」という用語は、適当なハイブリダイゼーション条件下で標的配列の少なくとも一部分(例えば、増幅された標的配列の一部分)に選択的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドを指す。一般に、プローブ配列は、「相補的」(例えば、コード鎖又はセンス鎖に対して相補的(+))又は「逆相補的」(例えば、アンチセンス鎖に対して相補的(-))のいずれかと特定できる。本開示のプローブは、任意の好適なサイズであることができ、望ましくは、約10~50個のヌクレオチド、好ましくは約12~35個のヌクレオチドを含む、それから本質的なる、又はそれからなることができる。
本明細書中で使用される「セット」、「プライマーセット」及び「プライマー及びプローブセット」という用語は、目的の標的配列若しくは標的核酸(例えば、SARS-CoV-2内の標的配列)を一緒にプライミングできる2つ以上のオリゴヌクレオチド及び/又は標的配列若しくは標的核酸を検出できる少なくとも1種のプローブを指す。ある特定の実施形態において、「セット」という用語は、増幅される標的配列又は標的核酸の5’末端とハイブリダイズする第1のオリゴヌクレオチド、及び増幅される標的配列又は標的核酸の相補体とハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドを含む1対のオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのセットは、試料中の1種以上の標的SARS-CoV-2(2019-nCoV)配列を増幅及び検出するのに使用できる。「標的配列」及び「標的核酸」という用語は、本明細書中で交換可能に使用され、開示される方法によって存在又は非存在を検出する予定の特定の核酸配列を指す。本開示の文脈において、標的配列は好ましくは、1種以上のオリゴヌクレオチドがそれにハイブリダイズしかつ増幅がそこから開始する核酸配列を含む。標的配列はまた、適当な増幅条件下でプローブが安定なハイブリッドを形成できるプローブハイブリダイズ領域を含むことができる。標的配列は一本鎖であっても二本鎖であってもよい。標的SARS-CoV-2配列は、SARS-CoV-2ゲノムの任意の部分内、例えば、ヌクレオカプシド(N)タンパク質をコードする遺伝子又はRNA依存性RNAポリメラーゼ(RDRP)をコードする遺伝子内に存在することができる。
一部の実施形態において、セットは、第1の増幅オリゴヌクレオチド、第2の増幅オリゴヌクレオチド及びプローブオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、セットは、配列番号1及び10~16のいずれかと少なくとも70%(例えば、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%)の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む;若しくは配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む;若しくは配列番号7と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号8と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号9と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む;若しくは配列番号17と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号19と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号18と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む;若しくは配列番号20若しくは21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25若しくは26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22~24のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む;又はそれらの組み合わせを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号1及び10~16のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;並びに配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号20と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22又は23と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、配列番号21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25又は26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号24と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、セットは、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)のリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドであって、配列番号17と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号19と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号18と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;若しくは配列番号20若しくは21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25若しくは26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22~24のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;又はそれらの組合せを含み、各プローブオリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含む。一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号20と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号22又は23と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは、配列番号21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25又は26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号24と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態において、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群は、配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み、プローブオリゴヌクレオチドは検出可能な標識を含む。オリゴヌクレオチドの第1のセットを含む。
一部の実施形態において、群は、配列番号11及び15のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み、プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、オリゴヌクレオチドの第2のセットをさらに含む。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはいずれも、オリゴヌクレオチドのその標的に対する結合親和性を安定化させる又は増強するために、任意の好適な方法で修飾することができる。例えば、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド配列は、1種以上の修飾オリゴヌクレオチドを含むことができる。さらに、内部スペーサー又は修飾を含む、リストに記載した配列はいずれも、修飾又はスペーサーなして使用することができる。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドはいずれも、例えば、スペーサー、ブロック基及び修飾ヌクレオチドを含むことができる。修飾ヌクレオチドは、天然ヌクレオチド及びヌクレオチド三リン酸と組成及び/又は構造が異なるヌクレオチド又はヌクレオチド三リン酸である。修飾は、ヌクレオチドを修飾する酵素、例えば、メチルトランスフェラーゼによる修飾によって生じる、天然起源のものを含む。修飾ヌクレオチドはまた、合成ヌクレオチド又は非天然起源のヌクレオチドを含む。例えば、修飾ヌクレオチドは、2’修飾、例えば、2’-O-メチル及び2’-フルオロを有するものを含む。他の2’-修飾ヌクレオチドも当技術分野において公知であり、例えば、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる米国特許第9,096,897号明細書に記載されている。本明細書中で使用される修飾ヌクレオチド及びヌクレオチド三リン酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する二本鎖核酸の1つの鎖上に修飾が存在する場合には修飾ヌクレオチド又はヌクレオチド三リン酸が修飾鎖を制限酵素による切断から保護するように、変更することができる。
ブロック基又はポリメラーゼ停止分子は、ポリメラーゼによる標的配列非依存的核酸重合を抑制する化学的部分である。ブロック基は、オリゴヌクレオチドが、標的核酸分子を結合できるが、検出可能なオリゴヌクレオチドプローブを標的として利用する鋳型の伸長を支持できないようにすることができる。例えば、ポリメラーゼの進行をさせない1つ以上の部分の存在は、オリゴヌクレオチドへの非核酸主鎖付加における又は複製ポリメラーゼの失速による、ポリメラーゼの停止を引き起こす可能性がある。これらの部分を有するオリゴヌクレオチドは、増幅反応の過程においてプローブの非正統的増幅を妨げる又は低減することができる。ブロック基の例としては、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、及び例えばコルジセピン、スペーサー部分、損傷したDNA塩基などを含む、3’-OHを欠いているヌクレオチド誘導体が挙げられる。スペーサーの例としては、例えば、C3スペーサーが挙げられる。スペーサーは、例えば、オリゴヌクレオチド内で、及びまた、例えば、他の基、例えば標識などを結合させるために末端で、使用され得る。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチド配列はいずれも、本明細書中に開示される配列のいずれかの相補体を含む、それから本質的になる、又はそれからなることができる。本明細書中で使用される「相補体」又は「相補的配列」という用語は、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドを有する安定な二本鎖をワトソン-クリック塩基対規則によって形成する核酸配列を指し、典型的には、開示されるオリゴヌクレオチドと約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%以上の同一性を共有する。核酸配列の同一性は、当技術分野において公知の任意の好適な数学アルゴリズム又はコンピューターソフトウェア、例えば、CLUSTAL-W、T-Coffee及びALIGN(核酸及びアミノ酸配列のアラインメントのため)、BLASTプログラム(例えば、BLAST2.1、BL2SEQ及びそれのそれ以降のバージョン)並びにFASTAプログラム(例えば、FASTA3×、FASTM及びSSEARCH)(配列アラインメント及び配列類似性の探索のため)などを使用して決定することができる。配列アラインメントアルゴリズムはまた、例えば、Altschulら、J.Molecular Biol.、215(3):403~410頁(1990);Beigertら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、106(10):3770~3775頁(2009);Durbinら編、Biological Sequence Analysis:Probalistic Models of Proteins and Nucleic Acids、Cambridge University Press、Cambridge、UK(2009);Soding、Bioinformatics、21(7):951~960頁(2005);Altschulら、Nucleic Acids Res.、25(17):3389~3402頁(1997);及びGusfield、Algorithms on Strings,Trees and Sequences、Cambridge University Press、Cambridge UK(1997)に開示されており、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドは、任意の好適な方法を使用して調製でき、種々のこのような方法は当技術分野において公知である(例えば、Sambrookら、Molecular Cloning. A Laboratory Manual、1989年、2.Supp.Ed.、Cold Spring Harbour Laboratory Press:New York、N.Y.;M.A.Innis(編)、PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications、Academic Press:New York、N.Y.(1990);P.Tijssen、Hybridization with Nucleic Acid Probes-Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology(パートI及びII)、Elsevier Science(1993);M.A.Innis(編)、PCR Strategies、Academic Press:New York、N.Y.(1995);及びF.M.Ausubel(編)、Short Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons:Secaucus、N.J.(2002);Narangら、Meth.Enzymol.、68:90~98頁(1979);Brownら、Meth.Enzymol.、68:109~151頁(1979);及びBelousovら、Nucleic Acids Res.、25:3440~3444頁(1997)を参照のこと;これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)。オリゴヌクレオチド対はまた、種々のツール、例えば、National Center of Biotechnology Information(NCBI)により提供されるPrimer-BLASTツールを使用して設計することができる。オリゴヌクレオチド合成は、オリゴ合成機、例えば、Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc.(Foster City、CA)、DuPont(Wilmington、DE)又はMilligen(Bedford、MA)から商業的に入手可能なもので行うことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、オーダーメードであることができ、例えば、Midland Certified Reagent Company(Midland、TX)、Eurofins Scientific(Louisville、KY)、BioSearch Technologies,Inc.(Novato、CA)などを含む、当技術分野において周知の種々の商業的供給元から入手できる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、ネイティブアクリルアミドゲル電気泳動、陰イオン交換HPLC(例えば、Pearsonら、J.Chrom.、255:137~149頁(1983)を参照のこと;これは参照により本明細書中に組み込まれる)、逆相HPLC(例えば、McFarlandら、Nucleic Acids Res.、7:1067~1080頁(1979)を参照のこと;これは参照により本明細書中に組み込まれる)を使用して精製することができる。
オリゴヌクレオチドの配列は、化学分解(例えば、Maxamら、Methods of Enzymology、65:499~560頁(1980)を参照のこと;これは参照により本明細書中に組み込まれる)、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型(MALDI-TOF)質量分析(例えば、Pielesら、Nucleic Acids Res.、21:3191~3196頁(1993)を参照のこと;これは参照により本明細書中に組み込まれる)、アルカリホスファターゼとエキソヌクレアーゼ消化の組合せ後の質量分析(Wuら、Anal.Biochem.、290:347~352頁(2001);これは参照により本明細書中に組み込まれる)などを含むがこれらに限定されるものではない、当技術分野において公知の任意の好適な配列決定方法を使用して検証することができる。
2.検出可能な標識
本明細書中に記載される任意の1種以上のオリゴヌクレオチド配列は、1種以上の増幅オリゴヌクレオチド及び/又はプローブオリゴヌクレオチドが測定されることができるように、検出可能な標識を含み得る。一実施形態において、本明細書中に記載されるプローブオリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、検出可能な標識を含む。本明細書中で使用される「検出可能な標識」という用語は、測定されることができるシグナルであって、その強度がそれに結合された実在物の量と関連する(例えば、それに比例する)シグナルを生成させる部分又は化合物を指す。標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合を検出するようにオリゴヌクレオチドにコンジュゲート又は連結されることができる、任意の好適な検出可能な標識を使用でき、その多くは当技術分野において公知である。一実施形態において、検出可能な標識は、間接的に検出され得る。間接的に検出可能な標識は典型的には、直接検出可能な標識に結合又はカップリングされる「コンジュゲート」と共に使用される特異的結合メンバーである。このようなコンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当技術分野において周知であり、特異的結合メンバーの特異的結合特性及び標識の検出可能な特性が損なわれないままであるように設計される。本明細書中で使用される「特異的結合メンバー」及び「コンジュゲート」という用語は、結合対の2つのメンバー、例えば、2つの異なる分子を指し、特異的結合メンバーは、本開示のポリヌクレオチドに特異的に結合し、「コンジュゲート」は特異的結合メンバーに特異的に結合する。対の2つのメンバー間の結合は典型的には、本質的に化学的又は物理的である。このような結合対の例としては、抗原と抗体、アビジン/ストレプトアビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子/基材と酵素などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書中に記載される任意の1種以上のオリゴヌクレオチド配列は、1種以上の増幅オリゴヌクレオチド及び/又はプローブオリゴヌクレオチドが測定されることができるように、検出可能な標識を含み得る。一実施形態において、本明細書中に記載されるプローブオリゴヌクレオチド配列のそれぞれは、検出可能な標識を含む。本明細書中で使用される「検出可能な標識」という用語は、測定されることができるシグナルであって、その強度がそれに結合された実在物の量と関連する(例えば、それに比例する)シグナルを生成させる部分又は化合物を指す。標的配列へのオリゴヌクレオチドの結合を検出するようにオリゴヌクレオチドにコンジュゲート又は連結されることができる、任意の好適な検出可能な標識を使用でき、その多くは当技術分野において公知である。一実施形態において、検出可能な標識は、間接的に検出され得る。間接的に検出可能な標識は典型的には、直接検出可能な標識に結合又はカップリングされる「コンジュゲート」と共に使用される特異的結合メンバーである。このようなコンジュゲートを合成するためのカップリング化学は、当技術分野において周知であり、特異的結合メンバーの特異的結合特性及び標識の検出可能な特性が損なわれないままであるように設計される。本明細書中で使用される「特異的結合メンバー」及び「コンジュゲート」という用語は、結合対の2つのメンバー、例えば、2つの異なる分子を指し、特異的結合メンバーは、本開示のポリヌクレオチドに特異的に結合し、「コンジュゲート」は特異的結合メンバーに特異的に結合する。対の2つのメンバー間の結合は典型的には、本質的に化学的又は物理的である。このような結合対の例としては、抗原と抗体、アビジン/ストレプトアビジンとビオチン、ハプテンとハプテンに特異的な抗体、相補的ヌクレオチド配列、酵素補因子/基材と酵素などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
望ましくは、プローブオリゴヌクレオチド配列のそれぞれが、検出可能な標識を含む。プローブのそれぞれが、同じ検出可能な標識又は異なる検出可能な標識で標識されることができる。
一部の実施形態において、検出可能な標識は、直接検出されることができる。このような直接検出可能な標識としては、例えば、放射性同位元素、フルオロフォア、化学発光団、酵素、コロイド粒子、蛍光微小粒子、挿入染料(例えば、SYBR Green又は臭化エチジウム)などが挙げられる。えり抜きの実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォア、例えば、フルオレセイン系染料、ポリハロフルオレセイン系染料、ヘキサクロロフルオレセイン系染料、クマリン系染料、ローダミン系染料、シアニン系染料、オキサジン系染料、チアジン系染料、スクアライン系染料、キレート化ランタニド系染料、アゾ系染料、トリフェニルメタン系染料又はBODIPY(登録商標)系染料であることができる。フルオロフォアの例としては、FAM(商標)、CAL-FLUOR(登録商標)、QUASAR(登録商標)、HEX(商標)、JOE(商標)、NED(商標)、PET(登録商標)、ROX(商標)、TAMRA(商標)、TET(商標)、TEXAS RED(登録商標)及びVIC(登録商標)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者ならば、直接検出可能な標識が、標識の検出を可能にするために追加の成分、例えば、基質、トリガー試薬、光などを必要とする場合があることがわかるであろう。オリゴヌクレオチド、例えば、プローブを標識するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、L.J.Kricka、Ann.Clin.Biochem.、39:114~129頁(2002);van Gijlswijkら、Expert Rev.Mol.Diagn.、1:81~91頁(2001);Joosら、J.Biotechnol.、35:135~153頁(1994);Smithら、Nucl.Acids Res.、13:2399~2412頁(1985);Connolyら、Nucl.Acids Res.、13:4485~4502頁(1985);Brokerら、Nucl.Acids Res.、5:363~384頁(1978);Bayerら、Methods of Biochem.Analysis、26:1~45頁(1980);Langerら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、78:6633~6637頁(1981);Richardsonら、Nucl.Acids Res.、11:6167~6184頁(1983);Brigatiら、Virol.、126:32~50頁(1983);Tchenら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81:3466~3470頁(1984);Landegentら、Exp.Cell Res.、15:61~72頁(1984);A.H.Hopmanら、Exp.Cell Res.、169:357~368頁(1987);及びTemsamaniら、Mol.Biotechnol.、5:223~232頁(1996)に記載されており、これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
一部の実施形態において、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドの任意の1種以上はまた、クエンチャー部分を含むことができる。検出可能な標識(例えば、フルオロフォア)及びクエンチャー部分がプローブの近傍に、例えば、プローブの末端に保持されている場合には、クエンチャー部分は検出可能な標識からのシグナル(例えば、蛍光)の検出を妨げる。2つの部分が物理的に分離されている場合には、シグナルは検出可能になる。クエンチャーは、当業界において公知の任意の好適なクエンチャー、例えば、BLACK HOLE QUENCHER(登録商標)1(BHQ-1(登録商標))、BLACK HOLE QUENCHER(登録商標)2(BHQ-2(登録商標))、BLACK HOLE QUENCHER(登録商標)3(BHQ-3(登録商標))、IOWA BLACK(登録商標)FQ、及びIOWA BLACK(登録商標)RQなどから選択され得る。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、FAMフルオロフォア、CAL-FLUOR(登録商標)又はQUASARフルオロフォア及びBHQ-1又はBHQ-2クエンチャーを含み得る。
特定の標識及び標識技術の選択は、いくつかの要因、例えば、標識方法の容易さ及びコスト、使用される異なる検出可能な標識間のスペクトル間隔、所望の試料標識量、ハイブリダイゼーション反応に対する(例えば、ハイブリダイゼーションプロセスの速度及び/又は効率に対する)検出可能な部分の効果、使用される増幅方法の性質、検出システムの性質、検出可能な標識によって生成されるシグナルの性質及び強度などに依存する。
3.SARS-CoV-2(2019-nCoV)を増幅及び検出するための方法
本開示は、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)を検出するための方法を提供する。この方法は、試料を、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット及び増幅用試薬と接触させるステップ;試料中に存在する1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列を増幅するステップ;1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2核酸配列にハイブリダイズするステップ;並びに検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。前述のオリゴヌクレオチドのセットに関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチドセットについての説明はまた、この開示される方法にも当てはまる。
本開示は、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)を検出するための方法を提供する。この方法は、試料を、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット及び増幅用試薬と接触させるステップ;試料中に存在する1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列を増幅するステップ;1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2核酸配列にハイブリダイズするステップ;並びに検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップを含む。前述のオリゴヌクレオチドのセットに関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチドセットについての説明はまた、この開示される方法にも当てはまる。
試料は、任意の好適な対象、典型的には哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ(cow)、ブタ、ウマ、非ヒト霊長類又はヒト)から得られる任意の好適な試料であることができる。好ましくは、対象はヒトである。試料は、任意の好適な生物学的供給源、例えば、鼻腔スワブ若しくはブラシ、又は全血、血清、血漿、間質液、唾液、眼球レンズ液(ocular lens fluid)、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水液(ascites fluid)、粘液(mucous)、関節液、腹水(peritoneal fluid)、膣液、月経分泌物、羊水、***、糞便などを含むがこれらに限定されるものではない、好適な生理学的流体から得ることができる。
試料は、当業者に公知のルーチン技術を使用して対象から得ることができ、試料は、生物学的供給源から入手したまま直接使用してもよいし、又は試料の特性を変更するために前処理後に使用してもよい。このような前処理としては、例えば、血液からの血漿の調製、粘稠な流体の希釈、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加、溶解などを挙げることができる。
対象から試料を得た後、試料は、本明細書中に記載される増幅オリゴヌクレオチド及びプローブを含むオリゴヌクレオチドのセットと接触させ、反応混合物を形成することができる。次いで、反応混合物を増幅条件下に置く。本明細書中で使用される「増幅条件」という用語は、増幅オリゴヌクレオチドのアニーリング及び/又は伸長を促進する条件を指す。このような条件は、当技術分野において周知であり、選択される増幅方法に依存する。増幅条件は、温度及び/又は温度サイクル、バッファー、塩、イオン強度、pHなどを含むがこれらに限定されるものではない、全ての反応条件を包含する。
試料中のSARS-CoV-2核酸配列の増幅は、当技術分野において公知の任意の好適な核酸配列増幅方法を使用して行い得る。一部の実施形態において、増幅としては、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写酵素PCR(RT-PCR)、リアルタイムPCR、転写媒介増幅(TMA)、ローリングサークル増幅、核酸配列ベース増幅(NASBA)、鎖置換増幅(SDA)、転写媒介増幅(TMA)、単一プライマー等温増幅(SPIA)、ヘリカーゼ依存性増幅(HDA)、ループ媒介増幅(LAMP)、リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅(RPA)、及びリガーゼ連鎖反応(LCR)が挙げられるが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列の増幅は、等温増幅(例えば、RPA又はNEAR)を使用して行われる。一部の実施形態において、SARS-CoV-2核酸配列の増幅及び検出は、ポイントオブケアデバイス(point of care device)(例えば、ID NOWシステム(Abbott))を使用して行われる。
一部の実施形態において、SARS-CoV-2核酸配列の増幅は、リアルタイムPCRを使用して行われる。本明細書中で使用される「リアルタイムPCR」は、増幅DNA産物をエンドポイント分析で検出する従来のPCRとは異なり、反応が進行するにつれて増幅産物の蓄積をリアルタイムで測定し、各サイクル後に産物の定量化を行うPCR法を指す。リアルタイムPCRはまた、当技術分野において「定量的PCR(qPCR)」として知られる。PCR産物のリアルタイム検出は、任意の二本鎖DNAにインターカレートする非特異的蛍光染料及び配列特異的蛍光標識DNAプローブの使用を含む。リアルタイムPCR技術及びシステムは当技術分野において公知であり(例えば、Dorak、M.Tevfik編 Real-time PCR. Taylor & Francis(2007);及びFragaら、「Real-time PCR」、Current protocols essential laboratory techniques:10-3(2008)を参照のこと;これらのそれぞれが参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる)、種々の供給元から商業的に入手可能であり(例えば、m2000rt REALTIME(商標)PCRシステム(Abbott Molecular,Inc.、Des Plaines、IL);CFXリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad Laboratories,Inc.、Hercules、CA);及びTAQMAN(商標)リアルタイムPCRシステム(ThermoFisher Scientific、Waltham、MA))、それらはいずれも、本明細書中に記載される方法において使用できる。
増幅に有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号1及び10~16のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;並びに/又は配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含み得る。
えり抜きの実施形態において、等温増幅法は、伝統的な増幅反応よりも速い時間枠でより短い配列を増幅するために、ニッキング及び伸長反応、「ニッキング及び伸長増幅」に依拠し得る。これらの方法は、例えば、等温条件下で2種の増幅オリゴヌクレオチド、1種又は2種のニッキング酵素及びポリメラーゼのみを使用する反応を含み得る。ニッキング及び伸長増幅に有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号7と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号8と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号9と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
ニッキング及び伸長増幅において、センス及びアンチセンス鎖を有する標的核酸配列を1対の増幅オリゴヌクレオチドと接触させる。第1の増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列アンチセンス鎖の3’末端と相補的な認識領域を3’末端に含む核酸配列、前記認識領域の上流のニッキング酵素部位、及び前記ニッキング酵素部位の上流の安定化領域を含む。第2の増幅オリゴヌクレオチドは、標的配列センス鎖の3’末端と相補的な認識領域を3’末端に含むヌクレオチド配列、前記認識領域の上流のニッキング酵素部位、及び前記ニッキング酵素部位の上流の安定化領域を含む。2種のニッキング酵素を用意する。一方のニッキング酵素は、第1の増幅オリゴヌクレオチドのニッキング酵素部位においてニッキング可能であるが、前記標的配列内ではニッキング可能でない。他方のニッキング酵素は、第2の増幅オリゴヌクレオチドのニッキング酵素部位においてニッキング可能であるが、前記標的配列内ではニッキング可能でない。DNAポリメラーゼは、増幅オリゴヌクレオチドの複数のサイクルの伸長を含む増幅条件下で使用し、それによって、ニッキング酵素によってニッキングされる二本鎖ニッキング酵素部位を生成して、増幅産物を産生する。例えば、米国特許第9,689,031号明細書;米国特許第9,617,586号明細書;米国特許第9,562,264号明細書;及び米国特許第9,562,263号明細書、並びに米国特許出願第15/467,893号明細書;米国特許出願第15/600,951号明細書;及び米国特許出願第16/243/829号明細書を参照のこと。これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。
一部の実施形態において、ID NOW COVID-19アッセイは、SARS-CoV-2 RNA中のRdRp遺伝子の高度に保存された領域を標的とするために、等温核酸増幅技術であるニッキング酵素増幅反応(NEAR)を使用する。一部の実施形態において、アッセイシステムは、溶出/溶解バッファーを収容する試料受け器;それぞれ凍結乾燥ペレットを収容する2つの密封型反応チューブを含む試験ベース;溶出された試料を試験ベースに移動させるための移動カートリッジ;及びID NOWインスツルメントを含む。ID NOW COVID-19アッセイは、陽性の結果をわずか5分で及び陰性の結果を13分で送り出し、広範囲の医療現場において迅速なCOVID-19の結果を提供する。
一部の実施形態において、ID NOW COVID-19 POCアッセイの検出下限(LOD)は、125コピー/mL以下である。インシリコ分析により、全ての鋳型及びプローブが、45カ国及び21都市並びに中国の省から報告された957のSARS-CoV-2配列と100%の相同性を有することが判明し、他のコロナウイルス、インフルエンザ、RSV及びライノウイルスを含む一般的な呼吸器疾患を引き起こす微生物に対して有意な交差反応性はないことが予測された。
臨床成績は、既知濃度のSARS-CoV-2 RNAを含む30個の人工的な試料及び30個の人工的な陰性試料において判定された。SARS-CoV-2 RNAは、全ての陽性試料で検出され(陽性一致パーセント100%[CI、88.6~100%])、陰性試料では検出されなかった(陰性一致パーセント100%[CI、88.6~100%])。
えり抜きの実施形態において、SARS-CoV-2核酸配列の増幅は、リコンビナーゼ及び関連タンパク質の特性に依拠するリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅(RPA)を使用して行って、DNAポリメラーゼ反応の配列特異的なプライミングを可能にする一本鎖相同DNAを二本鎖DNAに侵入させる。
RPAに有用なオリゴヌクレオチドのセットは、配列番号17と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号19と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号18と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド;又は配列番号20若しくは21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25若しくは26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22~24のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号20と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号22又は23と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。一部の実施形態において、第1の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドは配列番号25又は26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドは配列番号24と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む。
RPAにおいて、リコンビナーゼ剤を、第1及び第2の増幅オリゴヌクレオチドで接触させて、核タンパク質を形成する。これらの核タンパク質は、標的配列に接触して、第1の二本鎖構造を前記第1の鎖の第1の部分で形成し、二本鎖構造を前記第2の鎖の第2の部分で形成し、したがって、前記第1の増幅オリゴヌクレオチド及び第2の増幅オリゴヌクレオチドの3’末端は、標的配列を含むDNA上で互いに向かって配向される。核タンパク質中のこれらの増幅オリゴヌクレオチドの3’末端を、DNAポリメラーゼによって伸長させて、第1及び第2の二本鎖核酸並びに核酸の第1及び第2の置換鎖を生成させる。所望の増幅レベルが達成されるまで、これらのステップを繰り返す。
標的核酸配列のRPAに有用な方法及び材料は、当技術分野において公知である、米国特許第第7,270,981号明細書;米国特許第8,460,875号明細書;米国特許第7,399,590号明細書;米国特許第7,666,598号明細書;米国特許第8,030,000号明細書;米国特許第8,426,134号明細書;米国特許第8,945,845号明細書;米国特許第9,663,820号明細書;米国特許第10,329,603号明細書;米国特許第10,329,602号明細書;米国特許第8,017,339号明細書;米国特許第8,574,846号明細書;米国特許第8,962,255号明細書;米国特許第10,036,057号明細書;米国特許第8,071,308号明細書;米国特許第10,093,908号明細書;及び米国特許第8,637,253号明細書、並びに米国特許出願第15/099,754号明細書;米国特許出願第16/442,007号明細書;米国特許出願第14/705,150号明細書;及び米国特許出願第16/155,133号明細書を参照のこと;これらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる。例えば、好適なリコンビナーゼ剤としては、エシェリキア・コリ(E.コリ(E.coli))RecAタンパク質、T4 uvsXタンパク質、又は任意の門に由来する任意の相同タンパク質若しくはタンパク質複合体が挙げられる。他の非相同リコンビナーゼ剤を、RecAの代わりに、例えばRecT又はRecOとして利用してもよい。好適なリコンビナーゼローディングタンパク質としては、例えば、T4uvsY、E.コリrecO、E.コリrecR並びにこれらのタンパク質の誘導体及び組合せを挙げることができる。好適な一本鎖DNA結合タンパク質は、E.コリSSB若しくはT4gp32又はこれらのタンパク質の誘導体若しくは組合せであることができる。DNAポリメラーゼは、真核生物又は原核生物ポリメラーゼであってもよい。真核生物ポリメラーゼの例としては、pol-α、pol-β、pol-δ、pol-ε並びにそれらの誘導体及び組合せが挙げられる。原核生物ポリメラーゼの例としては、E.コリDNAポリメラーゼI Klenowフラグメント、バクテリオファージT4 gp43 DNAポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)ポリメラーゼIラージフラグメント、ファイ-29 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、バチルス・スブチリス(Bacillus subtilis)Pol I、E.コリDNAポリメラーゼI、E.コリDNAポリメラーゼII、E.コリDNAポリメラーゼIII、E.コリDNAポリメラーゼIV、E.コリDNAポリメラーゼV並びにそれらの誘導体及び組合せが挙げられる。RPAの他の成分としては、ATP、ATP類似体又はATP再生(ADPのATPへの変換)のためのシステムが挙げられる。このようなシステムは、例えば、フォスフォクレアチン及びクレアチンキナーゼを利用することができる。ATP又はATP類似体は、ATP、ATP-γ-S、ATP-β-S、ddATP又はそれらの組合せのいずれかであり得る。RPA反応はまた、AMPからADPを再生する及びピロホスフェートをホスフェート(ピロホスフェート)に変換するシステムを含み得る。RPAにおいて使用される好適なクラウディング剤としては、ポリエチレングリコール(PEG)、デキストラン及びフィコールが挙げられる。
試料中に存在する1種以上のSARS-CoV-2ウイルス核酸配列の増幅に続いて、開示される方法は、1種以上の、本明細書中に開示されるプローブオリゴヌクレオチド配列を1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列にハイブリダイズするステップをさらに含み得る。
1種以上の増幅された標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションに続いて、この方法は、検出可能な標識のそれぞれからのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅された標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップであって、(i)1種以上のシグナルの存在が、1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーション、及び試料中のSARS-CoV-2の存在を示し、かつ(ii)シグナルの非存在が試料中のSARS-CoV-2の非存在を示す、ステップを含む。1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列からのシグナルの検出は、検出可能な標識の種類に応じて、種々の周知の方法体系を使用して行うことができる。例えば、検出は、溶液リアルタイム蛍光を使用して又は固体表面法を使用して行うことができる。
4.SARS-CoV-2を有すると特定された対象の治療及び監視
本明細書中に記載される方法に従ってSARS-CoV-2を有すると特定された対象は、治療し、監視し(対象からの試料において判定されたSARS-CoV-2核酸の存在について)、治療及び監視し、並びに/又は当技術分野において公知のルーチン技術を使用して監視及び治療することができる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるこの方法は、本方法を使用して対象から得られた1つ以上の試料においてSARS-CoV-2核酸の存在が判定された場合に対象を治療するステップをさらに含む。
本明細書中に記載される方法に従ってSARS-CoV-2を有すると特定された対象は、治療し、監視し(対象からの試料において判定されたSARS-CoV-2核酸の存在について)、治療及び監視し、並びに/又は当技術分野において公知のルーチン技術を使用して監視及び治療することができる。一部の実施形態において、本明細書中に記載されるこの方法は、本方法を使用して対象から得られた1つ以上の試料においてSARS-CoV-2核酸の存在が判定された場合に対象を治療するステップをさらに含む。
治療は、対象が無症状であるか、又はSARS-CoV-2感染の軽度、中等度若しくは重度の症状を経験しているかに応じて、種々の形態を取り得る。例えば、軽度の症状を経験している対象は、発熱、咳(痰産生を伴う又は伴わない)、食欲不振、倦怠感、筋痛、咽頭痛、呼吸困難、鼻閉、頭痛、下痢、嘔気、嘔吐又はそれらの任意の組合せを経験する。中等度の症状を経験している対象は、数日間続く100.4°F超の発熱、悪寒、息切れ、嗜眠又はそれらの任意の組合せを経験する。このような対象はまた、肺炎にかかることがある。重度の感染を経験している対象は、呼吸困難、胸部の持続痛若しくは圧迫感、錯乱、覚醒不能、青みを帯びた唇若しくは顔又はそれらの任意の組合せを経験する。このような対象は、重症肺炎にかかることがある。
対象が無症状であるか又は軽度の症状を有する場合、対象は、安静、睡眠、保温、液体摂取(例えば、水分補給の持続)、他の対象との社会的交流の最小化(例えば、隔離又は強制隔離の持続、例えば、自宅隔離)又はそれらの任意の組合せによって治療することができる。さらに、対象は、症状が起こる及び/又は悪化するかどうか見るために監視することができる。
SARS-CoV-2による感染の中程度又は重度の症状を有する対象は、1種以上の薬物(例えば、レムデシビル)、ワクチン、回復期血漿療法(例えば、SARS-CoV-2による感染を克服した対象から採取した血液に由来する血漿を受ける)、呼吸支援若しくは補助(例えば、鼻カニューレ、フェイスマスク又は侵襲的若しくは非侵襲的(例えば、挿管)補助換気を通じて酸素補給を受ける)又はそれらの組合せによって治療することができる。前記治療のいずれかを受ける対象はまた、当技術分野において公知のルーチン技術を使用して監視することができる。
5.ワクチン接種
別の実施形態において、本開示は、SARS-CoV-2(2019-nCoV)に対する対象の少なくとも1回のワクチン接種及び/又はワクチン再接種(例えば、さらなるワクチン接種)と関連する、本明細書中に記載される方法の使用に関する。一部の実施形態において、本方法は、対象から得られた少なくとも1つの試料中のSARS-CoV-2核酸の存在を検出して、SARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチン(例えば、1回目の又は初回のワクチン、1回以上のさらなる又は追加のワクチンなど)を対象に投与すべきか否か又は投与できるか否かを判定するのに使用される。一部の実施形態において、試験される対象は、SARS-CoV-2に対して免疫がない又は免疫学的免疫(immunologic immunity)を欠いているような、無感作の対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、SARS-CoV-2に対して以前にワクチン接種されたことがあるが無感作である対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在SARS-CoV-2に感染しているが、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在SARS-CoV-2に感染しており、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にSARS-CoV-2に対するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のSARS-CoV-2感染から回復しており、かつ以前にSARS-CoV-2日するワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のSARS-CoV-2感染から回復しており、かつ以前にSARS-CoV-2日するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。
別の実施形態において、本開示は、SARS-CoV-2(2019-nCoV)に対する対象の少なくとも1回のワクチン接種及び/又はワクチン再接種(例えば、さらなるワクチン接種)と関連する、本明細書中に記載される方法の使用に関する。一部の実施形態において、本方法は、対象から得られた少なくとも1つの試料中のSARS-CoV-2核酸の存在を検出して、SARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチン(例えば、1回目の又は初回のワクチン、1回以上のさらなる又は追加のワクチンなど)を対象に投与すべきか否か又は投与できるか否かを判定するのに使用される。一部の実施形態において、試験される対象は、SARS-CoV-2に対して免疫がない又は免疫学的免疫(immunologic immunity)を欠いているような、無感作の対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、SARS-CoV-2に対して以前にワクチン接種されたことがあるが無感作である対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在SARS-CoV-2に感染しているが、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、現在SARS-CoV-2に感染しており、症状がなく又は軽度であり、かつ以前にSARS-CoV-2に対するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のSARS-CoV-2感染から回復しており、かつ以前にSARS-CoV-2日するワクチン接種を受けたことがない対象であり得る。一部の実施形態において、対象は、以前のSARS-CoV-2感染から回復しており、かつ以前にSARS-CoV-2日するワクチン接種を受けたことがある対象であり得る。
前記方法は、以前のSARS-CoV-2感染の時期及び/又は重症度の差異にかかわらず、行うことができる。投与されるワクチンが初回投与のワクチン、2回目(ブースターなど)投与のワクチン、3回目又はあらゆるさらなる追加投与(ブースターなど)投与のワクチンであるかにかかわらず、本明細書中に記載される方法を使用して試料中にSARS-CoV-2核酸の存在が検出される場合には、対象は一定期間(例えば、30日間、60日間、90日間など)待って、SARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチンを投与される必要がある。あるいは、試料中にSARS-CoV-2核酸の存在が検出されない場合には、少なくとも1つのワクチンを対象に投与することができる。
「少なくとも1つのさらなるワクチン又は少なくとも1回のワクチン接種」又は「少なくとも1つの追加ワクチン又は少なくとも1回の追加ワクチン接種」という表現は、1回目又は現在のワクチンが対象に投与され、続いてある後の時点で、追加の又はさらなるワクチン又はワクチン接種(例えば、N+1(Nは1回目又は現在のワクチン+追加の又はさらなるワクチンである)、N+2(Nは1回目+2つの追加のワクチンである)N+3、N+4、N+5、N+6、N+7、N+8、N+9、N+10~N+N’(N’は1~1000、1~500、1~100である))が投与される計画を包含する。
別の実施形態において、本明細書中に記載される方法は、対象にSARS-CoV-2に対する少なくとも1つのさらなるワクチンを投与する(例えば、1つ以上のブースターを受ける)べきか否かを判定するために;及び/又はSARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチンの投与後に対象を監視するために、対象にSARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチンが投与された後の一定の時間枠内に対象から得られた少なくとも1つの試料中のSARS-CoV-2核酸の存在を検出するのに使用される。一部の実施形態において、この方法は、対象にSARS-CoV-2に対する少なくとも1つのワクチンが投与された後の一定の時間枠内に試料を得るステップを含む。対象に少なくとも1つのSARS-CoV-2ワクチンが投与された後の時間枠は、少なくとも1日、少なくとも2日、少なくとも3日、少なくとも4日、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、少なくとも11日、少なくとも12日、少なくとも13日、少なくとも14日、少なくとも15日、少なくとも16日、少なくとも17日、少なくとも18日、少なくとも19日、少なくとも20日、少なくとも21日、少なくとも22日、少なくとも23日、少なくとも24日、少なくとも25日、少なくとも26日、少なくとも27日、少なくとも28日、少なくとも29日、少なくとも30日、少なくとも31日、少なくとも32日、少なくとも33日、少なくとも34日、少なくとも35日、少なくとも36日、少なくとも37日、少なくとも38日、少なくとも39日、少なくとも40日、少なくとも41日、少なくとも42日、少なくとも43日、少なくとも44日、少なくとも45日、少なくとも46日、少なくとも47日、少なくとも48日、少なくとも49日、少なくとも50日などであることができる。一部の実施形態において、試料は、対象に少なくとも1つのSARS-CoV-2ワクチンが投与された後約7~約21日以内に得る。さらに、なおさらなる実施形態において、対象の監視は、対象が1つ以上のワクチンを受けた後(例えば、SARS-CoV-2に対するワクチンの初回投与後、SARS-CoV-2に対するワクチンの2回目投与後など)の、ワクチン後総体症状又は副作用(例えば、疲労若しくは倦怠感、頭痛、めまい、又はもうろう状態、発熱若しくは悪寒、筋肉、骨、関節若しくは神経の症状、嘔気、嘔吐、下痢若しくは他の消化器症状、睡眠変化、リンパ節の膨大、皮膚/爪若しくは顔面の変化、眼、耳、口若しくはのど変化、咳、胸部若しくは呼吸症状、及び/又は記憶若しくは気分変化のうちの1つ以上)の監視を含む。
本明細書中に記載される方法を使用して、試料中にSARS-CoV-2核酸が検出されない場合には、少なくとも1つのさらなるワクチン(例えば、1つ以上のブースター)を対象に投与することができる。あるいは、試料中にSARS-CoV-2核酸が検出される場合には、少なくとも1つのさらなるワクチンを対象に投与してもしなくてもよい。
6.キット
本開示はまた、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)を増幅及び検出するためのキットを提供する。キットは、本明細書中に記載される少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット又は群を含む。キットは、核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びにSARS-CoV-2を増幅及び検出するための使用説明書をさらに含み得る。前記方法に関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのセットについての記載はまた、本明細書中に記載されるキットのそれらの同じ態様に当てはまる。多くのこのような試薬は、本明細書中に記載されており、又はそうでなければ当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。キットに含める(本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドに加えて)のに好適な試薬の例としては、例えば、ポリメラーゼ活性を有する1種以上の酵素、酵素補因子(例えば、マグネシウム又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD))、塩、バッファー、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド三リン酸(dNTP/rNTP;例えば、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸)遮断剤、標識剤などのような、核酸増幅反応に使用される従来の試薬が挙げられる。増幅反応に使用される他の試薬としては、ニッキング酵素、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、レゾルバーゼなどが挙げられる。
本開示はまた、試料中のSARS-CoV-2(2019-nCoV)を増幅及び検出するためのキットを提供する。キットは、本明細書中に記載される少なくとも1種のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書中に開示されるオリゴヌクレオチドのセット又は群を含む。キットは、核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びにSARS-CoV-2を増幅及び検出するための使用説明書をさらに含み得る。前記方法に関して本明細書中に示されたオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドのセットについての記載はまた、本明細書中に記載されるキットのそれらの同じ態様に当てはまる。多くのこのような試薬は、本明細書中に記載されており、又はそうでなければ当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。キットに含める(本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドに加えて)のに好適な試薬の例としては、例えば、ポリメラーゼ活性を有する1種以上の酵素、酵素補因子(例えば、マグネシウム又はニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD))、塩、バッファー、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド三リン酸(dNTP/rNTP;例えば、デオキシアデノシン三リン酸、デオキシグアノシン三リン酸、デオキシシチジン三リン酸及びデオキシチミジン三リン酸)遮断剤、標識剤などのような、核酸増幅反応に使用される従来の試薬が挙げられる。増幅反応に使用される他の試薬としては、ニッキング酵素、一本鎖結合タンパク質、ヘリカーゼ、レゾルバーゼなどが挙げられる。
キットは、本明細書中に記載される増幅試薬及びオリゴヌクレオチドを使用するための、例えば、試験試料を処理するための、核酸分子を抽出するための及び/又は試験を行うための、並びに得られた結果を解釈するための、使用説明書を含み得る。使用説明書は、印刷されていても電子的に提供されていてもよい(例えば、DVD、CD又はインターネットリソースを介して視聴若しくは取得するために入手可能)。
キットは固体(例えば、凍結乾燥された)形態又は液体形態で供給できる。本開示のキットの種々の成分は任意選択的に、個々の成分(例えば、増幅オリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド又はバッファー)のそれぞれのための異なる容器(例えば、バイアル、アンプル、試験管、フラスコ又はボトル)を含んでいてもよい。各成分は一般に、そのそれぞれの容器中に分注されるのに又は濃縮された形態で提供されるのに好適である。増幅/検出アッセイのある特定のステップを実施するのに好適な他の容器も、提供されてもよい。個々の容器は好ましくは、商業的販売のために厳密に閉じ込めた状態に保持される。
キットは、生体試料を得るためのスワブをさらに含み得る。一部の実施形態において、キットは、生体試料にアクセスするための及び/又は生体試料から核酸を抽出/単離するための試薬を含む。
7.実施例
[実施例1]
SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列の増幅を、種々の第1の増幅オリゴヌクレオチドを、配列番号3を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド及び配列番号5を含むプローブオリゴヌクレオチドと共に使用して、PCRによって行った。
[実施例1]
SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列の増幅を、種々の第1の増幅オリゴヌクレオチドを、配列番号3を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド及び配列番号5を含むプローブオリゴヌクレオチドと共に使用して、PCRによって行った。
SARS-CoV-2試料は、SARS関連コロナウイルス2の分離株USA-WA1/2020(BEI Resources)に由来するゲノムRNAであった。ゲノムRNAを、SARS-CoV-2の分離株USA-WA1/2020に感染させたセルコピテクス・アエチオプス(Cercopithecus aethiops)の腎臓上皮(Vero E6、ATCC(登録商標)CRL-1586(商標))細胞からの細胞溶解物及び上清の調製物から抽出した。ウイルスゲノムRNAは、細胞の核酸及びキャリアRNAのバックグラウンドにある。
PCRサイクリングパラメーター:
PCR反応混合物は、SARS-CoV-2、配列番号3及び配列番号1、10、12~14又は16のうちの1つを含むCOVID-19プライマーセット(プライマーセット1)、並びに配列番号5のプローブオリゴヌクレオチドを含んでいた。記載されている場合には、内部対照核酸及び内部対照に対するプライマーセットも、陽性対照として含めた。反応混合物はまた、反応バッファー、dNTP、参照染料、DNAポリメラーゼ(rTth)を、当技術分野において一般に使用される濃度で、含んだ。
表3は、プライマーセットのそれぞれについての結果を示す。SARS-CoV-2標的及び内部標準RNAはいずれも、サイクリング条件下で増幅した。
第2のCOVID-19プライマーセット(プライマーセット2)を、選択された第1のCOVID-19プライマーセットと共に含む追加のPCR反応を、行った。第2のCOVID-19プライマーセットは、配列番号2及び配列番号4を含んでいた。反応はまた、配列番号6をプローブオリゴヌクレオチドとして含んでいた。表4に示されるように、プライマーセット2は、いずれのプライマーセット1と比較してもより強いシグナル(dRn)を示したが、プラマーセット2にプライマーセット1を加えると最も強い全シグナルを示した。
[実施例2]
SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列の増幅を、増幅オリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの種々の組合せを用いて、リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅(TRA)を使用して行った。試験した組合せは、表5に示される。組合せ1は、標的領域を対象とし、組合せ2~5は第2の標的領域を対象とした。
SARS-CoV-2(2019-nCoV)核酸配列の増幅を、増幅オリゴヌクレオチドとプローブオリゴヌクレオチドの種々の組合せを用いて、リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅(TRA)を使用して行った。試験した組合せは、表5に示される。組合せ1は、標的領域を対象とし、組合せ2~5は第2の標的領域を対象とした。
図1A及び図1Bは、5つの組合せのそれぞれについての経時的なdRn値のグラフを示す。SARS-CoV-2標的は、全ての組合せについて反応条件下で増幅され、検出可能なレベルの増幅が反応開始から10分以内に起こった。組合せ1、4及び5では、標的増幅は4~6分で検出された(図1A~図1B)。
[実施例3]
2020年4月28日の時点でGenBankにおいて入手可能なすべての完全長SARS-CoV-2配列との相同性について、SARS-CoV-2プライマー及びプローブのそれぞれの配列を分析することによって、包括性(inclusivity)を実証した。26の国/地域(オーストラリア、ブラジル、中国、コロンビア、チェコ共和国、フランス、ギリシャ、香港、インド、イラン、イスラエル、イタリア、マレーシア、ネパール、オランダ、パキスタン、ペルー、南アフリカ、韓国、スペイン、スリランカ、スウェーデン、台湾、トルコ、USA及びベトナム)からの合計1383の完全長SARS-CoV-2ゲノム配列を分析した。99.5%(1376/1383)が、全てのSARS-CoV-2プライマー及びプローブ配列に対して100%の同一性を示し、0.5%(7/1383)が、プライマー又はプローブの1つに対して単一のミスマッチを含んでいた。
2020年4月28日の時点でGenBankにおいて入手可能なすべての完全長SARS-CoV-2配列との相同性について、SARS-CoV-2プライマー及びプローブのそれぞれの配列を分析することによって、包括性(inclusivity)を実証した。26の国/地域(オーストラリア、ブラジル、中国、コロンビア、チェコ共和国、フランス、ギリシャ、香港、インド、イラン、イスラエル、イタリア、マレーシア、ネパール、オランダ、パキスタン、ペルー、南アフリカ、韓国、スペイン、スリランカ、スウェーデン、台湾、トルコ、USA及びベトナム)からの合計1383の完全長SARS-CoV-2ゲノム配列を分析した。99.5%(1376/1383)が、全てのSARS-CoV-2プライマー及びプローブ配列に対して100%の同一性を示し、0.5%(7/1383)が、プライマー又はプローブの1つに対して単一のミスマッチを含んでいた。
2020年5月5日の時点でGISAIDデータベースにおいて入手可能なすべての完全長SARS-CoV-2配列との相同性について、SARS-CoV-2プライマー及びプローブのそれぞれの配列を分析することによって、包括性を実証した。81の国/地域からの合計14,964の完全長SARS-CoV-2ゲノム配列を分析し;1.1%(170/14,964)が単一ミスマッチを含み、0.04%(6/14,964)が2つのミスマッチを含み、0.007%(1/14964)が4つのミスマッチを含んでいた。
[実施例4]
リアルタイムRT-PCRを使用して、開示されるプライマーセットを既知のSARS CoV-2陽性試料、陰性試料及び非SARS CoV-2呼吸器試料を使用してAbbott Alinity mシステムで評価した。表6に示されるように、既知の陽性試料の希釈系列により、100コピー/mLの検出限界が決定された。検出限界(LOD)は、試験の結果、全(真陽性)複製物の95%以上が陽性であるSARS-CoV-2の最低検出可能濃度と定義した。
リアルタイムRT-PCRを使用して、開示されるプライマーセットを既知のSARS CoV-2陽性試料、陰性試料及び非SARS CoV-2呼吸器試料を使用してAbbott Alinity mシステムで評価した。表6に示されるように、既知の陽性試料の希釈系列により、100コピー/mLの検出限界が決定された。検出限界(LOD)は、試験の結果、全(真陽性)複製物の95%以上が陽性であるSARS-CoV-2の最低検出可能濃度と定義した。
予め試験された109個の凍結鼻咽喉スワブを、陽性(PPA)及び陰性(NPA)一致パーセントについて上記で使用されたリアルタイムPCRアッセイにおいて、再試験した(表7)。PPAは89.8%(53/59)であることが判明し、NPAは98%(49/50)であることが判明した。
臨床相関、交差反応性及び検出限界(表8)も、Abbott m2000リアルタイムSARS-CoV-2アッセイを使用して評価した。
合計104個の検体を、Abbott m2000リアルタイムSARS-CoV-2アッセイとAlinity m SARS-CoV-2リアルタイムRT-PCRアッセイの両方によって分析した。2つのアッセイ間の陽性一致パーセント(PPA)は100%(47/47)であり、陰性一致パーセント(NPA)は96.5%(55/57)であった。結果を表9及び10に要約する。
[実施例5]
英国において初めて同定されたSARS-CoV-2 B.1.1.7株は、伝播性の増加とスパイク遺伝子変異と関連が観察されたため、評価が最も懸念されている。スパイク遺伝子変異が主にB.1.1.7系統を特徴付けるが、ゲノム全体に追加の変異が存在すると、種々の診断アッセイの性能に影響を及ぼす可能性がある。
英国において初めて同定されたSARS-CoV-2 B.1.1.7株は、伝播性の増加とスパイク遺伝子変異と関連が観察されたため、評価が最も懸念されている。スパイク遺伝子変異が主にB.1.1.7系統を特徴付けるが、ゲノム全体に追加の変異が存在すると、種々の診断アッセイの性能に影響を及ぼす可能性がある。
GISAIDにおける(N=1787、2020年12月21日にアクセス)B.1.1.7系統の初期のインシリコ調査により、本明細書中に記載されるプライマー、プローブ及び方法の性能に懸念のある、系統を特徴付ける変異(lineage-defining mutation)は明らかにされなかった。ウイルス培養物(BEI NR-54011、EPI_ISL_751801)を65℃において30分間、熱不活性化し、希釈系列で試験した。他の株で以前に観察された予想範囲において、複数の希釈溶液が検出された(表11)。これらの結果は、本プライマー、プローブ及び方法がB.1.1.7株を確実に検出できるというインシリコ予測を裏付けた。これらは、英国公衆衛生庁(Public Health England)によって実施された最近の評価と一致している。
残りの患者鼻咽喉スワブ検体を用いて、さらなる評価を行った。全ての検体のゲノム配列を完成させ、B.1.1.7系統に属することが確認された。残量に限りがあるため、残りのVTM(ウイルス輸送用培地;viral transport media)を試験前に5~62.5倍に希釈した。充分な量の検体が全て検出された(表11)。
B.1.351系統は南アフリカで初めて同定された。それ以来、これは、十数カ国を超えて蔓延している。初期の報告は、このバリアントが中和抗体を逃れる可能性があることを示している。B.1.351系統の独特の変異プロフィールは、主にスパイク遺伝子変異K417N、E484K及びN501Yによって特徴付けられるが、ゲノム全体に追加の変異が存在すると、種々の診断アッセイの性能に影響を及ぼす可能性がある。
GISAIDにおける(N=195、2020年12月27日にアクセス)B.1.351系統の初期のインシリコ調査)により、本明細書中に記載されるプライマー、プローブ及び方法の性能に懸念のある、系統を特徴付ける変異は明らかにされなかった。2つのウイルス培養物(BEI NR-54008、NR-54009)を熱不活性化し、希釈系列で試験し、他の株で以前に観察された範囲において検出した(表12)。これらの結果は、本プライマー、プローブ及び方法がB.1.351系統を確実に検出できるというインシリコ予測を裏付けた。
前述の詳細な説明及び付随する実施例は、単に例示的なものであり、開示の範囲に対する制限と解釈されるべきではなく、開示の範囲は添付した特許請求の範囲及びその均等物によってのみ定義されることが理解される。
開示される実施形態に対する種々の変更及び修正は、当業者には明らかであり、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。
Claims (21)
- 試料中のSARS-CoV-2のリコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドのセットであって、
配列番号17と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号19と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号18と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド、若しくは
配列番号20若しくは21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号25若しくは26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号22~24のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチド、又は
それらの組合せ
を含み、
各プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
セット。 - 第1の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号20と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号25と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドが配列番号22又は23と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む、請求項1に記載のセット。
- 第1の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号21と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、第2の増幅オリゴヌクレオチドが配列番号25又は26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含み、プローブオリゴヌクレオチドが配列番号24と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む、請求項1に記載のセット。
- 検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項1~3のいずれかに記載のセット。
- 試料中のSARS-CoV-2を検出するための方法であって、
試料を、請求項1~4のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのセット及び増幅用試薬と接触させるステップ、
リコンビナーゼ-ポリメラーゼ増幅を使用して、試料中に存在する1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列を増幅するステップ、
1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2核酸配列にハイブリダイズするステップ、並びに
検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含む、方法。 - 検出可能な標識からの1つ以上のシグナルの存在が、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への、1種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す、請求項5に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドのセットからの第1及び第2の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む、請求項5又は6に記載の方法。
- 増幅用試薬が、ポリメラーゼ;リコンビナーゼ;リコンビナーゼローディングタンパク質;一本鎖結合タンパク質;バッファー;デオキシリボヌクレオチド;若しくはリボヌクレオチド三リン酸;クラウディング剤;ATP、ATP類似体若しくはATP産生系;又はそれらの組合せからなる群から選択される、請求項5~7のいずれかに記載の方法。
- 試料が、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含む、請求項5~8のいずれかに記載の方法。
- 試料中のSARS-CoV-2を検出するためのキットであって、
少なくとも1つの、請求項1~4のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドのセット、又は
配列番号17~26と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドのいずれか
を含む、キット。 - 核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びに/又は使用説明書をさらに含む、請求項10に記載のキット。
- 試料中のSARS-CoV-2を増幅及び検出するためのオリゴヌクレオチドの群であって、
配列番号2と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号4と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、及び配列番号6と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第1のセット
を含み、
プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
群。 - 配列番号11及び15のいずれかと少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第1の増幅オリゴヌクレオチド、配列番号3と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含む第2の増幅オリゴヌクレオチド、並びに配列番号5と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む、オリゴヌクレオチドの第2のセット
をさらに含み、
プローブオリゴヌクレオチドが検出可能な標識を含む、
請求項12に記載の群。 - 検出可能な標識がフルオロフォアである、請求項12又は13に記載の群。
- 試料中のSARS-CoV-2を検出するための方法であって、
試料を、請求項12~14のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの群及び増幅用試薬と接触させるステップ、
試料中に存在する1種以上の標的SARS-CoV-2核酸配列を増幅するステップ、
1種以上のオリゴヌクレオチドプローブを、1種以上の増幅された標的SARS-CoV-2核酸配列にハイブリダイズするステップ、並びに
検出可能な標識からのシグナルを測定することによって、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への1種以上のプローブオリゴヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを検出するステップ
を含む、方法。 - 検出可能な標識からの1つ以上のシグナルの存在が、1種以上の増幅されたSARS-CoV-2標的核酸配列への、1種以上のプローブオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを示す、請求項15に記載の方法。
- オリゴヌクレオチドのセットからの第1及び第2の増幅オリゴヌクレオチドをリコンビナーゼ剤と接触させるステップをさらに含む、請求項15又は16に記載の方法。
- 増幅用試薬が、ニッキング酵素、ポリメラーゼ、一本鎖結合タンパク質、リコンビナーゼ剤、ヘリカーゼ、レゾルバーゼ、酵素補因子、バッファー、デオキシリボヌクレオチド、若しくはリボヌクレオチド三リン酸、又はそれらの組合せを含む、請求項15~17のいずれかに記載の方法。
- 試料が、鼻腔スワブ若しくはブラシ、唾液、粘液、血液、血清、血漿又は糞便を含む、請求項15~18のいずれかに記載の方法。
- 試料中のSARS-CoV-2を検出するためのキットであって、
少なくとも1つの、請求項12~14のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドの群、又は
配列番号2~6、11及び15と少なくとも70%の類似性を有する核酸配列を含むオリゴヌクレオチドのいずれか
を含む、キット。 - 核酸配列を増幅及び検出するための試薬並びに/又は使用説明書をさらに含む、請求項20に記載のキット。
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