CN110887795A - 一种钼单原子纳米酶材料及其在黄嘌呤比色传感中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种钼单原子纳米酶材料及其在黄嘌呤比色传感中的应用。该钼单原子纳米酶材料利用ZIF‑8作为主体，乙酰丙酮钼作为客体，通过室温搅拌和高温煅烧的方法合成了钼单原子负载在氮掺杂的碳基底上的纳米材料。本发明主要应用于超灵敏和选择性检测人体尿液中黄嘌呤，利用钼单原子纳米酶专一高效的类过氧化物酶活性，构建了一种高选择性和灵敏性的比色传感平台。本发明充分利用了钼单原子纳米酶独特的结构和高效的酶活性，克服了天然酶易失活、稳定性差、成本高的问题，有效地提高了黄嘌呤检测的传感性能。
Description
技术领域
本发明属于生物传感技术应用领域，特别涉及一种钼单原子纳米酶材料及其在黄嘌呤比色传感中的应用。
背景技术
酶，作为一种重要的生物催化剂，具有催化效率高、底物专一、反应条件温和等特点，在生物催化反应中具有极其重要的地位。但其稳定性差、成本高、储存条件苛刻等缺点，限制了其广泛的应用。纳米酶，作为一种新型的人工模拟酶，可以模拟多种酶活性、成本低、易于储存和运输，兼具天然酶和纳米材料两者优势。目前已经有超过50多种材料和结构的纳米材料被开发成为纳米酶。因为纳米酶的高稳定性和易于修饰等优点，在生物传感和免疫测定等分析领域，纳米酶逐渐成为替代天然酶的热门材料。
目前，纳米酶材料已经能够具有较高的催化活性，而且具有可调和可控的纳米酶活性。但是，酶催化反应需要高度的底物专一性和选择性，现有纳米酶大多不能具有高度专一酶活性，无法满足实际生物催化的应用。到目前为止，具有高效专一酶活性的纳米酶还未被报道过。而且，普通纳米材料的结构和组分较为复杂，不利于构建专一的酶活性，在实际生物传感和分子检测中，会造成未知的干扰。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种钼单原子纳米酶材料及其在黄嘌呤比色传感中的应用。该单原子纳米酶材料通过将钼单原子引入到氮掺杂碳基底上，构建了一种钼单原子纳米酶，实现了高效且单一的类过氧化物酶活性，并成功应用于黄嘌呤比色传感器中，实现了较宽的线性范围、较高的灵敏性、较低的检测限和良好的稳定性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种钼单原子纳米酶材料，所述钼单原子纳米酶材料通过以下方法制备得到：
(1)将2-甲基咪唑溶于无水甲醇中，搅拌均匀，得到第一溶液，所述第一溶液的浓度为 0.05g/mL；
(2)将六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼溶于无水甲醇中，所述六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼的质量比为18:1，搅拌均匀，得到第二溶液，所述第二溶液的浓度为0.05g/mL；
(3)将步骤2所得第二溶液逐滴加入到步骤1所得的第一溶液中，所述第一溶液与第二溶液的体积比为1:1，室温下搅拌8-12h后，静置沉淀，通过离心方法去除无水甲醇，离心转速为8500rpm，时间为5min，离心3次，最后将沉淀置于60℃条件下真空干燥8h以上，得到白色固体。
(4)将步骤3所得的白色固体置于刚玉磁舟中，于管式炉中氮气气氛保护下，以5℃/min 的升温速度，升温至700-900℃，煅烧1-3h，得到钼单原子纳米酶材料。
一种所述钼单原子纳米酶材料在黄嘌呤比色传感中的应用。
进一步地，将5-10μl浓度为0.5U/mL的黄嘌呤氧化酶-PBS缓冲溶液加入到用PBS缓冲溶液稀释的人体尿液样本中，所述人体尿液样本的体积为200μl，在37℃下保温30min后，将权利要求1制备得到的钼单原子纳米酶材料加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，所述钼单原子纳米酶材料在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的浓度为1mg/mL，取50μl钼单原子纳米酶材料的醋酸-醋酸钠缓冲溶液加入到所述人体尿液样本中，并加入5-10μl浓度为5mM的3`3`5`5`-四甲基联苯胺，获得测试样本，保持测试样本的总体积为2.5mL，在37℃下保温30min，经紫外-分光光度计，检测黄嘌呤浓度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明通过简单的室温搅拌和高温煅烧的方法，得到了钼单原子纳米酶材料。采用该材料构建的比色传感器可以应用于选择性检测黄嘌呤中。在催化活性方面，合成出的具有明确单一结构的钼单原子催化剂，借助于其原子级分散活性位点和明确的结构，单原子催化剂可以模拟天然金属蛋白酶的活性位点，从而提高了其作为纳米酶的催化能力。单原子催化剂对于理解纳米酶的催化机理，弥补天然酶与纳米酶之间的鸿沟，展示出了巨大的潜力。比现有大多数的纳米酶，具有更单一高效的类过氧化物酶活性。其中钼单原子的引入，更能够有效的提高了单原子纳米酶催化剂对过氧化氢的特异性吸附，从而选择性提高了其用作类过氧化物酶的活性，弥补了纳米酶在特异性上与天然酶的差距，对实现高效灵敏检测人体尿液中痕量的黄嘌呤起到积极作用。
附图说明
图1为本发明的SEM图：图1a是本发明制备的室温搅拌得到的钼单原子前驱体的SEM 图；图1b是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的SEM图；
图2是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的球差校正高角环形暗场像- 扫描透射电子显微镜图片((AC)HAADF-STEM)；
图3是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的傅里叶变换拓展边X射线吸收精细结构在R空间的拟合曲线和结构；
图4是本发明制备的钼单原子纳米酶材料在过氧化氢-3`3`5`5`-四甲基联苯胺体系中的类过氧化物酶活性；
图5为本发明制备的钼单原子纳米酶材料检测过氧化氢的性质图；
图6为本发明制备的钼单原子纳米酶材料检测黄嘌呤的性质图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明本发明的技术解决方案，这些实施例不能理解为是对技术解决方案的限制。
实施例1：钼单原子纳米酶材料的制备
(1)将4g 2-甲基咪唑溶于80ml无水甲醇中，搅拌均匀，得到第一溶液，浓度为0.05g/mL；
(2)将六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼溶于80ml无水甲醇中，所述六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼的质量比为18:1，搅拌均匀，得到第二溶液；
(3)将步骤2所得第二溶液逐滴加入到步骤1所得的第一溶液中，室温下搅拌8h后，静置沉淀，通过离心方法去除无水甲醇，离心转速为8500rpm，时间为5min，离心3次，最后将沉淀在60℃下真空干燥8h以上，得到白色固体。
(4)将步骤3所得的白色固体置于刚玉磁舟中，于管式炉中氮气气氛保护下，以5℃/min 的升温速度，升温至700℃，煅烧3h，得到钼单原子纳米酶材料。
图1a为本发明制备的室温搅拌得到的钼单原子前驱体的扫描电子显微镜图片(SEM)，从图中可以看出钼单原子前驱体是菱形十二面体结构，直径约为40nm左右。图1b是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的扫描电子显微镜图片(SEM)，从图中可以看出，钼单原子前驱体在高温煅烧之后虽然有部分凹陷，但仍然保持菱形十二面体多孔立体结构，有利于钼单原子的分散，更有利于后续酶催化底物的吸附和酶催化反应的进行。
图2是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的球差校正高角环形暗场像- 扫描透射电子显微镜图片((AC)HAADF-STEM)，从图中可以看出钼单原子均匀分布在氮掺杂的碳基底上，无明显团聚。从而有利于后续钼单原子充分发挥单原子的结构优势，提升单原子纳米酶的催化活性，实现高效灵敏的生物小分子检测。
图3是本发明制备的高温煅烧得到的钼单原子纳米酶材料的傅里叶变换拓展边X射线吸收精细结构在R空间的拟合曲线和结构，从图中可以看出，没有Mo-Mo的配位峰出现，证实钼确实是以单原子形态存在的。单原子催化剂可以模拟天然金属蛋白酶的活性位点，从而为开发成高效的单原子纳米酶提供了理想的平台。
实施例2
(1)将4g 2-甲基咪唑溶于80ml无水甲醇中，搅拌均匀，得到第一溶液，所述第一溶液的浓度为0.05g/mL；
(2)将六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼溶于80ml无水甲醇中，所述六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼的质量比18:1，搅拌均匀，得到第二溶液；
(3)将步骤2所得第二溶液逐滴加入到步骤1所得的第一溶液中，室温下搅拌12h后，静置沉淀，通过离心方法去除无水甲醇，离心转速为8500rpm，时间为5min，离心3次，最后将沉淀置于60℃条件下真空干燥8h以上，得到白色固体。
(4)将步骤3所得的白色固体置于刚玉磁舟中，于管式炉中氮气气氛保护下，以5℃/min 的升温速度，升温至900℃，煅烧1h，经SEM、(AC)HAADF-STEM、XAFS的分析和表征，进一步确定得到了钼单原子纳米酶材料。
实施例3：
将实施例1制备得到的钼单原子纳米酶材料作为黄嘌呤比色传感器进行应用，具体步骤如下：
将5μl浓度为0.5U/mL的黄嘌呤氧化酶-PBS缓冲溶液加入到用PBS缓冲溶液稀释的人体尿液样本中，所述人体尿液样本的体积为200μl，在37℃下保温30min后，将实施例1 制备得到的钼单原子纳米酶材料加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，所述钼单原子纳米酶材料在醋酸 -醋酸钠缓冲溶液中的浓度为1mg/mL，取50μl钼单原子纳米酶材料的醋酸-醋酸钠缓冲溶液加入到所述人体尿液样本中，并加入5μl浓度为5mM的3`3`5`5`-四甲基联苯胺，获得测试样本，保持测试样本的总体积为2.5mL，在37℃下保温30min，经紫外-分光光度计，检测黄嘌呤浓度。根据底物的特征紫外-可见吸收曲线，可以评估材料的类过氧化物酶性质，还可以得到不同过氧化氢或黄嘌呤浓度下紫外-可见吸收曲线以及校正曲线。
图4为本发明所制备的钼单原子纳米酶材料在氧化氢-3`3`5`5`-四甲基联苯胺体系中的类过氧化物酶性质。从图中可看出，相比于没有加入催化剂和无钼单原子的氮掺杂碳的基底，引入钼单原子纳米酶之后，底物在652nm处的特征紫外-可见吸收峰明显增加，说明此材料具有良好的类过氧化物酶的性质。有利于后续充分发挥其单原子纳米酶的优势，构建相应的比色传感平台，实现高效灵敏检测生物小分子。
图5左图是本发明制备的钼单原子纳米酶材料在不同浓度过氧化氢-3`3`5`5`-四甲基联苯胺体系的紫外-可见吸收曲线。图5右图是对应于图5左图的紫外-可见吸收曲线曲线在652nm 处的吸光度与过氧化氢浓度的校准曲线。图5右图内插图是相应的体系颜色变化照片。从图中可看出，从图中可看出，该过氧化氢比色平台的线性范围为10μM-700μM。
图6左图是本发明制备的钼单原子纳米酶材料在不同浓度黄嘌呤-3`3`5`5`-四甲基联苯胺体系的紫外-可见吸收曲线。图6右图是对应于图6左图的紫外-可见吸收曲线曲线在652nm 处的吸光度与黄嘌呤浓度的校准曲线。图6右图内插图是相应的体系颜色变化照片。从图中可看出，从图中可看出，该黄嘌呤比色平台的线性范围为0μM-400μM，还具有较高的灵敏度(1.3621mM-1)、较低的检测限(10nM)和良好的稳定性、重复性。
另外，按照本领域公开的技术，本发明制备的钼单原子纳米酶材料可以应用于检测人体尿液中痕量的黄嘌呤含量，实现了满意的回收率：99.4％–101.9％。
实施例4
将10μl浓度为0.5U/mL的黄嘌呤氧化酶-PBS缓冲溶液加入到用PBS缓冲溶液稀释的人体尿液样本中，所述人体尿液样本的体积为200μl，在37℃下保温30min后，将实施例2制备得到的钼单原子纳米酶材料加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，所述钼单原子纳米酶材料在醋酸 -醋酸钠缓冲溶液中的浓度为1mg/mL，取50μl钼单原子纳米酶材料的醋酸-醋酸钠缓冲溶液加入到所述人体尿液样本中，并加入10μl浓度为5mM的3`3`5`5`-四甲基联苯胺，获得测试样本，保持测试样本的总体积为2.5mL，在37℃下保温30min，经紫外-分光光度计，同样可以检测黄嘌呤浓度为80.805±4.91μM。
Claims (3)
1.一种钼单原子纳米酶材料，其特征在于，所述钼单原子纳米酶材料通过以下方法制备得到：
(1)将2-甲基咪唑溶于无水甲醇中，搅拌均匀，得到第一溶液，所述第一溶液的浓度为0.05g/mL；
(2)将六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼溶于无水甲醇中，所述六水合硝酸锌和乙酰丙酮钼的质量比为18:1，搅拌均匀，得到第二溶液，所述第二溶液的浓度为0.05g/mL；
(3)将步骤2所得第二溶液逐滴加入到步骤1所得的第一溶液中，所述第一溶液与第二溶液的体积比为1:1，室温下搅拌8-12h后，静置沉淀，通过离心方法去除无水甲醇，离心转速为8500rpm，时间为5min，离心3次，最后将沉淀置于60℃条件下真空干燥8h以上，得到白色固体。
(4)将步骤3所得的白色固体置于刚玉磁舟中，于管式炉中氮气气氛保护下，以5℃/min的升温速度，升温至700-900℃，煅烧1-3h，得到钼单原子纳米酶材料。
2.一种权利要求1所述钼单原子纳米酶材料在黄嘌呤比色传感中的应用。
3.如权利要求2所述应用，其特征在于，将5-10μl浓度为0.5U/mL的黄嘌呤氧化酶-PBS缓冲溶液加入到用PBS缓冲溶液稀释的人体尿液样本中，所述人体尿液样本的体积为200μl，在37℃下保温30min后，将权利要求1制备得到的钼单原子纳米酶材料加入醋酸-醋酸钠缓冲溶液，所述钼单原子纳米酶材料在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中的浓度为1mg/mL，取50μl钼单原子纳米酶材料的醋酸-醋酸钠缓冲溶液加入到所述人体尿液样本中，并加入5-10μl浓度为5mM的3`3`5`5`-四甲基联苯胺，获得测试样本，保持测试样本的总体积为2.5mL，在37℃下保温30min，经紫外-分光光度计，检测黄嘌呤浓度。
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