CN110869495B - 间充质干细胞的制造方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题在于提供一种通过简便的工序进行的向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法及间充质干细胞，还提供一种利用上述的间充质干细胞的制造方法的分化诱导的细胞的制造方法、分化诱导的细胞及向脂肪细胞分化的分化抑制剂。根据本发明，提供一种向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法，所述制造方法包括在溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞的工序。

Description

间充质干细胞的制造方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种通过简便的工序进行的向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法。本发明涉及一种包括在分化诱导培养基中，培养抑制分化成上述脂肪细胞的间充质干细胞的工序的经分化诱导的细胞的制造方法。本发明涉及一种通过上述方法来制造的间充质干细胞及经分化诱导的细胞。本发明还涉及一种向脂肪细胞分化的分化抑制剂。
背景技术
活体内的脂肪细胞积聚所伴随的肥胖症及代谢综合症发病的基础为因存在于所积聚的脂肪细胞中的巨噬细胞引起的炎症反应。脂肪细胞的起源为间充质干细胞，骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及脂肪细胞等由间充质干细胞诱导。正在研究抑制间充质干细胞的分化的方法。
专利文献1中记载有，使用刚性处于150～750kPa的范围的凝胶及基质来保存间充质干细胞组的方法。专利文献2中记载有，脂肪分化抑制剂，其包含具有与RANK(NF-κB的受体活化剂)的半胱氨酸富集区(cysteine rich doma in)之一类似的序列的环肽来作为有效成分。专利文献3中记载有，具有特定的氨基酸序列且具有诱导人体骨髓干细胞的增殖/分化的抑制的活性的肽。专利文献4中记载有，在原核生物细胞内以最少单位表达从人Delta1的序列得到的多肽，使用改性剂及还原剂进行纯化来得到的具有干细胞分化抑制活性的多肽。
另一方面，作为再生医疗中的代表性脚手架材料，已知有明胶。明胶作为活体适当性较高且安全性高的材料而被知晓，医疗用途中的应用实情高。专利文献5中记载有，细胞支撑体，其由基因重组明胶(重组明胶)构成，且由具有规定特性的多孔体构成。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2015-043780号公报
专利文献2：日本特开2014-198686号公报
专利文献3：日本特开平3-228683号公报
专利文献4：日本特开2007-326834号公报
专利文献5：国际公开WO2011/108537号
发明内容
发明要解决的技术课题
专利文献1中，以规定的范围内的比率混合丙烯酰胺与双丙烯酰胺并进行凝胶化，由此制作具有规定刚性的凝胶，但是操作复杂。专利文献2～4中记载有，使用肽或多肽来抑制向脂肪的分化的内容，但是还期望通过简便的工序，抑制从间充质干细胞向脂肪细胞的分化的方法。
本发明的课题在于提供一种通过简便的工序进行的向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法及通过上述方法来制造的间充质干细胞。本发明的另一课题在于提供一种利用上述的间充质干细胞的制造方法的经分化诱导的细胞的制造方法及通过上述方法来制造的经分化诱导的细胞。本发明的另一个课题在于提供一种向脂肪细胞分化的分化抑制剂。
用于解决技术课题的手段
本发明人等为了解决上述课题而进行深入研究的结果，发现了通过在溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞而能够制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞。本发明是根据这些见解来完成的。
即，根据本发明，可提供以下发明。
＜1＞一种向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法，所述制造方法包括在溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞的工序。
＜2＞根据＜1＞所述的方法，其中，
重组明胶具有由胶原蛋白特征性的Gly-X-Y表示的序列的重复，X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同，重组明胶的分子量为2kDa以上且100kDa以下。
＜3＞根据＜1＞或＜2＞所述的方法，其中，
重组明胶具有由胶原蛋白特征性的Gly-X-Y表示的序列的重复，X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同，重组明胶的分子量为10kDa以上且90kDa以下。
＜4＞根据＜1＞至＜3＞中任一项所述的方法，其中，
重组明胶具有由胶原蛋白特征性的Gly-X-Y表示的序列的重复，X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，多个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同，重组明胶在一分子中包含2个序列以上细胞粘附信号。
＜5＞根据＜4＞所述的方法，其中，
细胞粘附信号为由Arg-Gly-Asp表示的氨基酸序列。
＜6＞根据＜1＞至＜5＞中任一项所述的方法，其中，
重组明胶的氨基酸序列由下述式表示。
A-[(Gly-X-Y)n]m-B式中，A表示任一氨基酸或氨基酸序列，B表示任一氨基酸或氨基酸序列，n个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，n个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种，n表示3～100的整数，m表示2～10的整数。另外，n个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。
＜7＞根据＜1＞至＜6＞中任一项所述的方法，其中，
重组明胶的氨基酸序列由下述式表示。
Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly式中，63个X分别独立地表示氨基酸中的任一种，63个Y分别独立地表示氨基酸中的任一种。另外，63个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。
＜8＞根据＜1＞至＜7＞中任一项所述的方法，其中，
重组明胶具有(1)序列号1中所记载的氨基酸序列或(2)与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上的序列同源性且具有细胞粘附性的氨基酸序列。
＜9＞根据＜1＞至＜8＞中任一项所述的方法，其中，
间充质干细胞为来自于骨髄的细胞或来自于软骨的细胞。
＜10＞根据＜1＞至＜9＞中任一项所述的方法，其中，
溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基为未分化维持用液体培养基。
＜11＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的方法，其中，
溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中的浓度为0.01μg/mL～500μg/mL。
＜12＞根据＜1＞至＜10＞中任一项所述的方法，其中，
溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中的浓度为0.02μg/mL～300μg/mL。
＜13＞一种经分化诱导的细胞的制造方法，所述制造方法包括：
通过＜1＞至＜12＞中任一项所述的方法来制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的工序；及
在分化诱导培养基中，培养抑制上述分化成脂肪细胞的间充质干细胞的工序。
＜14＞一种间充质干细胞，其通过＜1＞至＜12＞中任一项所述的方法来制造。
＜15＞一种经分化诱导的细胞，其通过＜13＞所述的方法来制造。
＜16＞一种向脂肪细胞分化的分化抑制剂，所述分化抑制剂包括具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。
发明效果
根据基于本发明的间充质干细胞的制造方法，能够通过简便的工序来制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞。根据利用上述的间充质干细胞的制造方法的经分化诱导的细胞的制造方法，能够通过简便的工序来制造所期望的细胞。通过本发明的方法来制造的间充质干细胞及经分化诱导的细胞在再生医疗等中有用。并且，根据基于本发明的向脂肪细胞分化的分化抑制剂，能够通过简便的工序来制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞。
附图说明
图1表示在细胞为UDE BM且培养基为MesenPro的情况下，用油红对细胞进行染色来确认了向脂肪细胞的分化的结果。
图2表示在细胞为UDE BM且培养基为DMEM的情况下，用油红对细胞进行染色来确认了向脂肪细胞的分化的结果。
图3表示在细胞为UDE BM且培养基为PRIME-XV的情况下，用油红对细胞进行染色来确认了向脂肪细胞的分化的结果。
图4表示在细胞为Yub2505且培养基为PRIME-XV的情况下，用油红对细胞进行染色来确认了向脂肪细胞的分化的结果。
图5表示在细胞为BMSC(Lonza：PT-2501)且培养基为MesenPro的情况下，改变重组明胶添加量来进行培养之后，用尼罗河红对使用Lonza(图5的上段的A)或者PromoCell(图5的下段的B)的脂肪分化诱导培养基进行脂肪分化的细胞进行染色来确认了向脂肪细胞的分化的结果。
图6表示对图5的显微镜照片计数分化成脂肪的细胞数的结果。图6的上段的A为使用Lonza的脂肪分化诱导培养基来进行脂肪分化的情况，图6的下段的B为使用PromoCell的脂肪分化诱导培养基来进行脂肪分化的情况。
图7表示在细胞为BMSC(Lonza：PT-2501)且培养基为MesenPro的情况下，改变重组明胶添加量来进行培养并测量细胞数的结果。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行详细说明。
本发明涉及一种向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法，尤其为包括在溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞的工序的方法。
根据本发明，能够抑制间充质干细胞分化成脂肪细胞。
进行使用间充质干细胞的细胞治疗的情况下，保证治疗效果的意义的重点在于避免在活体内容易受到周围的微小环境影响的间充质干细胞向非预期的方向(例如脂肪细胞)的组织分化。通过本发明的方法得到的细胞例如能够用于再生医疗中的骨组织修复或软骨组织修复等。
本发明中，在溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞。作为在溶解有重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞的时间并无特别限定，可以为间充质干细胞的维持或扩大培养时、间充质干细胞的分化诱导培养时的任一个，也可以为上述中的两个。
优选在间充质干细胞的维持或扩大培养时，能够在溶解有重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞。根据上述优选方式，溶解有具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基为未分化维持用液体培养基。根据上述优选方式，通过仅在间充质干细胞的维持或扩大培养时向培养基中添加重组明胶等简便的操作(无需向分化诱导培养基添加重组明胶)，能够抑制间充质干细胞分化成脂肪细胞。
＜重组明胶＞
本发明中所述的重组明胶是指，具有通过基因重组技术制成的类似明胶的氨基酸序列的多肽或蛋白样物质。能够在本发明中所使用的重组明胶优选具有由胶原蛋白特征性的Gly-X-Y表示的序列(X及Y分别独立地表示氨基酸中的任一种)的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。优选在一分子中包含2个序列以上的细胞粘附信号。作为重组明胶，能够使用具有来自于人体胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的明胶。例如能够使用EP1014176、US专利6992172号、国际公开WO2004/085473、国际公开WO2008/103041等中所记载的明胶，但是并不限定于这些。作为本发明中所使用的重组明胶而优选的明胶为以下方式的明胶。
重组明胶由于天然明胶的固有能力而生物相容性优异，并且并非来自于天然，因此无需担心牛海绵状脑病(BSE)等，从而非感染性优异。重组明胶不包含来自于动物的成分，因此能够在不使用血清(Serum free)及不使用来自于动物的成分(Xeno free)的条件下培养间充质干细胞。并且，与天然明胶相比，重组明胶均匀且序列已被确定，因此能够精密地设计。
重组明胶的分子量并无特别限定，优选为2000以上且100000以下(2kDa以上且100kDa以下)，更优选为2500以上且95000以下(2.5kDa以上且95k Da以下)，进一步优选为5000以上且90000以下(5kDa以上且90kDa以下)，最优选为10000以上且90000以下(10kDa以上且90kDa以下)。
重组明胶优选在胶原蛋白中具有以特征性Gly-X-Y表示的序列的重复。在此，多个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。Gly-X-Y中，Gly表示甘氨酸，X及Y分别独立地表示任一氨基酸(优选除了甘氨酸以外的任一氨基酸)。在胶原蛋白中，以特征性Gly-X-Y表示的序列是指，明胶/胶原蛋白的氨基酸成分及序列中，与其他蛋白质相比为非常特殊的部分结构。在该部分中，甘氨酸占总体的约3分之1，在氨基酸序列中是每3个中重复一个。甘氨酸为最简单的氨基酸，针对分子链的配置的束缚也较少，对凝胶化时的螺旋结构的再生贡献较大。以X及Y表示的氨基酸中包含较多的亚氨酸(脯氨酸、羟脯氨酸)，优选为占总体的10％～45％。优选重组明胶的序列的80％以上，进一步优选95％以上，最优选99％以上的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
通常的明胶中，极性氨基酸中具有电荷的氨基酸与无电荷氨基酸以1:1的比率存在。在此，极性氨基酸是指，具体而言，半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸及精氨酸，这些中极性无电荷氨基酸是指，半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸及酪氨酸。在本发明中所使用的重组明胶中，所构成的所有氨基酸中，极性氨基酸的比例为10～40％，优选为20～30％。并且，优选上述极性氨基酸中的无电荷氨基酸的比例为5％以上且小于20％，优选为小于10％。而且，优选为在序列上不包含丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸中的任一种氨基酸，优选两种以上的氨基酸。
在通常的多肽中，已知有作为细胞粘附信号而起作用的最小氨基酸序列(例如，Nagai Co.,Ltd.出版发行的“病态生理”Vol.9、No.7(1990年)527页)。本发明中所使用的重组明胶优选在1分子中具有2个以上的这些细胞粘附信号。
作为具体的序列，在粘附的细胞的种类较多的方面，优选以氨基酸单字母代码表示的RGD序列、LDV序列、REDV序列、YIGSR序列、PDSGR序列、RYVVLPR序列、LGTIPG序列、RNIAEIIKDI序列、IKVAV序列、LRE序列、DGEA序列及HAV序列的序列。进一步优选为RGD序列、YIGSR序列、PDSGR序列、LGTIPG序列、IKVAV序列及HAV序列，尤其优选为RGD序列。RGD序列中，优选为ERGD序列。通过使用具有细胞粘附信号的重组明胶，能够提高细胞的基质生产量。例如，作为细胞，在使用了间充质干细胞的软骨分化情况下，能够提高糖胺聚糖(GAG)的生产。
作为本发明中所使用的重组明胶中的RGD序列的配置，优选RGD之间的氨基酸数在0～100之间，优选在25～60之间不均匀。
从细胞粘附·增殖性的观点考虑，该最小氨基酸序列的含量优选在蛋白质1分子中为3～50个，进一步优选为4～30个，尤其优选为5～20个。最优选为12个。
在本发明中所使用的重组明胶中，RGD序列(基序)相对于氨基酸总数的比例优选至少为0.4％。当明胶包括350个以上的氨基酸时，优选为350个氨基酸的每一段包含至少一个RGD基序。RGD基序相对于氨基酸总数的比例进一步优选为至少0.6％，进一步优选为至少0.8％，进一步优选为至少1.0％，更进一步优选为至少1.2％，最优选至少为1.5％。肽内的RGD基序的数相对于250个氨基酸优选为至少4个，进一步优选为至少6个，进一步优选为至少8个，进一步优选为12个以上且16个以下。RGD基序的0.4％的比例中，每250个氨基酸对应于至少一个RGD序列。RGD基序的数为整数，因此为了满足至少0.4％的特征而包括251个氨基酸的明胶应包含至少两个RGD序列。关于本发明中的明胶，优选每250个氨基酸包含至少两个RGD序列，更优选每250个氨基酸包含至少3个RGD序列，进一步优选每250个氨基酸包含至少4个RGD序列。作为本发明中的明胶的另一方式，包含至少4个RGD基序，优选包含至少6个，更优选包含至少8个，进一步优选包含12个以上且16个以下的RGD基序。
重组明胶可以局部地进行水解。
优选本发明中所使用的重组明胶的氨基酸序列由式：A-[(Gly-X-Y)n]m-B表示。n个X分别独立地表示氨基酸的任一个，n个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。m优选表示2～10的整数，更优选表示3～5的整数。n优选为3～100的整数，进一步为15～70的整数，最优选为50～65的整数。A表示任一氨基酸或氨基酸序列，B表示任一氨基酸或氨基酸序列。另外，n个Gly-X-Y分别可以相同也可以不同。
更优选本发明中所使用的重组明胶的氨基酸序列由式：Gly-Ala-Pro-[(Gly-X-Y)63]3-Gly(式中，63个X分别独立地表示氨基酸的任一个，63个Y分别独立地表示氨基酸的任一个。另外，63个Gly-X-Y可以分别相同也可以不同。)表示。
重复单元中优选为键合多个天然存在的胶原蛋白的序列单元。在此所述的存在于天然中的胶原蛋白是指只要为存在于天然中的胶原蛋白则可以为任一个，优选为I型、II型、III型、IV型或V型胶原蛋白。更优选为I型、II型或III型胶原蛋白。根据另一方式，上述胶原蛋白的来源优选为人、牛、猪、小鼠或大鼠，更优选为来自于人。
本发明中所使用的重组明胶的等电点优选为5～10，更优选为6～10，进一步优选为7～9.5。关于重组明胶的等电点的测定，只要是能够测定公知的等电点的方法则并无限定，但是例如能够按照等电聚焦法(参考Maxey，C.R.(1976)；Phitogr.Gelatin 2，EditorCox，P.J.Academic，LonDon，EnGl.)，测定使1质量％明胶溶液通过阳离子及阴离子交换树脂的混晶管柱之后的pH来实施。
优选重组明胶未被去胺基化。
优选重组明胶不具有端肽。
优选重组明胶为通过对氨基酸序列进行编码的核酸而制备的实质上纯多肽。
本发明中所使用的重组明胶尤其优选为具有：
(1)序列号1中所记载的氨基酸序列，或
(2)与序列号1中所记载的氨基酸序列具有80％以上(进一步优选为90％以上，尤其优选为95％以上，最优选为98％以上)的序列同源性且具有细胞粘附性的氨基酸序列。
本发明中所使用的重组明胶的亲水性值「1/IOB」值优选为0至1.0。更优选为0～0.6，进一步优选为0～0.4。IOB是指，由藤田穆提出的基于表示有机化合物的极性/非极性的有机概念图的亲水性和疏水性的指数，其详细内容例如在“Pharmaceutical Bulletin”，vol.2,2,pp.163-173(1954)、“化学领域”vol.11,10,pp.719-725(1957)、“FRAGRANCEJOURNAL”，vol.50,pp.79-82(1981)等中进行了说明。简单而言，将所有的有机化合物的根源设为甲烷(CH4)，将其他化合物全都视为甲烷的衍生物，并将其碳原子数、取代基、相变部、环等分别设定为恒定数值，相加其得分之后求出有机性值(OV)、无机性值(IV)，并将该值绘制在以有机性值为X轴、无机性值为Y轴的图上。有机概念图中的IOB是指，有机概念图中的无机性值(IV)与有机性值(OV)之比、即为“无机性值(IV)/有机性值(OV)”。关于有机概念图的详细内容可参考《新版有机概念图-基础与应用-》(手背(单为甲时)田善生等著、三共出版、2008)。本说明书中，以求出IOB的倒数的“1/IOB”值表示亲水性和疏水性。该符号表示“1/IOB”值越小(接近0)，越亲水。
本发明中所使用的重组明胶中，由总平均亲水性(Grand average of hydropathicity(GRAVY))值表示的亲水性和疏水性标识优选为0.3以下且-9.0以上，进一步优选为0.0以下且-7.0以上。总平均亲水性值能够通过“Gasteiger E.,Hoogland C.,GattikerA.,Duvaud S.,Wilkins M.R.,Appel R.D.,Bairoch A.；Protein Identification andAnalysis Tools on the ExPASy Server；(In)John M.Walker(ed)：The ProteomicsProtocols Handbook,Humana Press(2005).pp.571-607”及“Gasteiger E.,Gattiker A.,Hoogland C.,Ivanyi I.,Appel R.D.,Bairoch A.；ExPASy：the proteomics server forin-depth protein knowledge and analysis.；Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003).”的方法得到。
关于本发明中所使用的重组明胶，本领域技术人员能够通过公知的基因重组技术来制造，例如能够依照EP1014176A2号公报、美国专利第6992172号公报、国际公开WO2004/085473号、国际公开WO2008/103041号等中所记载的方法来制造。具体而言，获取对规定的重组明胶的氨基酸序列进行编码的基因，并将其编入表达载体而制作重组表达载体，将其导入适当的宿主而制作转化体。以适当的培养基培养所得到的转化体，由此生成重组明胶，因此通过从培养物回收所产生的重组明胶，得到本发明中所使用的重组明胶。
本发明中，将重组明胶添加到间充质细胞培养时的液体培养基中。在溶解有重组明胶的液体培养基中的重组明胶的含量只要能够达到本发明的效果，则并无特别限定，但是通常为0.1ng/mL～500μg/mL，优选为1ng/mL～300μg/mL。与在现有技术文献中所记载的肽的含量相比，本发明的液体培养基中的重组明胶的含量大幅降低(约1/100,000倍量)，根据本发明，即使为更少量的添加量也能够达到优异的效果(向脂肪细胞的分化的抑制)。另外，本发明中，无需将重组明胶涂覆于培养器材中。
在溶解有重组明胶的液体培养基中的重组明胶浓度并无特别限定，但是从向脂肪细胞的分化受到抑制的性能的观点考虑，优选为0.01μg/mL以上，更优选为0.02μm/mL以上，进一步优选为0.01μg/mL以上，最优选为1μg/mL以上。从细胞增殖率的观点考虑，重组明胶浓度优选小于500μg/mL，更优选小于300μg/mL，进一步优选小于50μg/mL，最优选小于10μg/mL。
在溶解有重组明胶的液体培养基中的重组明胶浓度优选为0.01μg/mL以上且小于500μg/mL，优选为0.02μg/mL以上且小于300μg/mL，进一步优选为1μg/mL以上且小于50μg/mL，最优选为1μg/mL以上且小于10μg/mL。
＜培养基＞
液体培养基的种类只要为能够维持培养或扩大培养间充质干细胞的培养基则其种类并无特别限定，但是例如能够举出MesenPro(含有2％血清，生命科技)、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM)/F12(含有20％FBS(胎牛血清)(Gibco)，生命科技)、DMEM(含有10％FBS(Gibco)，SIGMA)、PRI ME-XV XSFM(无血清、JX能量)、MSCGM BulletKit(商标)(TakaraBio)、Mesencult-ACF(不含来自于动物的成分)及Mesencult-SF(无血清、均为veritas)、MSCGM BullrtKit(含有血清，Lonza)等。
＜间充质干细胞＞
本发明中所使用的间充质干细胞(MSC)为具有作为未分化细胞的复制能力且具有向骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及脂肪细胞等的分化能力的细胞。
间充质干细胞的起源并无特别限定，可以为人体间充质干细胞，也可以为小鼠、大鼠、猫或狗等来自于非人动物的间充质干细胞。
已知间充质干细胞能够从骨髄、软骨、脂肪组织，胎盘组织、脐带组织、牙髓等各种组织获取，其来源并无特别限定，但是间充质干细胞优选为来自于骨髄的细胞、来自于软骨的细胞或来自于脂肪的细胞。
间充质干细胞可以为投药的患者的自体细胞，也可以为异体细胞。
作为从各组织分离间充质干细胞的方法，能够采用以往的方法，例如能够通过胶原酶法从组织适当地分离间充质干细胞。例如，间充质干细胞能够将细胞表面标记(CD105、CD73、CD90等)作为标识来回收。
＜培养＞
作为在溶解有重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞时的培养条件，选择通常的细胞培养的条件即可。可例示37℃、5％CO2的条件等。培养中优选以适当的间隔(优选1天至7天1次，更优选3天至4天1次)交换培养基。培养期间并无特别限定，能够培养1天～20天，优选培养3天～15天，更优选培养3天～10天。
培养时能够使用板、培养皿、细胞培养用烧瓶、细胞培养用袋等细胞培养容器。另外，作为细胞培养用袋，优选具有透气性的袋。需要大量的细胞的情况下，也可以使用大型培养槽。培养能够实施开放体系或封闭体系中的任一个。
＜向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞＞
通过本发明的方法制造的向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞是指与在不含重组明胶的液体培养基中培养的间充质干细胞相比可抑制向脂肪细胞的分化能力的间充质干细胞。
通过在脂肪细胞分化培养基中培养间充质干细胞来进行向脂肪细胞的分化诱导之后确认向脂肪细胞的分化，由此能够评价向脂肪细胞的分化能力。脂肪细胞例如能够利用细胞形态的变化、脂肪细胞的特征性质或特异性标记来进行检测。脂肪细胞在细胞内积聚脂肪。因此，能够通过使用油红O对细胞内脂肪的染色来检测脂肪细胞。并且，作为(褐色)脂肪细胞的特异性标记，可举出UCP1、EVOL3(Elongation of very long chain fattyacid protein 3，延长极长链脂肪酸蛋白3)、PGC1A(PPAR gamma coactivator1-alpha，PPARγ共激活因子1-α)、PRDM16(PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16，PRD1-BF1-RIZ1同源结构域含有16)、CIDEA(Cell Death-Inducing DFFA-Like EffectorA，细胞死亡诱导DFFA样效应子A)等，能够将这些作为标识来检测脂肪细胞。另外，UCP1为解偶联蛋白质(UncouplinG protein)中的一种。特异性标记的检测时能够利用检疫的方法(基于抗体的检测)，但是关于蛋白质分子也可以通过其mRNA量的定量来实施检测。
根据本发明，可提供一种通过本发明的制造方法来制造的间充质干细胞。通过本发明的方法制造的间充质干细胞能够用于细胞移植。具体而言，本发明的细胞能够以在疾病部位移植细胞的目的来使用。作为移植方法，能够使用切开或内窥镜等。
＜经分化诱导的细胞的制造方法＞
根据本发明，可提供一种细胞的制造方法，其包括：通过上述的本发明的方法制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的工序；及在分化诱导培养基中培养上述向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的工序。根据上述方法，只要是能够从间充质干细胞分化诱导的细胞，则能够制造所期望的细胞。作为能够从间充质干细胞分化诱导的细胞，能够举出骨细胞、软骨细胞、心肌细胞及脂肪细胞等，但是并无特别限定。
分化诱导培养基能够根据应分化诱导的所期望的细胞的种类来适当选择。
进行向骨细胞的分化诱导的情况下，能够使用Lonza：Human Mesenchym al StemCell Osteogenic Differentiation Medium BulletKit等。
进行向软骨细胞的分化诱导的情况下，能够使用Lonza：Human Mesenchy malStem Cell Chondrogenic Differentiation Medium BulletKit等。
进行向心肌细胞的分化诱导的情况下，例如能够使用日本特开2009-136209中所记载的方法等。
进行向脂肪细胞的分化诱导的情况下，能够使用Lonza：Human Mesenchy malStem Cell Adipogenic Differentiation Medium BulletKit、PromoCell：Mes enchymalStem Cell Adipogenic Differentiation Medium等。
用于分化诱导的培养条件(除了培养基以外的培养条件)与在溶解有重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞时的培养条件相同。用于分化诱导的培养期间也并无特别限定，但是通常为3天～21天，优选为7天～18天。
根据本发明，还可提供一种通过上述细胞的制造方法来制造的分化诱导的细胞。上述的本发明的细胞能够用于移植细胞。具体而言，本发明的分化诱导的细胞能够以在疾病部位移植细胞的目的而使用。作为移植方法，能够使用切开或内窥镜等。
＜向脂肪细胞分化的分化抑制剂＞
根据本发明，可提供一种向脂肪细胞分化的分化抑制剂，其包含具有来自于胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶。重组明胶的详细内容为如在本说明书中所记载的内容。如在本说明书中所记载的内容，重组明胶通过溶解于用于培养间充质干细胞的液体培养基中而能够用作向脂肪细胞分化的分化抑制剂。将重组明胶作为向脂肪细胞分化的分化抑制剂而提供时的形态并无特别限定，可以将重组明胶作为溶液或粉末而提供，也可以以使重组明胶溶解于液体培养基的状态提供。
通过以下实施例对本发明进行进一步具体的说明，但是本发明并不限定于实施例。
实施例
[参考例1]重组明胶
作为重组明胶，准备了以下的CBE3(国际公开WO2008/103041号公报中记载)。
CBE3：分子量：51.6kD结构：Gly-Ala-Pro[(Gly-X-Y)63]3-Gly氨基酸数：571个
RGD序列：含有12个亚氨基酸：33％至100％的氨基酸为Gly-X-Y的重复结构。
CBE3的氨基酸序列中不含有丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、酪氨酸及半胱氨酸。
CBE3具有ERGD序列。
等电点：9.34
GRAVY值：-0.682
1/IOB值：0.323氨基酸序列(序列表的序列号1)(与国际公开WO2008/103041号公报的序列号3相同。但是末尾的X修改为“P”)
GAP(GAPGLQGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPIGPPGPAGAPGAPGLQGMPGERGAAGLPGPKGERGDAGPKGADGAPGKDGVRGLAGPP)3G
[实施例1]使用了来自于软骨的细胞Yub2505及来自于骨髄的细胞UDE BM的脂肪分化诱导实验
(1)实验1：CBE3添加(添加量：28ng/mL)
实验2：CBE3无添加
(2)材料
使用细胞：
Yub2505(国立成育医疗研究中心(以下称为成育研)设立的来自于软骨的细胞)
Yub2505按照参考文献(Nasu M，Takayama S，Umezawa A.Endochondralossification model system：Designed cell fate of human epiphyseal chondrocytesduring long-term implantation.J.Cell Physiol.2015；230：1376-1388)中所记载的方法来设立。
UDE BM(成育研设立的来自于骨髄的细胞)
UDE BM以以下的方法来设立。从骨中取出骨髄液，通过密度梯度离心分离来收集细胞。用磷酸缓冲生理盐水(PBS)清洗所回收的细胞，在DMEM(含有10％FBS)培养基中进行播种来培养。回收粘附于培养容器的细胞。
使用培养基：
MesenPro(含有2％血清、生命科技)：Yub2505、UDE BM
DMEM/F12(含有20％FBS(Gibco)，生命科技)：Yub2505
DMEM(含有10％FBS(Gibco)，SIGMA)：UDE BM
PRIME-XV XSFM(无血清、JX能量)：Yub2505、UDE BM
脂肪分化诱导培养基：Human Mesenchymal Stem Cell ADipoGenic Differentiation MeDium BulletKit(Lonza)
0.1质量％CBE3水溶液：cellnest(注册商标)(FUJIFILM Co.,Ltd.)
(3)方法
以下的细胞的培养均在37℃、5％CO2下进行。
在直径10cm的培养皿中分配MesenPro培养基8mL来维持培养各细胞。细胞播种量设为1×106cell/培养皿，培养期间设为5～7天。
用MesenPro(8mL)进行了培养基交换。此时，以使CBE3成为28ng/mL的方式进行了添加。Control中添加PBS(Nacalai Tesque)来代替CBE3。培养期间设为7天。
使用以使CBE3成为28ng/mL的方式添加到各培养基(MesenPro、DMEM、PRIME-XVXSFM)2mL的重组明胶，(Control中使用添加PBS(Nacalai Tesque)来代替CBE3的重组明胶)，并传代到6well plate，实施了预培养。细胞播种量设为0.2×106cell/well，培养期间设为3天。
培养基交换成脂肪分化诱导培养基(2mL)，开始了分化诱导。此时，每3，4天进行分化诱导，交替地交换培养基与维持培养基。分化诱导期间设为2周。
培养基交换成维持培养基(2mL)，进行了维持培养。维持培养期间设为7天。
用油红染色细胞，用显微镜拍摄25个画面，由此确认了向脂肪细胞的分化。
(4)结果
将确认了向脂肪的分化的结果示于图1～图4中。
细胞为UDE BM且培养基为MesenPro的情况(图1)、细胞为UDE BM且培养基为DMEM的情况(图2)、细胞为UDE BM且培养基为PRIME-XV的情况(图3)、细胞为Yub2505且培养基为PRIME-XV的情况(图4)的任一组合中，与实验2(CBE3无添加)相比，实验1(CBE3添加)可抑制向脂肪的分化。
[实施例2]使用了来自于人体骨髄的细胞BMSC的脂肪分化诱导实验
(1)实验：CBE3添加(添加量：0、0.028、2.8、28、280μg/mL)
(2)材料
使用细胞：
来自于人体骨髄的细胞BMSC(Lonza：PT-2501)
使用培养基：
MesenPro(含有2％血清、生命科技)
脂肪分化诱导培养基：Human Mesenchymal Stem Cell ADipoGenic Differentiation MeDium BulletKit(Lonza)、PromoCell：Mesenchymal Stem Cell A DipoGenicDifferentiation MeDium
0.1质量％CBE3水溶液：cellnest(注册商标)(FUJIFILM Co.,Ltd.)
(3)方法
以下的细胞的培养均在37℃、5％CO2下进行。
在直径10cm的培养皿中分配MesenPro培养基8mL，维持培养了BMSC细胞。细胞播种量设为5×105cell/well，培养期间设为6天。
使用以使CBE3成为0～280μg/mL的方式添加到MesenPro培养基2mL的重组明胶(Control中使用添加PBS(Nacalai Tesque)来代替CBE3的重组明胶)，传代到6well plate(Falcon TC)，实施了预培养。细胞播种量设为1.5×105cell/well，培养期间设为4天。
培养基交换成脂肪分化诱导培养基(Lonza/PromoCell)2mL，开始了分化诱导。Lonza培养基中，每3、4天进行分化诱导，交替地交换培养基与维持培养基。PromoCell培养基中，每3、4天交换分化诱导培养基。分化诱导期间设为17天。
培养基交换成维持培养基(2mL)，进行了维持培养。维持培养期间设为1天。
用尼罗河红染色细胞，用显微镜(KEYENCE CORPORATIONBZ-X700)拍摄25个画面，由此确认了向脂肪细胞的分化。300μm2以下的检测对象不计为脂肪细胞，而是计数为超过300μm2的脂肪细胞。
(4)结果
将确认了向脂肪的分化的结果示于图5、6中。(从图5的脂肪细胞染色照片计数诱导成脂肪细胞的细胞数的结果为图6)
在细胞为BMSC且培养基为MesenPro的情况、脂肪分化诱导培养基为Lonza、PromoCell的任一个情况下，均通过添加CBE3来抑制脂肪分化。CBE3添加量为2.8～280μg/mL的情况下脂肪分化明显地被抑制。
[实施例3]使用来自于人体骨髄的细胞BMSC的细胞增殖实验
(1)实验：CBE3添加(添加量：0、0.028、2.8、28μg/mL)
(2)材料
使用细胞：
来自于人体骨髄的细胞BMSC(Lonza：PT-2501)
使用培养基：MesenPro(含有2％血清、生命科技)
0.1质量％CBE3水溶液：cellnest(注册商标)(FUJIFILM Co.,Ltd.)
(3)方法
以下的细胞的培养均在37℃、5％CO2下进行。
在直径10cm的培养皿中分配MesenPro培养基8mL，维持培养至passage5(第五传代细胞)。细胞播种量设为0.4～1.0×106cell/培养皿，每次传代培养期间设为7天左右。
使用以使CBE3成为0～28μg/mL的方式添加到MesenPro培养基2mL的重组明胶(Control中使用添加PBS(Nacalai Tesque)来代替CBE3的重组明胶)、10cm培养皿(Sumitomo Bakelite Co.,Ltd.制)中作为passage6(第六传代细胞)而传代。细胞播种量设为0.4×106cell/培养皿，培养期间设为7天。经过7天之后使用Vi-Cell(BECKMAN COULTER)来测量了细胞数。
(4)结果
将测量了细胞数的结果示于图7中。表示在各个CBE3浓度中以N＝3进行培养并测定的结果的平均值。与CBE3无添加相比，通过CBE3的添加，培养7天之后的细胞数增加。细胞数的增加为2.8μg/mL时为峰值，进而成为高浓度，由此细胞数显示减小倾向。
序 列 表
<110> 富士胶片株式会社
<120> 间充质干细胞的制造方法及其应用
<130> 18F00683
<160> 10
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 571
<212> PRT
<213> 重组体
<400> 1
Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly
1 5 10 15
Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu
20 25 30
Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro
35 40 45
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
50 55 60
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
65 70 75 80
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro
85 90 95
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
100 105 110
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
115 120 125
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro
130 135 140
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly
145 150 155 160
Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala
165 170 175
Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro
180 185 190
Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly
195 200 205
Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp
210 215 220
Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
225 230 235 240
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
245 250 255
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
260 265 270
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg
275 280 285
Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly
290 295 300
Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu
305 310 315 320
Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro
325 330 335
Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly
340 345 350
Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala
355 360 365
Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro
370 375 380
Gly Leu Gln Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly
385 390 395 400
Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro
405 410 415
Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln Gly Met Pro
420 425 430
Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly
435 440 445
Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val
450 455 460
Arg Gly Leu Ala Gly Pro Ile Gly Pro Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala
465 470 475 480
Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly
485 490 495
Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro
500 505 510
Ile Gly Pro Pro Gly Pro Ala Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Leu Gln
515 520 525
Gly Met Pro Gly Glu Arg Gly Ala Ala Gly Leu Pro Gly Pro Lys Gly
530 535 540
Glu Arg Gly Asp Ala Gly Pro Lys Gly Ala Asp Gly Ala Pro Gly Lys
545 550 555 560
Asp Gly Val Arg Gly Leu Ala Gly Pro Pro Gly
565 570
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 2
Arg Glu Asp Val
1
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 3
Tyr Ile Gly Ser Arg
1 5
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 4
Pro Asp Ser Gly Arg
1 5
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 5
Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 6
Leu Gly Thr Ile Pro Gly
1 5
<210> 7
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 7
Arg Asn Ile Ala Glu Ile Ile Lys Asp Ile
1 5 10
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 8
Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 9
Asp Gly Glu Ala
1
<210> 10
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的说明: 粘附序列
<400> 10
Glu Arg Gly Asp
1

Claims (5)

1.一种向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的制造方法，所述制造方法包括在溶解有具有来自于人胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶的液体培养基中培养间充质干细胞的工序，
重组明胶的分子量为2kDa以上且100kDa以下，
重组明胶为序列号1中所记载的氨基酸序列，
间充质干细胞为来自于骨髄的细胞或来自于软骨的细胞，
所述液体培养基为未分化维持用液体培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
溶解有重组明胶的液体培养基中的重组明胶的浓度为0.01μg/mL～500μg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
溶解有重组明胶的液体培养基中的重组明胶的浓度为0.02μg/mL～300μg/mL。
4.一种经分化诱导的细胞的制造方法，所述制造方法包括：
通过权利要求1至3中任一项所述的方法来制造向脂肪细胞的分化受到抑制的间充质干细胞的工序；及
在分化诱导培养基中，培养抑制分化成所述脂肪细胞的间充质干细胞的工序。
5.一种抑制间充质干细胞向脂肪细胞分化的分化抑制剂，所述分化抑制剂包含具有来自于人胶原蛋白的部分氨基酸序列的氨基酸序列的重组明胶，
重组明胶的分子量为2kDa以上且100kDa以下，
重组明胶为序列号1中所记载的氨基酸序列，
间充质干细胞为来自于骨髄的细胞或来自于软骨的细胞。
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