CN110846357A - 一种降解玉米秸秆的方法 - Google Patents

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Abstract

一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：具体是将玉米秸秆机械粉碎、过筛、烘干后，用以Cu2+修饰的Fe3O4‑NH2‑PEI磁性纳米粒子作为载体的固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解，然后回收固定化漆酶，将降解后的玉米秸秆煮沸后加入NaOH进行洗涤，再加入纤维素酶进一步降解纤维素。本发明方法增强了固定化漆酶与底物亲和力，提高了漆酶在应用过程中的稳定性以及活性，从而提高降解效率，对木质素的降解率达到40.76%以上。消除了固定化漆酶以及降解产生的酚类物质等降解产物对纤维素酶活性的抑制，从而保证了纤维素酶活性，提高了纤维素的转化率，其转化率达到46.85%。

Description

一种降解玉米秸秆的方法
技术领域
本发明属于秸秆降解领域，具体涉及一种用固定化漆酶降解玉米秸秆的方法。
背景技术
玉米秸秆是一种非常丰富的可再生资源，其含有的木质纤维素是最有价值的生物能源。不同植物的木质纤维素组成及结构不同，玉米秸秆的木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。但玉米秸秆中纤维素、半纤维素和木质素互相交织在一起形成细胞壁结构，这种相互交织的结构决定了任何一类成分的降解必然会受到其它成分的制约，特别是木质素和半纤维素以共价键形式结合将纤维素包裹其中，形成一种天然的屏障阻碍纤维素酶与纤维素分子的接触，因此限制了纤维素的分解，使得纤维素分解酶降解秸秆效率低下，这阻碍了玉米秸秆的木质纤维素的有效利用。所以，对秸秆进行有效预处理是秸秆资源化利用中最为重要的一个环节，而木质纤维素有效利用的关键在于木质素能否被降解。
漆酶作为一种木质素降解酶，是一种有前途的温和清洁的降解木质素途径，在木质素降解过程中起着重要作用。漆酶通过改变木质素的疏水性和孔隙率，破坏木质素的结构，提高纤维素酶与纤维素结合，从而提高木质纤维素的利用率。但漆酶由于生产成本高，稳定性差、在使用过程中容易因为环境变化而变形失活，漆酶在工业上的应用并不广泛。
发明内容
针对上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种高效降解玉米秸秆的方法。
本发明目的通过以下技术方案实现：
一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：具体是将玉米秸秆机械粉碎、过筛、烘干后，用以Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子作为载体的固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解，然后回收固定化漆酶，将降解后的玉米秸秆煮沸后加入NaOH进行洗涤，再加入纤维素酶进一步降解纤维素。
进一步，上述用固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解具体是将固定化漆酶、玉米秸秆和NaAC-HAC缓冲液在35℃下进行振荡处理12～72h。
进一步，上述振荡速率为160转/min。
进一步，上述NaAC-HAC缓冲液的pH值为4.6。
进一步，上述固定化漆酶的添加量为10～60U g-1。
进一步，上述玉米秸秆与NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL。
进一步，上述玉米秸秆煮沸保持时间为20～30min，冷却后加入0.1％的NaOH溶液进行洗涤。
进一步，上述玉米秸秆和固定化漆酶的质量体积比为1g：50mL。
进一步，上述固定化漆酶是以Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子作为载体，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理40-70min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止。
进一步，所述漆酶为白腐真菌漆酶。
漆酶固定化过程中容易引起漆酶失活，固定的漆酶容易发生解吸。
发明人发现漆酶含有丰富的氨酸残基，能与过渡金属形成特殊共价键，金属亲和吸附漆酶，形成固定化漆酶，在降解玉米秸秆木质素过程中有效保证了酶的活性，同时在使用过程中可以特异性固定住漆酶，有效降低漆酶解吸、变成游离状态的几率。
进一步，上述含有漆酶的缓冲溶液是pH为4.6的NaAC-HAC缓冲溶液，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1mg：10mL，漆酶的浓度为0.5-4mg/mL。
优选的，上述震荡处理时间为50min，漆酶的浓度为2.5mg/mL。
一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆机械粉碎后，过40目筛，然后在105℃下干燥后备用；
(2)将漆酶固定在Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子上，形成固定化漆酶，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的NaAC-HAC缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理40-70min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止；其中NaAC-HAC缓冲液pH为4.6，漆酶的浓度为0.5-4mg/mL，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲溶液的质量体积比为1mg：10mL；
(3)将步骤(2)制备的固定化漆酶、步骤(1)处理的玉米秸秆和NaAC-HAC缓冲液在35℃下以160转/min速率下进行振荡处理12～72h；漆酶添加量10-60Ug-1，玉米秸秆与pH为4.6的NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL；
(4)经步骤(3)处理后，用磁铁吸附回收固定化漆酶，将回收固定化漆酶后的玉米秸秆洗涤后用清水煮沸20-30min，冷却后用0.1％的NaOH溶液进行洗涤，玉米秸秆与NaOH的质量体积比为1g：50mL；
(5)在经步骤(4)处理后的玉米秸秆中加入纤维素酶，在50℃下以140转/min的速率下振荡处理72h，纤维素酶的添加量为30fpu/g。
由于漆酶被固定化，漆酶在体系中移动的灵活性降低，漆酶与底物结合率下降，阻碍了漆酶的活性位点的利用；因此，将漆酶固定化很大程度上制约了漆酶对木质素的降解能力，本发明有效解决了该技术问题，使得固定化漆酶与底物有很好的亲和力，二者有效结合，充分利用了漆酶的活性位点、反应固定化漆酶与底物亲和力的米氏常数Km值为5.91，接近游离漆酶和底物的亲和力，提高了其降解能力。
另外，发明人发现，漆酶降解木质素过程中，漆酶存在于体系中对纤维素酶的活性有抑制作用，且漆酶降解木质素过程中产生的酚类物质等降解产物对纤维素酶的活性也有抑制作用，从而导致纤维素的转化率低。本发明通过上述固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解预处理，回收固定化漆酶后，消除了大量漆酶对纤维素酶的抑制作用，再通过将降解木质素后的玉米秸秆煮沸及NaOH洗涤步骤的配合，也消除了在降解过程中从载体上脱落到体系中的少量漆酶以及漆酶降解木质素生成的酚类物质等降解产物对纤维素酶的抑制作用，从而提高了后续纤维素酶对玉米秸秆中纤维素酶的水解能力。
本发明具有如下技术效果：
(1)通过漆酶与Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子的金属亲和吸附，可以回收重复利用漆酶，并降低漆酶的失活率，在重复6个循环后漆酶的活性约为50％，大大降低了漆酶在工业上的应用成本。
(2)增加了固定化漆酶与木质素的亲和性，提高了漆酶在应用过程中的活性及稳定性，从而提高降解效率，对木质素的降解率达到40.76％以上。
(3)消除了酚类物质等降解产物以及固定化漆酶对纤维素酶活性的抑制作用，从而保证了纤维素酶活性，提高了纤维素的转化率，其转化率达到了46.85％。
附图说明
图1：本发明降解前后的玉米秸秆的扫描电镜图。
图2：本发明中玉米秸秆降解前后的FTIR图和XRD图。
图3：温度和pH对固定化前后的漆酶的稳定性影响曲线图。
图4：固定化漆酶和游离漆酶对ABTS的稳定性。
图5：本发明固定化漆酶对木质素降解的影响；
其中，a为浓度-效率曲线图、b为时间-效率曲线图。
图6：不同预处理的纤维素转化效率曲线图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
本发明所使用的原材料如下：
玉米秸秆；白腐真菌漆酶由***秸秆生物利用重点实验室提供；纤维素酶、聚乙亚胺(PEI，支链，Mw＝10000g/mol)购自Sigma Aldrich(美国)；六水合氯化铁(FeCl3·6H2O)、乙二胺(EDA)、冰醋酸(HAC)、醋酸钠(NaAC)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、氢氧化钠(NaOH)、乙二醇(EG)、和乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，购自中国药业化学试剂有限公司；戊二醛(GA，50％水溶液)、氯乙酸钠(CH2ClCOONa)由天津智源试剂有限公司提供；硼氢化钠(NaBH4)。
Fe3O4-NH2制备：将4.3gFeCl3·6H2O加入0.67g乙二胺混合后，再加入1.34g醋酸钠和20mL乙二醇，在200℃下反应8h制得。Fe3O4-NH2也可由北京格加纳米技术有限公司提供。
本发明中Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子的制备按照现有技术(“Synthesis of polyethylenimine modified Fe3O4 nanoparticles withimmobilizedCu2+ for highly efficient proteins adsorption”，Yueping Guan et al.，Colloids and Surfaces A:Physicochemical and Engineering Aspects第443卷552–559页，2014年)公开的制备方法制得。
实施例1：
一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆机械粉碎后，过40目筛，然后在105℃下干燥后备用；
(2)将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的NaAC-HAC缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理40min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止；其中NaAC-HAC缓冲液pH为4.6，漆酶的浓度为0.5mg/mL，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲溶液的质量体积比为1mg：10mL；
(3)将步骤(2)制备的固定化漆酶、步骤(1)处理的玉米秸秆和NaAC缓冲液在35℃下以160转/min速率下进行振荡处理12h；漆酶添加量10Ug-1，玉米秸秆与pH为4.6的NaAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL；
(4)经步骤(3)处理后，用磁铁吸附回收固定化漆酶，将回收了固定化漆酶的玉米秸秆洗涤后用清水煮沸30min，冷却后用0.1％的NaOH溶液进行洗涤，玉米秸秆与NaOH的质量体积比为1g：50mL；
(5)在经步骤(4)处理后的玉米秸秆中加入纤维素酶，在50℃下以140转/min的速率下振荡处理72h，纤维素酶的添加量为30fpu/g。
实施例2：
一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆机械粉碎后，过40目筛，然后在105℃下干燥后备用；
(2)将漆酶固定在Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子上，形成固定化漆酶，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的NaAC-HAC缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理70min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止；其中NaAC-HAC缓冲液pH为4.6，漆酶的浓度为4mg/mL，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲溶液的质量体积比为1mg：10mL；
(3)将步骤(2)制备的固定化漆酶、步骤(1)处理的玉米秸秆和NaAC缓冲液在35℃下以160转/min速率下进行振荡处理72h；漆酶添加量60Ug-1，玉米秸秆与pH为4.6的NaAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL；
(4)经步骤(3)处理后，用磁铁吸附回收固定化漆酶，将回收了固定化漆酶的玉米秸秆洗涤后用清水煮沸20min，冷却后用0.1％的NaOH溶液进行洗涤，玉米秸秆与NaOH的质量体积比为1g：50mL；
(5)在经步骤(4)处理后的玉米秸秆中加入纤维素酶，在50℃下以140转/min的速率下振荡处理72h，纤维素酶的添加量为30fpu/g。
实施例3：
一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将玉米秸秆机械粉碎后，过40目筛，然后在105℃下干燥后备用；
(2)将漆酶固定在Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子上，形成固定化漆酶，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的NaAC-HAC缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理50min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止；其中NaAC-HAC缓冲液pH为4.6，漆酶的浓度为20.5mg/mL，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲溶液的质量体积比为1mg：10mL；
(3)将步骤(2)制备的固定化漆酶、步骤(1)处理的玉米秸秆和NaAC缓冲液在35℃下以160转/min速率下进行振荡处理40h；漆酶添加量50Ug-1，玉米秸秆与pH为4.6的NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL；
(4)经步骤(3)处理后，用磁铁吸附回收固定化漆酶，将回收固定化漆酶后的玉米秸秆洗涤后用清水煮沸25min，冷却后用0.1％的NaOH溶液进行洗涤，玉米秸秆与NaOH的质量体积比为1g：50mL；
(5)在经步骤(4)处理后的玉米秸秆中加入纤维素酶，在50℃下以140转/min的速率下振荡处理45h，纤维素酶的添加量为30fpu/g。
上述步骤(2)中制备固定化漆酶，其固定化率为87.4％，固定化效率为85.2％。
在pH值为4.6和35℃时，游离漆酶和固定化漆酶活性最高，如图3a和图3b所示。由于Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与漆酶之间很强的结合作用，氨基与过渡金属离子之间形成的特殊共价键，使得固定化漆酶对温度和pH值有更大的适应范围，具有更好的稳定性。
在30℃下测定NaAC-HAC缓冲液(pH 4.6)漆酶和ABTS的反应速率，并用LineweaverBurk曲线估算游离漆酶和固定漆酶的动力学性质(米氏常数(Km)和最大反应速率(Vmax))。Km和Vmax值根据Lineweaver-burk图双倒数模型计算，如下式(1)和(2)所述：
V＝(Vmax[S])/([S]+Km) (1)
1/V＝[(Km/Vmax)(1/[S])]+1/Vmax) (2)
Km反映了酶与底物的亲和力，Km值越小，酶与底物的亲和力越高。分别用Lineweaver Burk图的斜率和截距计算了氧化反应的Km和Vmax。游离漆酶和固定化漆酶的动力学测定如图4所示。带入公式计算出游离漆酶的Km值为5.86，固定化漆酶的Km值是5.91。可知固定化漆酶与底物的亲和力趋近于游离漆酶。
采用SEM分析了固定化漆酶降解前和降解后玉米秸秆表面结构的变化分别如图1a和图1b所示，扫描电镜观察结果表明，玉米秸秆降解后，表面变得粗糙、多孔、无序。
在研究漆酶浓度和处理时间对木质素降解的影响，当固定化漆酶的浓度增加时，木质素的降解率逐步增加，当漆酶的浓度超过50U g-1时，木质素的降解速率缓慢增加，如图5a所示。当固定化漆酶浓度为50U g-1，处理时间为72h时，木质素降解率可达40.76％，如图5b所示。
不同的预处理方法有不同的纤维素转化率。采用游离漆酶、失活漆酶和本发明的固定化漆酶对玉米秸秆进行预处理降解木质素后，纤维素转化率分别为14.35％、14.51％和27.33％。采用失活漆酶和游离漆酶对玉米秸秆进行降解后，与不采用漆酶降解的玉米秸秆相比，纤维素转化率均有显著降低。与游离漆酶预处理和失活漆酶预处理相比，固定化漆酶预处理玉米秸秆的纤维素转化率分别提高了12.98％和12.82％，而与未进行木质素降解预处理的玉米秸秆相比，纤维素转化率只提高了2.42％，如图6a所示。这是由于固定化漆酶在玉米秸秆预处理过程中从载体上脱落了少量漆酶，以及木质素降解产生的酚类化合物等降解产物，抑制了纤维素酶的活性。为了完全消除漆酶的抑制作用，我们将固定化漆酶处理后的玉米秸秆采用煮沸后加入0.1％NaOH洗涤的方法处理，消除了从载体脱落的少量漆酶和酚类物质等降解产物对纤维素酶的活性的抑制作用。结果表明，固定化漆酶处理后玉米秸秆的纤维素转化率达到46.85％，比没有采用漆酶及煮沸和0.1％NaOH洗涤的玉米秸秆的纤维素转化率高23.9％，如图6b所示。

Claims (9)

1.一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：具体是将玉米秸秆机械粉碎、过筛、烘干后，用以Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子作为载体的固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解，然后回收固定化漆酶，将降解木质素后的玉米秸秆煮沸后加入NaOH进行洗涤，再加入纤维素酶进一步降解纤维素。
2.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述用固定化漆酶对玉米秸秆中的木质素进行降解具体是将固定化漆酶、玉米秸秆和NaAC-HAC缓冲液在35℃下进行振荡处理12～72h。
3.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述振荡处理的振荡速率为160转/min。
4.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述固定化漆酶的添加量为10～60 U g-1。
5.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述玉米秸秆与pH为4.6的NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1g：200μL。
6.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述玉米秸秆煮沸保持时间为20～30min，冷却后加入0.1%的NaOH溶液进行洗涤。
7.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述固定化漆酶是以Cu2 +修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子作为载体，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理40-70min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止。
8.如权利要求1所述的一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于：所述含有漆酶的缓冲溶液是pH为4.6的NaAC-HAC缓冲溶液，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为1mg：10mL，漆酶的浓度为0.5-4mg/mL。
9.一种降解玉米秸秆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将玉米秸秆机械粉碎后，过40目筛，然后在105℃下干燥后备用；
（2）将漆酶固定在Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子上，形成固定化漆酶，具体是将Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子溶解于含有漆酶的NaAC-HAC缓冲溶液中，在25℃下以150转/min的速率振荡处理40-70min；反应后将制得的Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒和上清液分离；用超纯水对Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI漆酶磁性纳米颗粒连续洗涤，直到洗涤剂中未检测到漆酶活性为止；其中NaAC-HAC缓冲液pH为4.6，漆酶的浓度为0.5-4mg/mL，Cu2+修饰的Fe3O4-NH2-PEI磁性纳米粒子与NaAC-HAC缓冲溶液的质量体积比为1mg：10mL；
（3）将步骤（2）制备的固定化漆酶、步骤（1）处理的玉米秸秆和NaAC-HAC缓冲液在35℃下以160转/min速率下进行振荡处理12～72h；漆酶添加量10-60 Ug-1，玉米秸秆与NaAC-HAC缓冲液的质量体积比为 1g：200μL；
（4）经步骤（3）处理后，用磁铁吸附回收固定化漆酶，将回收了固定化漆酶的玉米秸秆洗涤后用清水煮沸20-30min，冷却后用0.1%的NaOH溶液进行洗涤，玉米秸秆与NaOH的质量体积比为1g：50mL；
（5）在经步骤（4）处理后的玉米秸秆中加入纤维素酶，在50℃下以140转/min的速率下振荡处理72h，纤维素酶的添加量为30fpu/g。
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