CN110846354B - 射干异黄酮苷元的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药制备技术领域，具体公开一种射干异黄酮苷元的制备方法。所述射干异黄酮苷元的制备方法，是将射干须根的醇提液去醇处理后加入粗毛纤孔菌的发酵液中进行酶解，去除酶解液中的酶和菌体杂质，进行树脂吸附纯化，得到射干异黄酮苷元。本发明制备条件温和，方法简单，成本低，大大提高了从射干须根中提取和制备的射干异黄酮苷元的纯度和收率。
Description
技术领域
本发明涉及中药制备技术领域，尤其涉及一种射干异黄酮苷元的制备方法。
背景技术
射干为鸢尾科植物的干燥根茎，味苦、性寒，入肝、肺经，具有清热解毒、利咽消痰的功效，主要用于咽喉肺痈、痰咳气喘等症，为治疗喉痹咽痛之要药。
采挖射干药材时会产生大量须根，须根中含有芒果苷、鸢尾苷、野鸢尾苷等异黄酮苷类的物质，以及鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素、白射干素等苷元物质，有研究表明次野鸢尾黄素等苷元物质对脂多糖诱导引起的巨噬细胞RAW264.7具有明显的抗炎特性，能够显著降低诱导型一氧化氮合酶的转录和翻译水平，以及降低NO的产生，同时次野鸢尾黄素等苷元物质能显著抑制肿瘤免疫细胞TNF-α、IL-1β、IL-6的转录和翻译水平，次野鸢尾黄素等苷元物质还能阻止α-突触核蛋白的积累，减缓羟多巴胺引起多巴胺能神经元的退行性病变，增强食物的敏感性、延长寿命，该化合物还具有对潜在帕金森疾病的治疗作用，而鸢尾苷和野鸢尾苷等异黄酮苷类物质的活性却不及异黄酮苷元。但射干须根中游离的异黄酮苷元含量较低，分离提取异黄酮苷元的难度大、提取收率低，得到的提取物中异黄酮苷元的纯度低，提取成本较高，因此，种植户都把采挖时产生的须根扔掉，浪费了大量的药材资源。
发明内容
针对现有从射干药材须根中分离提取异黄酮苷元的提取率低以及产物纯度低的问题，本发明提供一种射干异黄酮苷元的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种射干异黄酮苷元的制备方法，将射干须根的醇提液去醇处理后加入粗毛纤孔菌的发酵液中进行酶解，去除酶解液中的酶和菌体杂质，进行树脂吸附纯化，得到射干异黄酮苷元。
其中，粗毛纤孔菌为药用真菌粗毛纤孔菌[Inonotushispidus(Bull.:Fr.)P.Karst.]，曾用名粗毛黄褐孔菌(Xanthochroushispidus)，隶属于担子菌门(Basidiomycota)，伞菌纲(Agaricomycetes)，绣革孔菌目(Hymenochaetales)，绣革孔菌科(Hymenochaetaceae)，纤孔菌属(Inonotus)；该菌主要用来治疗多种癌症、关节炎、痛风和糖尿病等疾病以及消化不良等引起的各种胃病，粗毛纤孔菌主要含有多酚、三萜、甾醇及其衍生物、核苷、多糖等多种活性成分，其中多酚化合物Hispidin、Hispolon具有抗病毒、抗肿瘤和抗氧化等多种药理作用。
相对于现有技术，本发明提供的射干异黄酮苷元的制备方法中，利用粗毛纤孔菌发酵过程中产生的多种降解酶对射干须根醇提液中提取的异黄酮苷类物质进行水解，可以将醇提液中难以降解且生物活性较低的多种异黄酮苷类物质(芒果苷、鸢尾苷、野鸢尾苷等)充分水解转化形成异黄酮苷元，大大增加从射干须根中提取和制备得到的异黄酮苷元的收率，醇提液酶解后再进行树脂吸附纯化，可得到高纯度的异黄酮苷元，制备条件温和，制备方法简单，成本低，适合工业化生产。
优选的，所述射干须根的醇提液是将射干须根粉碎后加入60-80vt％的乙醇溶液中，50-70℃浸提得到。
优选的，所述射干须根粉碎至粒度为20-40目。
优选的，所述浸提过程分两次进行，第一次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:12-14，800-1000r/min浸提15-30min；第二次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:8-10，800-1000r/min浸提15-30min；合并两次浸提液，得到射干须根的醇提液。
上述醇提过程，可将射干须根中含有异黄酮苷类物质提取出来。
优选的，所述去醇处理过程是对射干须根的醇提液进行过滤，并用薄膜蒸发器减压浓缩至醇的含量≤5vt％。
对提取液进行去醇处理，可避免后续酶解过程中醇对酶的水解效率产生影响。
优选的，所述粗毛纤孔菌的发酵液是将粗毛纤孔菌接种到培养液中，28-30℃培养7-10天，用匀浆机对培养液中的菌体进行破壁处理得到的匀浆酶液。
破壁处理，可以使菌体中的胞内酶充分释放出来，增加酶的浓度和种类，提高酶解效率。
优选的，所述粗毛纤孔菌的发酵液的添加体积为去醇处理后的浓缩液体积的5-10％。
优选的，所述酶解过程为：40-55℃、pH 4-6的条件下酶解1-3天。
上述酶解条件下，可提高酶解液中的酶对异黄酮苷类物质的水解效率。
优选的，所述培养液按质量配比包括0.6-0.8％的麦芽提取物、0.07-0.08％的酵母提取物、0.8-1.2％的蛋白胨和余量的蒸馏水。
优选的，所述去除酶解液中的酶和菌体杂质的过程为：向酶解液中加入絮凝剂，沉淀2-3h，进行离心过滤，得到清液。
上述除杂方法可充分去除酶解液中的酶及其他大分子蛋白和菌体碎片，保证后续树脂吸附处理的顺利进行。
优选的，所述絮凝剂为壳聚糖、明胶和A+B澄清剂中的一种或多种的组合；所述絮凝剂的加入量为酶解液质量的3-5％。
优选的，所述树脂为大孔吸附树脂，具体可选用HPD700、LX-17和LK-17大孔树脂中的一种。
优选的，所述树脂吸附纯化过程为：将酶解液稀释1-1.5倍，加入大孔吸附树脂中，控制吸附流速为1-1.5BV/h，吸附完成后，先用20-40vt％的乙醇溶液进行洗脱除杂，再用60-80vt％的乙醇溶液洗脱、浓缩和干燥。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明实施例提供的，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
一种射干异黄酮苷元的制备方法，包括以下步骤：
原料预处理：将1kg射干须根粉碎至粒径大小为20目的粉末；
醇提：称取粉碎后的射干须根原料，在50℃水浴中用60％的乙醇搅拌浸提两次，第一次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:12，800r/min浸提15min；第二次浸提过程中，经过第一次浸提后的射干须根与乙醇溶液的质量比为1:8，800r/min浸提15min；
浓缩去醇：将两次醇提液混合并过滤，再用薄膜蒸发器进行减压浓缩至醇提液达到无醇状态；
酶解：将药用真菌粗毛纤孔菌接种到培养液中，28℃培养7天，用匀浆机将对培养液中的菌体进行破壁匀浆处理得到匀浆酶液，其中培养液按质量配比包括0.6％的麦芽提取物、0.07％的酵母提取物、0.8％的蛋白胨和余量的蒸馏水；将浓缩去醇后的醇提液加入匀浆中，浓缩液的体积为醇提液体积的5％，在40℃、pH 4的条件下酶解1天；
沉淀和过滤：在酶解液中加入壳聚糖，壳聚糖的加入量为酶解液质量的3％，絮凝沉淀2h，进行离心过滤，得到清液；
树脂吸附纯化：将清液稀释1倍，加入HPD700大孔吸附树脂中，控制吸附流速为1BV/h，吸附完成后，先用20vt％的乙醇溶液进行洗脱除杂，再用60vt％的乙醇溶液进行洗脱、真空浓缩和干燥，得到22g异黄酮苷元产物；
得到的异黄酮苷元产物中，异黄酮苷元的含量为77.1％。
实施例2
一种射干异黄酮苷元的制备方法，包括以下步骤：
原料预处理：将1kg射干须根粉碎至粒径大小为30目的粉末；
醇提：称取剪切或粉碎后的射干须根原料，在60℃水浴中用70％的乙醇搅拌浸提两次，第一次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:13，900r/min浸提20min；第二次浸提过程中，经过第一次浸提后的射干须根与乙醇溶液的质量比为1:9，900r/min浸提20min；
浓缩去醇：将两次醇提液混合并过滤，再用薄膜蒸发器进行减压浓缩至醇提液达到无醇状态；
酶解：将药用真菌粗毛纤孔菌接种到培养液中，29℃培养8天，用匀浆机将对培养液中的菌体进行破壁匀浆处理得到匀浆酶液，其中培养液按质量配比包括0.7％的麦芽提取物、0.075％的酵母提取物、1％的蛋白胨和余量的蒸馏水；将浓缩去醇后的醇提液加入匀浆中，浓缩液的体积为醇提液体积的8％，在50℃、pH 5的条件下酶解2天；
沉淀和过滤：在酶解液中加入明胶，明胶的加入量为酶解液质量的4％，絮凝沉淀2.5h，进行离心过滤，得到清液；
树脂吸附纯化：将清液稀释1倍，加入LX-17大孔吸附树脂中，控制吸附流速为1.2BV/h，吸附完成后，先用30vt％的乙醇溶液进行洗脱除杂，再用70vt％的乙醇溶液进行洗脱、真空浓缩和干燥，得到21g异黄酮苷元产物；
得到的异黄酮苷元产物中，异黄酮苷元的含量为79.5％。
实施例3
一种射干异黄酮苷元的制备方法，包括以下步骤：
原料预处理：将1kg射干须根粉碎至粒径大小为40目的粉末；
醇提：称取剪切或粉碎后的射干须根原料，在70℃水浴中用80％的乙醇搅拌浸提两次，第一次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:14，1000r/min浸提30min；第二次浸提过程中，经过第一次浸提后的射干须根与乙醇溶液的质量比为1:10，1000r/min浸提30min；
浓缩去醇：将两次醇提液混合并过滤，再用薄膜蒸发器进行减压浓缩至醇提液达到无醇状态；
酶解：将药用真菌粗毛纤孔菌接种到培养液中，30℃培养10天，用匀浆机将对培养液中的菌体进行破壁匀浆处理得到匀浆酶液，其中培养液按质量配比包括0.8％的麦芽提取物、0.08％的酵母提取物、1.2％的蛋白胨和余量的蒸馏水；将浓缩去醇后的醇提液加入匀浆中，浓缩液的体积为醇提液体积的10％，在55℃、pH 6的条件下酶解3天；
沉淀和过滤：在酶解液中加入A+B澄清剂，A+B澄清剂的加入量为酶解液质量的5％，絮凝沉淀3h，进行离心过滤，得到清液；
树脂吸附纯化：将清液稀释1倍，加入LK-17大孔吸附树脂中，控制吸附流速为1.5BV/h，吸附完成后，先用40vt％的乙醇溶液进行洗脱除杂，再用80vt％的乙醇溶液进行洗脱、真空浓缩和干燥，得到24g异黄酮苷元产物；
得到的异黄酮苷元产物中，异黄酮苷元的含量为80.2％。
对比例1
去掉实施例1中的酶解过程，直接将浓缩去醇后的醇提液进行树脂吸附纯化；
最终可得到16g异黄酮苷元产物，其中异黄酮苷元的含量为53.1％。
对比例2
用β-葡萄糖苷酶代替实施例1中的真菌粗毛纤孔菌发酵液匀浆，对去醇后的射干须根醇提液进行酶解，具体酶解方法为，将β-葡萄糖苷酶加入去醇后的射干须根醇提液中，β-葡萄糖苷酶的加入量为4000U/g射干须根原料，40℃、pH5的条件下酶解1天；
其它方法与实施例1相同，得到18g异黄酮苷元产物，其中异黄酮苷元的含量为61.8％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种射干异黄酮苷元的制备方法，其特征在于：将射干须根的醇提液去醇处理后加入粗毛纤孔菌的发酵液中进行酶解，去除酶解液中的酶和菌体杂质，进行树脂吸附纯化，得到射干异黄酮苷元；所述粗毛纤孔菌的发酵液的添加体积为射干须根的醇提液去醇处理后的浓缩液体积的5-10％；
所述酶解过程为：40-55℃、pH 4-6的条件下酶解1-3天；
所述树脂吸附纯化过程为：将酶解液稀释1-1.5倍，加入大孔吸附树脂中，控制吸附流速为1-1.5BV/h，吸附完成后，先用20-40vt％的乙醇溶液进行洗脱除杂，再用60-80vt％的乙醇溶液洗脱、浓缩和干燥。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述射干须根的醇提液是将射干须根粉碎后加入60-80vt％的乙醇溶液中，50-70℃浸提得到。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述射干须根粉碎至粒度为20-40目；和/或
所述浸提过程分两次进行，第一次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:12-14，800-1000r/min浸提15-30min；第二次浸提过程中，射干须根与乙醇溶液的质量比为1:8-10，800-1000r/min浸提15-30min。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述去醇处理过程是对醇提液进行过滤、蒸发浓缩至醇提液中醇的含量≤5vt％。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述粗毛纤孔菌的发酵液是将粗毛纤孔菌接种到培养液中，28-30℃培养7-10天，对培养液中的菌体进行破壁处理得到的匀浆酶液。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于：所述培养液按质量配比包括0.6-0.8％的麦芽提取物、0.07-0.08％的酵母提取物、0.8-1.2％的蛋白胨和余量的蒸馏水。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述去除酶解液中的酶和菌体杂质的过程为：向酶解液中加入絮凝剂，沉淀2-3h，进行离心过滤，得到清液。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述絮凝剂为壳聚糖和明胶中的一种或多种的组合；所述絮凝剂的加入量为酶解液质量的3-5％。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述树脂为大孔吸附树脂。
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