CN110846330B - 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 - Google Patents
一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110846330B CN110846330B CN201810952553.5A CN201810952553A CN110846330B CN 110846330 B CN110846330 B CN 110846330B CN 201810952553 A CN201810952553 A CN 201810952553A CN 110846330 B CN110846330 B CN 110846330B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ripk4
- gene
- sequence
- pig
- foot disease
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 208000014770 Foot disease Diseases 0.000 title claims abstract description 41
- 238000013310 pig model Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 244000309715 mini pig Species 0.000 claims abstract description 55
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 23
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 15
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 14
- 238000010171 animal model Methods 0.000 claims description 12
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 12
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 claims description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 4
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 4
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 101100034355 Homo sapiens RIPK4 gene Proteins 0.000 abstract description 23
- 101001089248 Homo sapiens Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 4 Proteins 0.000 abstract description 23
- 102100033734 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 4 Human genes 0.000 abstract description 23
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 abstract description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 abstract description 10
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 6
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 abstract description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 abstract description 2
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 40
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 12
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 6
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 6
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 5
- 230000013011 mating Effects 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 101100034357 Arabidopsis thaliana RIPK gene Proteins 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 4
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 3
- 231100000221 frame shift mutation induction Toxicity 0.000 description 3
- 230000037433 frameshift Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 208000021005 inheritance pattern Diseases 0.000 description 3
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 3
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 208000030450 Bartsocas-Papas syndrome Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000032170 Congenital Abnormalities Diseases 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 2
- 238000012254 genetic linkage analysis Methods 0.000 description 2
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036244 malformation Effects 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 206010008418 Cheilosis Diseases 0.000 description 1
- 206010009269 Cleft palate Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010017076 Fracture Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101150039072 INSA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 206010042778 Syndactyly Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000007698 birth defect Effects 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000857 drug effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 1
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 238000011813 knockout mouse model Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 208000022638 pyogenic arthritis-pyoderma gangrenosum-acne syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 1
- 238000010374 somatic cell nuclear transfer Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
- C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
- C12Y207/01037—Protein kinase (2.7.1.37)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/108—Swine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种小型猪的RIPK4突变基因,所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比,具有c.1397_1398insA的突变。本发明提供了一种构建体,所述构建体包含所述RIPK4突变基因。本发明还提供了一种重组细胞,所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。本发明提供了一种制备蹼足病小型猪模型的方法,所述方法包括:改变小型猪的RIPK4基因,使RIPK4基因的位于第8号外显子的第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A。利用本发明提供的RIPK4突变基因制备大型蹼足病猪模型,研究蹼足病的发病机理,对于临床预防、诊断和治疗蹼足病具有重大的指导意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,具体涉及一种RIPK4突变基因,本发明还涉及该突变基因用于构建蹼足病(Bartsocas-Papas syndrome)小型猪模型的用途以及一种蹼足病小型猪模型的构建方法。
背景技术
小型猪是一种非常好的可用于研究人类疾病的致病病因、分子机制以及治疗方法的动物模型。巴马小型猪为我国特有的地方猪种,主要产自中国广西省,在外观上巴马猪表现为典型的“两头乌”特征,即头部和臀尾部毛发为黑色,而其他部分为白色。近年来,巴马猪因其具有体型较小以及解剖学结构与人类相近的优势,逐渐被广大科学工作者认定为是构建人类疾病医学研究的大动物模型的良好材料,故此具有极高的培育价值。
蹼足病(Bartsocas-Papas syndrome)是一种在新生儿中发病率较低的遗传出生缺陷,常常导致死亡,主要表现为唇裂/腭裂的症状,还有其它方面的异常,如皮肤皱褶,并趾(并指),生殖器异常等。
现有的Bartsocas-Papas syndrome综合征的疾病模型是小鼠,但小鼠的生理结构上与人类相差甚远,所以,亟需在与人类生理结构相近的大型动物中构建该疾病的模型,从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种小型猪的RIPK4突变基因,具有该突变基因的转基因家系小型猪的表型和遗传模式与人类蹼足病(Bartsocas-Papas syndrome)相符合,可以作为该人类遗传疾病的大动物模型,从而为针对该疾病的病理研究、药物筛选、药效评价等研究提供支持。
一方面,本发明提供了一种小型猪的RIPK4突变基因,所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比,具有c.1397_1398insA的突变。
具体地,所述突变基因的突变位点位于第8号外显子,所述腺嘌呤(A)***到1397位碱基和1398位碱基之间,导致其编码氨基酸发生移码突变(p.Asn466LysfsTer169)。具体地,所述RIPK4突变基因的466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys),后面翻译的氨基酸发生移码突变。
优选地,所述RIPK4突变基因序列如SEQ ID NO:29所示。
优选地,所述小型猪为巴马小型猪。
另一方面,本发明提供了一种构建体,所述构建体包含所述RIPK4突变基因。
本发明还提供了一种重组细胞,所述重组细胞由所述构建体转化受体细胞获得。优选地,所述重组细胞为猪细胞,更优选地为巴马小型猪细胞。
根据本发明的实施例,所述重组动物细胞的基因组中具有编码突变型RIPK4的核酸序列,其中,与野生型RIPK4相比,所述突变型RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys),后面翻译的氨基酸发生移码突变。
再另一方面,本发明提供了一种制备蹼足病小型猪模型的方法,所述方法包括:
改变小型猪的RIPK4基因,使RIPK4基因的位于第8号外显子的第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A。
在本发明的一些实施例中,根据实际需要,利用基因工程技术,改变正常猪的RIPK4基因,在第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A,获得蹼足病猪模型。在另一些实施例中,也可以利用基因工程技术改变除猪以外的其它动物的RIPK4基因的相应位点,从而获得所需的大型或小型蹼足病动物模型,例如蹼足病猴模型,蹼足病小鼠模型,等等。
本发明还提供一种筛选RIPK4基因突变的蹼足病小型猪模型的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取待测生物样品的核酸DNA;
2)确定所述核酸DNA的序列;
3)所述核酸的序列或其互补序列,与野生型RIPK4基因相比具有c.1397_1398insA突变,所述突变是蹼足病的指示;
所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。
在步骤2)中,确定所述核酸的序列包括如下步骤:
采用猪RIPK4基因的特异性引物进行PCR,得到扩增产物并对扩增产物进行测序;
优选地,所述正向引物(F)序列如SEQ ID NO:27所示,反向引物(R)序列如SEQ IDNO:28所示。
SEQ ID NO:27 5’-3’:CGCCCCTCTAGGTCTCAGAT;
SEQ ID NO:28 5’-3’:GGCATTGACGCTGATCTTGC
本发明还提供一种筛选RIPK4基因突变蹼足病小型猪模型的试剂盒,包括液态的或粉末状的猪RIPK4基因的特异性引物。所述试剂盒可以包括PCR所需的其它试剂,如缓冲液、dNTP、聚合酶;还可以包括回收PCR产物所需的试剂和耗材,如溶胶液、收集管、洗涤液等。以待测样品的DNA为模板,利用所述试剂盒和本发明提供的筛选RIPK4基因突变蹼足病猪的方法进行检测,操作简便,能快速鉴别大量样品。
为获得蹼足病的大型动物模型,本发明对巴马小型猪进行ENU(N-乙基-N-亚硝基脲)化学诱变,向野生型雄性小型猪注射ENU,得到F0代小型猪;然后将其与同品种的野生型雌性小型猪交配,获得F1代小型猪;将F1代雄性小型猪和野生型雌性小型猪交配,获得F2代小型猪;所述的F1代雄性小型猪小型猪所述的F2代雌性小型猪交配,获得F3代小型猪(野生公猪51头,野生母猪34头,畸形公猪12头,畸形母猪9头,畸形比例为21/106=19.81%),所述的F3代小型猪进行表型筛选,获得具有蹼足病表型的家系小型猪,其携带RIPK4纯合突变基因。
本发明的家系小型猪的蹼足病性状遗传模式符合常染色体单基因隐性遗传的孟德尔遗传定律(正常表型公猪51头,正常表型母猪34头,畸形公猪12头,畸形母猪9头,畸形比例为21/106=19.81%)。统计F3代中野生型个体和突变表型个体的数量,并进行比对,由于野生型:突变型比例约为1:1,符合孟德尔显性遗传1:1的分离定律;同时,在突变体中既有雌性与雄性的比例接近1:1,表明该突变表型与性别无关,从而确定所述突变表型是常染色体显性遗传的。
在根据本发明的一个实施方案中,所述ENU的注射剂量为50~100mg/kg,更优选地,所述ENU的注射剂量为60~70mg/kg;进一步优选地,所述ENU的注射剂量为65mg/kg。
在根据本发明的一个实施方案中,还包括:检测ENU注射后的野生型雄性小型猪的***品质,当注射后的野生型雄性小型猪的***品质回复正常水平后,再使注射后的野生型雄性小型猪与同品种野生型雌性小型猪交配。
表型分析结果显示,本发明的蹼足病小型猪模型体型显著变小,背部皮肤有黑斑,甚至全部变黑,耳朵黏连在皮肤上,口鼻有融合,没有尾巴,四肢较短,并且脚趾发育不全。
通过全基因组关联分析,确定了蹼足病小型猪模型的致病基因为RIPK4基因,对RIPK4基因的外显子全测序,结果显示,所述突变基因的突变位点位于第8号外显子,第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A,能够导致RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys),后面翻译的氨基酸发生移码突变。根据数据检索得知,RIPK4基因在人类、猴、猪、牛、羊、马、猫、狗、兔、小鼠、大鼠等哺乳动物中十分保守,因此,利用本发明提供的RIPK4突变基因制备大型蹼足病猪模型,研究蹼足病的发病机理,对于临床预防、诊断和治疗蹼足病具有重大的指导意义。
再一方面,本发明提供了本发明的基因突变动物在作为用于研究人类蹼足病的模型中的用途。优选地,所述基因突变动物优选为巴马小型猪。
在根据本发明的一个实施方案中,本发明通过对小型猪模型进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置;优选地,通过基因克隆测序得到与RIPK4位点紧密连锁的突变位点。
再一方面,本发明提供了本发明的突变基因、构建体、重组细胞或试剂盒在制备用于筛选治疗和/预防蹼足病的动物模型中的用途;优选地,所述动物模型为哺乳动物模型;更优选地,所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。
本发明提供的带有RIPK4基因突变的小型猪,其表型与人类蹼足病十分相似,从而提供了一种非常好的人类蹼足病的动物模型,可用于人类蹼足病病因病理研究,治疗方式研究及药物筛选。另外,本发明提供的方法避免了巴马猪与其他白色的猪种杂交,不会引入外源遗传信息,因而不会增加巴马猪遗传背景的复杂度,这有助于下一步纯化遗传背景和近交系的建立。
附图说明
以下,结合附图来详细说明本发明的实施方案,其中:
图1为本发明的蹼足病巴马小型猪模型(Mut)和野生型小猪(WT)的全身表型;
图2为本发明的蹼足病巴马小型猪模型(Mut)和野生型小猪(WT)的基因型鉴定结果,箭头所示为基因编码区的突变位点;
图3为对本发明的蹼足病巴马小型猪模型和野生型小猪的皮肤进行了HE染色,其中WT为野生型小猪,Mut为本发明的蹼足病巴马小型猪模型,结果发现突变猪的表皮角化层有显著的异常,主要表现为角化层较为疏松;
图4为本发明的蹼足病巴马小型猪模型和野生型小猪的RIPK4蛋白的表达情况,发明人构建了体外超表达载体RIPK4-HA-WT和RIPK4-HA-Mut并转染293T细胞,然后检测RIPK4的表达情况;结果发现,RIPK4突变后,蛋白有显著的降解,说明突变影响了蛋白的稳定性。
具体实施方式
下面结合附图和实施例进一步说明本发明,应当理解,实施例仅用于进一步说明和阐释本发明,并非用于限制本发明。
广西巴马小型猪 购自第三军医大学,在中国科学院动物研究所北方大动物研究基地繁育
ENU Sigma(N8509bulk package)
麻醉剂(***) 东北农业大学
犬醒宝尼可刹米注射液 江西博大动物医药保健公司
实施例1蹼足病巴马小型猪遗传家系的建立
1)向广西巴马小型猪公猪注射ENU,注射计量为65mg/kg,注射频率为每周一次,连续三周,
2)***品质检测,诱变后公猪***进行品质检测,检测指标包括公猪***体积、***密度、***存活率和畸形率,至质量回复到正常水平后,与野生型母猪交配,产生F1代。
3)用F1代小型公猪与同品种的野生型雌性小型猪交配,获得F2代小型猪;
4)用F1代小型公猪与同其后代F2雌性小型猪交配,获得F3代小型猪;
5)大规模筛查特殊表型,观测F3代猪中是否有特殊表型。
6)F1公猪和F2母猪进行交配产生F3代,确定其遗传模式。对新生猪进行表型筛选,得到发育畸形的广西巴马小型猪。
7)在该突变家系,F3代共出生85头两头乌,21头畸形个体,卡方检验(X2=1.5220<3.81,P>0.05)可以确定,该突变是符合孟德尔遗传模式的。
如图1所示的,“RIPK4-/-”为获得的人类蹼足病的小型猪模型,其表型为四肢较短,背部大部分区域为黑色,口鼻融合等;“+/+”为野生型的广西巴马小型猪,其表型为两头乌。
实施例2蹼足病巴马小型猪遗传家系的基因突变定位
通过对F3代猪进行遗传连锁分析和基因克隆测序确定突变位置,提取F3代猪耳组织的DNA,并通过设计引物进行PCR反应,对PCR产物进行电泳分离,得到与RIPK4位点紧密连锁的突变位点。
1.DNA提取和质量检测
①取适量耳组织装入1.5ml离心管,用小剪刀剪碎,加入500μL的SNET溶液和10μL蛋白酶K,在摇床中55℃,200rmp震荡过夜消化;
②待组织消化完全,12000rmp离心1min使毛发沉淀,将上清转移到新的1.5ml EP管;
③加入500μL苯酚:氯仿:异戊醇=25:24:1,在常温下震荡30min;
④将溶液在12000rmp,15min离心,小心吸取200μL上清转移至新的离心管,避免中间蛋白层荡起;
⑤在上清中加入200μL的异丙醇,轻轻上下颠倒约1min,12000rmp,离心15min;
⑥在离心管底部可见少量白色沉淀,倒掉溶液,注意不要倒掉沉淀,加入1ml 70%乙醇,轻弹离心管底部使沉淀浮起;
⑦12000rmp,离心5min,保留DNA沉淀,将乙醇吸出,室温晾干DNA;
⑧加入100μLTE,静置10min,用枪轻轻吹打溶液使DNA溶解;
⑨使用NANOdrop对DNA溶液进行浓度和质量检测,DNA浓度应>100ng/μL,A260/280在1.8-2.0之间,A260/230>2;
⑩将DNA溶液稀释至100ng/μL,吸取2μL DNA溶液混合1μL10×loadingbuffer,在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳,120V,20min。质量合格的DNA样品应为主带清晰无断裂,无蛋白和RNA污染。
2.引物设计
针对NCBI数据库中目标基因RIPK4基因的外显子的序列,利用Primer5软件进行引物设计,设计好的引物序列(表1)送至Invitrogene进行引物合成。
表1引物序列
3.PCR扩增
使用天根2×Taq PCRmix进行PCR,25μL体系
使用如下PCR扩增程序:
在94℃下,预变性3min;94℃变性30s,50-65℃退火30s,72℃延伸1min,共30个循环;最后72℃温育10min。
得到的PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶电泳中电泳检测产物,然后进行下步测序。如果扩增的序列中为纯合A***(c.1397_1398insA),则对应的猪为致病猪。
如图2所示,下部为本发明的巴马小型猪模型的基因型鉴定结果,而上部为野生型广西巴马小型猪的基因型鉴定结果。其中,蹼足病巴马小型猪模型的所述突变基因序列如SEQ ID NO:29所示。
其中,加粗ATG是起始密码子;斜体加粗为终止密码子。
下划线处表示突变基因的突变位点,其位于第8号外显子,第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A,能够导致RIPK4的蛋白质翻译466位天冬酰胺(Asn)突变为赖氨酸(Lys)
SEQ ID NO:29
实施例3蹼足病巴马小型猪遗传家系的特征分析
表型分析发现,该突变猪体型显著变小,背部皮肤有黑斑,甚至全部变黑,耳朵黏连在皮肤上,口鼻有融合,没有尾巴,四肢较短,并且脚趾发育不全。RIPK4敲除小鼠表现出皮肤表皮分化异常,发明人对该突变猪的皮肤进行了HE染色(图3),结果发现突变猪的表皮角化层有显著的异常,主要表现为角化层较为疏松。
实施例4 RIPK4的蛋白质的表达
由于没有在猪上可以使用的RIPK4 N端抗体,发明人构建了体外超表达载体RIPK4-HA-WT和RIPK4-HA-Mut并转染293T细胞,然后检测RIPK4的表达情况。结果发现,RIPK4突变后,蛋白有显著的降解,说明突变影响了蛋白的稳定性(图4)。
实施例5蹼足病巴马小型猪遗传工程疾病动物模型制备
通过CRISPR/Cas9***介导的高效遗传修饰,将RIPK4基因突变位点(c.1397_1398insA)靶向导入正常猪RIPK4基因相应序列,阳性猪表现为蹼足病表型并呈显性遗传。
1.设计gRNA,以第8号外显子为模板,设计可以打靶突变位点(c.1397_1398insA)附近序列的gRNA;
2.体外切割实验鉴定步骤1中的gRNA打靶效率;
3.将Cas9质粒和步骤2中筛选到的gRNA质粒转染胎儿成纤维细胞之后,对阳性细胞进行筛选和鉴定。将筛选到的含有RIPK4基因突变位点(c.1397_1398insA)的细胞进行扩繁和冻存;
4.以步骤3中胎儿成纤维细胞作为核供体,进行体细胞核移植和胚胎移植,从而获得蹼足病巴马小型猪遗传工程疾病动物模型。
最后说明的是,以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述,但本领域技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途
<130> DIC18110038
<160> 29
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgctcgcttc ttccccg 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgactcagg tggagagaaa 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taaccttggc actgaagccc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcgtcagcat ccgttttcca 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctgctccttc cgatcgtgc 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcaggaaagt cccagggtag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctgaaaagg ctctcggtgg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cctatgcaaa agcctgcgtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgggaagac aggacagatg 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agcctgaaac accaagaaga ca 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcttggggac acaggaatgc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
caatcaggcc agcacgtctt 20
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcaatgtc ctcctgtggg t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
tctctggatt tgtcctgacg c 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
acaggagagc atctggggat 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agcttgacaa tgggcaggtg 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ggagaagaac gcctctgtcc 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ccctggaact tgaggctctg 20
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aagctgctgc tggaggaga 19
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aaacaggcac tccgctacaa 20
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atctgcttgg gcgtcacc 18
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aaagcaggtc agaaaccccc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctgctctctt ctagccgcac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acgtgttcgg catatcacca 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tcattgtcac ctgtgtcgca 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgcctcaaat gctggtttgc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cgcccctcta ggtctcagat 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggcattgacg ctgatcttgc 20
<210> 29
<211> 3683
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
tgggcacctg ggcgaccgcg gcggcgcggg gcggcggctg gacgcgcgcg atggagggcg 60
agagccggag cccgtgggcc ctggggctgc tgcgcacctt cgacgcgagc gagttcgcgg 120
gctgggagaa ggtcggctcg ggcggcttcg ggcaggtgta caaggtgcgc cacgtccact 180
ggaagacctg gctcgccatc aagtgctcgc cgagcctgca cgtcgacgac agggagcgca 240
tggagcttct ggaagaagcc aagaagatgg agatggccaa gttccgctac gtgctgcccg 300
tgtacggcat ctgccaggag ccggtgggcc tggtcatgga gtacatggag acgggctccc 360
tggagaggct gctggcctcc gagccgctgc cctgggacct gcgcttccgc atcatccacg 420
agacggcggt gggcatgaac ttcctgcact gcatggcccc gcctctcctc cacctggacc 480
tcaagcccgc caacatcctg ctggacgccc actaccacgt caagatttcc gacttcgggc 540
tggccaagtg caacgggctg tcccacgcac acgacctcag catggacggc ctgttcggca 600
ccatcgccta cctccctccg gagcgcatcc gggagaagag ccggctcttc gacaccaagc 660
acgacgtgta cagcttcgcc atcgtgctct ggggcgtgct cacgcagaag aagccctttg 720
cagatgagaa gaacatcctg cacgtcatgg tgaaggtggt gaagggccac cgccccgagc 780
tgccgcccat ctgcagaccc cggccgcgcg cctgcaggag cctcctgcgc ctcatgcagc 840
ggtgctggca cggggacccc cgagaacggc ccagcttcca agaaatcact tccgaaactg 900
aggacctgtg cgagaagcct gatgaggagg tcagagagcc ggctcgagag ccagacgtga 960
gaagcccgcc cgagggggag gccgaggccg aggccgaggc gcccgtgccc gccccgctca 1020
agcgagcctc cgccccgacc ttcgacaacg actacagcct ctccgagctg ctgtcccagc 1080
tggactcggg cgtctcccag cccctccagg gcccggagga cctcagccgc agctcctccg 1140
aatccaagct cccgtccgcc agcagcggca agaggctctc aggcgtgtcc tctgtcgatt 1200
ccgccttctc ctccagaggg tcgctgtcct tgtccttcga gcgggagcct tccaccagcg 1260
agctcggcac ctccgacgtc cagaagagga agctcgtgga tgccatcgtg aacggggaca 1320
ccagcaggct gatgaagatc ctgcagccgc aggacgtcga cctggtcctg gacggcggcg 1380
ccagcctgct gcacctggcc gtggaggccg ggcaggagga ctgcgtcaag tggctgctgc 1440
tcaacaaatg ccaaccccaa cctgaccaac cggaagggct ccaccccgct ccacgtggct 1500
gtggagaagc gcgtgcgggg cgtcgtggag ctgctgctgg cccgcaagat cagcgtcaat 1560
gccacggacg aggaccagtg gacggccctg cacttcgccg cccagaacgg ggacgagggc 1620
agcacgcggc tgctgctgga gaagaacgcc tctgtccacg aggcggactg cgagggccgc 1680
acgcccatgc acgtggcctg ccagcacggc caggagggcg tcgtgcgcat cctgctgcgc 1740
cgtggcgtgg acgtgggcct gccggggaag gacgcctggg cgccgctgca ctacgccgcc 1800
tggcagggcc acctgcccat tgtcaagctg ctggccaagc agcccggcgt gagcgtcaac 1860
gcccagacgc tggacgggag gacgcccctg cacctggccg cccagcgcgg gcactaccgc 1920
gtggcccgcg tcctcatcga cctgcactct gacgtcaaca tgtgcaacct gctggcgcag 1980
acgcccctgc acgtggctgc ggagacgggc cacacgagca ccgccaggct gctcctgcac 2040
cgtggcgccc accgggaggc ggtgaccgcg gagggctgca ccgccctgca cctggcctcc 2100
cgcagcggcc acctggcgac cgtcaagctg ctgctggagg agaaggccga cctgctggcc 2160
cgggggcccc gcagccagac ggcgctgcac ctggccgcgg ctggcggcca ctcggaggtg 2220
gtggaggagc tggtgtgcgc cgacgtgctc gacctatcgg acgagcaggg gctcagcgcg 2280
ctgcacctgg ccgcccaggg ccggcacacc aagaccgtgg agacgctgct cagacacggg 2340
gcccacgtca acctgcagag cctcaagttc cagggtggcc ccggccccgc cgccacgctc 2400
ctgcggcgga gcaagaccta gcctgctgcc ctgggagatg gggcccgcgg ggtccctgtc 2460
ccagcgctgt gctccgctcg ccgtgtgtgg ccgtcgagag gcaggtggct gctgactctg 2520
gattcgcgcc agcatctgct tgggcgtcac ccttgggacg gcgtcggtct gggtgggctc 2580
gcccatccgc ccgtcggtgc accggtgtcg gaggggtggg ggctcggagg catctcgccg 2640
cgcttctggc tcgtgacacg ggccccttgg tgacgaaacc gagagcccac cgtcctgggc 2700
cgagctgccg ccaaccgccc ggaacgcacc gtctggggag gcaggtgtgg gaggagctgt 2760
gtcttttctc tccatttgca gcggcaggcg gagaggcctg ttccagaacg ttgtagcgga 2820
gtgcctgttt catcgtgtgt cgtcttagac gggcgctgtc gactgctgct tagacgcagt 2880
caaaccattc ccgttgttgg gtggtccggt cccggagtga ctgtaacgtg agtggttggt 2940
ctttaagcca caacccatca tcggacctgc tctcttctag ccgcacgcat tcgtccgtcg 3000
gtcagtcctc gtgagcggcc acccacgtgt gctgacccgc ggcctcgtgc atttctcacc 3060
gtagaagaca tcgagcgctg gcgtcaaatg tcggcgtcct gaaggatggg ctgacaacct 3120
cagtttggga ctcagaacag tgttccctgc ttagagggtc ccacctttct cctcattttc 3180
tttccagatc tcgtttttgg caaagggggg tggtttgtgc tgagtgatgc tgttttgggg 3240
tccccccggg ggtttctgac ctgctttgca aacagctaca ctgtgcaggg gcctcggctt 3300
tgggggggtg acccccgagt cgggtccaga agacagcctc atggtctcgg acgtagaagc 3360
cccgttcttt cattgtcacc tgtgtcgcac atgccactgt tggggtgagt tggccgcagg 3420
ccctcccctg tgtgcggaca tggccgtcgg ccgggcgtgt gagtcagaga tcgatgctga 3480
ttgatgtacc gtatgtgttc atatgattct gtggacagga ccgttctttt ctatgacagg 3540
aaatatccag actgcttaga actggctatg ttttaatagg cctcgtgctt ttaatatgtt 3600
accctatggt gatatgccga acacgtggaa gaaaaaggtt ttctttgata tcaataaagc 3660
tgttttcttc ctcctccttc aaa 3683
Claims (12)
1.一种小型猪的RIPK4突变基因,所述突变基因与野生型猪RIPK4基因相比,具有c.1397_1398insA的突变;
其中,所述RIPK4突变基因的序列如SEQ ID NO: 29所示。
2.一种构建体,所述构建体包含如权利要求1所述的RIPK4突变基因。
3.一种重组细胞,所述重组细胞由如权利要求2所述的构建体转化受体细胞获得。
4.根据权利要求3所述的重组细胞,其中,所述重组细胞为猪细胞。
5.根据权利要求3所述的重组细胞,其中,所述重组细胞为巴马小型猪细胞。
6.一种制备蹼足病小型猪模型的方法,所述方法包括:
改变小型猪的RIPK4基因,使RIPK4基因的第1397位碱基和1398位碱基之间***腺嘌呤A,
其中,改变后的RIPK4基因的序列如SEQ ID NO: 29所示。
7.一种非诊断目的的筛选具有RIPK4突变基因的蹼足病小型猪模型的方法,所述方法包括以下步骤:
1)提取待测生物样品的核酸DNA;
2)确定所述核酸DNA的序列;
3)所述核酸的序列或其互补序列,与野生型RIPK4基因相比具有c.1397_1398insA突变,所述突变是蹼足病的指示;
其中,所述突变型RIPK4基因的序列如SEQ ID NO: 29所示,所述生物样品选自血液、皮肤、毛发和肌肉中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,在步骤2)中,确定所述核酸的序列包括如下步骤:
采用猪RIPK4基因的特异性引物进行PCR,得到扩增产物并对扩增产物进行测序;
其中,正向引物序列如SEQ ID NO: 27所示,反向引物序列如SEQ ID NO: 28所示。
9.一种筛选RIPK4基因突变蹼足病小型猪模型的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括RIPK4基因的特异性引物;
其中,正向引物序列如SEQ ID NO: 27所示,反向引物序列如SEQ ID NO: 28所示。
10.如权利要求1所述的突变基因、如权利要求2所述的构建体、如权利要求3至5中任一项所述的重组细胞或如权利要求9所述的试剂盒在制备用于筛选蹼足病的动物模型中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途,其中,所述动物模型为哺乳动物模型。
12.根据权利要求11所述的用途,其中,所述哺乳动物为小鼠、猴或小型猪。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810952553.5A CN110846330B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810952553.5A CN110846330B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN110846330A CN110846330A (zh) | 2020-02-28 |
CN110846330B true CN110846330B (zh) | 2021-08-27 |
Family
ID=69595091
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201810952553.5A Active CN110846330B (zh) | 2018-08-21 | 2018-08-21 | 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN110846330B (zh) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114181944B (zh) * | 2020-09-14 | 2023-10-03 | 中国科学院动物研究所 | 突变基因及构建短肢性侏儒症小型猪模型的方法和用途 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2336363A1 (en) * | 2004-05-14 | 2011-06-22 | Rosetta Genomics Ltd | MicroRNAs and uses thereof |
WO2016066770A1 (en) * | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Stallergenes | Markers of immune response |
CN106535630A (zh) * | 2014-04-28 | 2017-03-22 | 重组股份有限公司 | 猪中的多重基因编辑 |
CN108245680A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-07-06 | 中南大学湘雅三医院 | Ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用 |
-
2018
- 2018-08-21 CN CN201810952553.5A patent/CN110846330B/zh active Active
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2336363A1 (en) * | 2004-05-14 | 2011-06-22 | Rosetta Genomics Ltd | MicroRNAs and uses thereof |
CN106535630A (zh) * | 2014-04-28 | 2017-03-22 | 重组股份有限公司 | 猪中的多重基因编辑 |
WO2016066770A1 (en) * | 2014-10-29 | 2016-05-06 | Stallergenes | Markers of immune response |
CN108245680A (zh) * | 2018-02-12 | 2018-07-06 | 中南大学湘雅三医院 | Ripk4作为靶位点在制备治疗膀胱癌药物中的应用 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
"Confirmation that RIPK4 mutations cause not only Bartsocas-Papas syndrome but also CHAND syndrome";Tiffany Busa et al.;《American Journal of medical genetics》;20171231;第173A卷;摘要 * |
"Crystal Structure of Ripk4 Reveals Dimerization-Dependent Kinase Activity";Christine S. Huang et al.;《Structure》;20180426;第26卷;第767页第1栏第1段 * |
"Exome Sequence Identifies RIPK4 as the Bartsocas-Papas Syndrome Locus";Karen Mitchell et al.;《The American Journal of Human Genetics》;20120113;第90卷;摘要 * |
"唇腭裂的分子遗传学研究进展";何淼等;《口腔生物医学》;20170331;第8卷(第1期);第32-36页 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN110846330A (zh) | 2020-02-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109706184B (zh) | 自闭症模型犬的建立方法 | |
CN105518132A (zh) | 缺乏lincRNA的非人类动物 | |
JP2010029219A (ja) | 動物モデルの開発のための方法 | |
CN111808887B (zh) | 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法 | |
CN110846330B (zh) | 一种突变基因及其用于构建蹼足病小型猪模型的用途 | |
US20220369608A1 (en) | Method for establishing diabetes disease model dog | |
CN111876418B (zh) | 先天性黑蒙模型犬的建立方法 | |
CN112889754A (zh) | 一种糖原累积病Ⅰb型基因点突变小鼠模型的构建方法及应用 | |
CN105238793A (zh) | 引起内耳Mondini畸形的猪SOX10突变基因及其应用 | |
CN110846321B (zh) | 一种突变基因及其用于构建斑色鱼鳞癣小型猪模型的用途 | |
JP6201265B2 (ja) | 所望の形質を有する豚の作出方法 | |
CN110195057A (zh) | Hr基因经遗传修饰的非人动物或其子代的制备方法及应用 | |
CN114181944B (zh) | 突变基因及构建短肢性侏儒症小型猪模型的方法和用途 | |
CN111705063A (zh) | Asgr1突变基因及其在制备哺乳动物肝损伤敏感模型中的应用 | |
CN113207808A (zh) | 一种柯乐猪的选育方法 | |
CN111808859B (zh) | WAS基因的gRNA及其应用 | |
CN114868707B (zh) | 一种代谢性脑病和心律失常疾病的斑马鱼模型及其应用 | |
CN115181170A (zh) | 一种猪tmc1突变基因及其用途 | |
CN114317603B (zh) | 一种Foxi3基因定点突变小鼠模型的构建方法及其应用 | |
CN103145824B (zh) | 一种突变型隐色素基因1和突变型隐色素基因1的转基因猪 | |
KR20230130639A (ko) | 마이오스타틴 유전자가 변형된 형질전환 동물 | |
JP5344732B2 (ja) | ヒトtpo受容体の膜貫通部位を有するキメラtpo受容体導入ノックイン非ヒト哺乳動物 | |
CN114592008A (zh) | 一种非人哺乳动物性早熟动物模型的建立方法及其用途 | |
CN117143916A (zh) | Wnt10a基因功能缺失变异疾病模型犬的建立方法 | |
CN114517212A (zh) | 一种crx基因缺失型突变的猫突变体的构建方法及应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |