CN111808887B - 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法 - Google Patents

一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法。本发明提供了一种制备MSTN双等位基因突变细胞的方法，为对牛离体成纤维细胞基因组的MSTN基因双等位基因的第一外显子的靶点区域均进行基因组编辑，使外显子1提前形成终止密码子而终止表达，得到MSTN双等位基因突变细胞；本发明建立了一种制备无任何外源DNA整合的双MSTN等位基因小片段缺失的（MSTN ‑4/‑4）敲除牛，重要的这种牛与自然存在的比利时蓝牛牛有非常相似的双肌臀表型。

Description

一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法。
背景技术
随着我国政府对农业问题的持续关注和大力支持，我国农业发展取得了长足的进步，特别是与动物相关的畜牧类产业的飞速发展，使人民的生活状况及饮食结构获得了极大的改善。国内外实践表明，在畜牧业发展中，品种贡献率达到40％以上，因此动物育种技术在促进畜牧业乃至农业发展中发挥至关重要甚至是不可替代的作用。然而在我国，主要畜牧类品种则严重依赖于进口，在主要的畜牧类品种中，肉牛品种依赖程度接近90%！这意味着动物农业整个产业链的源头—品种严重依赖于国际市场。因此如果国家要进一步提高畜牧业的效率、进一步保证畜牧业产业链的安全，动物育种则是重中之重。
在200多年前，有欧洲的饲养者发现某些品种牛的肌肉异常发达，这种发达的肌肉表型后来被称之为“双肌”型（Double-Muscled Phenotype）。比利时蓝（Belgian Blue）牛和皮尔蒙特（Piedmontese）牛就是2 个经过长期遗传选育得到的“双肌”牛品种（图1）。“双肌”牛的外部特征包括腿相对较短，骨管较细但骨骼较大，臀部、大腿、上臂、胸以及起支撑作用的中前端肌肉群十分发达。与普通牛相比，“双肌”牛有较多的脂肪沉积于肋间和脂肪窝，且脂肪的沉积从内到外呈逐渐减少的趋势。“双肌”牛胴体的肉骨比、瘦肉率比普通牛高，优质高价肉比例大，而且脂肪率较低，口感良好，在市场上颇受欢迎。有研究表明，“双肌”性状可以使牛在相同饲喂条件下肌肉产量增加20%-30%，“双肌”牛在育种和屠宰场都受到很高的评价，是肉牛中非常优良的品种。但是由于我们国内没有肉牛种源，因此通过传统育种技术很难培育出类似比利时蓝和皮尔蒙特这种双肌臀表型的高品质肉牛。
随后，科研工作对控制肌肉生长相关机制进行研究。最早，肌肉生长抑制（Myostatin, MSTN）基因最早是由McPherron& Lee 于1997 年在小鼠中发现的。研究发现该基因由3个外显子和2个内含子组成，只有一个开放阅读框，可编码376 个氨基酸，蛋白结构具有TGF-β 超家族的典型特征。同年，Mcpherron和Lee 研究解开了比利时蓝牛和皮尔蒙特牛（图1）所具有的“双肌”性状之迷。这是因为它的myostatin 基因在外显子3 的功能核心区域丢失了11 bp 的核苷酸序列（图2），造成移码突变，使得缺失突变后面的第14 位密码子变为终止密码子，蛋白翻译提前终止（C-端活性区仅翻译了7 个氨基酸），合成无功能的myostatin 蛋白。在皮尔蒙特“双肌”牛中，myostatin 第三外显子中包含了一个错义突变（核甘酸G 突变为A），结果造成蛋白功能核心区域一个保守的半胱氨酸被酪氨酸取代（图2）。该半胱氨酸直接参与二硫键的形成，对于维持蛋白质的三维结构起着非常重要的作用。由于酪氨酸取代了半胱氨酸，不能形成二硫键，造成蛋白质的空间结构发生改变，导致myostatin 功能全部或几乎全部丧失。
虽然知道了机制，但是很难通过传统的基因打靶技术去模拟制备这种“双肌臀”牛。第一，在牛中通过传统基因打靶进行MSTN单等位基因敲除的效率非常低，MSTN双等位基因敲除更难上加难。第二，同时传统基因打靶技术会引入筛选标记基因，这样与天然的双肌臀牛基因组差异巨大，同时筛选标记基因会引起生物安全问题。第三，通过传统基因打靶技术很难获得纯和的11bp或者单碱基突变这种自然突变类型的牛。
随着人造核酸酶的不断进展（ZFNs/TALENs/Cas9）,大动物双等位基因敲除技术大大提高，同时也有很多MSTN基因敲除动物的出现，然而这些研究依然存在很多问题，第一，同样存在筛选标记基因或者人造核酸酶基因；第二，两条双等位基因的缺失大小及类型不同，这些造成动物体内存在多种转录本，影响功能研究及动物本身。这些都可能是目前没有获得存活正常的MSTN基因敲除大动物的原因之一。重要的这些基因编辑动物的基因型与自然突变类型牛的基因型差异巨大。因此建立模拟制备自然突变的双肌臀牛意义重大。
发明内容
本发明一个目的是提供一种制备MSTN双等位基因突变细胞的方法。
本发明提供的方法，为对牛离体成纤维细胞基因组的MSTN基因双等位基因的第一外显子的靶点区域均进行基因组编辑，使所述第一外显子提前形成终止密码子而终止表达，得到MSTN双等位基因突变细胞；
所述靶点区域为序列4第1-23位所示的核苷酸。
或本发明提供制备MSTN双等位基因突变细胞的方法，为使牛离体成纤维细胞基因组的MSTN基因双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸均缺失，其他核苷酸序列不变，得到MSTN双等位基因突变细胞；
所述MSTN基因双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
上述方法中，所述基因组编辑通过CRISPR/CRISPR-Cas9***进行；
所述CRISPR/CRISPR-Cas9***中的sgRNA的靶区域为序列4第1-23位所示的核苷酸。
上述方法中，所述CRISPR/CRISPR-Cas9***的sgRNA为序列8。
上述方法中，所述CRISPR/CRISPR-Cas9***为如下1）或2）：
1）表达所述sgRNA和Cas9的质粒；
2）所述sgRNA和所述Cas9蛋白的mRNA。
上述方法具体包括如下步骤：将所述CRISPR/CRISPR-Cas9***导入所述离体牛成纤维细胞系中，得到MSTN双等位基因突变细胞。
本发明另一个目的是提供一种制备双肌臀牛的方法。
本发明提供的方法，为将上述方法制备的所述MSTN双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母牛体内，生产的子代即为双肌臀牛。
上述双肌臀牛的基因组中含有MSTN双等位基因突变；所述MSTN双等位基因突变为将MSTN基因双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸均缺失，其他核苷酸序列不变得到的基因。
所述MSTN基因双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
本发明还有一个目的是提供一种MSTN双等位突变基因。
本发明提供的MSTN双等位突变基因，为将MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失，其他核苷酸序列不变，得到的片段；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
本发明还有一个目的是提供一种用于制备双肌臀牛的物质。
本发明提供的物质，为使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2；
所述物质为上述方法中的所述CRISPR/CRISPR-Cas9***。
使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质在制备双肌臀牛中的应用也是本发明保护的范围；
或，使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质在双肌臀牛育种中的应用也是本发明保护的范围；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
上述双肌臀牛为模拟自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛。
本发明建立了一种制备无任何外源DNA整合的双MSTN等位基因小片段缺失的（MSTN -4/-4）敲除牛，重要的这种牛与自然存在的比利时蓝牛有非常相似的双肌臀表型。本发明的优点如下：1、制备的双肌臀牛的双等位基因均为-4bp缺失，比较难得，小片段的缺失更接近自然突变，更重要的是对于育种来说双等位基因具有相同的突变类型更适合稳定遗传及品系建立；2、得到的双肌臀牛已正常存活5年，一直保持双肌臀表型，且能稳定传代，说明本发明的方法构建的双肌臀牛表型稳定，适宜遗传育种；3、这种缺失突变双肌臀表现明显；4、由于构建具有“双肌臀”表型的牛的过程中没有导入质粒，无需考虑质粒整合问题，且无筛选标记基因存在，更加安全，与自然突变接近。
附图说明
图1为具有“双肌臀”表型的比利时蓝牛（图左）和皮尔蒙特牛图片（图右）。
图2为比利时蓝牛（第三外显子11bp删除）和皮尔蒙特牛（第三外显子G-A）点突变示意图。
图3为无外源DNA整合的MSTN基因双等位基因小片段删除牛制备流程图。
图4为MSTN特异性Cas9效率验证。
图5为MSTN双等位基因 4bp 敲除牛在5年龄时双肌臀表型。
图6为MSTN双等位基因敲除牛DNA测序结果。
图7为MSTN双等位基因敲除牛cDNA测序结果。
图8为MSTN双等位基因敲除牛Q-PCR结果。
图9为MSTN双等位基因敲除牛背膘厚度测量结果。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中荷斯坦奶牛成纤维细胞系（也称为野生型成纤维细胞）按照如下方法制备：
取荷斯坦奶牛的耳部皮肤组织，耳部下缘背侧去毛后以70%酒精清洗干净，再用刀片从耳部下缘背侧剔取面积为1cm2左右的皮肤，置于0℃的DMEM/F12中尽快运回实验室，以PBS和70%酒精清洗数遍后剪碎成1mm3左右的小块，DMEM/F12清洗2遍后分批植块于含1mLDMEM/F12+10%FBS的25cm2的培养瓶中，待组织块贴壁牢固后再补加DMEM/F12+10%FBS至6mL，于37℃、5% CO2培养箱培养6-7d，每2d换液1次，待细胞生长汇合后，以0.25%胰蛋白酶（trypsin）消化传代2-3次，分批以DMEM/F12+20%FBS+10%DMSO 冻存。这样，经原代培养、传代培养、冷冻等体外培养操作，建立了荷斯坦奶牛成纤维细胞系。
实施例1、MSTN双等位基因突变的sgRNA筛选
本研究利用CRISPR/Cas9结合体细胞克隆技术制备MSTN基因敲除牛。Cas9质粒直接进行转染细胞，往往有许多缺点，比如随机整合、抗性基因的引入、多拷贝数造成基因过表达等。鉴于此，采用Cas9的mRNA 形式来转染细胞：一是不存在随机整合到宿主细胞的可能性，既保持了转染细胞遗传信息的稳定性，又能避免引入异源基因造成生物安全方面的问题；二是由于mRNA有一定的半衰期，在一定程度上控制了基因的表达量以及表达时间，这对于细胞的危害（基因的过表达，off-targeting 效应等）将会降低。同时为了避免使用筛选标记基因，本研究使用本实验室建立的单细胞培养技术，制备无外源DNA整合的MSTN基因双等位基因小片段删除牛，技术路线见图3。
一、用于MSTN双等位基因突变的物质
1、表达载体PX330-gRNA
本研究选择MSTN基因外显子1区域作为打靶位点,MSTN基因序列如序列1所示，外显子1序列如序列2所示。
设计3个cas9，其识别序列分别为：Cas9-1: AACGGTCATTACCATGCCCACGG;Cas9-2：GCAGGACTACTCACACTCCGTGG;Cas9-3：CGGAGTGTGAGTAGTCCTGCTGG。
根据设计出的序列分别合成单链寡核苷酸，合成方法如下：
CRISPR/Cas9-F1：CACCGaacggtcattaccatgccca、CRISPR/Cas9-R1:AAACtgggcatggtaatgaccgttC；
CRISPR/Cas9-F2：CACCGgcaggactactcacactccg、CRISPR/Cas9-R2:AAACcggagtgtgagtagtcctgcC；
CRISPR/Cas9-F3：CACCGcggagtgtgagtagtcctgctgg、CRISPR/Cas9-R3:AAACccagcaggactactcacactccgC。
将上述各个CRISPR/Cas9-F与CRISPR/Cas9-R退火获得带粘性末端的双链DNA 片段gRNA1、带粘性末端的双链DNA 片段gRNA2和带粘性末端的双链DNA 片段gRNA3；
将PX330（购自Addgene，该载体含有Cas9蛋白表达单元）载体经BbsⅠ酶切回收片段，再将上述gRNA1、gRNA2和gRNA3分别连入该回收片段中，获得 CRISPR/Cas9 表达载体PX330-sgRNA1、PX330-sgRNA2、PX330-sgRNA3。
表达载体PX330-sgRNA1为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA1***PX330载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA1与该载体上的Cas9蛋白结合区共同表达sgRNA1，用于靶向目标序列，并结合cas9蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA1编码基因（其序列见序列3，其中第1-20位核苷酸为靶区域结合区，第21-100位核苷酸为与cas9蛋白结合区域），表达sgRNA1。
表达载体PX330-sgRNA2为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA2***PX330载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA2与该载体上的Cas9蛋白结合区共同表达sgRNA2，用于靶向目标序列，并结合cas9蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA2编码基因（其序列见序列4，其中第1-23位核苷酸为靶区域结合区，第24-103位核苷酸为与cas9蛋白结合区域），表达sgRNA2。
表达载体PX330-sgRNA3为将带粘性末端的双链DNA 片段gRNA3***PX330载体的BbsⅠ酶切位点间得到的质粒；gRNA3与该载体上的Cas9蛋白结合区共同表达sgRNA3，用于靶向目标序列，并结合cas9蛋白进行目标区域的切割。该质粒中含有sgRNA3编码基因（其序列见序列5，其中第1-20位核苷酸为靶区域结合区，第21-100位核苷酸为与cas9蛋白结合区域），表达sgRNA3。
上述表达载体可以作为CRISPR-Cas9***组分。
2、切割效率验证
Cas9在哺乳动物细胞中介导基因敲除, 主要是通过 DNA双链断裂形成小片段的碱基缺失或者碱基***, 而这种小片段的基因修饰可以被 T7E1酶切进行检测。其基本原理为：当作用靶点发生双链断裂后, 细胞会启动 DNA修复机制对其进行修复, 从而产生多种类型的碱基缺失或***突变型。经过 PCR扩增目标序列后, 由于部分碱基的缺失或***, 不同分子之间经过 PCR再次梯度退火会产生 DNA鼓泡, 而 T7E1会特异性识别鼓泡位置并进行切割, 从而鉴定cas9是否能在目的位点介导基因敲除。
针对切割位置，设计PCR扩增引物：
设计PCR扩增引物cas9-F: 5’ GAATGAGAACAGCGAGCAG 3’、cas9-R: 5’ATAGGCTTCAACCTCTACAGA3’。
1）Cas9电转牛成纤维细胞
(1) 电转前2d, 将2×105 个荷斯坦奶牛成纤维细胞系复苏于6孔板培养皿内,加4ml 含10% （体积百分含量）胎牛血清（FBS）的 DMEM培养液（购自Gibco）。置37℃、5% CO2 培养箱中培养。
(2) 待6孔板细胞长满后，约1×106个细胞，用1 ml 0.25%胰蛋白酶（购自Gibco）溶液消化细胞。以1000 g 离心5 min 沉淀细胞。将细胞沉淀用PBS缓冲液（购自Gibco） 洗1次。将细胞重新悬浮于100μL电击缓冲液（购自LOZA公司）中，得到细胞悬浮液。
(3) 向100μL上述（2）得到的细胞悬浮液中分别加入上述1中的3μg 表达载体PX330-sgRNA1、PX330-sgRNA2和PX330-sgRNA3，混合后转入电击杯（购自LOZA公司）中。
(4) 以 1.2KV/cm的电场强度和 1ms的脉冲时间,电击细胞。
(5) 将电击后的细胞转入60mm 的细胞培养皿中；加入4 ml 含10%（体积百分含量）胎牛血清的DMEM 培养液，于CO2 培养箱中培养，细胞生长状态恢复，得到Cas9电转PX330-sgRNA1牛成纤维细胞、Cas9电转PX330-sgRNA2牛成纤维细胞和Cas9电转PX330-sgRNA3牛成纤维细胞。
2）PCR扩增
分别提取上述1）得到的电转后48 h的Cas9电转PX330-sgRNA1牛成纤维细胞、Cas9电转PX330-sgRNA2牛成纤维细胞、Cas9电转PX330-sgRNA3牛成纤维细胞和荷斯坦奶牛成纤维细胞系（WT）的基因组DNA。
以基因组DNA为模板, 用上述Cas9-F 和Cas9-R作为引物进行PCR扩增，得到PCR产物。
3）PCR 产物进行梯度退火
将上述2）得到的PCR产物进行柱纯化回收, 并测定 PCR 产物浓度，对 PCR 产物进行梯度退火, 得到梯度退火的 PCR 产物。
上述梯度退火的体系如下表1所示：
表1为梯度退火的体系
体系 20 μL
PCR产物 400 ng
Taq Buffer（购自康为世纪） 2.0 μL
ddH2O 补充至 20 μL体系
上述PCR产物梯度退火程序如表2所示：
表2为PCR产物梯度退火程序
温度 时间 Ramp
95°C 10min -2°C
95°C-85°C 1 min -0.3°C
85°C-75°C 1 min -0.3°C
75°C-65°C 1 min -0.3°C
65°C-55°C 1 min -0.3°C
55°C-45°C 1 min -0.3°C
45°C-35°C 1 min -0.3°C
35°C-25°C 1 min -0.3°C
4°C Hold —
4）对上述3）得到的梯度退火的 PCR 产物进行 T7E1酶切, 酶切体系如下表3所示：
表3为酶切体系
体系 25 μL
梯度退火的 PCR 产物 20 μL
Buffer 2.1(NEB) 2.5 μL
T7E1(NEB) 0.5 μL
ddH2O 补充至 25 μL体系
反应程序：将表3所示的酶切反应在 37°C 恒温培养箱中进行, 酶切反应时间 1h，得到酶切产物。
将上述酶切产物进行聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)电泳检测，采用8%的聚丙烯酰胺凝胶，电泳结束后, EB对PAGE胶进行染色；通过ImageJ软件对酶切条带进行灰度分析, 确定Cas9切割效率。
切割效率为PCR主条带和切割后的条带的强度比值。
切割效率检测结果如图4上图所示，WT为荷斯坦奶牛成纤维细胞系，百分数表示切割效率，gRNA1、gRNA2、gRNA3分别对应Cas9电转PX330-sgRNA1牛成纤维细胞、Cas9电转PX330-sgRNA2牛成纤维细胞和Cas9电转PX330-sgRNA3牛成纤维细胞；结果表明，在牛的成纤维细胞中, 针对MSTN位点的三个gRNA1、gRNA2、gRNA3对应的CRISPR-Cas9***均具有较高的切割活性, 经生物学灰度分析软件分析, 其切割效率分别为20%、 35%、1%。
为了进一步确定sgRNA介导的双链断裂是在靶区域, 将具有较高切割活性的Cas9电转PX330-sgRNA2牛成纤维细胞，提取基因组DNA为模板，用Cas9-F 和Cas9-R引物扩增，得到的PCR 产物回收, 进行T-A 克隆测序。
测序结果与野生MSTN基因序列（序列1）比对,证实sgRNA2在靶位点发生了有效切割（图4下图），因此可以成为介导外源基因敲除的有利工具。
实施例2、MSTN双等位基因突变牛胎儿成纤维细胞系及双肌臀肉牛的制备
一、MSTN双等位基因突变细胞的制备
1、体外转录cas9 mRNA
pX330载体（购自Addgene）表达cas9蛋白。
以pX330载体为模板，用T7-Cas9-F:ttaatacgactcactatagGGAGAATGGACTATAAGGACCACGAC和T7-Cas9-R:GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC为引物扩增，得到PCR产物，即为cas9编码基因（序列6）。
利用美国Ambion公司的体外转录及加polyA试剂盒将上述cas9编码基因体外转录制备cas9蛋白的mRNA，具体过程如下：
a、体外转录 mRNA（Ambion试剂盒法）
1)室温配制体外转录 mRNA 体系：
表4为体外转录 mRNA 体系
组分 体积
PCR产物 总量1μg
2×NTP/CAP 10μL
10×Buffer 2μL
RNA 合成酶 2μL
ddH2O Up to 20μL
2) 混合完全，37℃ 孵育 1 hr；
3) 加入 1μL TURBO DNA 酶，消化质粒模板，37℃孵育 15min，得到mRNA。
b、体外转录 mRNA 加polyA（Ambion试剂盒法）
1)室温配制体外转录 mRNA 加polyA体系：
表5为体外转录 mRNA 加polyA体系
组分 体积
mRNA 20μL
5×E-PAP Buffer 20μL
MnCl2(25mM) 10μL
ATP(10mM) 10μL
E-PAP 4μL
ddH2O 36μL
Total 100μL
2)混合完全，37℃孵育 1hr。
c、体外转录 mRNA 回收（Ambion试剂盒法）
1)向上述步骤反应产物加入 350μL 结合液（binding buffer），吹吸混匀；
2) 加入 250μL 无水乙醇，混合均匀；
3) 将样品转移到柱子中，10000g 室温离心 1min；
4) 弃掉滤液，重新装好柱子，500μL 洗脱液漂洗柱子，10000g 室温离心 1min；
5) 重复漂洗一次；弃掉滤液，空柱离心 15s；
6) 将柱子放入一个新的离心管中，加入 50μL 洗脱液（Nuclease-free 水）到柱子中央位置，盖好盖子 60℃孵育 10min，10000g 室温离心 1min，收集洗脱液，得到cas9mRNA溶液（浓度为2μg/μL，其中cas9 mRNA的核苷酸序列为序列6的t替换为U得到的序列）。
2、体外转录sgRNA
1）sgRNA2编码基因的获得
以实施例1制备的pX330-sgRNA2载体为模板，用T7-sgRNA-F:ttaatacgactcactatagggcaggactactcacactccg和T7- sgRNA -R:AAAAGCACCGACTCGGTGCC为引物扩增，得到PCR产物，即为含有sgRNA2编码基因的序列（序列7，第1-20位为T7启动子，第21-40位为靶区域，第41-120位为cas9蛋白结合区域）。
2）取步骤1得到的PCR产物作为模板，配置下表中体外转录体系(MEGAshortscript™ T7 Transcription Kit，AM1354, Ambion)，37℃孵育 2 h。
表6为sgRNA2体外转录体系
组分 体积
PCR产物 总计2μg
2×ATP/CTP/UTP/GTP 2/2/2/2μL
10×Reaction Buffer 2 μL
Enzyme Mix 2 μL
总计 20 μL
3）完成步骤2后，向反应体系中加入1μL TURBO DNA 酶，37℃孵育 15min。
4）完成步骤3后，加入2倍体积无水乙醇沉淀转录产物，-20℃静置30min，13000rpm 离心 30min，弃去上清液，取沉淀。
5）采用75%（v/v）乙醇水溶液充分洗涤步骤4得到的沉淀，弃去上清液，超净台充分吹干，Nuclease-free 水充分溶解sgRNA，得到sgRNA2溶液（浓度为5μg/μL，sgRNA2的序列为序列8）。
3、MSTN双等位基因突变牛成纤维细胞系的制备
(1) 于转染前2d,将建立的荷斯坦奶牛成纤维细胞系复苏于6孔板中,加4 ml 含10% 小牛血清的 DMEM培养液（均购自Gibco）, 置37℃、5% CO2 培养箱中培养。
(2) 用1 ml 0.25%胰蛋白酶（购自Gibco）溶液消化细胞。以1000 g 离心5 min 沉淀细胞。将细胞沉淀用PBS（购自Gibco） 洗1次。将细胞重新悬浮于1 ml PBS （购自Gibco）中，得到细胞悬液。
(3) 利用细胞计数仪（Sigma）进行细胞计数。在2×106个细胞悬液中将上述1得到的体外转录的cas9 mRNA溶液（使转染体系中的cas9 mRNA为4μg）与上述2得到的sgRNA2溶液（使转染体系中的sgRNA2为4μg）充分混匀后，得到转染体系，将该转染体系共转入电击杯，进行电击（电场强度为1.2KV/cm，脉冲时间为1ms）。
(4) 以1.2KV/cm的电场强度和1ms的脉冲时间,电击细胞。
(5)完成步骤（4）后，将电击后的细胞转入培养皿（规格为60mm皿），加入4mL含10%（v/v）胎牛血清的DMEM培养液，37℃、5%CO2培养2d，得到转染后细胞。
(6) 将上述步骤(5)得到的转染后细胞培养至融合率达80%-90%时，用37℃的0.25%胰酶（购自Gibco）消化，含10%（v/v）FBS的DMEM培养基终止消化后，离心收集细胞。
(7) 用含20%（v/v）FBS的DMEM培养基重悬细胞，取部分细胞进行计数，将细胞稀释至100个/mL，得到细胞悬浮液。向20个已添加9mL含20%（v/v）FBS的DMEM培养基的培养皿中各加入1mL细胞悬浮液（100个/mL），37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。
(8)待培养皿中的细胞克隆生长至直径达2mm以上时，去除培养基，DPBS冲洗后，用克隆环罩在克隆团上，向其中滴加约100μL 37℃的0.25%胰酶（购自Gibco），消化约3min后，滴加含10%（v/v）FBS的DMEM培养基终止消化，轻轻吹打后将其转移至48孔板中扩大培养。
(9) 48孔板中细胞融合率达90%时，消化后取一半细胞用于细胞克隆基因型鉴定，剩余一半继续在孔板中培养。
(10)用于鉴定基因型的细胞经过1000g离心5min 后，弃上清，依据细胞沉淀量加入20μL细胞裂解缓冲液（50Mm KCL，2.5mM Mgcl2，10mM Tris-Hcl，0.45% NP40，0.45% 吐温20和0.2mg/mL 蛋白酶K），得到细胞裂解液。
(11)吸取3μL细胞裂解液为模板进行PCR鉴定，鉴定引物序列如下：P1：5’GAATGAGAACAGCGAGCAG 3’、P2：5’ATAGGCTTCAACCTCTACAGA3’。反应体系如下：
表7为PCR鉴定体系
体系 20 μL
DNA 模板 1.0μL
Forward primer (10μM) 0.4 μL
Reverse primer (10μM) 0.4 μL
dNTP 0.4 μL
LA DNA聚合酶 0.3 μL
10× PCR Buffer 2.0 μL
ddH<sub>2</sub>O 15.5μL
反应程序如下:
PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 sec，52℃ 30 sec，72℃ 1 min，35 个循环；72℃ 5 min，4℃结束。
得到767bp大小的条带。
将PCR产物进行纯化、测序，将PCR产物连接到pMD-19t质粒载体中，转化大肠杆菌感受态后，挑取多个单菌落进行测序，将测序结果与野生型MSTN基因（序列1）进行比对，获得详细的突变信息，即可确定该细胞系是否突变及突变类型。
结果如下：筛选细胞克隆点52个，经过PCR测序分析，共得到30个阳性细胞克隆点，其中单等位基因突变的细胞克隆点28个，双等位基因突变克隆点1个，双等位基因突变的类型为双等位基因-4/-4bp缺失，-4/-4bp缺失类型可以形成移码突变，如图6所示，将该突变形式的基因命名为MSTN双等位突变基因，将含有该突变基因的细胞命名MSTN双等位基因牛成纤维细胞突变体。
MSTN双等位突变基因为MSTN的双等位基因（序列1）的第一外显子（序列2）的第503-506位的GAGT缺失，其他核苷酸序列不变，即牛成纤维细胞中2个同源染色体上的MSTN的第一外显子（序列2）的第503-506位的GAGT均缺失。
由于与野生型MSTN基因相比，MSTN双等位突变基因的等位基因的两条链均为4bp缺失，在缺失区域前的第一外显子和之后的外显子序列均无变化，但是由于缺失，导致提前出现了终止子，见图7，所以MSTN提前终止，造成蛋白功能丧失。
二、MSTN双等位基因突变牛的获得
1、***的成熟培养
从屠宰厂收集成年母牛（黄牛）的卵巢，置于30℃的生理盐水在4h内送到实验室，37℃的PBS液中清洗三遍后，以直径为0.7mm针头抽取直径为2-8mm的卵泡，回收形态均匀、结构致密的卵丘-***-复合体(COCs)，以成熟液(M199+10%FBS+0.01U/mL bFSH+0.01U/mL bLH+1µg/mL ***)洗涤两遍，然后将卵丘-***-复合体以50-60枚/孔放入含成熟液的四孔板，在38.5℃、5%CO2培养箱中成熟培养20h后，将成熟的***放入0.1%（质量g/体积ml）透明质酸酶溶液（溶剂为PBS）的管内振荡2-3min后，再用玻璃管轻轻吹打，使卵丘细胞与***完全脱离，选择形态完整，细胞质均匀并排出带有第一极体的***为胞质受体。
2、核移植程序和克隆胚胎的体外培养
（1）取上述一得到的处于对数生长期的MSTN双等位基因牛成纤维细胞突变体，用0.25%胰蛋白酶消化5min，得到单细胞。
（2）将步骤（1）得到的单细胞（供体细胞）移入上述1得到的胞质受体的透明带内，再先置于Zimmerman液（100mL Zimmerman液由蔗糖0.9854g、四水合醋酸镁10.7mg、一水合醋酸钙1.8mg、磷酸氢二钾7.4mg、还原型谷胱甘肽3.1mg、牛血清蛋白1.0mg和水组成）中平衡3-5min，再置于融合槽内转动***使供体细胞与***接触而与电场垂直，同时在场强为2.5kV/cm的直流脉冲场中，在脉冲时间为10μs、脉冲次数为2次、脉冲间隔为1s的条件下融合（融合仪为BTX公司的产品，型号为ECM-2001），迅速移入含10%（v/v）FBS的M199液（Gibco公司的产品），37℃、5%CO2培养30min，得到重构胚。
（3）取步骤2得到的重构胚，加入含有5uM的钙离子载体A23178（购自Sigma）的CR1aa培养液（100mL CR1aa培养液由0.67g氯化钠、0.023g氯化钾、0.22g碳酸氢钠、2mg丙酮酸钠、100μl酚红和水组成）处理5min；弃液相，再加入含有5μg/mL细胞松驰素B和10μg/mL放线菌酮的CR1aa培养液处理5h（目的为激活重组胚）；弃液相，加入含5%（v/v）FBS的CR1aa培养液，37℃、5%CO2培养48h，观察卵裂率（约80%），7-8d观察囊胚发育率（约30%），得到双等位突变克隆囊胚。
（4）将上述（3）得到的形态优良的第7d的双等位突变克隆囊胚移入同期的受体牛的子宫角内。在移植后的第30d对受体母牛进行B超检测以确定受胎情况，并分别在移植后的第60d和第90d进行直肠检测以确定妊娠率，妊娠率为40%。
（5）对妊娠母牛按常规饲养方法进行饲养，经过280天，妊娠母牛正常分娩，得到体细胞克隆种牛（即为MSTN双等位基因敲除牛）。
三、表型检测
1、双肌臀表型
饲养体细胞克隆种牛，5岁时拍照观察，如图5所示，可以看出，本发明的方法制备的MSTN双等位基因敲除牛存活时间长，直至5岁仍有稳定的双肌臀表型。
2、背膘厚检测
在遗传学上，背膘厚度可以作为生长指标；在品种选育上，其与产肉性能以及瘦肉率呈正相关，用于研究和比较不同家畜的种质特性，从而选育生长速度快、产肉多的优良品种。在营养学上，可以作为衡量家畜胴体品质和育肥效果的重要指标。背膘厚可以一定程度表示脂肪多少，背膘厚度越厚廋肉率越低;相反，则廋肉率高。
在上述2得到体细胞克隆种牛（MSTN双等位基因敲除牛）3岁时，对其背膘厚度进行测量。背膘厚的测量取三点测量，即肩胛后沿、最后肋处及腰荐接合处距背正中线4厘米处作为膘厚和眼肌厚的测量点，而后取三点平均值。
将荷斯坦奶牛成纤维细胞系按照上述二的方法培育，生产得到具有野生型MSTN基因的公牛。
结果如图9所示，可以看出，与野生型黄牛公牛（n=5）相比，MSTN双等位基因敲除牛（MSTN-/-）的背膘厚显著降低（图9），数值以 Mean ± SD 表示, *** P < 0.001。
四、MSTN双等位基因敲除牛的基因型鉴定
1、基因组DNA的PCR鉴定
采集上述二制备的3岁时MSTN 双等位基因敲除牛（公牛）耳部组织样，用Qiagen试剂盒提取基因组DNA，按照下述方法进行PCR鉴定：
利用PCR方法鉴定MSTN基因敲除牛，引物序列如下：MSTN-F：5’-tgctcctgccgagaaagtat -3’；MSTN-R：5’- AAACAGTCTGTGAAGTTACCT -3’，对基因组DNA进行PCR扩增。PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 sec，62℃ 30 sec，72℃ 120 sec，30 个循环；72℃ 7 min。
得到700bp的PCR扩增产物。
再将该PCR扩增产物进行TA克隆测序，结果该MSTN基因为MSTN双等位突变基因，即在第一外显子区域双等位基因具有相同的4bp缺失。
2、cDNA测序鉴定
外科手术取上述二制备的3岁时MSTN 双等位基因敲除牛（公牛）背部肌肉组织一块，用QIAGENRNeasy Mini Kit 试剂盒提取RNA，反转录得到cDNA作为模板。
利用RT-PCR方法鉴定MSTN基因敲除牛，引物序列如下：MSTN-F：5’-AGATTCACTGGTGTGGCAAG -3’；MSTN-R：5’- TGTCAAGTTTCAGAGATCGGAT -3’，对cDNA后进行PCR扩增。PCR反应程序为94℃ 5 min；94℃ 30 sec，62℃ 30 sec，72℃ 120 sec，30 个循环；72℃ 7 min。
扩增出719bp的片段。
再将该PCR扩增产物（MSTN双等位突变基因）进行TA克隆测序。
结果如图7所示，PCR产物为MSTN双等位突变基因，该突变基因为MSTN第一外显子（序列2）的第503-506位均缺失4bp，造成移码突变，造成蛋白翻译在126个AA提前终止，造成表达没有C端的无功能性的MSTN蛋白，此结果与自然突变的皮尔蒙特牛非常类似。
3、Q-PCR测定MSTN表达情况
上述2中制备的cDNA作为模板，利用荧光定量PCR鉴定MSTN表达情况，引物序列如下：MSTN-QF：5’-ATGCCCACGGAGTCTGATCTT-3’；MSTN-QR：5’- TTTGATTTCAATGCCTAAGTT-3’。
以具有野生型MSTN基因的公牛（WT）的背部肌肉组织一块，用QIAGENRNeasy MiniKit 试剂盒提取RNA，反转录得到cDNA作为模板为对照。
Q-PCR反应体系为如下表8所示：
表8为Q-PCR反应体系
体系 20 μL
cDNA 1.0 μL
Forward primer (10 μM) 1.0 μL
Reverse primer (10 μM) 1.0 μL
2 × SYBR green master mix（购自Roche） 10.0 μL
DEPC 水 7.0 μL
PCR反应程序为95℃ 5 min；95℃ 15 sec，60℃ 1 min，40 个循环；95℃ 15 sec，60℃ 15 sec，95℃ 15 sec。
结果如图8所示，与WT牛相比，MSTN双等位基因突变牛（MSTN-/-）中， MSTN基本无表达，这充分证实本研究中制备的-4/-4bp缺失基因敲除牛可以按预期造成移码突变，造成无目标mRNA的表达，进而造成无功能性的MSTN蛋白，此结果与自然突变的皮尔蒙特牛非常类似。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种制备与自然突变比利时蓝牛类似的双肌臀肉牛的方法
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7490
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tttaatatta aagtaggatt ttcattatgt gttaagaatt tattcaggga aacaagtttc 60
tcaaattata gcagaaaatc ttttactagt atcacagtct tttcatttaa gtcttcctga 120
ataaatctgt attttctaat tatacaagac taaaaataat ttaatataac aaataaaatt 180
atttttactt caaatgctta cttaaatagt ataaaatcat tttattttct gagggaaaag 240
catatcaact ttttaagtat gaagtgtaaa ttaagattta ttcacttaaa ttataatttt 300
taaagtttca catataaaga tgaataagat ctaagtgtat atgttattgt taataaagtt 360
tttaattttt cgaatgtcac atacagcctt tattattcat agatttattc cttttaagaa 420
gtagtcaaat gaatcagctc acccttgact gtaacaaaat actgtttggt gacttgtgac 480
agacagggtt ttaacctctg acagcgagat tcattgtgga gcaagagcca atcacagatc 540
ccgacgacac ttgtctcatc aaagttggaa tataaaaagc cacttggaat acagtataaa 600
agattcactg gtgtggcaag ttgtctctca gactgggcag gcattaacgt ttggcttggc 660
gttactcaaa agcaaaagaa aagtaaaagg aagaagtaag aacaagggaa aagattgtat 720
tgattttaaa accatgcaaa aactgcaaat ctctgtttat atttacctat ttatgctgat 780
tgttgctggc ccagtggatc tgaatgagaa cagcgagcag aaggaaaatg tggaaaaaga 840
ggggctgtgt aatgcatgtt tgtggaggga aaacactaca tcctcaagac tagaagccat 900
aaaaatccaa atcctcagta aacttcgcct ggaaacagct cctaacatca gcaaagatgc 960
tatcagacaa cttttgccca aggctcctcc actcctggaa ctgattgatc agttcgatgt 1020
ccagagagat gccagcagtg acggctcctt ggaagacgat gactaccacg ccaggacgga 1080
aacggtcatt accatgccca cggagtgtga gtagtcctgc tggtgcagag caacgactct 1140
gctgactgct gttctagtgt tcatgagaaa ccgatctatt ttcaggctct tttaacaagc 1200
tgctggcttg tatgtaagga ggaggggaaa gagctttttt caagatttca tgagaaatag 1260
accaatgaga ctgaaagctg ctactttatt tgtttcctta gagagctaaa aagctaaaaa 1320
tcaaaaatga aatgcttgca tagcattcat gttatatagt ttagtatgac aactataaca 1380
tgtttatgtt ttcacagctt aatgctacca aggtaaagga ttgggagaca gtatcagcaa 1440
tgtgaaaaat ttacatcaaa tttcctaatt gcatttggtt gcctgaaata tgcatttata 1500
ataacaggtt tttttttttt ttcattaata aaagagaaag gaagaaatct gtagaggttg 1560
aagcctatct gggcatttgc tgaacactta gaatgacttc tgttattcaa aactatttct 1620
catagggttt ttatggtctt cacagagtat ctaattttga aagctattag agtggaaagg 1680
ataaaagaat attcttaata aacttaatgt attagtaaga gcaataagga agtaaacaca 1740
gcatagtgaa aaatcatgag ctaatcagca gaaaattcta agaaataaac attttaatta 1800
caaagttcca cttataccct gaccatggta ctattgttga gagtacctgg tctgcacata 1860
tctaggaggc acatgcttaa taaccttcta aaatattatt ttattcctca taggagggag 1920
aactattacc tatatgtagt acctatgttg tttctgaaag ataatatgtt tcatatattt 1980
ctgttgcagt cacttcaaac ctatactcaa ggaaagggag acaggcacct caacagagaa 2040
ggcatgacca gaaagagttt tgtgccatgt gtctgcgatc ttgctttata cagggctcta 2100
cccactttaa actggactca aaacagtttc aaaatactgc tttttcttat taagtaacta 2160
gtttataagg caacaaataa atttccttta agactgtgct atcagataat cctggaatag 2220
atttgcctta cttataaaca atcttgagaa aacaaaaagg caagaaattg ctaagtgctt 2280
ctgcttacaa tgacagcctg gccctaaaga caatgttttc taagttttga aacagcttga 2340
atacaacatc taagttttgg tgctaattac ctgctagttt ttttattttt ttcctttaaa 2400
aggctgtccc agcgtcctaa cataacagat gcactatatt ttctgctaat tcccgaggct 2460
cagttagttg ctcactgtgt cttgtcccca ggtaattcag gcctggggga agggttcctt 2520
cctccagact gattggtaca gctgctcagt aagtgtaact actcagattc ccaaagaatt 2580
ctaagtggat gttcttccac agtgtctctt gttctctcta atcatcatca ttttaaaatt 2640
tcatccactt ttcattcctt aatagaattt tccttagtcc acagttctct ggaaaggaag 2700
taggctgctc ataacagctg aaaaaacata tacctaaaag attctgaaaa gctgtaataa 2760
ctgttatact tgatattttg ctgttatgaa tgaaatgcta catatttttc cattttaaaa 2820
gactaaatat gcacacatta ttccaattaa aaaaatgttc atagattgat atggaggtgt 2880
tcgttcgttt ttcataaaaa tgatcttagt aacttttttt tcttattcat ttatagctga 2940
tcttctaacg caagtggaag gaaaacccaa atgttgcttc tttaaattta gctctaagat 3000
acaatacaat aaactagtaa aggcccaact gtggatatat ctgaggcctg tcaagactcc 3060
tgcgacagtg tttgtgcaaa tcctgagact catcaaaccc atgaaagacg gtacaaggta 3120
tactggaatc cgatctctga aacttgacat gaacccaggc actggtattt ggcagagcat 3180
tgatgtgaag acagtgttgc agaactggct caaacaacct gaatccaact taggcattga 3240
aatcaaagct ttagatgaga atggccatga tcttgctgta accttcccag aaccaggaga 3300
agatggactg gtaagtgatt actgaaaata acatgctaaa aaccttgtta tgtgtttatt 3360
cataatgtga atgaatagta gtgaaaaata actaccagtt tcctgtgctt ataagccaga 3420
caaaggtgcc ttaccccagt ggtagccctg tacccaataa aagtaggtgt cccatttcac 3480
atcctatgaa acactctctt gatactttga ctttgcatga ggatttaaaa gaaaaaaagt 3540
tatactatgg tccttaagtt tttagggaat tctttggaat tgagaatgaa atataaaatg 3600
ctttccattg atgtgctaca tgattatata cataaaaaca tgaagtcttc acagtggatt 3660
ctagtacaca cccaacaaca cattttttcc cccagaagag tgaccaattt gttaaaattc 3720
ttttgcttaa taaagcagaa aaatgaactc tacaagttat aattaaaata aaatgctttt 3780
acttatagaa attaactaga tatatgttca ggtttatata ctattaaata tactatattt 3840
aagatctctc atgataaata tgttccttgt tttatagact attgatgcac tgatgtatat 3900
gtggattact ttgtgaatta cccctggtaa aattaaaaat ttcaggctag ttaacttgta 3960
ctacttagct attttctgaa ctgtcttact gttctttaac aggagttaac ttaggtaatg 4020
tcaactaatt taatataaag tcaaacagaa aataatgcct tatatattat aaaaattaat 4080
aaaaaaccat tttaaaatct agtataagtt tagagctact cactcttctg gcttatctat 4140
gcttgtattt acttctgttt tcaaaaaatt ttttaatgtg accatacctt ttatttccat 4200
ttattgatat aatttacaac aaaagattat acttgcaagc tttatggttt ttaaatggtc 4260
ttttttgtag tgaatatcat atctaaatga tatctaaatg taaagtaaat catacctaaa 4320
tgaaaacata ttctttaaga cattataaaa ttttccaggt gatcaatttt tctttaaata 4380
tactacataa aatgttattg actcccaaaa tgatgttatt ttgtataatc ttaaatacca 4440
ataattacca ggtctatttt ggttttagtg taggataaaa aagaatgtgt tcttttttct 4500
aggtagcatt ttaatgatca aagttggtga cgtgacagag gtcttaagta ttattaaaca 4560
gatgattaat aagatgtatt cctcagactt ttccatataa aaggaaaaat gtctcaaatt 4620
catgaaaaga ttggtacagg aggaggatta gcaaattgta gtttaaatat ctgaatggaa 4680
acatttttta gtgaaagaat aaagggaata tcattgtatc ttcttctgag tctgtgcctc 4740
tctctcttgg agttagtctt tccaacccta tatacttacc actatcttca tccctctacc 4800
ttcctttttc ccattacatc tgtgcagtac tgggtggcaa ctattgtgtt tcggtgttaa 4860
catccaagtt tccctgaata agaccaagtg aatggaggat gaatgagtat acctatccct 4920
ccaggagtca tcagacatat ttagccacca tatttaatca ataagcagga agacataagc 4980
tagccttgtc cctcttcttt cctccctgct cctttctctt ctcttccccc tctcccttta 5040
ctgtcatcca tcagtatttt cacagcatct attatgtgtc aggcattcag atactcaaac 5100
ggaggaaaac aagaataaac aagacaaaga tctgaccaca ggggaatccc tatggctact 5160
gtagactttt gagccataaa ggaagaatca agcctagtgt aaatgaaaat tccttaatgc 5220
tgtgcctttt aaaaagaaat gtgacataag caaaatgatt agttttcttt ctttaataat 5280
gagtccttga ggtaggagag tgttttggga tctattatta actcttcttt cctttccata 5340
cagactcctt ttttagaagt caaggtaaca gacacaccaa aaagatctag gagagatttt 5400
gggcttgatt gtgatgaaca ctccacagaa tctcgatgct gtcgttaccc tctaactgtg 5460
gattttgaag cttttggatg ggattggatt attgcaccta aaagatataa ggccaattac 5520
tgctctggag aatgtgaatt tgtatttttg caaaagtatc ctcataccca tcttgtgcac 5580
caagcaaacc ccagaggttc agccggcccc tgctgtactc ctacaaagat gtctccaatt 5640
aatatgctat attttaatgg cgaaggacaa ataatatacg ggaagattcc agccatggta 5700
gtagatcgct gtgggtgttc atgaggtcta tatttggttc atagcttcct caaacatgga 5760
aggtcttccc ctcaacaatt ttgaaactgt gaaattatgt accacaggct ataagcctag 5820
agtatgctac agtcacttaa gcacaagcta cagtatatga gctaaaaaga gagaatatat 5880
gctatggttg gcatttaacc atcaaaacaa atcgtataat aaaacgtttt atgatttcca 5940
gagtttttga actaggagat caaattccat ttatgttcaa atatatcaca acacatgcag 6000
gtgaatgaaa gcaattctcc ttgtcttctg gtgaattaaa ggagtatgct ttaaaatcta 6060
tttctttaca gtttcactta atatttacag aaaaatctat atgtagtatt ggtaaaatgc 6120
agtattgtta tataccatta tttgaaacat ccttaaacac ttgaatttat attgtatgat 6180
agcatacttg gtaagatgag attccacaaa atagggatgg cacaccgtac gcaagttacc 6240
attcctatac tgattgatac agtacattaa cagtttttgc caatggtgct aatacaatag 6300
gctgaatggc tgatgttatc aggtttatca agcaaaaaac gttcaggaaa gtaataagtt 6360
tctcctttct tcaggtgcat tttcacactc ctccctatgg gcaatggatg ttctatagag 6420
aaagaaaact cattctccta gaggtctaca ttcaattctg tagcatactt ggagaagctg 6480
cattgaaaag gcagtcaaaa agtattcatt ttggtcaaaa tttcaaaatt atagcctgcc 6540
tttgcaatac tgcagctttt aggatgaaat aatggaaatg actgattcta tcaatattgt 6600
ataaaaagat tttgaaatag ttgcatttat ataatatgta tacaatattg ttttgtaaat 6660
aaatgtctcc ttttttattt actttggtat atttttacag taaggacatt tcaaattaag 6720
tattaaggca caaagacatg tcatgtagga cataaaagca aaagcctata ttttggagca 6780
aattagttga ttaaatagtg gtcttaaaac tccatatgct aatggttaga tggttatatt 6840
acaatcattt tatatttttt tacattatta gcattcactt atggattcat caacagtttc 6900
atgttataat gattaactct agatttctgg tttccacttt attataaaag tttaatgact 6960
gagcacaaaa gtttggttta gaaattttag gtctgctact ctagtttctc atgagtgaaa 7020
ttcctgttaa attggttctg gtcaagttgc tttaaacata caaaagcaag gactagctac 7080
atctgtttca tttctcttta tcttgacctg aaaactattt atatgttttc ttaggttcaa 7140
tttccaaatg cattgcagtt ggcaagggta tatggtccta gagttacaag ttctactgaa 7200
gccacaggga cacagggagg ctgcatcttt tcccgagcac ttaatgagac tgacacactt 7260
atctgagttt gggggaatac attttcaaat tgaactgaga aataattagg aagtgcctag 7320
aatccttacg tgcaacacta tttatacatg tttttgaagt gagctctctt ctccactcct 7380
ggccagttta ataacttagc tctaaagaag tgactatgtt taattagcag tgactaattc 7440
tctctggtgt tctgagtctt aaataaataa tttataagta tgataaatac 7490
<210> 2
<211> 2427
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 2
agattcactg gtgtggcaag ttgtctctca gactgggcag gcattaacgt ttggcttggc 60
gttactcaaa agcaaaagaa aagtaaaagg aagaagtaag aacaagggaa aagattgtat 120
tgattttaaa accatgcaaa aactgcaaat ctctgtttat atttacctat ttatgctgat 180
tgttgctggc ccagtggatc tgaatgagaa cagcgagcag aaggaaaatg tggaaaaaga 240
ggggctgtgt aatgcatgtt tgtggaggga aaacactaca tcctcaagac tagaagccat 300
aaaaatccaa atcctcagta aacttcgcct ggaaacagct cctaacatca gcaaagatgc 360
tatcagacaa cttttgccca aggctcctcc actcctggaa ctgattgatc agttcgatgt 420
ccagagagat gccagcagtg acggctcctt ggaagacgat gactaccacg ccaggacgga 480
aacggtcatt accatgccca cggagtctga tcttctaacg caagtggaag gaaaacccaa 540
atgttgcttc tttaaattta gctctaagat acaatacaat aaactagtaa aggcccaact 600
gtggatatat ctgaggcctg tcaagactcc tgcgacagtg tttgtgcaaa tcctgagact 660
catcaaaccc atgaaagacg gtacaaggta tactggaatc cgatctctga aacttgacat 720
gaacccaggc actggtattt ggcagagcat tgatgtgaag acagtgttgc agaactggct 780
caaacaacct gaatccaact taggcattga aatcaaagct ttagatgaga atggccatga 840
tcttgctgta accttcccag aaccaggaga agatggactg actccttttt tagaagtcaa 900
ggtaacagac acaccaaaaa gatctaggag agattttggg cttgattgtg atgaacactc 960
cacagaatct cgatgctgtc gttaccctct aactgtggat tttgaagctt ttggatggga 1020
ttggattatt gcacctaaaa gatataaggc caattactgc tctggagaat gtgaatttgt 1080
atttttgcaa aagtatcctc atacccatct tgtgcaccaa gcaaacccca gaggttcagc 1140
cggcccctgc tgtactccta caaagatgtc tccaattaat atgctatatt ttaatggcga 1200
aggacaaata atatacggga agattccagc catggtagta gatcgctgtg ggtgttcatg 1260
aggtctatat ttggttcata gcttcctcaa acatggaagg tcttcccctc aacaattttg 1320
aaactgtgaa attatgtacc acaggctata agcctagagt atgctacagt cacttaagca 1380
caagctacag tatatgagct aaaaagagag aatatatgct atggttggca tttaaccatc 1440
aaaacaaatc gtataataaa acgttttatg atttccagag tttttgaact aggagatcaa 1500
attccattta tgttcaaata tatcacaaca catgcaggtg aatgaaagca attctccttg 1560
tcttctggtg aattaaagga gtatgcttta aaatctattt ctttacagtt tcacttaata 1620
tttacagaaa aatctatatg tagtattggt aaaatgcagt attgttatat accattattt 1680
gaaacatcct taaacacttg aatttatatt gtatgatagc atacttggta agatgagatt 1740
ccacaaaata gggatggcac accgtacgca agttaccatt cctatactga ttgatacagt 1800
acattaacag tttttgccaa tggtgctaat acaataggct gaatggctga tgttatcagg 1860
tttatcaagc aaaaaacgtt caggaaagta ataagtttct cctttcttca ggtgcatttt 1920
cacactcctc cctatgggca atggatgttc tatagagaaa gaaaactcat tctcctagag 1980
gtctacattc aattctgtag catacttgga gaagctgcat tgaaaaggca gtcaaaaagt 2040
attcattttg gtcaaaattt caaaattata gcctgccttt gcaatactgc agcttttagg 2100
atgaaataat ggaaatgact gattctatca atattgtata aaaagatttt gaaatagttg 2160
catttatata atatgtatac aatattgttt tgtaaataaa tgtctccttt tttatttact 2220
ttggtatatt tttacagtaa ggacatttca aattaagtat taaggcacaa agacatgtca 2280
tgtaggacat aaaagcaaaa gcctatattt tggagcaaat tagttgatta aatagtggtc 2340
ttaaaactcc atatgctaat ggttagatgg ttatattaca atcattttat atttttttac 2400
attattagca ttcacttatg gattcat 2427
<210> 3
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 3
aacggtcatt accatgccca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100
<210> 4
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
gcaggactac tcacactccg gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100
<210> 5
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
cggagtgtga gtagtcctgc gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60
cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 100
<210> 6
<211> 4313
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
ttaatacgac tcactatagg gagaatggac tataaggacc acgacggaga ctacaaggat 60
catgatattg attacaaaga cgatgacgat aagatggccc caaagaagaa gcggaaggtc 120
ggtatccacg gagtcccagc agccgacaag aagtacagca tcggcctgga catcggcacc 180
aactctgtgg gctgggccgt gatcaccgac gagtacaagg tgcccagcaa gaaattcaag 240
gtgctgggca acaccgaccg gcacagcatc aagaagaacc tgatcggagc cctgctgttc 300
gacagcggcg aaacagccga ggccacccgg ctgaagagaa ccgccagaag aagatacacc 360
agacggaaga accggatctg ctatctgcaa gagatcttca gcaacgagat ggccaaggtg 420
gacgacagct tcttccacag actggaagag tccttcctgg tggaagagga taagaagcac 480
gagcggcacc ccatcttcgg caacatcgtg gacgaggtgg cctaccacga gaagtacccc 540
accatctacc acctgagaaa gaaactggtg gacagcaccg acaaggccga cctgcggctg 600
atctatctgg ccctggccca catgatcaag ttccggggcc acttcctgat cgagggcgac 660
ctgaaccccg acaacagcga cgtggacaag ctgttcatcc agctggtgca gacctacaac 720
cagctgttcg aggaaaaccc catcaacgcc agcggcgtgg acgccaaggc catcctgtct 780
gccagactga gcaagagcag acggctggaa aatctgatcg cccagctgcc cggcgagaag 840
aagaatggcc tgttcggaaa cctgattgcc ctgagcctgg gcctgacccc caacttcaag 900
agcaacttcg acctggccga ggatgccaaa ctgcagctga gcaaggacac ctacgacgac 960
gacctggaca acctgctggc ccagatcggc gaccagtacg ccgacctgtt tctggccgcc 1020
aagaacctgt ccgacgccat cctgctgagc gacatcctga gagtgaacac cgagatcacc 1080
aaggcccccc tgagcgcctc tatgatcaag agatacgacg agcaccacca ggacctgacc 1140
ctgctgaaag ctctcgtgcg gcagcagctg cctgagaagt acaaagagat tttcttcgac 1200
cagagcaaga acggctacgc cggctacatt gacggcggag ccagccagga agagttctac 1260
aagttcatca agcccatcct ggaaaagatg gacggcaccg aggaactgct cgtgaagctg 1320
aacagagagg acctgctgcg gaagcagcgg accttcgaca acggcagcat cccccaccag 1380
atccacctgg gagagctgca cgccattctg cggcggcagg aagattttta cccattcctg 1440
aaggacaacc gggaaaagat cgagaagatc ctgaccttcc gcatccccta ctacgtgggc 1500
cctctggcca ggggaaacag cagattcgcc tggatgacca gaaagagcga ggaaaccatc 1560
accccctgga acttcgagga agtggtggac aagggcgctt ccgcccagag cttcatcgag 1620
cggatgacca acttcgataa gaacctgccc aacgagaagg tgctgcccaa gcacagcctg 1680
ctgtacgagt acttcaccgt gtataacgag ctgaccaaag tgaaatacgt gaccgaggga 1740
atgagaaagc ccgccttcct gagcggcgag cagaaaaagg ccatcgtgga cctgctgttc 1800
aagaccaacc ggaaagtgac cgtgaagcag ctgaaagagg actacttcaa gaaaatcgag 1860
tgcttcgact ccgtggaaat ctccggcgtg gaagatcggt tcaacgcctc cctgggcaca 1920
taccacgatc tgctgaaaat tatcaaggac aaggacttcc tggacaatga ggaaaacgag 1980
gacattctgg aagatatcgt gctgaccctg acactgtttg aggacagaga gatgatcgag 2040
gaacggctga aaacctatgc ccacctgttc gacgacaaag tgatgaagca gctgaagcgg 2100
cggagataca ccggctgggg caggctgagc cggaagctga tcaacggcat ccgggacaag 2160
cagtccggca agacaatcct ggatttcctg aagtccgacg gcttcgccaa cagaaacttc 2220
atgcagctga tccacgacga cagcctgacc tttaaagagg acatccagaa agcccaggtg 2280
tccggccagg gcgatagcct gcacgagcac attgccaatc tggccggcag ccccgccatt 2340
aagaagggca tcctgcagac agtgaaggtg gtggacgagc tcgtgaaagt gatgggccgg 2400
cacaagcccg agaacatcgt gatcgaaatg gccagagaga accagaccac ccagaaggga 2460
cagaagaaca gccgcgagag aatgaagcgg atcgaagagg gcatcaaaga gctgggcagc 2520
cagatcctga aagaacaccc cgtggaaaac acccagctgc agaacgagaa gctgtacctg 2580
tactacctgc agaatgggcg ggatatgtac gtggaccagg aactggacat caaccggctg 2640
tccgactacg atgtggacca tatcgtgcct cagagctttc tgaaggacga ctccatcgac 2700
aacaaggtgc tgaccagaag cgacaagaac cggggcaaga gcgacaacgt gccctccgaa 2760
gaggtcgtga agaagatgaa gaactactgg cggcagctgc tgaacgccaa gctgattacc 2820
cagagaaagt tcgacaatct gaccaaggcc gagagaggcg gcctgagcga actggataag 2880
gccggcttca tcaagagaca gctggtggaa acccggcaga tcacaaagca cgtggcacag 2940
atcctggact cccggatgaa cactaagtac gacgagaatg acaagctgat ccgggaagtg 3000
aaagtgatca ccctgaagtc caagctggtg tccgatttcc ggaaggattt ccagttttac 3060
aaagtgcgcg agatcaacaa ctaccaccac gcccacgacg cctacctgaa cgccgtcgtg 3120
ggaaccgccc tgatcaaaaa gtaccctaag ctggaaagcg agttcgtgta cggcgactac 3180
aaggtgtacg acgtgcggaa gatgatcgcc aagagcgagc aggaaatcgg caaggctacc 3240
gccaagtact tcttctacag caacatcatg aactttttca agaccgagat taccctggcc 3300
aacggcgaga tccggaagcg gcctctgatc gagacaaacg gcgaaaccgg ggagatcgtg 3360
tgggataagg gccgggattt tgccaccgtg cggaaagtgc tgagcatgcc ccaagtgaat 3420
atcgtgaaaa agaccgaggt gcagacaggc ggcttcagca aagagtctat cctgcccaag 3480
aggaacagcg ataagctgat cgccagaaag aaggactggg accctaagaa gtacggcggc 3540
ttcgacagcc ccaccgtggc ctattctgtg ctggtggtgg ccaaagtgga aaagggcaag 3600
tccaagaaac tgaagagtgt gaaagagctg ctggggatca ccatcatgga aagaagcagc 3660
ttcgagaaga atcccatcga ctttctggaa gccaagggct acaaagaagt gaaaaaggac 3720
ctgatcatca agctgcctaa gtactccctg ttcgagctgg aaaacggccg gaagagaatg 3780
ctggcctctg ccggcgaact gcagaaggga aacgaactgg ccctgccctc caaatatgtg 3840
aacttcctgt acctggccag ccactatgag aagctgaagg gctcccccga ggataatgag 3900
cagaaacagc tgtttgtgga acagcacaag cactacctgg acgagatcat cgagcagatc 3960
agcgagttct ccaagagagt gatcctggcc gacgctaatc tggacaaagt gctgtccgcc 4020
tacaacaagc accgggataa gcccatcaga gagcaggccg agaatatcat ccacctgttt 4080
accctgacca atctgggagc ccctgccgcc ttcaagtact ttgacaccac catcgaccgg 4140
aagaggtaca ccagcaccaa agaggtgctg gacgccaccc tgatccacca gagcatcacc 4200
ggcctgtacg agacacggat cgacctgtct cagctgggag gcgacaaaag gccggcggcc 4260
acgaaaaagg ccggccaggc aaaaaagaaa aagtaagaat tcctagagct cgc 4313
<210> 7
<211> 120
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ttaatacgac tcactatagg gcaggactac tcacactccg gttttagagc tagaaatagc 60
aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt 120
<210> 8
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
gggcaggacu acucacacuc cgguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102

Claims (8)

1.一种制备MSTN双等位基因突变细胞的方法，为使牛离体成纤维细胞基因组的MSTN基因双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸均缺失，其他核苷酸序列不变，得到MSTN双等位基因突变细胞；
所述MSTN基因双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2；
所述基因组编辑通过CRISPR进行；
所述CRISPR采用的CRISPR/CRISPR-Cas9***中的sgRNA的靶区域为序列4第1-23位所示的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/CRISPR-Cas9***的sgRNA为序列8。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述CRISPR/CRISPR-Cas9***为如下1）或2）：
1）表达所述sgRNA和Cas9的质粒；
2）所述sgRNA和所述Cas9蛋白的mRNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将所述CRISPR/CRISPR-Cas9***导入所述牛离体成纤维细胞中，得到MSTN双等位基因突变细胞。
5.一种制备双肌臀牛的方法，为将权利要求1-4任一所述方法制备的所述MSTN双等位基因突变细胞通过体细胞核移植入母牛体内，生产的子代即为双肌臀牛。
6.一种MSTN双等位突变基因，为将MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失，其他核苷酸序列不变，得到的片段；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
7.一种用于制备双肌臀牛的物质，为使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2；
所述物质为权利要求1-4任一方法中的所述CRISPR/CRISPR-Cas9***。
8.使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质在制备双肌臀牛中的应用；
或，使牛基因组中MSTN双等位基因的第一外显子的第503-506位核苷酸缺失的物质在双肌臀牛育种中的应用；
所述MSTN双等位基因的第一外显子的核苷酸序列为序列2。
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