CN110845457B - 松萝酸衍生物及其制法和在阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents

松萝酸衍生物及其制法和在阿尔茨海默病药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了松萝酸衍生物及其制法和在阿尔茨海默病药物中的应用，衍生物及其药学上可接受的盐，包含结构如通式(I)或通式(II)所示的化合物，其中，R选自H、C5‑C8烷基、多取代苯环、多取代杂环。本发明所制备的松萝酸衍生物衍生物能抑制tau蛋白聚集和神经炎症，在制备治疗阿尔茨海默病药物中有良好的应用前景。
Figure DDA0002242412030000011

Description

松萝酸衍生物及其制法和在阿尔茨海默病药物中的应用
技术领域
本发明涉及天然化合物结构改造，具体为松萝酸衍生物及其制法和在阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer’s Disease,AD)是一种神经退行性疾病。目前AD病理主要存在两种假说：Aβ沉积和tau蛋白神经纤维缠结。由于Aβ药物的研发相继失败，tau蛋白假说逐渐受到了药物研发者的重视。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，它主要起到维持微管稳定性的作用。在AD大脑中，tau蛋白过度磷酸化，从微管上脱落并聚集，形成具有神经毒性的神经元纤维缠结(NTFs)，微管解聚并失去功能。神经纤维缠结的程度与AD进程高度相关，因此针对tau蛋白设计治疗AD的药物具有重要意义。但AD是一个复杂的神经退行性疾病，只针对tau蛋白本身并不能有效的阻断tau蛋白病理。Tau蛋白与神经炎症的关系密不可分，聚集的tau蛋白可以作为炎症因子诱发和加重神经炎症，神经炎症的发生也会诱导tau蛋白过度磷酸化并导致其聚集，神经炎症还会促进tau蛋白传播到正常神经元，诱发神经变性。不仅如此，***性炎症也影响到AD的病理。因此，能够同时抑制tau蛋白聚集和神经炎症的发生尤为重要。
Tau蛋白抑制剂在研发中具有挑战性。最主要的原因是筛选中所采用的的方法——硫黄素-T法容易出现假阳性效果，并且，所参考的现有抑制剂改造困难。大多抑制剂如亚甲蓝和杨梅素等都有可能存在内滤效应，并且替换和增补其基团的可行性和有效性并不大。而tau蛋白在聚集后形成丰富的β-折叠结构也使得药物的从头设计困难重重。另外tau蛋白抑制剂单一阻断tau蛋白的聚集并不能打破tau蛋白级联网络，而不能从根本上解除tau蛋白病理。天然产物是tau蛋白抑制剂中的重要一员，但也存在一定弊端。最主要的原因是天然产物的来源和从头合成不易。而缺乏构效关系的分析也导致后续天然产物的简化困难。同时报道的天然产物抑制剂缺乏对其细胞毒或动物模型的改善效果的研究，这限制了其进一步应用。
松萝酸是一类主要存在于松萝中含量极高的次级代谢产物，其来源易得。松萝酸在体外具有优秀的抗炎活性。
发明内容
发明目的：本发明的目的是公开一类松萝酸衍生物，该类衍生物是通过对松萝酸进行结构改造所得。本发明另一目的是提供衍生物的制备方法。本发明还有一目的是指出该类衍生物能抑制tau蛋白聚集和神经炎症，可以用于阿尔茨海默病的治疗。
技术方案：本发明所述松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐，包含结构如通式(I)或通式(II)所示的化合物：
Figure BDA0002242412010000021
其中，R选自H、C5-C8烷基、多取代苯基及多取代杂环。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐，含结构如通式(II)所示的化合物，其中，R为4-苯甲酸，完整的化合物结构式为：
Figure BDA0002242412010000022
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐，所述衍生物选自下述化合物：
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((5-羟基戊基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-5-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-4-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((4-羟基-2,6-二甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((3,5-二-叔丁基-4-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((3,4,5-三甲氧基苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-4-((1-(6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-1,3-二氧代-3,9b二氢二苯并[b，d]呋喃-2(1H)-亚烷基)乙基)氨基)-2-羟基苯甲酸
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b二甲基-2-(1-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((3-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((3-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((5-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡嗪-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-(喹啉-8-基氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-2-(1-((1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((1-甲基-1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-(苯并[d]噻唑-5-基氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-1-(3-氟苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-1-(4-氟苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-1-(4-(叔丁基)苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸
(R)-3-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸
(R)-2-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸
乙基(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸甲酯
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(3-甲氧基苯基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯磺酰胺
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-4-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(6-甲基哒嗪-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡嗪-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲腈
(R)-8-乙酰基-1-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-1-(苯并[d]噻唑-2-基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-氧代-3,4-二氢-酞嗪-1-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(苯基磺酰基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-甲苯磺酰基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-((4-甲氧基苯基)磺酰基)-3,4a，6-三甲基-1-甲苯磺酰基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，选自如下任一方法：
(1)在烧瓶中加入(+)-松萝酸，加入无水乙醇混悬，再加入不同取代的苯胺、脂肪胺或杂环胺，在氩气保护下75-85℃反应3-5h，监测反应至完全，加入HCl溶液酸化，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，洗涤有机相，干燥，浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚体系洗脱得目标产物；其中，若不同取代的苯胺、脂肪胺或杂环胺为胺盐酸盐，则先将胺盐酸盐混悬于无水乙醇中，加入吡啶75-85℃搅拌至溶解，再加入(+)-松萝酸，氩气保护反应3-5h，其余步骤相同；
(2)在烧瓶中加入(+)-松萝酸，加入无水乙醇混悬，再加入水合肼、不同取代的苯肼或杂环肼或磺酰肼，在氩气保护下75-85℃反应1-3h，监测反应至完全，加入HCl溶液酸化，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，洗涤有机相，干燥，浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚体系洗脱得目标产物；其中，若水合肼、不同取代的苯肼或杂环肼或磺酰肼为肼盐酸盐，则先将肼盐酸盐混悬于无水乙醇中，加入吡啶75-85℃搅拌至溶解，再加入(+)-松萝酸氩气保护反应1-3h，其余步骤相同。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，所述洗涤有机相是使用饱和NaCl溶液洗涤有机相。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，所述干燥为用无水硫酸钠干燥。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备tau蛋白抑制剂中的应用。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备神经炎症抑制剂中的应用。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备全长2N4R tau蛋白抑制剂中的应用。
所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
有益效果：本发明松萝酸衍生物可以在体外降低AcPHF6六肽的自聚，通过CD谱图和透射电镜验证，同时对肝素诱导的全长2N4R tau蛋白也有较为优秀的抑制活性，在活性测试浓度下，对SH-SY5Y细胞、LO2细胞和BV2细胞均无明显细胞毒，并且保持了松萝酸的抗炎活性，抑制了LPS刺激BV2细胞产生NO释放量。动物行为学实验显示其明显改善了大鼠的认知，故它们可以作为tau蛋白抑制剂和神经炎症抑制剂来控制阿尔茨海默病病情的发展。
附图说明
图1为化合物18和30抑制AcPHF6自聚动力学曲线；
图2为化合物18和30抑制AcPHF6自聚的CD图谱；
图3为化合物18和30抑制AcPHF6自聚的透射电镜图像；
图4为化合物30抑制肝素诱导的全长tau蛋白动力学；
图5为化合物30对SH-SY5Y和LO2的细胞毒；
图6为化合物30对BV2的细胞毒和抑制LPS刺激BV2细胞产生NO的抑制率；
图7为化合物30对大鼠行为学的改善作用。
具体实施方式
本发明(+)-松萝酸购买自国内公司，实例化合物4-50制备方法如下所示：
Figure BDA0002242412010000061
实施例1化合物(4)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((5-羟基戊基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
将100mg(+)-松萝酸(0.290mmol，1.0eq)混悬于5mL无水乙醇中，在搅拌中缓慢滴加5-氨基-1-戊醇0.033mL(0.320mmol，1.1eq)。滴加结束后，在80℃氩气保护下反应4h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物4.收率约79％，黄色固体。m.p.127-129℃.1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.39(s,1H),13.05(t,J＝5.3Hz,1H),12.32(s,1H),5.86(s,1H),4.38(t,J＝5.1Hz,1H),3.54(t,J＝6.7Hz,2H),3.42(q,J＝6.2Hz,2H),2.64(s,3H),2.59(s,3H),1.97(s,3H),1.65(m,5H),1.53-1.44(m,2H),1.43-1.37(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.36,197.68,189.45,175.27,173.46,162.99,158.18,156.23,106.79,105.64,102.81,102.00,101.36,60.95,56.78,44.01,32.42,32.20,31.49,28.64,23.35,18.63,7.97.
实施例2化合物(5)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为4-氯-2-氨基苯酚。收率约89％，黄色固体。m.p.154-155℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.53(bs,1H),13.40(s,1H),12.02(s,1H),10.62(s,1H),7.47(d,J＝3.5Hz,1H),7.30(dd,J＝8.5,3.5Hz,1H),7.03(d,J＝8.5Hz,1H),6.00(s,1H),2.66(s,3H),2.52(s,3H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.43,198.58,189.99,174.98,174.16,163.05,157.97,156.18,151.19,129.59,127.06,124.72,122.92,118.24,106.98,105.51,103.00,102.73,101.46,57.22,32.09,31.53,20.79,7.99.
实施例3化合物(6)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为2-氨基-5-氯苯酚。收率约84％，黄色固体。m.p.147-149℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.52(bs,1H),13.40(s,1H),12.03(s,1H),10.87(s,1H),7.36(d,J＝8.5Hz,1H),7.05(d,J＝2.3Hz,1H),6.98(dd,J＝8.5,2.3Hz,1H),5.98(s,1H),2.66(s,3H),2.51(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.40,198.51,189.99,174.83,174.13,163.04,157.97,156.17,152.99,133.43,128.74,122.84,119.72,116.65,106.97,105.51,103.02,102.72,101.44,57.19,32.11,31.52,20.81,7.99.
实施例4化合物(7)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-5-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为邻氨基对甲苯酚。收率约82％，黄色固体。m.p.134-136℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.50(bs,1H),13.41(s,1H),12.12(s,1H),10.05(s,1H),7.11(d,J＝2.0Hz,1H),7.06(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.92(d,J＝8.2Hz,1H),5.98(s,1H),2.66(s,3H),2.51(s,3H),2.24(s,3H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.41,198.38,189.95,174.69,174.04,163.03,158.03,156.19,149.63,130.37,128.84,127.37,123.08,116.81,106.93,105.56,102.78,102.76,101.43,57.11,32.15,31.52,20.84,20.41,7.99.
实施例5化合物(8)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-4-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为6-氨基间甲酚。收率约84％，黄色固体。m.p.132-134℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.47(bs,1H),13.40(s,1H),12.13(s,1H),10.20(s,1H),7.17(d,J＝8.0Hz,1H),6.84(d,J＝1.8Hz,1H),6.73(dd,J＝8.3,1.8Hz,1H),5.97(s,1H),2.66(s,3H),2.51(s,3H),2.28(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.40,198.31,189.91,174.62,174.00,163.03,158.04,156.19,151.68,139.73,126.92,120.95,120.55,117.35,106.92,105.57,102.82,102.76,101.43,57.09,32.16,31.51,21.36,20.78,7.99.
实施例6化合物(9)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((4-羟基-2,6-二甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为3,5-二甲基-4-氨基苯酚。收率约76％，淡棕色固体。m.p.283-285℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.03(bs,1H),13.42(s,1H),12.16(s,1H),9.63(s,1H),6.62(d,J＝5.9Hz,2H),6.00(s,1H),2.66(s,3H),2.32(s,3H),2.07(s,3H),2.02(s,3H),1.98(s,3H),1.72(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.45,198.29,189.99,176.61,174.13,162.98,158.04,157.49,156.18,135.92,135.58,125.86,115.46,106.90,105.56,102.84,102.35,101.41,57.02,32.17,31.56,19.71,18.34,18.22,8.01.
实施例7化合物(10)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((4-羟基-5-异丙基-2-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
取6-氨基百里酚盐酸盐64.44mg(0.320mmol,1.1eq)于5mL无水乙醇中，在80℃搅拌下滴加0.025mL吡啶(0.320mmol,1.1eq)，至盐酸盐完全溶解后，加入(+)-松萝酸100mg(0.290mmol,1.0eq)，在80℃氩气保护下反应4h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物10.收率约73％，黄色固体。m.p.129-131℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.41(bs,1H),13.40(s,1H),12.17(s,1H),9.62(s,1H),7.03(s,1H),6.76(s,1H),5.96(s,1H),3.18(hept,J＝7.0Hz,1H),2.65(s,3H),2.44(s,3H),2.09(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H),1.15(dd,J＝7.0,2.0Hz,6H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.36,198.20,189.98,175.16,174.00,163.03,158.06,156.17,154.73,133.65,131.63,126.36,124.61,117.26,106.91,105.55,102.73,102.58,101.40,57.05,32.20,31.50,26.61,22.85,20.55,17.56,7.98.
实施例8化合物(11)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((3,5-二-叔丁基-4-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为4-氨基-2,6-二叔丁基苯酚。收率约61％，黄色固体。m.p.194-196℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.62(bs,1H),13.42(s,1H),12.18(s,1H),7.39(s,1H),7.04(s,2H),5.97(s,1H),2.66(s,3H),2.52(s,3H),1.98(s,3H),1.70(s,3H),1.39(s,18H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ200.82,197.71,189.37,173.71,173.34,162.45,157.43,155.59,153.54,140.44,127.52,121.79,106.30,104.95,102.14,102.01,100.81,56.51,34.65,31.59,30.96,30.00,20.32,7.42.
实施例9化合物(12)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((3,4,5-三甲氧基苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为3,4,5-三甲氧基苯胺。收率约90％，黄色固体。m.p.210-212℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.68(bs,1H),13.39(s,1H),12.03(s,1H),6.76(s,2H),5.98(s,1H),3.81(s,6H),3.70(s,3H),2.65(s,3H),2.58(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.36,198.58,190.04,174.84,174.08,163.09,157.95,156.16,153.78,137.54,131.75,106.99,105.44,104.11,102.69,102.66,101.43,60.60,57.23,56.72,32.18,31.50,20.99,7.98.
实施例10化合物(13)：(R，E)-4-((1-(6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-1,3-二氧代-3,9b二氢二苯并[b，d]呋喃-2(1H)-亚烷基)乙基)氨基)-2-羟基苯甲酸的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为4-氨基水杨酸。收率约54％，淡黄色固体。m.p.196-197℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.74(bs,1H),13.42(s,1H),12.06(s,1H),9.95(s,1H),7.31(m,1H),6.92-6.77(m,2H),6.74(s,1H),6.00(s,1H),2.66(s,3H),2.54(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ200.72,197.82,189.37,173.64,173.43,162.31,158.03,157.22,155.43,136.36,130.18,115.86,115.01,112.15,106.21,104.77,101.99,101.97,100.69,56.47,31.36,30.82,20.17,7.27.
实施例11化合物(14)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b二甲基-2-(1-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为4-(4-甲基哌嗪)苯胺。收率约87％，黄色固体。m.p.216-217℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.62(bs,1H),13.41(s,1H),12.14(s,1H),7.22(d,J＝9.0Hz,2H),7.03(d,J＝9.0Hz,2H),5.98(s,1H),3.21(t,J＝5.1Hz,4H),2.66(s,3H),2.54(s,3H),2.47(t,J＝5.1Hz,4H),2.24(s,3H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.43,198.33,189.92,174.10,174.02,163.04,158.04,156.21,150.85,126.62,126.59,115.79,106.93,105.56,102.77,102.70,101.44,57.12,54.90,47.96,46.15,32.15,31.53,20.80,8.00.
实施例12化合物(15)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮的制备.
制备过程同实例1。将原料替换为4-氨基-N,N-二甲基苯胺。收率约71％，黄色固体。m.p.220-221℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.59(bs,1H),13.41(s,1H),12.18(s,1H),7.19(d,J＝9.0Hz,2H),6.79(d,J＝9.0Hz,2H),5.98(s,1H),2.95(s,6H),2.66(s,3H),2.54(s,3H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.44,198.23,189.87,173.98,173.91,163.03,158.07,156.22,150.27,126.54,124.30,112.78,106.91,105.59,102.79,102.65,101.44,57.08,40.47,32.17,31.54,20.80,8.01.
实施例13化合物(16)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((3-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为3-氨基-N,N-二甲基苯胺。收率约74％，黄色固体。m.p.198-199℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.72(bs,1H),13.41(s,1H),12.09(s,1H),7.29(t,J＝8.1Hz,1H),6.76(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),6.65(d,J＝2.3Hz,1H),6.61(dd,J＝7.6,1.8Hz,1H),5.99(s,1H),2.93(s,6H),2.66(s,3H),2.56(s,3H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.42,198.49,190.04,174.51,174.09,163.05,158.01,156.19,151.66,136.90,130.37,113.03,112.31,109.31,106.96,105.53,102.72,102.65,101.45,57.18,40.42,32.16,31.53,20.93,8.00.
实施例14化合物(17)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((3-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为2-氨基-3-羟基吡啶。收率约58％，黄色固体。m.p.229-231℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ15.05(bs,1H),13.39(s,1H),11.89(s,1H),10.99(s,1H),7.99(m,1H),7.41(m,1H),7.27(m,1H),5.99(s,1H),2.85(s,3H),2.66(s,3H),1.99(s,3H),1.72(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.42,199.14,189.87,174.04,173.53,163.04,157.92,156.18,146.96,139.41,138.89,124.34,124.29,107.01,105.56,104.05,102.81,101.46,57.43,31.90,31.53,21.26,7.99.
实施例15化合物(18)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((5-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备.
制备过程同实例1。将原料替换为2-氨基-5-羟基吡啶。收率约63％，黄棕色固体。m.p.233-235℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.90(bs,1H),13.41(s,1H),11.96(s,1H),10.40(s,1H),8.08(d,J＝2.6Hz),7.45-7.27(m,2H),6.00(s,1H),2.65(d,6H),1.99(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ200.87,198.32,189.43,173.56,172.93,162.45,157.32,155.57,153.17,140.61,136.54,124.63,120.54,106.39,104.91,102.42,102.19,100.85,56.73,31.41,30.97,20.42,7.42.
实施例16化合物(19)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备.
制备过程同实例1。将原料替换为2,5-二氨基吡啶。收率约59％，黄色固体。m.p.242-244℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.43(bs,1H),13.41(s,1H),12.10(s,1H),7.92(d,J＝2.8Hz,1H),7.41(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),6.52(d,J＝8.7Hz,1H),6.33(s,2H),5.96(s,1H),2.65(s,3H),2.51(s,3H),1.97(s,3H),1.69(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ200.81,197.75,189.29,174.22,173.37,162.45,159.13,157.39,155.57,144.51,134.51,121.38,107.67,106.33,104.91,102.22,102.14,100.80,56.53,31.58,30.95,20.11,7.41.
实施例17化合物(20)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡嗪-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为吡嗪-2,5-二胺。收率约62％，棕色固体。m.p.127-128℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.76(bs,1H),13.41(s,1H),11.96(s,1H),8.09(d,J＝1.3Hz,1H),7.80(d,J＝1.4Hz,1H),6.84(s,2H),6.00(s,1H),2.66(s,3H),2.62(s,3H),1.98(s,3H),1.71(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ200.86,198.22,189.34,173.54,173.14,162.44,157.32,155.57,154.95,138.36,134.48,129.96,106.38,104.91,102.49,102.18,100.84,56.70,31.44,30.97,20.35,7.42.
实施例18化合物(21)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((1-甲基-1H-苯并[d]咪唑-5-基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为1-甲基苯并咪唑-5-胺。收率约78％，淡黄色固体。m.p.246-247℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.82(bs,1H),13.41(s,1H),12.11(s,1H),8.31(s,1H),7.86-7.60(m,2H),7.28(dd,J＝8.5,2.0Hz,1H),5.99(s,1H),3.89(s,3H),2.66(s,3H),2.55(s,3H),1.99(s,3H),1.73(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.40,198.45,190.02,174.74,174.05,163.06,158.02,156.19,146.91,143.95,134.63,130.18,120.61,117.04,111.61,106.95,105.54,102.76,102.74,101.44,57.17,32.17,31.52,31.41,20.84,8.00.
实施例19化合物(22)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-(喹啉-8-基氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为8-氨基喹啉。收率约87％，棕色固体。m.p.121-123℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ15.41(bs,1H),13.41(s,1H),12.05(s,1H),9.00(dd,J＝4.2,1.7Hz,1H),8.51(dd,J＝8.4,1.7Hz,1H),8.04(dd,J＝8.2,1.2Hz,1H),7.92(d,J＝7.4Hz,1H),7.78-7.54(m,2H),6.03(s,1H),2.67(s,3H),2.64(s,3H),1.99(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.39,198.71,190.03,174.14,174.08,163.08,157.98,156.19,151.60,142.18,137.16,133.05,129.05,128.55,126.68,126.36,123.15,106.97,105.56,103.60,102.84,101.45,57.31,32.14,31.54,21.55,8.00.
实施例20化合物(23)：(R，E)-2-(1-((1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为5-氨基吲哚。收率约66％，黄色固体。m.p.260-261℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.76(bs,1H),13.41(s,1H),12.18(s,1H),11.37(bs,1H),7.61-7.39(m,3H),7.06(dd,J＝8.6,2.1Hz,1H),6.50(d,1H),6.00(s,1H),2.67(s,3H),2.56(s,3H),1.99(s,3H),1.73(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.42,198.32,189.98,174.49,174.01,163.04,158.08,156.22,135.53,128.28,127.86,127.65,119.00,117.42,112.72,106.93,105.60,102.80,102.62,102.11,101.44,57.11,32.19,31.53,20.86,8.00.
实施例21化合物(24)：(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((1-甲基-1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为1-甲基-1H-吲哚-5-胺。收率约76％，黄色固体。m.p.228-230℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ14.77(bs,1H),13.41(s,1H),12.17(s,1H),7.61-7.46(m,2H),7.46(d,J＝3.1Hz,1H),7.13(dd,J＝8.7,2.0Hz,1H),6.50(d,J＝3.1Hz,1H),5.99(s,1H),3.84(s,3H),2.67(s,3H),2.55(s,3H),1.99(s,3H),1.73(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.42,198.35,189.98,174.52,174.02,163.05,158.07,156.22,136.00,132.07,128.58,127.82,119.08,117.70,111.13,106.93,105.59,102.80,102.66,101.45,101.35,57.12,33.20,32.18,31.53,20.85,8.00.
实施例22化合物(25)：(R，E)-6-乙酰基-2-(1-(苯并[d]噻唑-5-基氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮的制备。
制备过程同实例1。将原料替换为1,3-苯并噻唑-5-胺。收率约83％，淡黄色固体。m.p.192-193℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ14.93(bs,1H),13.43(s,1H),12.04(s,1H),9.53(s,1H),8.33(d,J＝8.4Hz,1H),8.19(d,J＝2.0Hz,1H),7.54(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),6.04(s,1H),2.67(s,3H),2.59(s,3H),2.00(s,3H),1.74(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.48,198.69,190.11,174.83,174.22,163.05,159.09,157.96,156.20,153.94,134.64,133.85,124.03,123.77,120.65,107.00,105.51,102.97,102.77,101.47,57.29,32.10,31.57,20.97,8.02.
实施例23化合物(26)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
将100mg(+)-松萝酸(0.290mmol，1.0eq)混悬于5mL无水乙醇中，在搅拌中缓慢滴加水合肼0.021mL(0.320mmol，1.1eq)。滴加结束后，在80℃氩气保护下反应2h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物4.收率约52％，黄色固体。m.p.217-218℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.67(bs,1H),13.35(s,1H),10.26(s,1H),6.04(s,1H),2.71(s,3H),2.53(s,3H),2.02(s,3H),1.66(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.64,182.39,180.40,162.71,156.55,156.51,156.43,142.68,111.38,107.41,106.46,105.64,102.08,45.34,33.56,31.54,10.76,7.97.
实施例24化合物(27)：(R)-8-乙酰基-1-(3-氟苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
取3-氟苯肼盐酸盐40.30mg(0.320mmol,1.1eq)于5mL无水乙醇中，在80℃搅拌下滴加0.025mL吡啶(0.320mmol,1.1eq)，至盐酸盐完全溶解后，加入(+)-松萝酸100mg(0.290mmol,1.0eq)，在80℃氩气保护下反应2h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物27.收率约80％，橘黄色固体。m.p.176-177℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.33(s,1H),11.14(s,1H),7.76-7.38(m,4H),6.64(s,1H),2.63(s,3H),2.48(s,3H),1.97(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.36,196.68,172.89,163.64,162.96-161.69,157.18,156.77,150.97,149.34,139.39-139.31,132.02-131.95,120.41-120.39,116.04-115.87,111.86-111.66,110.82,106.93,104.77,101.67,90.45,60.33,31.48,30.56,13.49,7.93.
实施例25化合物(28)：(R)-8-乙酰基-1-(4-氟苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-氟苯肼盐酸盐。收率约48％，黄色固体。m.p.218-219℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),11.20(s,1H),7.81-7.60(m,2H),7.58-7.34(m,2H),6.54(s,1H),2.62(s,3H),2.48(s,3H),1.98(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.39,196.64,172.68,163.04,162.95-161.09,157.22,156.79,150.71,149.19,134.44-134.41,126.80-126.73,117.13-116.95,110.60,106.89,104.80,101.67,90.29,60.25,31.49,30.55,13.49,7.95.
实施例26化合物(29)：(R)-8-乙酰基-1-(4-(叔丁基)苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-叔丁基苯肼盐酸盐。收率约91％，黄色固体。m.p.247-249℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),11.26(s,1H),7.60(m,4H),6.58(s,1H),2.65(s,3H),2.48(s,3H),2.00(s,3H),1.77(s,3H),1.35(s,9H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.51,196.68,172.61,162.95,157.26,156.88,151.73,150.65,148.82,135.57,126.92,123.94,110.56,106.85,104.87,101.70,90.52,60.21,35.03,31.53,30.52,13.55,7.99.
实施例27化合物(30)：(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为4-肼基苯甲酸。收率约63％，黄色固体.m.p.181-182℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),13.18(bs,1H),11.14(s,1H),8.14(d,J＝8.6Hz,2H),7.81(d,J＝8.6Hz,2H),6.68(s,1H),2.63(s,3H),2.50(s,3H),1.98(s,3H),1.77(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.36,196.73,173.03,166.94,162.96,157.17,156.76,151.22,149.29,141.30,131.30,130.80,123.94,111.02,106.94,104.81,101.68,90.58,60.36,31.49,30.51,13.52,7.95.
实施例28化合物(31)：(R)-3-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为3-肼基苯甲酸。收率约71％，黄色固体.m.p.167-169℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,2H),11.17(s,1H),8.15(d,J＝2.0Hz,1H),8.05(dt,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.93(ddd,J＝8.0,2.3,1.1Hz,1H),7.74(t,J＝7.9Hz,1H),6.59(s,1H),2.63(s,3H),2.49(s,3H),1.97(s,3H),1.77(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.37,196.68,172.90,166.82,162.95,157.19,156.75,151.01,149.20,138.23,132.82,130.68,129.56,128.30,124.72,110.80,106.92,104.80,101.65,90.31,60.33,31.53,30.54,13.50,7.94.
实施例29化合物(32)：(R)-2-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为2-肼基苯甲酸盐酸盐。收率约69％，黄色固体。m.p.248-249℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),13.21(s,1H),11.28(s,1H),8.00(dd,J＝7.8,1.4Hz,1H),7.80(td,J＝7.7,1.5Hz,1H),7.75–7.54(m,2H),6.24(s,1H),2.61(s,3H),2.46(s,3H),2.00(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.47,196.53,172.48,166.67,162.98,157.29,156.89,151.17,149.92,136.49,133.40,131.42,130.47,129.62,128.68,110.01,106.89,104.63,101.69,89.81,60.34,31.49,30.89,13.50,7.99.
实施例30化合物(33)：乙基(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸甲酯的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为4-肼基苯甲酸乙酯。收率约66％，亮黄色固体。m.p.226-227℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),11.16(s,1H),8.16(d,J＝8.6Hz,2H),7.85(d,J＝8.6Hz,2H),6.71(s,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),2.65(s,3H),2.50(s,11H),2.00(s,3H),1.78(s,3H),1.36(t,J＝7.1Hz,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.43,196.84,173.17,165.40,162.96,157.18,156.80,151.29,149.40,141.57,131.16,129.83,124.09,111.08,106.96,104.89,101.74,90.62,61.59,60.41,31.51,30.48,14.65,13.53,7.99.
实施例31化合物(34)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(4-甲氧基苯基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-甲氧基苯肼盐酸盐。收率约42％，黄色固体。m.p.211-212℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.38(s,1H),11.29(s,1H),7.58(d,J＝8.9Hz,2H),7.14(d,J＝8.9Hz,2H),6.49(s,1H),3.85(s,3H),2.64(s,3H),2.47(s,3H),1.99(s,3H),1.76(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.47,196.58,172.41,162.94,159.73,157.27,156.85,150.43,148.79,131.00,125.97,115.23,110.36,106.84,104.86,101.68,90.37,60.17,56.07,31.53,30.55,13.52,7.99.
实施例32化合物(35)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(3-甲氧基苯基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备.
制备过程同实例24。将原料替换为3-甲氧基苯肼盐酸盐。收率约47％，亮黄色固体。
m.p.95-97℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),11.21(s,1H),7.51(t,J＝8.1Hz,1H),7.30–6.98(m,3H),6.57(s,1H),3.85(s,3H),2.63(s,3H),2.48(s,3H),1.98(s,3H),1.76(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.43,196.66,172.65,162.95,160.47,157.22,156.82,150.68,149.07,139.06,131.02,116.46,115.04,110.65,109.94,106.87,104.81,101.68,90.51,60.26,56.08,31.52,30.56,13.52,7.96.
实施例33化合物(36)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-甲磺酰基苯肼盐酸盐。收率约74％，黄色固体。m.p.163-164℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),11.11(s,1H),8.23-8.08(m,2H),8.05-7.85(m,2H),6.72(s,1H),3.32(s,3H),2.62(s,3H),2.51(s,4H),1.97(s,3H),1.77(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.34,196.79,173.22,162.95,157.14,156.74,151.46,149.65,141.77,140.60,129.26,124.72,111.15,106.97,104.80,101.68,90.53,60.43,44.00,31.47,30.49,13.53,7.95.
实施例34化合物(37)：(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯磺酰胺的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-磺酰胺基苯肼盐酸盐。收率约79％，黄色固体。m.p.298-299℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),11.16(s,1H),8.03(d,J＝8.6Hz,2H),7.90(d,J＝8.7Hz,2H),7.56(s,2H),6.72(s,1H),2.64(s,3H),2.50(s,3H),1.99(s,3H),1.78(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.43,196.82,173.15,162.96,157.18,156.80,151.28,149.43,144.10,140.33,127.77,124.45,111.05,106.95,104.87,101.72,90.60,60.39,31.52,30.48,13.53,7.99.
实施例35化合物(38)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-4-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-肼吡啶盐酸盐。收率约83％，黄褐色固体。m.p.248-250℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.39(s,1H),11.11(s,1H),8.60(dd,J＝5.0,1.8Hz,1H),8.08(td,J＝7.9,1.9Hz,1H),7.96(d,J＝8.3Hz,1H),7.51–7.46(m,1H),7.45(s,1H),2.69(s,3H),2.51(s,3H),2.00(s,3H),1.74(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.50,196.88,172.85,163.00,157.13,156.90,152.15,151.05,149.22,148.79,140.31,123.43,115.63,111.63,106.95,104.87,101.78,92.95,60.43,31.66,30.63,13.66,7.99.
实施例36化合物(39)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
取3-肼基吡啶双盐酸盐58.16mg(0.320mmol,1.1eq)于5mL无水乙醇中，在80℃搅拌下滴加0.050mL吡啶(0.320mmol,2.2eq)，至盐酸盐完全溶解后，加入(+)-松萝酸100mg(0.290mmol,1.0eq)，在80℃氩气保护下反应2h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物39.收率约75％，黄色固体。m.p.121-122℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),11.15(s,1H),8.91(d,J＝2.6Hz,1H),8.82-8.60(m,1H),8.14(dt,J＝8.2,2.0Hz,1H),7.66(dd,J＝8.2,4.8Hz,1H),6.68(s,1H),2.63(s,3H),2.50(s,3H),1.98(s,3H),1.76(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.39,196.73,173.02,162.96,157.18,156.78,151.30,149.92,149.78,145.11,134.83,132.07,124.93,110.90,106.93,104.79,101.69,90.25,60.35,31.48,30.54,13.50,7.96.
实施例37化合物(40)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为2-肼吡啶。收率约68％，亮黄色固体。m.p.210-211℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.39(s,1H),11.11(s,1H),8.65-8.52(m,1H),8.08(m,1H),8.02-7.91(m,1H),7.48(m,1H),7.46(s,1H),2.69(s,3H),2.50(s,3H),2.00(s,3H),1.74(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.50,196.88,172.85,162.99,157.13,156.90,152.15,151.06,149.21,148.79,140.31,123.43,115.63,111.63,106.94,104.87,101.78,92.95,60.43,31.66,30.63,13.66,7.99.
实施例38化合物(41)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为2-甲氧基-5-肼基吡啶。收率约40％，黄色固体。m.p.196-197℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.35(s,1H),11.21(s,1H),8.47(d,J＝2.8Hz,1H),8.01(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H),7.04(d,J＝8.8Hz,1H),6.58(s,1H),3.95(s,3H),2.63(s,3H),2.48(s,3H),1.98(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.40,196.62,172.66,163.68,162.95,157.22,156.81,150.87,149.71,142.95,136.13,129.33,111.76,110.52,106.88,104.79,101.68,90.18,60.25,54.31,31.46,30.56,13.49,7.97.
实施例39化合物(42)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(6-甲基哒嗪-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为3-肼基-6-甲基哒嗪。收率约58％，亮黄色固体。m.p.242-243℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),11.01(s,1H),8.12(d,J＝9.0Hz,1H),7.86(d,J＝9.0Hz,1H),7.37(s,1H),2.70(s,3H),2.68(s,3H),2.51(s,3H),2.00(s,3H),1.74(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.53,196.98,173.42,162.98,160.23,157.05,156.84,154.81,151.63,149.62,131.06,120.76,111.85,107.00,104.83,101.77,92.60,60.63,31.61,30.60,21.82,13.65,8.00.
实施例40化合物(43)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡嗪-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为吡嗪-2-肼。收率约73％，淡黄色固体。m.p.230-232℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),10.99(s,1H),9.21(d,J＝1.3Hz,1H),8.73(d,J＝2.6Hz,1H),8.67(dd,J＝2.5,1.4Hz,1H),7.34(s,1H),2.68(s,3H),2.52(s,3H),1.99(s,3H),1.74(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.44,196.79,173.44,163.01,157.03,156.79,151.76,150.26,148.34,143.61,142.79,137.61,111.84,107.07,104.80,101.78,92.33,60.72,31.63,30.64,13.63,7.99.
实施例41化合物(44)：(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲腈的制备。
制备过程同实例24。将原料替换为4-氰基苯肼盐酸盐。收率约37％，黄色固体。m.p.136-137℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.34(s,1H),11.10(s,1H),8.08(d,J＝8.5Hz,2H),7.90(d,J＝8.5Hz,2H),6.70(s,1H),2.64(s,3H),2.49(s,3H),1.98(s,3H),1.77(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.37,196.81,173.28,162.97,157.14,156.75,151.48,149.66,141.46,134.45,124.75,118.64,111.24,111.18,106.99,104.83,101.72,90.55,60.46,31.51,30.49,13.53,7.96.
实施例42化合物(45)：(R)-8-乙酰基-1-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为2-肼基-1H-1,3-苯并咪唑。收率约62％，黄色固体。m.p.246-248℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),13.28(bs,1H),11.01(s,1H),7.66(m,1H),7.49(m,2H),7.24(m,2H),2.71(s,3H),2.55(s,3H),2.00(s,3H),1.75(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.50,196.60,173.95,163.01,157.00,156.76,151.83,149.92,145.46,142.09,133.28,123.38,122.78,119.12,112.17,111.48,107.10,104.87,101.79,91.69,61.02,31.69,30.80,13.55,7.99.
实施例43化合物(46)：(R)-8-乙酰基-1-(苯并[d]噻唑-2-基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为2-肼基苯并噻唑。收率约88％，黄绿色固体。m.p.281-282℃.1H NMR(600MHz,Chloroform-d)δ13.34(s,1H),10.80(s,1H),7.96(d,J＝8.2Hz,1H),7.85(d,J＝7.9Hz,1H),7.54–7.45(m,2H),7.39(td,J＝7.6,1.1Hz,1H),2.74(s,3H),2.58(s,3H),2.11(s,3H),1.79(s,3H).13C NMR(151MHz,Chloroform-d)δ200.51,196.24,174.75,163.70,159.82,157.31,156.28,152.85,150.97,149.62,132.66,126.83,125.46,122.79,121.54,111.95,108.56,103.78,101.69,91.44,61.32,31.43,30.80,13.34,7.52.
实施例44化合物(47)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-氧代-3,4-二氢-酞嗪-1-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
将100mg(+)-松萝酸(0.290mmol，1.0eq)混悬于5mL无水乙醇中，再加入62mg 1-氯-4-肼基酞嗪(0.320mmol，1.1eq)。在80℃氩气保护下反应2h至点板监测反应完全。当溶液冷却至室温后，混合液在减压下浓缩干燥，用5mL乙酸溶液重新溶解，加入醋酸钠60mg(0.800mmol,3.0eq),继续回流2h。反应监测结束后用1N的盐酸溶液酸化，混合物用乙酸乙酯萃取三次并合并有机相。有机相用饱和氯化钠溶液洗三次，用无水硫酸钠干燥，浓缩后拌样过硅胶柱，石油醚/乙酸乙酯积体系即得目标产物47，收率约33％，黄褐色固体。m.p.315-316℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),13.05(s,1H),11.16(s,1H),8.40-8.29(m,1H),8.12-7.92(m,2H),7.88-7.64(m,1H),6.75(s,1H),2.60(s,3H),2.54(s,3H),2.00(s,3H),1.76(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ201.38,196.85,172.93,162.92,160.03,157.11,156.79,152.22,151.08,138.18,134.57,133.25,129.13,127.24,126.78,125.40,110.23,106.90,104.85,101.69,90.37,60.52,31.43,30.62,13.63,8.00.
实施例45化合物(48)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(苯基磺酰基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为苯磺酰肼。收率约93％，黄色固体。m.p.208-209℃.1H NMR(600MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),10.68(s,1H),8.19-8.05(m,2H),7.90-7.81(m,1H),7.73(t,J＝7.8Hz,2H),7.06(s,1H),2.72(s,3H),2.37(s,3H),1.98(s,3H),1.69(s,3H).13C NMR(151MHz,DMSO-d6)δ201.48,196.91,175.55,162.88,156.70,156.56,153.18,152.89,136.37,136.21,130.73,128.49,111.58,107.17,105.03,101.78,90.08,61.21,31.64,30.52,13.63,7.98.
实施例46化合物(49)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-甲苯磺酰基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为对甲苯磺酰肼。收率约95％，黄色固体。m.p.221-222℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.36(s,1H),10.71(s,1H),7.99(d,J＝8.2Hz,2H),7.52(d,J＝8.2Hz,2H),7.05(s,1H),2.72(s,3H),2.41(s,3H),2.36(s,3H),1.99(s,3H),1.69(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.52,196.96,175.48,162.92,156.76,156.62,153.03,152.71,147.54,133.29,131.16,128.57,111.53,107.20,105.08,101.85,90.15,61.20,31.65,30.54,21.71,13.63,8.00.
实施例47化合物(50)：(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-((4-甲氧基苯基)磺酰基)-3,4a，6-三甲基-1-甲苯磺酰基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮的制备。
制备过程同实例23。将原料替换为4-甲氧苯磺酰肼。收率约94％，黄色固体。m.p.200-201℃.1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),10.73(s,1H),8.06(d,J＝9.0Hz,2H),7.22(d,J＝9.0Hz,2H),7.06(s,1H),3.87(s,3H),2.72(s,3H),2.37(s,3H),1.99(s,3H),1.69(s,3H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ201.52,196.95,175.31,165.31,162.91,156.77,156.62,152.84,152.40,131.22,127.15,115.94,111.40,107.17,105.05,101.83,90.20,61.13,56.61,31.65,30.55,13.64,8.00.
实施例51药理学实验及数据：
一、ThT荧光法测试化合物抑制AcPHF6六肽自聚活性：
实验方法：将AcPHF6六肽粉末溶于六氟异丙醇(HFIP)并分装于EP管中，溶液在通风橱过夜以挥干溶剂，将AcPHF6六肽置于-80℃冰箱置使用。在实验前将AcPHF6溶于纯水中配成1mM的溶液，化合物用DMSO配成10mM的母液，ThT用磷酸缓冲液(pH＝7.4)配成10mM的母液。取96孔黑板，加入终浓度为100μM的AcPHF6，20μM的ThT以及10μM的化合物，用磷酸缓冲液(pH＝7.4)作为缓冲体系，终体积为100μL。用0.1％的DMSO替代化合物为对照，10μM的杨梅素为阳性对照。将黑色96孔板***荧光酶标仪，设定参数为：总时间120min,每分钟读数一次，在读数前震荡10s(400rpm)，温度为25℃，激发波长和发射波长分别为440nm和490nm。取60min到70min之间的数值平均值计算抑制率。每个化合物设置三个副孔，每个实验重复三次，实验结果表达为平均值±SEM。
表1本发明化合物在10μM时抑制AcPHF6自聚的活性
Figure BDA0002242412010000201
Figure BDA0002242412010000211
Figure BDA0002242412010000221
Figure BDA0002242412010000231
a)n.a.代表无活性。
从表1可知，50个化合物中有38个在10μM时存在抑制AcPHF6自聚的活性。其中抑制活性最好的是化合物18和30，而松萝酸钠并没有展现出活性。通过构效关系发现，在烯胺结构系列，小基团杂环(如吡啶)的引入可以大幅提高六肽的抑制活性，而大基团杂环或多取代苯活性较弱。对于吡唑环系列，苯甲酸基团可以明显增加六肽抑制活性，且化合物30-33表明了羧基以及其取代位置的重要性，其中羧基在对位活性最好。
化合物18和30的动力学结果见图1。图1表明化合物18和30都明显降低了AcPHF6自聚与ThT荧光染料结合产生的荧光。
二、圆二色谱(CD)谱图验证
实验方法：制备六肽孵育方法同ThT荧光法，但溶液中不含有ThT。在磷酸缓冲液中加入终浓度为100μM的AcPHF6和10μM的化合物18和30，0.1％的DMSO作为对照。在400rpm下每分钟震荡10s，共2h，温度设定为25℃。结束后立即测试CD谱图，设定CD光谱范围为200-260nm。将最终结果转换成Δεres，曲线用Savitzky-Golay法平滑。结果见图2，图2在220nm处的负吸收峰以及200nm左右的正吸收峰是β-折叠的特征吸收峰，峰值越大代表β-折叠的含量越高。化合物18(蓝色曲线)和化合物30(红色曲线)都降低了β-折叠的含量，但化合物30的作用更为明显。
三、透射电镜(TEM)验证
实验方法：制备六肽孵育方法同CD光谱法。孵育结束后，取10μL的溶液置于铜网格上3min，用吸水纸吸取多余水分，再用10μL的1％磷钨酸染色3min,去除多余溶液并干燥后，用透射电镜观察。结果见图3，图3A展示了在没有抑制剂存在的情况下，AcPHF6六肽聚集成了纤维网状结构。图3B展示了在化合物18存在下的六肽聚集效果，此时纤维结构被破坏，但仍有部分纤维结构存在。图3C展示了在化合物30存在下的六肽聚集效果，此时在事业中几乎观察不到纤维结构，并且蛋白聚集成了小于5nm的点状结构。图3结果表明化合物30的抑制活性远优于化合物18。
四、化合物30对肝素诱导全长2N4R tau蛋白聚集的抑制能力
实验方法：全长蛋白纯化：将全长tau蛋白基因克隆到pET-28a载体上，蛋白标签为His并将质粒转入大肠杆菌(BL21)。在37℃下细菌生长至OD值为0.6时，加入1mM的IPTG诱导细菌表达蛋白。4h后，离心收集细菌并超声破碎细菌。再次离心收集上清液。将破碎液过滤后在His-亲和层析柱上样，用低浓度的咪唑(20mM)洗脱下杂蛋白后，再用高浓度的咪唑(200mM)洗脱下目标蛋白。洗脱后的全长tau蛋白跑完SDS凝胶电泳后用考马斯亮蓝染色验纯。将全长tau蛋白在超滤管中浓缩后，置于-80℃冰箱直至使用。
全长2N4R tau蛋白动力学测试：取96孔黑板，每个孔中加入终浓度为10μM的全长2N4R tau蛋白，10μM化合物30，10μM肝素钠，1mM DTT以及10μM ThT。无化合物对照孔以0.1％DMSO代替。终体积为200μL。缓冲体系为PBS 1×。将96孔板***荧光酶标仪，设定参数为：在600rpm震动2min后测定荧光，周期为4min，总时间为24h，在荧光到达最大并且稳定不变后结束，温度为37℃，设定发射波长和激发波长分别为440nm和490nm。记录每个时间点的荧光数值。结果见图4，图4表明化合物30显著降低了由肝素钠诱导的全长tau蛋白聚集。化合物30不仅降低了蛋白聚集的纤维数量而且降低了纤维的聚集进程。在此条件下化合物的抑制率为50％。本发明其他化合物的结果虽然没有化合物30显著，但均存在降低由肝素钠诱导的全长tau蛋白聚集的作用。
五、SH-SY5Y和LO2细胞毒性
实验方法：SH-SY5Y或LO2接种于DMEM培养基中，并辅以10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素，置于37℃下、5％二氧化碳培养箱中培养。将细胞以3000-5000每孔的密度分别植于96孔板中，细胞生长24h后，加入混有不同浓度的化合物30的新鲜培养基继续培养。24h后，加入10μL MTT(5mg/ml)，继续培养4h。将培养基吸出加入150μL DMSO溶解甲瓒结晶，摇床放置15min，570nm下测定吸光度并计算细胞存活率。实验结果见图5，图5表明化合物30在20μM下对SH-SY5Y细胞增殖基本无影响，但在高浓度下显示出一定细胞毒性。但化合物30在高浓度(50μM)下对LO2也未有明显的细胞毒性。
六、BV2细胞毒性及抑制LPS诱导的BV2细胞释放炎症因子一氧化氮的作用
实验方法：BV2细胞培养方法和化合物30对BV2细胞毒测试类似于SH-SY5Y和LO2细胞。松萝酸钠作为细胞毒对照。将BV2细胞以30000每孔的密度接种于96孔板中生长18h，加入含有不同浓度化合物的新鲜培养基继续培养，1h后加入10μL的浓度为1ng/ml的LPS继续培养18h。取上清50μL用NO试剂盒测定NO的抑制率。实验结果见图6，图6A和图6B表明化合物在10μM下对BV2无细胞毒性。但化合物30改善了松萝酸母核对BV2的细胞毒性。图6C表明化合物30在10μM下基本保持了松萝酸母核的抗炎活性，NO抑制率为41％。
七、动物行为学实验
实验方法：大鼠分为四组：control、model、30(5mg/kg)和30(10mg/kg)。化合物用8％的DMSO和1％的吐温-80助溶。后两组在注射不同药物的同时，control和model组注射相同体积的助溶剂作为对照。注射一周后用冈田酸(OA)注射大鼠同侧海马造模，再注射一周，并用Morris水迷宫评价化合物30对大鼠认知障碍的改善效果。实验结果见图7，图7A表明注射14d后药物对大鼠体重无影响。图7B表明大鼠在训练5d中逃逸潜伏期的变化，相对于模型组，control组和30(10mg/kg)组的逃逸潜伏期明显缩短。图7C表明游泳速度无差别，化合物对大鼠生理状态无影响。图7D、E表明在最后一天考试中撤离隐藏平台后，大鼠在目标象限中的停留时间以及在虚拟平台的穿梭次数。同时表明了化合物30对大鼠记忆力的明显改善。图7F是大鼠水迷宫的游泳代表路线图，可以直观看出大鼠记忆改善的效果。

Claims (10)

1.一种松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐，其特征在于所述衍生物选自下述化合物：
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-氯-2-羟基苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-5-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((2-羟基-4-甲基苯基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((3,4,5-三甲氧基苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-4-((1-(6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-1,3-二氧代-3,9b二氢二苯并[b，d]呋喃-2(1H)-亚烷基)乙基)氨基)-2-羟基苯甲酸
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b二甲基-2-(1-((4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((4-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((3-(二甲基氨基)苯基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((3-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-2-(1-((5-羟基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡啶-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-((5-氨基吡嗪-2-基)氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-2-(1-((1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1，3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-7,9-二羟基-8,9b-二甲基-2-(1-((1-甲基-1H-吲哚-5-基)氨基)亚乙基)二苯并[b，d]呋喃-1,3(2H，9bH)-二酮
(R，E)-6-乙酰基-2-(1-(苯并[d]噻唑-5-基氨基)亚乙基)-7,9-二羟基-8,9b-二甲基二苯并[b，d]呋喃-1,3-(2H，9bH)-二酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-1-(4-(叔丁基)苯基)-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-3-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸
(R)-2-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸
乙基(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲酸甲酯
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(3-甲氧基苯基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-(甲基磺酰基)苯基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-4-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡啶-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-1-(6-甲氧基吡啶-3-基)-3,4a，6-三甲基-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(6-甲基哒嗪-3-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(吡嗪-2-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-4-酮
(R)-4-(8-乙酰基-5,7-二羟基3,4a，6-三甲基-4-氧代-4,4a-二氢-1H-苯并呋喃并[3,2-f]吲唑-1-基)苯甲腈
(R)-8-乙酰基-5,7-二羟基-3,4a，6-三甲基-1-(4-氧代-3,4-二氢-酞嗪-1-基)-1,4a-二氢-4H-苯并呋喃并[3，2-f]吲唑-4-酮。
2.一种如权利要求1所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于选自如下任一方法：
(1)在烧瓶中加入(+)-松萝酸，加入无水乙醇混悬，再加入不同取代的苯胺、脂肪胺或杂环胺，在氩气保护下75-85℃反应3-5h，监测反应至完全，加入HCl溶液酸化，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，洗涤有机相，干燥，浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚体系洗脱得目标产物；其中，若不同取代的苯胺、脂肪胺或杂环胺为胺盐酸盐，则先将胺盐酸盐混悬于无水乙醇中，加入吡啶75-85℃搅拌至溶解，再加入(+)-松萝酸，氩气保护反应3-5h，其余步骤相同；
(2)在烧瓶中加入(+)-松萝酸，加入无水乙醇混悬，再加入水合肼、不同取代的苯肼或杂环肼或磺酰肼，在氩气保护下75-85℃反应1-3h，监测反应至完全，加入HCl溶液酸化，乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯相，洗涤有机相，干燥，浓缩后用硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯/石油醚体系洗脱得目标产物；其中，若水合肼、不同取代的苯肼或杂环肼或磺酰肼为肼盐酸盐，则先将肼盐酸盐混悬于无水乙醇中，加入吡啶75-85℃搅拌至溶解，再加入(+)-松萝酸氩气保护反应1-3h，其余步骤相同。
3.根据权利要求2所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于所述洗涤有机相是使用饱和NaCl溶液洗涤有机相。
4.根据权利要求2所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于所述干燥为用无水硫酸钠干燥。
5.如权利要求1所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备tau蛋白抑制剂中的应用。
6.如权利要求1所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备神经炎症抑制剂中的应用。
7.如权利要求1所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备全长2N4R tau蛋白抑制剂中的应用。
8.如权利要求1所述的松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
9.一种松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备tau蛋白抑制剂和神经炎症抑制剂中的应用，其特征在于所述松萝酸衍生物的结构式如下所示：
Figure FDA0003606979250000041
10.一种松萝酸衍生物及其药学上可接受的盐在制备治疗阿尔茨海默病药物中的应用，其特征在于所述松萝酸衍生物的结构式如下所示：
Figure FDA0003606979250000042
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