CN1108374C - 用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法。该微载体为核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质，所用磁粉的平均粒径为0.1-5微米，磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1.2-1∶5，微载体的平均粒径为120微米～300微米。方法包括磁粉硅烷化、磁核制备、磁核表面处理、包被基质、微载体表面修饰。由高分子聚合物包裹磁粉形成，由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂与磁粉经悬浮聚合制得。微载体具有刚性致密结构。

Description

用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法
本发明涉及一种动物细胞培养技术，特别是涉及一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体及其制备方法。
大规模培养动物细胞可用于生产许多生物制品，如疫苗、药用蛋白、细胞代谢物等。培养贴壁依赖性细胞最初是采用滚瓶***，劳动强度大，单位体积提供的细胞生长面积小，按培养体积计算培养效率低。1967年Van Wezel开发了微载体培养***，培养贴壁依赖性细胞。微载体是直径几十至几百微米的微珠。用微载体培养贴壁依赖性细胞时，细胞贴壁在微载体上，微载体悬浮于培养基中。因为微载体有很大的比表面积，因而大大提高了培养效率。
目前常用的动物细胞培养微载体按基质划分有以下几类：(1)交联葡聚糖；(2)碳水化合物，如DEAE-纤维素微载体；(3)蛋白质，如明胶微载体；(4)多糖类，如几丁质；(5)橡胶；(6)玻璃，如空心玻璃珠；(7)塑料，如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺。商品牌号有Biocarrier，Superbeads，Biosilon，Cytosphere，Cytodexl，Cytodex2，Cytodex3等，这些牌号均没有磁响应。
用于微载体培养的生物反应器有气升式生物反应器、通气搅拌笼式生物反应器、柱式反应器、机械搅拌式反应器、帆式搅拌反应器、流化床生物反应器等类型。由于微载体悬浮于液体中，相互碰撞，对细胞的生长不利，故微载体的量一般为1-5克/升，最高达到12-15克/升，所获细胞密度一般为106-107/ml。如果给柱式反应器中加上纵向磁场，同时其中的微载体颗粒又有磁敏性，则在一定条件下可以形成稳定的颗粒床层，颗粒在空间相对静止，装填密度可以达到很高，而液体可以自由通过，压降很低，因此可以实现高密度培养。
关于动物细胞培养用磁敏性微载体，文献1：U.S.S.R.SU1567623报道了一种真核细胞培养用磁敏性微载体的制备方法，是将Fe、Co、Ni的氧化物与明胶混合制粒、研磨，然后用蛋白酶处理直到表面光滑，所用氧化物为0.005-0.05μm的粉末。该载体由于将磁粉与基质直接混合，难以保证磁粉***露和伤害细胞。
本发明为了提高动物细胞大规模培养的密度和反应器的效率，提供了一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其可用于在磁场动物细胞培养反应器中培养动物细胞。该微载体既要对磁场有响应，又要适于细胞的贴壁、生长，还不能有磁粉的泄露，以免污染培养液和伤害细胞。本发明还提供了上述用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法。
本发明的技术方案如下：
用于动物细胞培养的磁敏性微载体是核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质，所用磁粉的平均粒径为0.1-5微米，磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1.2-1∶5，微载体的平均粒径为120微米～300微米。
所说的磁粉为γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。所说的高分子聚合物可由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂制备，其中单体包括可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体，如苯乙烯系列，如苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯或α-甲基苯乙烯，和甲基丙烯酸甲酯。引发剂包括悬浮聚合常用的引发剂，如过氧化苯甲酰(BPO)或偶氮二异丁腈(AIBN)。交联剂包括悬浮聚合常用的交联剂，如二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯。壳层基质包括适合不同种类的细胞贴壁和生长的基质，如明胶、葡聚糖等。
微载体表面还可以根据需要进行化学修饰，以改变其电荷分布、亲水性等。
上述微载体的制备是采用高分子聚合物包裹磁粉形成磁敏核，再在外面包被一层基质，经后处理，即得到磁敏性微载体。
具体的制备包括下面两个步骤：1.磁核制备
将聚合单体与交联剂按体积比为100∶2-40混合均匀，按每100ml单体加入0.5-1克的引发剂，于60℃-70℃维持搅拌，按每100ml反应液再加入25-75克磁粉，以1.2-2℃/分钟的速度升温至80-90℃。提高搅拌转速，加入是单体体积6-15倍的重量百分比为3-8％的明胶溶液，聚合3-4小时。90-100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃以上热水浸洗3-5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于100℃以下烘干，得所需磁核。2.包被基质
用pH值为5.0-7.2的磷酸缓冲液配制重量百分比为5％-20％的明胶溶液，按每克磁核(湿)需10-100ml明胶溶液的比例将磁核加入到明胶溶液中，搅拌5分钟以上。将该液加入到搅拌中的4-8倍于明胶溶液体积的甲苯液中，甲苯液中溶有Sp80的比例为0.5-4mlSp80/克于明胶，于40-50℃搅拌5分钟以上，使裹有明胶的磁核充分分散，之后降温至0-10℃，搅拌5分钟以上。按照0.2-3ml戊二醛溶液/克干明胶的比例滴加重量百分比为10-50％的戊二醛溶液，升温到20-30℃，交联1-3小时。过滤收集微珠，用pH值为7.0-7.2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9-10，加入NaBH4至溶液中的NaBH4的重量百分比浓度为0.5-2％，还原10-24小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，用梯度乙醇冲洗(重量百分比为60％，70％，80％，95％)，于70℃以下烘干，得本发明的微载体。
为了获得更好的效果，也可采用下面的五步骤制备。
即在第1步骤的“磁核制备”之前加上一个磁粉硅烷化步骤：其是对磁粉的表面进行处理，使之更容易与高分子聚合物融合，以提高磁核的磁粉含量。向100体积份的重量百分比为0.1-1％的醋酸水溶液中加入0.2-10体积份的硅烷溶液，搅拌均匀，根据需要加入一定量磁粉，低速搅拌10分钟以上，过滤，于100℃以下烘干，研细。
在第1步骤的“磁核制备”和第2步骤的“包被基质”之间加上磁核表面处理步骤：其是对磁核的表面进行处理，使之更容易挂上不同种类的细胞贴壁和生长的基质。将磁核(干)加入到适量铬酸洗液或磺化液中使磁核被浸没并悬浮，略搅拌，室温浸泡3分钟以上。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。
在第2步骤“包被基质”之后加上微载体表面修饰步骤；将已包被的微载体颗粒(干)加入到能淹没载体并能使之悬浮的1～2M DEAECl·HCl的溶液中，于40-50℃搅拌10分钟以上。向体系缓慢加入是DEAECl·HCl溶液体积的0.5～3倍的1～3M NaOH溶液，搅拌1小时以上。过滤，依次用去离子水、0.05～0.5M HCl、0.05～0.5mM HCl、去离子水、pH值为7.0-7.2的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干，或置于70％的乙醇保存。
在制备磁核时，将磁粉加入到单体、交联剂和引发剂的混合物中以后，可经过10-20分钟的预聚合，再加入分散上述混合物的明胶溶液。所制得的微载体可以进一步进行包括DEAE修饰或衍生化的表面修饰。
本发明的磁核由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂与磁粉经悬浮聚合制得，制备出的磁核的平均粒径为60μm-100μm，磁粉含量为30％-50％(wt)。
微载体的平均粒径为120μm-300μm，湿比重1.1-1.5g/cm3，微载体具有刚性致密结构。壳核式结构的微载体，其壳层为有利于细胞贴壁、生长的基质，这种结构既使微载体对磁场有响应，又隔绝了磁粉与细胞的直接接触，还防止了在培养基中磁粉的泄露、污染培养液和对细胞的伤害，培养结果表明适于Vero细胞贴壁生长。
下面结合实施例对本发明进行详细说明。实施例1：1.磁粉硅烷化
向重量百分比为0.1％的醋酸水溶液100ml中加入0.2ml硅烷溶液，搅拌均匀，加入10克铁氧体粉末(Fe3O4)，低速搅拌3小时，过滤，将磁粉于70℃烘干，研细，得硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)。2.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)0.4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BPO)0.1g，于65℃、450rpm转速搅拌下，加入硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)5g，以1.2℃/分钟的速度升温至80℃。提高搅拌转速至650rpm，加入重量百分比为8％明胶溶液120ml，聚合4小时。100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃热水浸洗5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于70℃烘干，得干磁核。3.磁核表面处理
取4ml铬酸洗液，加入0.5g磁核(干)略搅拌，室温浸泡3分钟。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。4.包被基质
用pH值为5.5的磷酸缓冲液配制20ml重量百分比为15％的明胶溶液，然后加入0.5g磁核(湿)，搅拌0.5小时，将该液加入到搅拌中的溶有1.5ml Sp80的150ml甲苯液中，50℃搅拌5分钟，搅拌速度300rpm，之后转入冰水浴，降温至0℃，搅拌10分钟。滴加9ml重量百分比为10％的戊二醛溶液，升温到20℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.0的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9，加入NaBH4至2％浓度，还原10小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用609％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。5.微载体表面修饰
称取已包被微载体颗粒(干)0.5克，加入15ml 2M DEAECl·HCl溶液，于50℃搅拌10分钟。向体系缓慢加入10ml 3M NaOH溶液，搅拌1小时。过滤，依次用去离子水、0.05MHCl、0.05mM HCl、去离子水、pH值为7的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再依次以60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。所得微载体粒径为60-300微米，平均粒径200微米，湿比重1.37g/cm3。
实施例2：1.磁粉硅烷化
向0.5％的醋酸水溶液100ml中加入2ml硅烷溶液(比例)，搅拌均匀，加入15克磁粉，低速搅拌浸泡1小时，过滤，将磁粉于85℃烘干，研细，得硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)。2.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BPO)0.2g，于60℃、450rpm转速搅拌下，加入硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)10g，以1.6℃/分钟的速度升温至85℃。提高搅拌转速至650rpm，加入5％明胶溶液200ml，聚合3.5小时。95℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以80℃热水浸洗4次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于85℃烘干。3.磁核表面处理
取2ml磺化液，加入0.5g磁核(干)略搅拌，室温浸泡10分钟。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。4.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH5.0的磷酸缓冲液配制的5ml 20％的明胶溶液中，搅拌1小时，将该液加入到搅拌中的溶有2ml Sp80的40ml甲苯液中，40℃搅拌20分钟，搅拌速度400rpm，之后转入冰水浴，降温至5℃，搅拌20分钟。滴加1ml20％的戊二醛溶液，升温到25℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.1的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至9.5，加入NaBH4至1％浓度，还原18小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。5.微载体表面修饰
称取已包被微载体颗粒(干)0.5克，加入10ml 1M DEAECl·HCl溶液，于50℃搅拌0.5小时。向体系缓慢加入5ml 2M NaOH溶液，搅拌1小时。过滤，依次用去离子水、0.2MHCl、0.2mM HCl、去离子水、磷酸缓冲液液冲洗载体颗粒，再依次以60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。所得微载体粒径为60-400微米，平均粒径240微米，湿比重1.45g/cm3。
实施例3：1.磁粉硅烷化
向1％的醋酸水溶液100ml中加入10ml硅烷溶液，搅拌均匀，加入20克磁粉，低速搅拌10分钟，过滤，将磁粉于100℃烘干，研细。2.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)8ml，混合均匀后加入偶氮二异丁腈(AIBN)0.15g，于70℃、450rpm转速搅拌下，加入硅烷化的铁氧体粉末(Fe3O4)15g，以2℃/分钟的速度升温至90℃。提高搅拌转速至650rpm，加入3％明胶溶液300ml，聚合3小时。90℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以90℃热水浸洗3次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于100℃烘干。3.磁核表面处理
取1ml铬酸洗液，加入0.5g磁核(干)略搅拌，室温浸泡20分钟。过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。4.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH7.2的磷酸缓冲液配制的50ml 5％的明胶溶液中，搅拌5分钟，将该液加入到搅拌中的溶有10ml Sp80的200ml甲苯液中，45℃恒温搅拌10分钟，搅拌速度200rpm，之后转入冰水浴，降温至10℃，搅拌5分钟。滴加0.5ml 50％的戊二醛溶液，升温到30℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至10，加入NaBH4至0.5％浓度，还原24小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于70℃烘干。5.微载体表面修饰
称取已包被微载体颗粒(干)0.5克，加入5ml 1.5M DEAECl·HCl溶液，于50℃搅拌1小时。向体系缓慢加入15ml 1M NaOH溶液，搅拌1小时。过滤，依次用去离子水、0.5M HCl、0.5mM HCl、去离子水、磷酸缓冲液液冲洗载体颗粒，再依次以60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，置于70％的乙醇保存。所得微载体粒径为60-280微米，平均粒径180.微米，湿比重1.50g/cm3。
实施例4：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入对乙烯基甲苯20ml、异氰尿酸三烯丙酯0.4ml，混合均匀后加入偶氮二异丁腈(AIBN)0.1g，于65℃、500rpm转速搅拌下，加入铁氧体粉末(Fe3O4)5g，以1.2℃/分钟的速度升温至80℃。提高搅拌转速至750rpm，加入重量百分比为8％明胶溶液120ml，聚合4小时。100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃热水浸洗5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于70℃烘干，得干磁核。2.包被基质
用pH值为6.0的磷酸缓冲液配制20ml重量百分比为15％的明胶溶液，然后加入0.5g磁核(湿)，搅拌0.5小时，将该液加入到搅拌中的溶有1.5ml Sp80的150ml甲苯液中，50℃搅拌5分钟，搅拌速度300rpm，之后转入冰水浴，降温至0℃，搅拌10分钟。滴加9ml重量百分比为10％的戊二醛溶液，升温到20℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.0的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9，加入NaBH4至2％浓度，还原10小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。所得微载体粒径为45-300微米，平均粒径190微米，湿比重1.28g/cm3。
实施例5：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入间乙烯基甲苯20ml、二乙烯基苯(DVB)4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BP0)0.2g，于60℃、500rpm转速搅拌下，加入铁氧体粉末(Fe3O4)10g，以1.6℃/分钟的速度升温至85℃。提高搅拌转速至750rpm，加入5％明胶溶液200ml，聚合3.5小时。95℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以80℃热水浸洗4次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于85℃烘干。2.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH6.5的磷酸缓冲液配制的5ml 20％的明胶溶液中，搅拌1小时，将该液加入到搅拌中的溶有2ml Sp80的40ml甲苯液中，40℃搅拌20分钟，搅拌速度400rpm，之后转入冰水浴，降温至5℃，搅拌20分钟。滴加1ml 20％的戊二醛溶液，升温到25℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.1的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至9.5，加入NaBH4至1％浓度，还原18小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。所得微载体粒径为50-350微米，平均粒径230微米，湿比重1.36g/cm3。
实施例6：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入α-甲基苯乙烯20ml、异氰尿酸三烯丙酯8ml，混合均匀后加入偶氮二异丁腈(AIBN)0.15g，于70℃、500rpm转速搅拌下，加入铁氧体粉末(Fe3O4)15g，以2℃/分钟的速度升温至90℃。提高搅拌转速至750rpm，加入3％明胶溶液300ml，聚合3小时。90℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以90℃热水浸洗3次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于100℃烘干。2.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH7.0的磷酸缓冲液配制的50ml 5％的明胶溶液中，搅拌5分钟，将该液加入到搅拌中的溶有10ml Sp80的200ml甲苯液中，45℃恒温搅拌10分钟，搅拌速度200rpm，之后转入冰水浴，降温至10℃，搅拌5分钟。滴加0.5ml 50％的戊二醛溶液，升温到30℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至10，加入NaBH4至0.5％浓度，还原24小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于70℃烘干。所得微载体粒径为50-280微米，平均粒径165微米，湿比重1.39g/cm3。
实施例7：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)0.4ml，混合均匀后加入偶氮二异丁腈(AIBN)0.1g，于65℃、500rpm转速搅拌下，加入γ-Fe(OH)2粉末5g，以1.2℃/分钟的速度升温至80℃。提高搅拌转速至750rpm，加入重量百分比为8％明胶溶液120ml，聚合4小时。100℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以60℃热水浸洗5次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于70℃烘干，得干磁核。2.包被基质
用pH值为6.0的磷酸缓冲液配制20ml重量百分比为15％的明胶溶液然后加入0.5g磁核(湿)，搅拌0.5小时，将该液加入到搅拌中的溶有1.5ml Sp80的150ml甲苯液中，50℃搅拌5分钟，搅拌速度300rpm，之后转入冰水浴，降温至0℃，搅拌10分钟。滴加9ml重量百分比为10％的戊二醛溶液，升温到20℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.0的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9，加入NaBH4至2％浓度，还原10小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于60℃烘干。所得微载体粒径为40-270微米，平均粒径165微米，湿比重1.10g/cm3。
实施例8：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)4ml，混合均匀后加入过氧化苯甲酰(BPO)0.2g，于60℃、500rpm转速搅拌下，加入γ-Fe2O3粉末10g，以1.6℃/分钟的速度升温至85℃。提高搅拌转速至750rpm，加入5％明胶溶液200ml，聚合3.5小时。95℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以80℃热水浸洗4次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于85℃烘干。2.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH6.5的磷酸缓冲液配制的5ml 20％的明胶溶液中，搅拌1小时，将该液加入到搅拌中的溶有2ml Sp80的40ml甲苯液中，40℃搅拌20分钟，搅拌速度400rpm，之后转入冰水浴，降温至5℃，搅拌20分钟。滴加1ml 20％的戊二醛溶液，升温到25℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.1的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至9.5，加入NaBH4至1％浓度，还原18小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于50℃烘干。所得微载体粒径为40-360微米，平均粒径210微米，湿比重1.24g/cm3。
实施例9：1.磁核制备
在圆底烧瓶中加入苯乙烯(St)20ml、二乙烯基苯(DVB)8ml，混合均匀后加入偶氮二异丁腈(AIBN)0.15g，于70℃、500rpm转速搅拌下，加入γ-Fe(OH)2粉末15g，以2℃/分钟的速度升温至90℃。提高搅拌转速至750rpm，加入3％明胶溶液300ml，聚合3小时。90℃熟化2小时。过滤收集颗粒，以90℃热水浸洗3次，以冷水冲洗，以无水乙醇室温冲洗，以无水乙醇浸泡过夜，于100℃烘干。2.包被基质
将0.5g磁核(湿)加入到用pH7.0的磷酸缓冲液配制的50ml 5％的明胶溶液中，搅拌5分钟，将该液加入到搅拌中的溶有10ml Sp80的200ml甲苯液中，45℃恒温搅拌10分钟，搅拌速度200rpm，之后转入冰水浴，降温至10℃，搅拌5分钟。滴加0.5ml 50％的戊二醛溶液，升温到30℃，交联2小时。过滤收集微珠，用pH值为7.2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH至10，加入NaBH4至0.5％浓度，还原24小时。以磷酸缓冲液洗微球三次，依次用60％，70％，80％，95％的乙醇冲洗，于70℃烘干。所得微载体粒径为40-200微米，平均粒径140微米，湿比重1.19g/cm3。

Claims (9)

1.一种用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于：该微载体为核壳式结构，内核为磁敏核，磁敏核由磁粉和包裹磁粉的高分子聚合物构成，壳层为适于细胞贴壁、生长的基质，所用磁粉的平均粒径为0.1-5微米，磁敏核直径与微载体直径的比值为1∶1.2-1∶5，微载体的平均粒径为120微米～300微米；
所说的高分子聚合物由常用的可经悬浮聚合形成球状颗粒的单体、引发剂和交联剂制备，其中单体选自苯乙烯、对乙烯基甲苯、间乙烯基甲苯、α-甲基苯乙烯或甲基丙烯酸甲酯；引发剂包括过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈；交联剂包括二乙烯基苯和异氰尿酸三烯丙酯。
2.按照权利要求1所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于：所说的磁粉为γ-Fe(OH)2、γ-Fe2O3或Fe3O4。
3.按照权利要求1所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体，其特征在于：壳层基质是明胶、葡聚糖。
4.一种制备权利要求1～3任意一项所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：包括下面两个步骤：(1)磁核制备：
将聚合单体与交联剂按体积比为100∶2-40混合均匀，按每100ml单体加入0.5-1克的引发剂，于60℃-70℃维持搅拌，按每100ml反应液再加入25-75克磁粉，以1.2-2℃/分钟的速度升温至80-90℃，提高搅拌转速，加入是单体体积6-15倍的重量百分比为3-8％的明胶溶液，聚合3-4小时，90-100℃熟化2小时，过滤收集颗粒，依次用热水浸洗，冷水冲洗，用无水乙醇室温冲洗，用无水乙醇浸泡过夜，于100℃以下烘干；(2)包被基质：
用pH值为5.0-7.2的磷酸缓冲液配制重量百分比为5％-20％的明胶溶液，按每克湿磁核需10-100ml明胶溶液的比例将磁核加入到明胶溶液中，搅拌5分钟以上，将该液加入到搅拌中的4-8倍于明胶溶液体积的甲苯液中，甲苯液中溶有Sp80的比例为0.5-4mlSp80/克干明胶，于40-50℃搅拌5分钟以上，使裹有明胶的磁核充分分散，之后降温至0-10℃，搅拌5分钟以上，按照0.2-3ml戊二醛溶液/克干明胶的比例滴加重量百分比为10-50％的戊二醛溶液，升温到20-30℃，交联1-3小时，过滤收集微珠，用pH值为7.0-7.2的磷酸缓冲液洗三次。在载体-磷酸缓冲液体系中加入饱和硼砂液调pH值至9-10，加入NaBH4至溶液中的NaBH4的重量百分比浓度为0.5-2％，还原10-24小时，以磷酸缓冲液洗微球三次，用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干。
5.按照权利要求4所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：在上述第(1)步骤之前加入一个磁粉硅烷化步骤：向100体积份的重量百分比为0.1-1％的醋酸水溶液中加入0.2-10体积份的硅烷溶液，搅拌均匀，根据需要加入一定量磁粉，低速搅拌10分钟以上，过滤，于100℃以下烘干，研细。
6.按照权利要求4所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：在上述第(1)步骤和上述第(2)步骤之间加入一个磁核表面处理步骤：将干磁核加入到适量铬酸洗液或磺化液中使磁核被浸没并悬浮，略搅拌，室温浸泡3分钟以上，过滤，以大量去离子水冲洗颗粒至洗涤水为中性。
7.按照权利要求4所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：在第(2)步骤之后加入一个微载体表面修饰步骤：将已包被的干微载体颗粒，加入到能淹没载体并能使之悬浮的1～2M DEAECl·HCl溶液中，于40-50℃搅拌10分钟以上，向体系缓慢加入是DEAECl·HCl溶液体积的0.5～3倍的1～3M NaOH溶液，搅拌1小时以上，过滤，依次用去离子水、0.05～0.5M HCl、0.05～0.5mM HCl、去离子水、pH值为7.0-7.2的磷酸缓冲液冲洗载体颗粒，再用梯度乙醇冲洗，于70℃以下烘干，或置于70％的乙醇保存。
8.按照权利要求4所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：制备磁核时，将磁粉加入到单体、交联剂和引发剂的混合物中以后，经过10-20分钟的预聚合，再加入分散上述混合物的明胶溶液。
9.按照权利要求4～8任意一项所述的用于动物细胞培养的磁敏性微载体的制备方法，其特征在于：所制得的微载体可以进一步进行包括DEAE修饰或衍生化的表面修饰。
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