CN110833630A - 一种促进伤口愈合的敷料及其应用 - Google Patents

一种促进伤口愈合的敷料及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及伤口处理技术领域，具体地说，涉及一种促进伤口愈合的敷料及其应用，包括至少一层脱细胞基质层，脱细胞基质层的制备流程为：将动物组织依次通过低渗处理、高渗处理、物理剥离、去污剂处理、核酸酶处理、干燥处理和灭菌处理，制得脱细胞基质。本发明中促进伤口愈合的敷料能够用于牙周、皮肤、尿道组织、肛肠组织、膀胱组织等软组织修复，优化脱细胞工艺，先通过物理法去除大部分细胞，继而脱脂，最后利用酶消法去除细胞核残留的抗原，不仅能降低制作成本，还可以提高脱细胞效率，充分发挥其组织修复能力，脱细胞基质层以动物组织为原料，去除免疫成分，保留细胞外基质三维结构，提供伤口愈合所需的微环境，具有加速创面愈合功效。

Description

一种促进伤口愈合的敷料及其应用
技术领域
本发明涉及伤口处理技术领域，具体为一种促进伤口愈合的敷料及其应用。
背景技术
因割伤、烧伤，溃疡以及代谢失衡等导致诸如牙周、皮肤、肛肠、尿道、膀胱等软组织受损时，很容易引起局部甚至全身性问题，严重的甚至危及生命。因此，尽早封闭创面，并提供伤口适宜的修复环境，能够有效地加速创面愈合。凭借低廉的成本和丰富的原材料来源，纱布、水胶体等敷料是当前使用较为广泛的一类敷料，但这些传统的敷料只具备基本的物理隔离功能，缺乏有力的促愈合功效，难以恢复受损组织处正常的生理功能，因此开发一种具有促进伤口愈合功效的敷料具有重大的临床意义。
作为天然的生物材料，脱细胞基质具备有利于细胞粘附、增殖和分化的三维骨架结构，更为重要的是，由于不含细胞表面特异性识别位点，脱细胞基质不易引发受体的排斥反应，具有良好的生物相容性，可作为组织修复材料广泛应用于牙周、皮肤、肛肠、膀胱、尿道等软组织修复领域。
目前常用的脱细胞方法主要有物理法、化学法、酶消法以及上述方法联合使用，然而这些方法容易出现细胞抗原性去除不彻底或细胞外基质的三维结构遭到破坏的问题，影响最终组织修复效果。例如，中国专利文献CN109395166A仅通过物理法机械去除细胞，无法完全去除抗原性物质，可能导致免疫排斥性。再比如中国专利文献CN102218160A，该方法能最大限度地去除抗原性物质，但是其细胞质基质成份也遭到破坏，促进组织修复能力削弱。而中国专利文献CN109550075A，该方法引入额外的化学交联剂，降低了该脱细胞基质的生物相容性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进伤口愈合的敷料及其应用，以解决上述背景技术中提出的某种或某些缺陷。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种促进伤口愈合的敷料，包括至少一层脱细胞基质层。
作为优选，所述脱细胞基质层的来源包括哺乳动物的真皮基质、胃粘膜下层、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、心包膜、羊膜的一种。
作为优选，所述脱细胞基质层的制备流程为：将动物组织依次通过低渗处理、高渗处理、物理剥离、去污剂处理、核酸酶处理、干燥处理和灭菌处理，制得脱细胞基质，具体制备方法包括如下步骤：
S1：将动物组织加入低渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，利用渗透压差，使细胞吸水涨破；
S2：将S1中处理过的动物组织加入高渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，通过高渗溶液进一步破坏细胞；
S3：将S2中处理过的动物组织用细胞刮除去残留细胞；
S4：将S3中处理过的动物组织加入含0.1％-10％去污剂的水溶液中孵育，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h；
S5：将S4中处理过的动物组织加入PBS缓冲液中，之后加入20-200U/mL的DNA酶和1-20U/mL的RNA酶，在4-40℃下振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-40℃，孵育时间为2h-36h；
S6：将S5中处理过的动物组织采用冷冻干燥法处理24h-96h；
S7：将S6中处理过的动物组织采用钴60射线处理，制得脱细胞基质。
作为优选，所述低渗溶液为超纯水。
作为优选，所述高渗溶液为1-10M氯化钠溶液。
作为优选，所述去污剂为十二烷基磺酸钠、Triton-100和脱氧胆酸钠中的一种或几种。
作为优选，冷冻干燥法的冷冻温度在-80℃至-20℃，真空度在0Pa-10Pa。
作为优选，钴60射线的辐射剂量为5KGy-25KGy。
另一方面，本发明还提供了一种促进伤口愈合的敷料的应用，包括上述的促进伤口愈合的敷料，将促进伤口愈合的敷料均匀涂覆于牙周、皮肤、尿道组织、肛肠组织、膀胱组织或软组织修复。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本促进伤口愈合的敷料及其应用中促进伤口愈合的敷料能够用于牙周、皮肤、尿道组织、肛肠组织、膀胱组织等软组织修复，优化脱细胞工艺，先通过物理法去除大部分细胞，继而脱脂，最后利用酶消法去除细胞核残留的抗原，脱细胞基质层的制备方法不仅能够降低制作成本，而且可以提高脱细胞效率，充分发挥其组织修复能力。
2、本促进伤口愈合的敷料及其应用中促进伤口愈合的敷料包括至少一层脱细胞基质层，脱细胞基质层以动物组织为原料，去除免疫成分，保留细胞外基质三维结构，提供伤口愈合所需的微环境，具有加速创面愈合功效。由本发明制备的敷料能有效地解决当前产品促愈合功效不强，制备工艺复杂以及化学交联剂残留等问题，可广泛应用于创伤修复领域。
附图说明
图1是本发明中敷料的扫描电子显微镜图；
图2是本发明细胞毒性实验分析柱状图；
图3是本发明创面愈合实验分析折线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供以下技术方案：
一种促进伤口愈合的敷料，包括至少一层脱细胞基质层，脱细胞基质层的来源包括哺乳动物的真皮基质、胃粘膜下层、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、心包膜、羊膜的一种。
进一步的，脱细胞基质层的制备流程为：将动物组织依次通过低渗处理、高渗处理、物理剥离、去污剂处理、核酸酶处理、干燥处理和灭菌处理，制得脱细胞基质，具体制备方法包括如下步骤：
S1：将动物组织加入低渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，利用渗透压差，使细胞吸水涨破，低渗溶液为超纯水；
S2：将S1中处理过的动物组织加入高渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，通过高渗溶液进一步破坏细胞，高渗溶液为1-10M氯化钠溶液；
S3：将S2中处理过的动物组织用细胞刮除去残留细胞；
S4：将S3中处理过的动物组织加入含0.1％-10％去污剂的水溶液中孵育，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，去污剂为十二烷基磺酸钠、Triton-100和脱氧胆酸钠中的一种或几种；
S5：将S4中处理过的动物组织加入PBS缓冲液中，之后加入20-200U/mL的DNA酶和1-20U/mL的RNA酶，在4-40℃下振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-40℃，孵育时间为2h-36h；
S6：将S5中处理过的动物组织采用冷冻干燥法处理24h-96h，冷冻干燥法的冷冻温度在-80℃至-20℃，真空度在0Pa-10Pa；
S7：将S6中处理过的动物组织采用钴60射线处理，制得脱细胞基质，钴60射线的辐射剂量为5KGy-25KGy。
另一方面，本发明还提供了一种促进伤口愈合的敷料的应用，包括上述促进伤口愈合的敷料，将促进伤口愈合的敷料均匀涂覆于牙周、皮肤、尿道组织、肛肠组织、膀胱组织或软组织修复。
实施例1
(1)将牛心包组织加入超纯水中振荡孵育，振速50rpm，孵育温度为4℃，孵育时间为36h；
(2)将上述组织加入5M氯化钠溶液振荡孵育，振速100rpm，孵育温度为25℃，孵育时间为24h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含0.1％的十二烷基磺酸钠的水溶液中孵育，孵育温度为60℃，孵育时间为2h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入20U/mL的DNA酶和20U/mL的RNA酶，在4℃下振荡孵育，振速200rpm，孵育时间为36h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-40℃，真空度在5Pa，冷冻干燥法处理72h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为15KGy。
实施例2
(1)将猪小肠粘膜组织加入超纯水中振荡孵育，振速100rpm，孵育温度为20℃，孵育时间为12h；
(2)将上述组织加入10M氯化钠溶液振荡孵育，振速200rpm，孵育温度为30℃，孵育时间为8h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含1％的Triton-100的水溶液中孵育，孵育温度为30℃，孵育时间为6h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入60U/mL的DNA酶和2U/mL的RNA酶，在25℃下振荡孵育，振速300rpm，孵育时间为4h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-60℃，真空度在2Pa，冷冻干燥法处理48h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为10KGy。
实施例3
(1)将猪羊膜组织加入超纯水中振荡孵育，振速80rpm，孵育温度为30℃，孵育时间为6h；
(2)将上述组织加入1M氯化钠溶液振荡孵育，振速80rpm，孵育温度为10℃，孵育时间为10h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含10％的脱氧胆酸钠的水溶液中孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为12h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入200U/mL的DNA酶和20U/mL的RNA酶，在40℃下振荡孵育，振速200rpm，孵育时间为3h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-80℃，真空度在0Pa，冷冻干燥法处理24h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为25KGy。
实施例4
(1)将猪真皮组织加入超纯水中振荡孵育，振速300rpm，孵育温度为60℃，孵育时间为4h；
(2)将上述组织加入8M氯化钠溶液振荡孵育，振速200rpm，孵育温度为50℃，孵育时间为18h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含5％的十二烷基磺酸钠和0.1％Triton-100的混合水溶液中孵育，孵育温度为4℃，孵育时间为20h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入100U/mL的DNA酶和20U/mL的RNA酶，在4℃下振荡孵育，振速200rpm，孵育时间为4h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-60℃，真空度在4Pa，冷冻干燥法处理48h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为5KGy。
实施例5
(1)将猪膀胱组织加入超纯水中振荡孵育，振速80rpm，孵育温度为45℃，孵育时间为6h；
(2)将上述组织加入6M氯化钠溶液振荡孵育，振速200rpm，孵育温度为40℃，孵育时间为2h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含5％的Triton-100和5％的脱氧胆酸钠混合水溶液中孵育，孵育温度为35℃，孵育时间为6h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入80U/mL的DNA酶和4U/mL的RNA酶，在30℃下振荡孵育，振速300rpm，孵育时间为8h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-60℃，真空度在3Pa，冷冻干燥法处理36h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为10KGy。
实施例6
(1)将猪胃组织加入超纯水中振荡孵育，振速80rpm，孵育温度为15℃，孵育时间为10h；
(2)将上述组织加入4M氯化钠溶液振荡孵育，振速60rpm，孵育温度为20℃，孵育时间为4h；
(3)将上述组织用细胞刮除去残留的细胞；
(4)将上述组织加入含8％的十二烷基磺酸钠和0.5％的脱氧胆酸钠混合水溶液中孵育，孵育温度为25℃，孵育时间为8h；
(5)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入50U/mL的DNA酶和16U/mL的RNA酶，在4℃下振荡孵育，振速200rpm，孵育时间为36h；
(6)将上述组织动物在冷冻温度-20℃，真空度在1Pa，冷冻干燥法处理24h；
(7)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为8KGy。
对比例1
(1)将猪膀胱组织加入超纯水中振荡孵育，振速80rpm，孵育温度为45℃，孵育时间为6h；
(2)将上述组织加入含5％的Triton-100和5％的脱氧胆酸钠混合水溶液中孵育，孵育温度为35℃，孵育时间为6h；
(3)将上述组织加入PBS缓冲液中，随后加入80U/mL的DNA酶和4U/mL的RNA酶，在30℃下振荡孵育，振速300rpm，孵育时间为8h；
(4)将上述组织动物在冷冻温度-60℃，真空度在3Pa，冷冻干燥法处理36h；
(5)将上述组织采用钴60射线处理，辐射剂量为10KGy。
如图2所示，将上述实施例1-6与对比例1制得的促进伤口愈合的敷料进行细胞毒性试验，根据GB/T16886.5-2008体外细胞毒性要求，采用生长旺盛的L929细胞系为实验细胞。培养基为含10％(V/V)胎牛血清的DMEM。分别以实施例5和对比例1所述的敷料为实验组，以含10％胎牛血清的新鲜无菌DMEM培养基为阴性对照组，以质量分数为5％的苯酚溶液为阳性对照组，试验在96孔板上进行，每孔细胞个数约10000个，其中，阴性对照组中加200μL含10％胎牛血清的新鲜无菌DMEM培养基，实验组分别按照10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL的浓度分别加入按实施例1和对比例1所述的敷料，其中实验组每孔中的溶液为200μL的阴性对照液。阳性对照组则加入相应含量的苯酚溶液(质量分数为5％)，并补充阴性对照液使阳性对照孔中每孔的溶液体积为200μL。接着，将该96孔板置于37℃恒温培养箱中，恒温培养24h后取出培养板，每孔加入20μLMTT溶液，继续培养4h,接着弃去原液，每孔加入150μL二甲亚砜，低速振荡十分钟后在紫外分光光度计上以570nm波长处测定吸光度值(ABS)。
相对细胞活性(％)＝ABS570实验组/ABS570阴性对照×100％
实验结果显示，实施例5所述的敷料具有0级细胞毒性。
如图3所示，将上述实施例1-6与对比例1制得的促进伤口愈合的敷料进行创面愈合实验，将SD大鼠麻醉、消毒后在其背部取直径约为2cm的创面，实验组为按照实施例5制备的敷料以及对比例1制备的敷料；分别以空白组和纱布组作为对照组。术后7天，14天，21天观察伤口愈合情况，结果显示，相较于对照组，使用实施例5敷料的SD大鼠，背部创面愈合的更快，具有显著的促进愈合的作用。
此外，将上述实施例1-6与对比例1制得的促进伤口愈合的敷料分别对其进行HE染色后统计残余细胞的数量，结果如下表所示：
组别 细胞个数(个/cm<sup>2</sup>)
实施例1 2.26
实施例2 0.98
实施例3 1.58
实施例4 1.79
实施例5 0.46
实施例6 1.68
对比例1 30.79
本发明的促进伤口愈合的敷料及其应用，该敷料包括至少一层脱细胞基质层。脱细胞基质层以动物组织为原料，去除免疫成分，保留细胞外基质三维结构，提供伤口愈合所需的微环境，具有加速创面愈合功效。由本发明制备的敷料能有效地解决当前产品促愈合功效不强，制备工艺复杂以及化学交联剂残留等问题，可广泛应用于创伤修复领域。本发明优化脱细胞工艺，先通过物理法去除大部分细胞，继而脱脂，最后利用酶消法去除细胞核残留的抗原，脱细胞基质层的制备方法不仅能够降低制作成本，而且可以提高脱细胞效率，充分发挥其组织修复能力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种促进伤口愈合的敷料，其特征在于：包括至少一层脱细胞基质层。
2.根据权利要求1所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：所述脱细胞基质层的来源包括哺乳动物的真皮基质、胃粘膜下层、小肠粘膜下层、膀胱粘膜下层、心包膜、羊膜的一种。
3.根据权利要求2所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：所述脱细胞基质层的制备流程为：将动物组织依次通过低渗处理、高渗处理、物理剥离、去污剂处理、核酸酶处理、干燥处理和灭菌处理，制得脱细胞基质，具体制备方法包括如下步骤：
S1：将动物组织加入低渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，利用渗透压差，使细胞吸水涨破；
S2：将S1中处理过的动物组织加入高渗溶液中振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h，通过高渗溶液进一步破坏细胞；
S3：将S2中处理过的动物组织用细胞刮除去残留细胞；
S4：将S3中处理过的动物组织加入含0.1％-10％去污剂的水溶液中孵育，孵育温度为4-60℃，孵育时间为2h-36h；
S5：将S4中处理过的动物组织加入PBS缓冲液中，之后加入20-200U/mL的DNA酶和1-20U/mL的RNA酶，在4-40℃下振荡孵育，振速50-300rpm，孵育温度为4-40℃，孵育时间为2h-36h；
S6：将S5中处理过的动物组织采用冷冻干燥法处理24h-96h；
S7：将S6中处理过的动物组织采用钴60射线处理，制得脱细胞基质。
4.根据权利要求3所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：所述低渗溶液为超纯水。
5.根据权利要求3所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：所述高渗溶液为1-10M氯化钠溶液。
6.根据权利要求3所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：所述去污剂为十二烷基磺酸钠、Triton-100和脱氧胆酸钠中的一种或几种。
7.根据权利要求3所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：冷冻干燥法的冷冻温度在-80℃至-20℃，真空度在0Pa-10Pa。
8.根据权利要求3所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：钴60射线的辐射剂量为5KGy-25KGy。
9.一种促进伤口愈合的敷料的应用，包括权利要求1-8任意一项所述的促进伤口愈合的敷料，其特征在于：将促进伤口愈合的敷料均匀涂覆于牙周、皮肤、尿道组织、肛肠组织、膀胱组织或软组织修复。
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