CN110832068A - 使用反义分子治疗癌症的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开涉及使用针对***1受体(IGF‑1R)的反义(AS)核酸治疗癌症的组合物和方法。所述AS可以全身施用于所述患者，或者可以用于产生自体癌细胞疫苗。在实施方式中，在包含肿瘤细胞和有效量的所述AS的可植入辐照生物扩散室中提供所述AS。辐照所述室，将其植入受试者腹部，并刺激远侧攻击肿瘤的免疫应答。本文所公开的组合物和方法可以用于治疗多种不同类型的癌症，例如，胶质母细胞瘤。

Description

使用反义分子治疗癌症的方法和组合物
相关申请的引证
本发明申请主张标题分别为“Methods and Compositions for TreatingCancers Using Antisense(使用反义分子治疗癌症的方法和组合物)”的2017年3月9日提交的美国临时专利申请No.62/469,003和2018年2月13日提交的美国临时专利申请No.62/629,972的优先权，以上每篇专利申请的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。
技术领域
本发明公开涉及使用针对***-1受体(IGF-1R)的反义核酸治疗癌症的组合物和方法。本发明公开还涉及通过用至少一个包含肿瘤细胞和针对IGF-1R的反义核酸的可植入的辐照的生物扩散室(参见美国专利No.6,541,036和PCT/US2016/026970，以上专利以其全部内容作为参考并入本文)处理受试者来治疗癌症的组合物和方法。
以电子形式提交的文本文件的说明
以电子形式一同提交的文本文件的内容以其全部内容作为参考并入：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：IMVX_005_02WO_SeqList.txt，记录日期2018年3月8日，文件大小12千字节)。
背景技术
尽管在癌症疗法中取得了进展，但是恶性神经胶质瘤，具体地多形性胶质母细胞瘤和多种其它癌症仍预后不良。标准治疗，如(例如)化疗、外束辐射和近距放射治疗的改变仅在无进展生存期和总生存期两者中提供了小幅改善。尽管在理论上是有希望的，但是免疫疗法试验尚未解决实体瘤所产生的问题。对于神经胶质瘤的治疗，美国国家癌症研究所估计年发病率为每年约28,000例，如果将复发性神经胶质瘤患者包括在内的话，则将提高至50,000例之上。因此，在本领域中需要获得用于癌症，并且具体地脑癌的新型和改善的治疗。
发明内容
本发明公开表明靶向***受体-1(IGF-1R)的反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)在受试者中有效刺激应答，当在本文所述的治疗方法中使用时，其治疗癌症。在具体的方面，单独作为自体(自体同源，autologous)癌细胞疫苗的一部分或者任选地随同全身施用一起，所述方法对于患者中癌症的治疗是有效的。在优选的方法中，本文所公开的方法作为单一疗法(即在不存在化疗的情况下和在不存在放射疗法的情况下)提供了有效的癌症疗法。
在实施方式中，本发明公开提供了用于植入到具有肿瘤的受试者中的生物扩散室，所述生物扩散室包含辐照的肿瘤细胞和辐照的***受体-1反义寡脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)。在实施方式中，从所述受试者的切除位点除去肿瘤细胞。
在实施方式中，本发明公开提供了包含辐照的IGF-1R AS ODN和辐照的贴附-富集的粉碎的(morselized)肿瘤细胞的扩散室；其中所述生物扩散室包含对细胞不透但对IGF-1R AS ODN可透的膜。
在实施方式中，使用内窥镜装置从切除位点除去肿瘤细胞。在其它实施方式中，使用组织粉碎器(tissue morselator)从切除位点除去肿瘤细胞。在其它实施方式中，所述组织粉碎器包含位于固定外套管(stationary outer cannula)内的高速往复内套管(high-speed reciprocating inner cannula)。所述外套管可以包含侧孔，并且进一步其中通过电子控制的可变吸力将肿瘤细胞吸入所述侧孔中。在实施方式中，所述组织粉碎器在切除位点不产生热。在其它实施方式中，在将它们置于生物扩散室中之前，对于巢蛋白表达富集肿瘤细胞。在一些实施方式中，所述室的植入抑制了受试者中肿瘤的再生长。在一些实施方式中，所述室的植入将肿瘤的再生长抑制至少3个月、至少6个月、至少12个月或至少36个月。
在其它实施方式中，本发明公开提供了制备用于植入具有肿瘤的受试者中的生物扩散室的方法，所述方法包括在存在IGF-1R AS ODN的情况下，将肿瘤细胞置于生物扩散室中，并辐照所述生物扩散室，其中使用在切除位点不产生热的组织粉碎器从受试者中的切除位点除去肿瘤细胞。典型地，使用多个室。例如，约10个室，或者约20个室。有利地，当所述室中的细胞数目为约750,000至约1,250,000；例如，每室约1,000,000个，其中植入20个室时，获得了最优抗肿瘤应答。
在一些实施方式中，所述组织粉碎器是内窥镜装置。在其它实施方式中，所述组织粉碎器包含位于固定外套管内的高速往复内套管。在其它实施方式中，所述外套管包含侧孔，并且通过电子控制的可变吸力将肿瘤细胞吸入所述侧孔中。
在实施方式中，本发明公开提供了治疗具有肿瘤的受试者的方法，所述方法包括将一个或多个生物扩散室植入所述受试者中，其中所述一个或多个生物扩散室包含辐照的肿瘤细胞和辐照的***受体-1反义寡脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)，其中使用在切除位点不产生热的组织粉碎器从受试者中的切除位点除去肿瘤细胞。
附图说明
图1a-1g显示了代表性的生物扩散室。图1a.构成部件；图1b.组装的室；图1c.PMMA孔塞(port plug)以密封所述室；图1d.聚偏氟乙烯Durapore膜的显微照片；图1e.真实室的顶视图和侧视图；图1f.和图1g.移植之后的Durapore膜的H&E染色石蜡切片；图1f.来自人体试验14379-101的移植的磷酸盐缓冲盐水对照室；图1g.来自人体试验14379-101的移植的疫苗室。
图2a-2c显示了I期试验(IND 14379-101，NCT01550523)中受试者的存活量度。图2a.试验中患者的总生存期；图2b.具有两个存活组的规程存活期。9位患者死于疾病发展，同时1位患者死于脑内出血，并且2位患者死于败血病。对于长(N＝4)和短(N＝8)存活组，整体规程存活期分别为48.2周和9.2周(log-排序(log-rank)＝.014)。图2c.排除了1个严重淋巴细胞减少的离群值和3个非疾病-相关死亡的线性回归显示了规程(protocol)存活期和招募时的淋巴细胞计数之间的强相关性(R2＝.8，p＝.0028)。
图3a-3d显示了具有相关生理学测量的放射照相反应。图3a.来自短存活组的患者成象的实例。患者TJ11：A-D；患者TJ10：E-H。A、E：术前T1-钆-增强的轴面图像；G：T1-钆-增强的冠状面图像；C：术前轴面FLAIR图像。B、D、F、H：各个术后3个月图像。图3b.来自长存活组的患者成象的实例。患者TJ06：A-D；患者TJ09：E-H。A、E：术前T1-钆-增强的轴面图像；C、F：术前轴面FLAIR图像。B、D、F、H：各个术后3个月图像。图3c.长存活组中，肿瘤中相对脑血容量v.表观扩散系数之间的关系；在ADC和rCBV之间存在强相关性(R2＝.96，p＝.0005)。图3d.短存活组中，肿瘤中相对脑血容量v.表观扩散系数之间的关系。
图4a-4c显示了通过存活组，对所述移植室的检查。图4a.移植室结构完整且无活细胞。来自C-p和C-v室两者的膜的外表面覆盖了CD15+和CD163+细胞，但是C-v膜上的数量显著提高；图4b.存活组之间的室中因子分析显示在长存活组中VEGF、PDGF-α、IL-11、CCL5、MCP-3和MIP-1d显著室升高，而一些可溶性癌症标志物在短存活组中显著升高，包括NSE、骨连接蛋白和YKL40。混合判别分析独立鉴别了这些组差异；图4c.对于两个组，C-v中与神经胶质瘤巨噬细胞招募有关的两个趋化因子显著低于其它可测量来源。骨膜蛋白(Periostin)和CCL2水平两者均显著低于血清或SN(肿瘤细胞上清液)值，表明所述室中产生这些趋化因子的细胞的去除。
图5a-5e显示了疫苗接种后的PBMC和细胞因子水平。在处理后时期内，在疫苗接种之后，免疫效应细胞改变和细胞因子/趋化因子改变的连续测量；长存活组(患者TJ03、TJ14、TJ06、TJ09)；短存活组的实例，患者TJ13(对于所有其它短存活组，参见图6)。行：图5a.疫苗接种之后的连续PBMC计数；图5b.疫苗接种之后PBMC亚群百分比的连续评价，图5c.CCL21和CXCL12的连续水平；图5d.CD14+CD16-巨噬细胞的绝对计数与MCP-1(CCL2)的关系；注意，图5b中与巨噬细胞水平的相关性和术后CCL2峰。在短存活组中，CCl2水平保持显著较高(参见图6)。图5e.疫苗接种之后假定的TH-1细胞因子应答的缩放(成比例)比较(TNF-α×2；CXCL9×350；CXCL10×80)。注意到如下所示的显著相关性：对于两个组，TNF-α峰与CCL2峰高度相关(R2＝.99，p＝.003)。CD14+16-细胞中存在显著的直接围术期减少(immediate perioperative decrease)(p＝.008)，但在短存活组中未观察到(p＝.78)。仅对于长存活组，在CD4和CXCL12之间存在显著相关性(R2＝.62，p<.0001)。另外，在总单核细胞计数和CD14+16-单核细胞水平之间注意到强相关性(图5B和5D，R2＝.8，p<.0001)并且在长存活组(图5)中注意到循环T细胞和单核细胞个数之间的负相关关系(R2＝.66，p<.0001)，其在短存活组中无显著差异(参见图6)。
图6a-6e显示了短存活组患者(患者TJ01、TJ01、TJ07、TJ08、TJ10、TJ11、TJ12)中PBMC和细胞因子的疫苗接种后水平。行：图6a.疫苗接种之后的连续PBMC计数；图6b.疫苗接种之后PBMC亚群百分比的连续评价(T细胞；B细胞；单核细胞)；图6c.CCL21和CXCL12的连续水平；图6d.CD14+CD16-巨噬细胞的绝对计数与MCP-1(CCL2)的关系。与长存活组相比，短存活组中CCl2的水平保持显著更高。图6e.疫苗接种之后假定的TH-1细胞因子应答的缩放比较(TNF-α×2；CXCL9×350；CXCL10×80)。还显示了IFN-g。
图7a-7h显示了疫苗接种之后特异性促肿瘤单核细胞群体的损失。在3个月的一段时间内观察到了显著的肿瘤消退。图7a.TME IGF-1R+细胞的单相趋势(顺序量表)；在从初始诊断至疫苗接种的配对病例(N＝5)中，无显著性差异；从疫苗接种至尸检的配对病例(N＝4)显示IGF-1R+细胞显著减少(p＝.003)。图7b.具有从初始诊断至疫苗接种和尸检的可评价石蜡切片的两位患者中的IGF-1R阳性细胞(患者TJ06和TJ10)。图7c.TME CD163M2巨噬细胞的双相趋势，从诊断至复发显著升高(每位患者，每个治疗阶段，5个Aperio 400×视野(field)；左图，配对*p<.0001，N＝6)，然后在疫苗接种之后，从复发至尸检，显著损失(右图，配对*p<.0001，N＝4)。图7d.在从初始诊断至疫苗接种和尸检具有可评价的石蜡切片的相同的两位患者(患者TJ06和TJ10)中的CD163+细胞；在疫苗接种v.复发时CD163升高(配对，p＝.052)，随后在尸检v.疫苗接种时TME CD163M2巨噬细胞显著减少(配对，*p＝.001)。图7e.在短存活组中，在手术时记录的外周CD163单核细胞和CD163TAM水平之间的显著相关性(R2＝.80，p＝.02)。图7f.在长存活组中，外周和TAM CD163细胞之间的非显著相关性。图7g.来自石蜡切片的荧光免疫组织化学显微照片。A、C：疫苗接种之前，第二次手术切除时的患者TJ10，和B、D：尸检时；E-H：在标准护理之后获自经历再切除术的胶质母细胞瘤患者的尸检样品；I、J：未处理的，死后偶然发现的胶质母细胞瘤。图7h.从初始诊断至尸检，TJ06中对于治疗反应的时间过程。TME中的CD163细胞在标准治疗之后升高并且在疫苗接种之后至尸检降低的双相发生。CD163TAM的损失与肿瘤中rCBV和ADC值两者的升高有关。在每次疫苗接种之后出现血清硝酸盐水平峰值，并且它与伴随的rCBV/ADC升高有关。
图8a-8d显示了通过细胞因子或者来自研究受试者的血清使未成熟的单核细胞分化。图8a.通过M2细胞因子使单核细胞极化后的IGF-1R上调。M1巨噬细胞不上调IGF-1R，***p＝.0004。图8b.根据材料和方法中所述的巨噬细胞极化规程，在用IGF-1R AS ODN处理后单核细胞亚型(亚组，subset)分布中的差异。流式细胞术显示IGF-1R AS ODN选择性靶向M2巨噬细胞的除去。图8c.规程患者血清使未成熟的单核细胞分化为共表达IGF-1R和PD-L1的CD163+表型。IGF-1R AS ODN以剂量-依赖性方式在100-倍浓度范围内敲低该巨噬细胞群体。所有值均为平均荧光强度。对每个患者血清共培育进行重复测量，比较平均值。***p<.0001，**p＝.0001，*p＝.0002，◆◆◆p＝.0003，◆◆p＝.0009，◆p＝.009，
Figure BDA0002200964950000051
p＝.0018，
Figure BDA0002200964950000052
p＝.026。图8d.图8c中平均值的总结。
图9a-9d显示了与第一次期中分析中的标准护理相比时，无进展生存期和总生存期两者显著改善。图9a.与标准护理(SOC)相比的整个研究组的无进展生存期(PFS)；黑色虚线是95％置信区间；图9b.总生存期(OS)。在两种情况下，SOC低于95％CI的下限，从而反映了显著的改善；图9c.期中分析时存活组的PFS；图9d.期中分析时存活组的OS。
图10a-10d显示了1b期研究的总结信息和干扰素-γ水平与在先试验以及所述试验内的组间的比较。图10a.在新诊断的疫苗组中，在疫苗接种之后IFN-γ升高的趋势(p＝.06)；图10b.在新诊断的疫苗组中，中值IFN-γ显著升高(p＝.02)；图10c.在20个室的组中IFN-γ水平显著升高，***p<.0001，**p<.006，*p<.02；图10d.标记的IGF-1R AS ODN从所述生物扩散室中随时间的扩散速率。
图11a-11j显示了在初始小鼠模型(空白小鼠模型、首次接受实验的小鼠模型，mouse model)中完全配制的生物扩散室(辐照和外源添加的AS ODN两者)对促炎细胞因子产生的影响。在植入后24小时，单独填充GL261细胞的移植的小鼠室内容物的Luminex分析；具有2μg IGF-1R AS ODN添加或者用5Gy X射线对GL261细胞辐照的部分制剂；或者完全配制的自体疫苗(GL261，2μg IGF-1R AS ODN和5Gyγ-辐照)。图11a.G-CSFGL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0117；图11b.IL-1a,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.008；图11c.IL-1b,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0067；图11d.IL-2,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0002；图11e.IL-9,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0413；图11f.IL-10,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0001；图11g.IL-12(p40),GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.001；图11h.IL-13,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0065；图11i.IL-15,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0013；图11j.M-CSF,GL261-AS-irr v.PBS p＝.007。测试但未显示的其它细胞因子：IL-6,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0836；GM-CSF,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0854；lix,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0001；kc,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0112；TNF-a,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0082；VEGF,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0004；lif,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0140；IL-7,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0038；IL-12(p70)GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0120；IFN-γ,GL261-AS-irr v.GL261-irr p<.0290。
图12显示了通过IGF-1R AS ODN；NOBEL反义分子750μg v.NOBEL正义分子(有义分子，sense)75μg，7.5μg，DWA反义分子750μg，7.5μg，对照，***p<.0009；NOBEL反义分子75μgv.NOBEL正义分子，DWA反义分子7.5μg的来自两位正常受试者(深和浅)的外周血单核细胞(PBMC)的树突状细胞(DC)激活的滴定曲线。
图13a-13b显示了使用来源于接种疫苗小鼠的T细胞，来自完全配制的室的内容物的体外T细胞应答。图13a.通过用回收自所述室的抗原预激(prime)的DC的促炎T细胞应答；对于体外完整制剂v.无抗原，**p<.01；对于完整制剂v.外来体，*p<.03；图13b.通过用回收自所述室的抗原攻击(脉冲，pulse)的DC的促炎T细胞应答；对于完整制剂v.无抗原，**p<.005；对于完整制剂v.外来体，*p<.007。
图14a-14d是对NOBEL反义分子剂量滴定的双相反应的示意图。
图15a-15b显示了通过来源于6位不同的神经胶质瘤患者的血清的过夜培育，来自3位正常受试者的同种异体单核细胞的M2极化。对照不与血清培育。1000-倍稀释曲线显示了共表达图15a.PDL-1和图15b.CD163的M2巨噬细胞的减少，从100pg NOBEL反义分子至1μg的显著敲低。每幅图中的线是总平均值。1μg NOBEL v.未处理，***p<.0002。
图16显示了移植的疫苗室细胞因子水平v.移植的PBS对照室的比较。***p，.005；***p<.01；***p<.02；**p<.03；*p<.05。
图17是剂量反应曲线，其显示了全身性IGF-1R AS-ODN对侧腹神经胶质瘤肿瘤生长抑制的双相反应。将106个GL261细胞植入C57BL/6小鼠侧腹，并且在20天后，在通常在循环CD163阳性细胞中观察到升高的时期之前，用单次0.75mg(正方形)或者0.075mg(三角形)剂量的NOBEL IGF-1R AS-ODN腹膜内注射小鼠。然后，追踪小鼠的肿瘤发展。将未注射疫苗的小鼠(圆形)用作对照。
图18是流式细胞术数据，其显示全身性IGF-1R AS-ODN治疗抑制循环M2单核细胞的积累。将所述数据表示为表达CD163(右侧峰)的细胞个数的柱状图，其中标记为“媒介物”的一条线表示用PBS(媒介物)处理的肿瘤-植入的小鼠，标记为“AS-ODN”的另一条线表示用NOBEL IGF-1R AS-ODN处理的所植入的小鼠。在图中注释了这些线。
图19显示了在侧腹植入用NOBEL IGF-1R AS-ODN或PBS(媒介物)处理的神经胶质瘤细胞的小鼠的肿瘤发病率。治疗和未治疗组之间的肿瘤发病率具有显著差异(*＝p<0.05)。
图20显示了在侧腹植入神经胶质瘤细胞并且用或不用NOBEL IGF-1R AS-ODN处理的Tbet缺陷型小鼠中的肿瘤发病率。组间肿瘤发病率具有显著差异(*＝p<0.05)。
图21a、21b和21c显示了疫苗接种之后，来自随时间(术后14-42天)连续血液抽取的混合的患者血清中的促炎细胞因子水平(pg/ml)。在患者血清中观察到了促炎细胞因子的显著剂量-依赖性升高。图21d、21e和21f显示了肿瘤组织湿重得率和受试者的细胞因子得率之间的相关性(多项式最佳拟合)。当在处理后，细胞在20个室中分布时，3克的组织湿重得率产生了最高的细胞因子得率。
图22是代表性的完全配制的生物扩散室的示意图。当将所述室植入患者中时，反义分子和肿瘤抗原扩散通过所述室的多孔膜，从而导致产生了肿瘤-特异性免疫应答，减少了M2极化和减少了M2+细胞的个数。
图23是代表性免疫方法的示意图。如果患者未对第一轮疫苗接种充分应答，则任选地根据需要，并且有时与其它治疗结合，多次重复所述程序。
图24a和25b是Kaplan-Meier曲线，其分别显示了意向处理组(N＝30)中患有脑肿瘤的人患者中的中值无进展生存期(P-FS)和中值总生存期(OS)。(在以上图9中显示了期中分析)。用所植入的20个室处理“接种疫苗的”群体，并且每个室含有2μg NOBEL。使用历史数据表示“SoC”群体(N＝76)。所述数据显示了总生存期和癌症无进展生存期两者的显著提高。
图25a和25b是Kaplan-Meier曲线，其分别显示了接种疫苗和标准护理(SoC)组中比较相同性别和中值年龄的无进展生存期和总生存期。所述数据显示了总生存期和癌症无进展生存期两者的显著提高。
图26a和26b是Kaplan-Meier曲线，其显示了当排除从治疗中退出和死于其它原因的5位患者时的无进展生存期和总生存期。
图27a和27b是Kaplan-Meier曲线，其显示了当排除未完成标准护理(SOC)规程的9位患者时的无进展生存期和总生存期。
图28a、28b、28c、28d显示了基于高疫苗组中的细胞得率所引起的IFN-γ应答。所述数据显示了基于所述室中的细胞个数的最优IFN-γ释放。对于图28a和28b，以百万个细胞显示细胞得率。将IFN-γ表示为平均荧光强度(MFI)。这些数据来自每个室含有2μgNOBEL的20-室组。数据表示为多项式拟合(三次曲线)。图28c和20db是图28a和b中数据的提取，图28a和b显示了细胞个数得率(高达2000万个细胞)分别相对于平均和峰值IFNγ应答之间的显著线性关系。在本文中，数据表示为pg/ml。
图29a、29b和29c显示了对于包封前的IGF-1R反义分子的预培育，相对于室制剂的IFN-γT细胞应答。图29a显示了用于评价T细胞对肿瘤抗原的应答的规程。对于图29b，在体外临床室范式之后，制备了抗原。将约1百万个离体GL261肿瘤细胞单独或与指定的反义分子浓度一起注入所述室中并在置于PBS中的所述室中培育过夜。在随后的几天，提取室内容物并用于攻击初始(原始的，naive)树突状细胞。将未用反义分子处理过夜的室内容物加入至具有指定量的NOBEL的树突状细胞中。将树突状细胞保持未接受实验以用作对照。在用抗原攻击过夜后，收集树突状细胞并与来自免疫动物的T细胞在用细胞因子IFNγ的ELIPSPOT检测抗体涂覆的细胞培养板中培育过夜。在培育过夜之后，对所涂覆的板进行处理并显色以对于对每个抗原应答的产生IFNγ的T细胞的数目进行计数。图29b中的数据显示在从含有GL261细胞加反义分子的室所回收的材料中检测到肿瘤抗原，但是即使在攻击树突状细胞(DC)时将反义分子加入至所述材料，在来自单独与细胞培养的室的材料中未检测到肿瘤抗原。所述数据显示需要在所述室中反义分子与神经胶质瘤细胞来产生免疫刺激性肿瘤抗原。对于图29c，将GL261细胞在培养皿中涂板，并用4mg NOBEL每1百万个细胞处理过夜或者保持未处理。然后，收集细胞并将其以1百万个细胞和2μg NOBEL每室置于室中。然后，将所述室在PBS中培育过夜并在随后一天提取内容物。然后，用所述室内容物攻击树突状细胞，并如上所述测量IFNγ的分泌。所述数据显示用反义分子过夜处理GL261细胞提高了通过这些细胞所产生的抗原的量，如通过产生IFNγ的肿瘤-免疫T细胞的数目的增加所检测的。
图30a、30b、30c和30d显示了小鼠模型中巢蛋白的表达水平对效力的影响。图30a显示高巢蛋白水平与IGF-1R反义分子处理后的存活改善相关。在小鼠侧腹植入含有表达高或低巢蛋白水平的GL261细胞以及4mg反义分子的室。对照组接受单独的高巢蛋白表达细胞，但是未加入反义分子。将所述室在侧腹保留24小时。然后，使免疫应答发展数周，并且在室植入后35天，颅内激发小鼠。在激发后，监测免疫小鼠以及非免疫对照的存活。图30b显示高巢蛋白水平与更好的临床疾病得分有关。所述数据显示在治疗组中，在用完全配制的室疫苗接种后，在原位模型中，发病率得分与脑肿瘤发展有关。图30c和图30d显示抗GL261细胞抗体产量的增加与高巢蛋白表达水平有关。图30c显示在室植入后28天/颅内植入前，对使用来自实验小鼠的血清；来自采集自所述小鼠的全血的分离血清所实施的细胞ELISA测定数据测试对GL261细胞的抗体反应性。通过ELISA测定，测试血清对GL261细胞的全IgG反应性。图30d显示了使用来自实验小鼠的血清，对GL261细胞测试抗体反应性的颅内激发后35天/室移植后71天的细胞ELISA数据。
具体实施方式
定义
所有在本文中未定义的术语具有它们常见的本领域承认的含义。
除非上下文中另外明确要求，否则如本文所使用的术语如“一个”(“a”、“an”)和“所述”包括单数和复数对象。
如本文所使用的，当放在数值之前时，术语“约”表示正负10％范围内的值。例如，“约100”涵盖了90和110。
如本文所使用的，术语“自体的(自体同源的，autologous)”表示获自相同个体的细胞或组织。
如本文所使用的，术语“自体的癌细胞疫苗”是指部分通过从个体分离肿瘤细胞并离体处理这些肿瘤细胞所产生的治疗剂。然后，将所述细胞再施用于所述肿瘤细胞所分离自的个体。在实施方式中，自体癌细胞疫苗可以包含除所述肿瘤细胞之外的其它组分，如缓冲液和/或反义核酸。在实施方式中，“自体癌细胞疫苗”可以表示含有肿瘤细胞和一种或多种其它组分的生物扩散室。在某些方面，所述“自体癌细胞疫苗”可以是“完全配制的室(fully formulated chamber)”，其在本文中也称为“完全配制的生物扩散室”。
如本文所使用的，术语“完全配制的室”或者“完全配制的生物扩散室”是包括自体肿瘤细胞以及包含在肿瘤微环境(TME)中的其它细胞的生物扩散室，所述细胞在与第一量的IGF-1R AS ODN在所述室中包封之前可以处理或可以不处理。通过外源添加第二量，例如，至少2μg IGF-1R AS ODN包封细胞，然后用5Gy的γ-辐射辐照所述室。
如本文所使用的，术语“小分子”包括核酸、肽、蛋白和化学物质(如(例如)通过细胞所产生的细胞因子和生长激素)，但是不包括细胞、外来体或微泡。
如本文所使用的术语“靶向IGF-1R表达的”或“靶向IGF-1R表达”是指施用具有设计以结合至IGF-1R的序列的反义核酸。
如本文所使用的，术语“全身施用”是指在整个受试者身体实现物质递送。典型的全身施用途径包括肠胃外施用、透皮施用、腹膜内施用、静脉内施用、皮下施用和肌内施用。
其它施用途经包括口服、鼻部施用、局部施用、眼内施用、口腔(颊部)施用、舌下施用、***施用、肝内施用、心内施用、胰腺内施用、通过吸入和通过植入的泵施用。
反义分子
反义分子是按照沃森和克里克碱基配对规则通过结合至所靶向的mRNA互补序列而起作用的核酸。当在互补螺旋之间发生杂交时，通过主动和/或被动机制抑制靶标mRNA的翻译。在被动机制中，mRNA和外源核苷酸序列之间的杂交导致防止核糖体复合物读取信息的双螺旋(双链，duplex)的形成。在主动机制中，杂交促进RnaseH的结合，其破坏了RNA但保留了完整的反义分子以与另一个互补的mRNA靶标杂交。所述机制中的任一种或两者抑制蛋白翻译，从而有助于或保持了恶性表型。作为治疗剂，反义分子比常规药物的选择性显著更强，并因此更有效且毒性更低。
本文所公开的方法和组合物包括反义分子用于治疗癌症的使用。通常，所述反义分子是反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)。在一些实施方式中，所述反义分子包括修饰的磷酸酯主链。在某些方面，所述磷酸酯主链修饰使得所述反义分子更耐受核酸酶的降解。在某些实施方式中，所述修饰是锁定的反义分子(locked antisense)。在其它实施方式中，所述修饰是硫代磷酸酯键。在某些方面，所述反义分子含有一个或多个硫代磷酸酯键。在某些实施方式中，所述硫代磷酸酯键通过赋予核酸酶耐受性来使所述反义分子稳定，借此提高其半衰期。在一些实施方式中，所述反义分子可以是部分硫代磷酸酯-键连接的。例如，最高达约1％，最高达约3％，最高达约5％，最高达约10％，最高达约20％，最高达约30％，最高达约40％，最高达约50％，最高达约60％，最高达约70％，最高达约80％，最高达约90％，最高达约95％或者最高达约99％的所述反义分子可以是硫代磷酸酯-键连接的。在一些实施方式中，所述反义分子是完全硫代磷酸酯-键连接的。在其它实施方式中，硫代磷酸酯键可以与磷酸二酯键交替。在某些实施方式中，所述反义分子具有至少一个末端硫代磷酸酯单磷酸酯。
在一些实施方式中，所述反义分子包含一个或多个CpG基序。在其它实施方式中，所述反义分子不包含CpG基序。在某些方面，所述一个或多个CpG基序是甲基化的。在其它方面，所述一个或多个CpG基序是未甲基化的。在某些实施方式中，当将所述反义分子施用于受试者时，所述一个或多个未甲基化的CpG基序引起先天性免疫应答。在一些方面，通过含有未甲基化的CpG的反义分子与Toll样受体(TLR)的结合来介导先天性免疫应答。
在某些实施方式中，所述反义分子包含至少一个末端修饰或“帽”。所述帽可以是5'和/或3'-帽结构。术语“帽”或“末端-帽”包括在寡核苷酸的任一端(相对于末端核糖核苷酸)的化学修饰，并且包括5'端的最后两个核苷酸之间和3'端的最后两个核苷酸之间的键处的修饰。所述帽结构可以提高所述反义分子对核酸外切酶的耐受性，同时不会损害与靶标序列或细胞机制的分子相互作用。可以根据它们提高的体外或体内效力来选择这些修饰。所述帽可以存在于5'-末端(5'-帽)或3'-末端(3'-帽)或者可以存在于两个末端。在某些实施方式中，所述5'-和/或3'-帽独立地选自硫代磷酸酯单磷酸酯、脱碱基(abasic)残基(部分)、硫代磷酸酯键、4'-硫代核苷酸、碳环核苷酸、二硫代磷酸酯键、倒置的核苷酸(inverted nucleotide)或倒置的脱碱基部分(2'-3'或3'-3')、二硫代磷酸酯单磷酸酯和甲基膦酸酯部分。当作为帽结构的一部分时，所述硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯键通常位于5'端的两个末端核苷酸之间和3'端的两个末端核苷酸之间。
在优选的实施方式中，所述反义分子靶向***1受体(IGF-1R)的表达。IGF-1R是与胰岛素受体共有70％的同源性的酪氨酸激酶细胞表面受体。当通过其配体(IGF-I、IGF-II和胰岛素)激活时，它调控广泛的细胞功能，包括增殖、转化和细胞存活。IGF-1R不是正常生长的绝对需要，但是它对于可能在恶性组织中发生的锚定-非依赖性条件中的生长是必不可少的。在Baserga等人,Vitamins and Hormones,53:65-98(1997)中提供了对于肿瘤中IGF-1R的作用的综述，以上文献以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，所述反义分子是针对生长因子或生长因子受体，如(例如)IGF-1R的DNA或RNA的寡核苷酸。
在某些实施方式中，所述反义分子是针对IGF-1R的脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)。作为SEQ ID NO：19提供了IGF-1R的全长编码序列(参见，例如，PCT/US2016/26970，以上专利以其全部内容作为参考并入本文)。
在某些实施方式中，所述反义分子包含与IGF-1R信号序列互补的核苷酸序列，其包括RNA或DNA。IGF-1R的信号序列是30个氨基酸的序列。在其它实施方式中，所述反义分子包含与IGF-1R信号序列的部分互补的核苷酸序列，其包括RNA或DNA。在一些实施方式中，所述反义分子包含与IGF-1R的密码子1-309互补的核苷酸序列，其包括RNA或DNA。在其它实施方式中，所述反义分子包含与IGF-1R的密码子1-309的部分互补的核苷酸序列，其包括RNA或DNA。
在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN的长度为至少约5个核苷酸，至少约10个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约35个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约45个核苷酸或者至少约50个核苷酸。在一些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN的长度为约15个核苷酸至约22个核苷酸。在某些方面，所述IGF-1R AS ODN的长度为约18个核苷酸。
在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN在18℃形成二级结构，但是在约37℃不形成二级结构。在其它实施方式中，所述IGF-1R AS ODN在约18℃或在约37℃不形成二级结构。在其它实施方式中，所述IGF-1R AS ODN在任何温度都不形成二级结构。在其它实施方式中，所述IGF-1R AS ODN在37℃不形成二级结构。在具体的实施方式中，所述二级结构是发夹环结构。
在一些方面，所述IGF-1R AS ODN包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段。在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN可以与SEQ ID NO：1或其片段具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约98％或者100％的同一性。在一些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN包含一个或多个硫代磷酸酯键。
在某些方面，所述IGF-1R AS ODN由SEQ ID NO：1组成。NOBEL是具有硫代磷酸酯主链和与IGF-1R基因中密码子2-7互补的序列的18-聚体寡脱氧核苷酸。照此，NOBEL是针对IGF-1R的反义寡核苷酸(IGF-1R AS ODN)。在5'末端作为IGF-1R基因的互补序列所获得的NOBEL序列是：
5’-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3’。
由于其硫代磷酸酯主链，NOBEL具有稳定的储存寿命并且耐受核酸酶的降解。可以通过与本领域的技术人员已知的寡脱氧核苷酸的引入有关的任何标准方法提供NOBEL的施用。有利地，可以施用具有低毒性/无毒性的本文所公开的AS ODN，包括NOBEL。基于小鼠实验(尾静脉中40μg)，即使约2g/kg的水平(按比例缩放)也未显示出毒性问题。可以根据本领域的技术人员已知的常规程序生产NOBEL。
所述反义分子，例如，SEQ ID NO：1所示的NOBEL序列还可以包含如美国专利No.9,744,187中所公开的一个或多个p-乙氧基主链修饰，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。在一些实施方式中，所述反义分子的核酸主链包含至少一个p-乙氧基主链键。例如，最高达约1％，最高达约3％，最高达约5％，最高达约10％，最高达约20％，最高达约30％，最高达约40％，最高达约50％，最高达约60％，最高达约70％，最高达约80％，最高达约90％，最高达约95％或者最高达约99％的所述反义分子可以是p-乙氧基-连接的。其余的键可以是磷酸二酯键或硫代磷酸酯键或其组合。在优选的实施方式中，每个寡核苷酸中50％至80％的磷酸酯主链键是p-乙氧基主链键，其中每个寡核苷酸中20％至50％的磷酸酯主链键是磷酸二酯主链键。
在NOBEL序列的多模式作用的一些或全部中，多种IGF-1R反义序列是生物活性的。18-聚体NOBEL序列具有IGF-1R受体下调活性以及TLR激动剂活性两者，并且小鼠中的其它实验表明两种活性均为体内抗肿瘤免疫活性所必需的。尽管AS ODN分子具有抗肿瘤活性，但是互补的正义序列不具有，尽管其也具有CpG基序。
在某些实施方式中，所述反义分子的序列选自SEQ ID NO 1-14，如表1所示。在一些实施方式中，所述反义分子与SEQ ID NO 1-14中的一个或多个具有90％的序列同一性。在一些实施方式中，所述反义分子与SEQ ID NO 1-14中的一个或多个具有80％的序列同一性。在一些实施方式中，所述反义分子与SEQ ID NO 1-14中的一个或多个具有70％的序列同一性。
表1：用于IGF-1R AS ODN配制的其它下游序列
在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN包含SEQ ID NO：1-14中任一项所示的核苷酸序列或其片段。在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN可以与SEQ ID NO：1-14中的任一项或其片段具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约98％或者100％的同一性。
在一些实施方式中，所述反义分子下调细胞中IGF-1R途径下游基因的表达。在某些方面，所述下游基因是己糖激酶(Hex II)。在一些实施方式中，所述反义分子下调细胞中管家基因的表达。在一些方面，所述管家基因是L13。
在某些方面，化学合成了IGF-1R AS ODN。在某些实施方式中，通过固相有机合成生产IGF-1R AS ODN。在一些方面，使用穿流技术(flow-through technology)在配备有封闭化学柱式反应器的合成仪中进行IGF-1R AS ODN的合成。在一些实施方式中，固体载体上的每个合成循环序列包括多个步骤，所述步骤顺序进行直至获得全长IGF-1R AS ODN。在某些实施方式中，以液体形式储存IGF-1R AS ODN。在其它实施方式中，在储存之前将IGF-1RAS ODN冷冻干燥。在一些实施方式中，在使用之前将冷冻干燥的IGF-1R AS ODN溶于水。在其它实施方式中，在使用之前将冷冻干燥的IGF-1R AS ODN溶于有机溶剂。在其它实施方式中，将冷冻干燥的IGF-1R AS ODN配制成药物组合物。在一些方面，所述药物组合物是液体药物组合物。在其它方面，所述药物组合物是固体药物组合物。还在美国专利公开No.2017/0056430中描述了其它反义核酸，以上专利以其全部内容作为参考并入本文。
自体癌细胞疫苗
简介
免疫疗法目前用于靶向具有一个共同细胞抗原的血液学恶性肿瘤。不幸地，实体瘤显著更为复杂，其代表了遗传变化向具有无法鉴别个数的肿瘤-特异性靶标的恶性状态的表观遗传发展。甚至更困难的是，在WHO诊断性癌症组(diagnostic cancer group)中，肿瘤表型存在显著变化。自体细胞疫苗将涵盖所有这些变化和所有这些靶标并且代表了实体瘤癌症的理想受试者-特异性免疫疗法。然而，自体癌细胞疫苗不可以来源于原代细胞培养，因为连续传代改变了肿瘤表型，从而因此减弱了肿瘤特异性抗原系列。这还将在每次传代时需要不可能的批次放行合格批准(lot-release qualification)。本发明公开通过将新鲜切除的粉碎的肿瘤细胞涂板并将它们在24小时内作为贮存抗原(depot antigen)重新植入来消除这些问题，如图22所示。在某些方面，通过确保在所述室中存在适当数目的细胞以及本文所述的其它特定分子获得了在本文中实现的优良结果。
先前研究已通过使用抗原呈递细胞设计了自体细胞疫苗以代替自体肿瘤细胞。在本范式中，从预处理血浆白细胞去除术中收集受试者的单核细胞并使其离体分化为自体树突状细胞(DC)。然后，用引起DC激活/成熟的受试者的肿瘤粗裂解液使所述树突状细胞呈递，并且在随后的时间点，在受试者中作为DC疫苗注射目前通过肿瘤抗原交叉预激(cross-primed)的成熟的树突状细胞。然而，离体分化将失去仅在体内发生的一些关键刺激性组分。另外，来自造血前体的DC的分化需要在昂贵的设施中通过劳动密集的细胞处理进行大量体外操纵。本发明公开通过提供内源DC成熟过程和促进适当免疫应答出现的免疫调节性和免疫刺激性反义寡脱氧核苷酸(AS-ODN)而避免了这些问题。更具体地，本发明公开提供了包含来源于患者的分散的肿瘤细胞和辐照的反义分子的生物扩散室，所述生物扩散室在所述患者中植入治疗有效的时间。不受任何理论束缚，认为辐照的肿瘤细胞、反义分子和生物扩散室的组合一起作用以模拟局部免疫应答，并且通过减少或消除M2细胞来提高所述应答，从而防止免疫***的减弱。
因此，本发明公开显示包含新鲜切除的肿瘤细胞和IGF-1R AS ODN的辐照的可植入生物扩散室安全地用作用于癌症免疫疗法的有效的受试者-特异性自体细胞疫苗。照此，所主张的可植入生物扩散室在受试者中引起选择性靶向肿瘤细胞的免疫应答的应用为癌症，特别是GBM的治疗提供了新型且有意义的方法。
生物扩散室
代表性的扩散室包含具有两个末端，第一末端和第二末端的室筒。在实施方式中，所述生物扩散室是在任一侧由多孔的细胞-不透膜，如Millipore Corporation生产的Duropore膜加盖的小环。任选地，所述末端之一可以作为室体的一部分封闭，从而仅保留一端打开以使用多孔膜密封。可以由塑料、特氟隆、聚酯或者强力、柔韧且能够耐受化学处理的任何惰性材料制备所述膜。可以由任何物质制备所述室，如且不限于塑料、特氟隆、有机玻璃(lucite)、钛、胶质玻璃(树脂玻璃，Plexiglass)或者对人无毒且人良好耐受的任何惰性材料。另外，所述室应能够耐受灭菌。在一些方面，所述扩散室在使用之前用环氧乙烷灭菌。在2018年1月24日提交的美国临时专利申请No.62/621,295、美国专利No.6,541,036、PCT/US16/26970和美国专利No.5,714,170中描述了其它适合的室，以上每篇专利以其全部内容作为参考并入本文。
在某些实施方式中，所述膜允许小分子通过但不允许细胞通过(即，细胞不可以离开或进入所述室)。在一些方面，所述膜的孔径允许核酸及其它化学物质(如(例如)细胞所产生的细胞因子)从所述室扩散出，不允许细胞在所述室和植入它的受试者之间通过。在本发明公开中有用的生物扩散室包括不允许细胞在所述室和植入它的受试者之间通过的任何室，然而条件是所述室允许因子在所述室和受试者之间交换和通过。因此，在某些方面，所述孔径具有防止体积大于100μm3的材料进出所述室的截止值。在一些实施方式中，所述膜的孔的直径为约0.25μm或更小。例如，所述孔可以具有约0.1μm的直径(参见图1)。在具体的方面，所述孔直径的范围在0.1μm至0.25μm。还参见Lange等人,J.Immunol.,1994,153,205-211和Lanza等人,Transplantation,1994,57,1371-1375，以上每篇文献以其全部内容作为参考并入本文。这种孔径防止细胞进出所述室。在某些实施方式中，扩散室由14mm有机玻璃(Lucite)环和0.1μm孔径的亲水性Durapore膜(Millipore,Bedford,Mass.)构成。
在某些实施方式中，生物扩散室包含允许IGF-1R AS ODN扩散出所述室的膜。在一些实施方式中，约50％的IGF-1R AS ODN在约12小时内扩散出所述室，约60％的IGF-1R ASODN在约24小时内扩散出所述室，约80％的IGF-1R AS ODN在约48小时内扩散出所述室，和/或约100％的IGF-1R AS ODN在约50小时内扩散出所述室。
在示例性方法中，为了组装所述生物扩散室，使用胶粘剂(胶，glue)和压力以产生密封，将第一多孔膜附接至第一扩散室的一侧。类似地，将第二多孔膜附接至第二扩散室环。可以用还可提供更紧密密封的橡胶衬垫(垫圈)将所述膜固定就位。将所述扩散室环保持过夜(最短8小时)至干燥。然后，使用胶粘剂将第一扩散室环和第二扩散室环彼此附接并保持过夜(最短8小时)至干燥。在优选的实施方式中，所述第一室环和第二室环的连接过程包括使用2二氯乙烷作为溶剂以有利于所述两个环之间的粘合。参见，例如，图22显示了两个多孔膜。在替代方法中，所述室可以仅具有一边含有多孔膜。
在所述室的筒部分上，设置了一个或多个可以被封盖覆盖的开口(例如，孔口)，一旦植入所述室，则从受试者身体外部进入所述室，因此允许重新填充所述扩散室。所述开口允许对内容物多次和连续采样而不会污染并且不会损害受试者，因此显著减少了对所述受试者实施植入程序的次数。在植入到患者中之前，可以用骨蜡、由(例如)PMMA制备的孔塞或封盖密封所述一个或多个开口。所述封盖可以是螺旋型(screw-on type)自封橡胶并且配合所述开口。在一些构造中，所述扩散室可以含有两个或更多个注射开口或孔口。可以通过移除受试者身体外部的封盖并***常规针头和注射器来进入所述开口以实施所述室内容物的采样。在一些实施方式中，所述室还可以包括移除装置。这种装置有利于从患者移除所述室。
在实施方式中，所述室用作抗原贮存器(抗原储库，antigen depot)，其设计使得出于促进治疗性宿主免疫应答的目的使肿瘤抗原扩散出所述室。外源IGF-1R AS ODN和离体辐照促进促炎反应。这种制剂与临床和放射照相的改善、基于规程的延长存活有关，并且代表了我们理解为引起或提高肿瘤免疫效果的包括外源活性药物成分(API)和辐照的新型自体细胞疫苗。此外，低浓度IGF-1R AS ODN的添加对于促炎反应是至关重要的(图12)。
在某些实施方式中，本发明公开提供了用于植入患有癌症的受试者中的生物扩散室，其包括：(a)肿瘤细胞；和(b)有效量的反义分子。在其它实施方式中，提供了治疗受试者中癌症的方法，其包括：(a)获得包含肿瘤细胞和有效量的反义核酸的生物扩散室；(b)辐照所述生物扩散室和内容物；和(c)将所述辐照的生物扩散室在所述受试者中植入治疗有效的时间。
在某些实施方式中，所述IGF-1R AS ODN以约0.5μg至约10μg的范围内的量存在于所述生物扩散室中。在某些方面，所述IGF-1R AS ODN以每室约1μg至约5μg，或者每室约2μg至4μg的范围内的量存在。在具体的方面，所述IGF-1R AS ODN以每室约2μg的量存在。在具体的方面，所述IGF-1R AS ODN以每室约4μg的量存在。不受理论束缚，认为这些水平促进了受试者中提高的Th1应答，同时避免了受试者中M2免疫刺激性应答。
在某些实施方式中，在所述室中包封之前，不用IGF-1R AS ODN处理肿瘤细胞。然而，通常，在所述室中包封之前，用IGF-1R AS ODN处理肿瘤细胞。包封前处理细胞的时间可以不同。例如，可以在包封之前立即用IGF-1R AS ODN离体处理肿瘤细胞最长达约4小时，最长达约6小时，最长达约8小时，最长达约12小时或者最长达约18小时。通常，包封前可以离体处理肿瘤组织约12小时至约18小时。方便地，可以在持续长达过夜的预处理之后包封细胞。不受理论束缚，认为包封前处理在刺激肿瘤抗原产生中起到所期望的作用。
用于包封前处理的IGF-1R AS ODN的量可以在约1mg至8mg每百万细胞的范围内；例如，约2mg至约6mg每百万细胞，约3mg至约5mg每百万细胞。通常，用于包封前处理的IGF-1R AS ODN的量为约4mg每百万细胞。
在一些实施方式中，以约至少2mg/ml至至少约5mg/ml的范围的浓度使用用于肿瘤细胞离体处理的IGF-1R AS ODN。在某些方面，以至少4mg/ml的浓度使用IGF-1R AS ODN。在具体的实施方式中，以4mg/ml的浓度使用IGF-1R AS ODN。
在某些实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN和存在于所述室中的IGF-1R AS ODN是相同的。在其它实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN和存在于所述室中的IGF-1R AS ODN是不同的。在某些实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN的长度为至少约5个核苷酸，至少约10个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约35个核苷酸，至少约40个核苷酸，至少约45个核苷酸或者至少约50个核苷酸。在一些实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN的长度为约15个核苷酸至约22个核苷酸。在某些方面，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN的长度为约18个核苷酸。
在某些实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN在18℃形成二级结构，但是在约37℃不形成二级结构。在其它实施方式中，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R ASODN在约18℃或在约37℃不形成二级结构。在其它实施方式中，用于离体处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN在任何温度都不形成二级结构。在其它实施方式中，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN在37℃不形成二级结构。在具体的实施方式中，所述二级结构是发夹环结构。
在一些方面，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段。在某些实施方式中，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN可以与SEQ ID NO：1或其片段具有至少约70％，至少约75％，至少约80％，至少约85％，至少约90％，至少约95％，至少约96％，至少约98％或者100％的同一性。在某些方面，用于处理肿瘤细胞的IGF-1R AS ODN是SEQ ID NO：1。
在用AS-ODN处理肿瘤细胞一段时间之后，除去所述AS-ODN并将新鲜的AS-ODN加入至所述室，然后在植入受试者中之前对其进行辐照。在某些方面，用约1Gy，约2Gy，约4Gy，约5Gy，约6Gy，约10Gy或者最高达约15Gy的量的γ辐照处理所述生物扩散室。在某些方面，辐照剂量不超过约5Gy。在其它方面，辐照剂量为至少约5Gy。在一些方面，辐照剂量为5Gy。在某些实施方式中，可以辐照所述生物扩散室至少1次、至少2次、至少3次、至少4次或者至少5次。在一些实施方式中，在植入受试者中之前辐照所述室少于约24小时。在其它实施方式中，在植入所述受试者中之前辐照所述室约24小时。在其它实施方式中，在植入所述受试者中之前辐照所述室至少约24小时。在其它实施方式中，在植入所述受试者中之前辐照所述室不超过约48小时。在其它实施方式中，在植入所述受试者中之前辐照所述室至少约48小时。
尽管通常在植入之前杀死肿瘤细胞；例如，通过辐照杀死，但是不需要杀死所述细胞并且的确可以有利地将所述细胞维持在存活状态以促进抗原的释放。因此，在某些实施方式中，在植入之前可以不辐照所述细胞。然而，出于安全的目的，期望防止向受试者中释放活肿瘤细胞。
可以将肿瘤细胞以不同的数目置于扩散室中。在某些实施方式中，将约1×104至约5×106个肿瘤细胞置于每个扩散室中。在其它实施方式中，将约1×105至约1.5×106个肿瘤细胞置于所述扩散室中。在其它实施方式中，将约5×105至1×106个肿瘤细胞置于受试者可以使用的所述室中。我们已发现肿瘤细胞的数目可以影响受试者的抗肿瘤应答并且应选择适当的范围以提高获得所期望的结果的机会。图28显示了来自植入20个室的患者的数据并且显示了对应于免疫应答的细胞得率(细胞产量)(数百万个细胞)。在室中约750,000至约1,250,000个细胞的范围内抗肿瘤免疫应答是最优的，其峰值在约1百万个细胞/室。施用多个含有辐照的肿瘤细胞的室并且为了维持最优免疫应答，优选地将细胞数目/室维持在所述范围内。优选地，所述肿瘤细胞是完整的并且未自溶或另外受损，如本文所述的。
在某些实施方式中，可以优选地在室中维持细胞与AS ODN的比。因此，在某些方面，室可以含有约2μg AS ODN和750,000至1,250,000个细胞；例如，1,000,000个细胞。因此，细胞与AS ODN的比可以在每μg AS ODN约3.75×105个至约6.25×105个的范围内；例如，每μg约5.0×105个细胞。因此，在接受20个室的典型患者中，AS ODN的总剂量为约40μg。
通常，如本文所述，施用将在室中；然而，在某些方面，所述辐照的细胞和IGF-1RAS ODN可以共施用于所述受试者而无需共同物理地包含在所述室中或者另一种容器中。在使用该方式的某些方法中，所述辐照的细胞和IGF-1R AS ODN因此在受所述受试者生理学限制的体内分散、扩散或代谢。因此，在某些方面，例如，可以如本文所述制备所使用的肿瘤细胞以用于所述室并可以将其与IGF-1R AS ODN一起施用，但是所述施用可以不包含在物理容器内。这种施用通常是肌内施用。
对于室的肿瘤组织制备
通过手术从受试者移除用于在自体疫苗接种中使用的肿瘤细胞。在实施方式中，使用组织粉碎器从患者移除肿瘤细胞。所述提取装置优选地组合了位于固定外套管内的高速往复内套管和电子控制的可变吸力(suction)。所述外套管的直径为1.1mm、1.9mm、2.5mm或者3.0mm，并且长度为10cm、13cm或25cm。所述仪器还依赖于边口切割和位于距干燥器钝端0.6mm的吸孔。所述孔进入要除去的组织的温和送进压力和吸力的组合，将所期望的组织吸入所述侧孔，使得能够通过所述内套管的往复切割作用进行受控且精确的组织切除。重要特征是不存在旋转桨叶；这避免将非计划组织吸入所述孔中。适合装置的实例是
Figure BDA0002200964950000201
组织吸出器(NICOIndianapolis,IN)，它是可以用于通过直接、显微或内窥镜可视化的软组织去除的微创手术***。吸入所剃除的组织，将其在收集室中聚集，并收集在无菌组织捕获器(trap)中。在无菌组织捕获器中收集组织期间，从所述制备物中除去血液。优选地，所述无菌捕获器(sterile trap)在所述捕获器的底部含有收集盘以及含有提供通向所述捕获器的通道的杆。所述捕获器结构还可以含有从所述捕获器中可移除的内部勺-形结构(ladle-shaped structure)以有利于从所述捕获器中的组织去除。
优选地，所述粉碎器在切除位点或沿其轴不产生热，并且不需要超声波能以用于组织去除。因此，在具体的实施方式中，所述肿瘤组织是粉碎的肿瘤组织(即在不存在热的情况下并且任选地在不存在超声波处理的情况下通过边口切割所获得的肿瘤剃除的组织)。有利地，吸出器-提取物和粉碎的组织具有比通过其它方法除去的组织更高的存活力。据信部分由于去除期间所述肿瘤细胞对高温的限制暴露，所述提取方法维持了更高的肿瘤细胞存活力。例如，本文中所述的方法在去除期间未将肿瘤细胞暴露于高于25℃。因此，所述细胞未暴露于高于体温(即约37℃)的温度。
获自所述受试者的肿瘤组织的量可以是不同的。优选地，从所述患者获得了至少1，至少2，至少3克或者至少4克的量的湿肿瘤组织。从所述无菌组织捕获器中除去所述组织，并通过用无菌移液器吸取以打碎大组织片段来使其解聚。然后，将所述解聚的细胞悬液置于无菌组织培养板上的含有血清的培养基中，并在组织培养箱中培育。该涂板步骤用于通过贴壁富集所期望的功能性细胞，并且有助于从所述制备物中除去碎片。因此，在本文所述的治疗中使用的肿瘤细胞优选地基本由来自肿瘤组织的贴壁细胞组成或者由来自肿瘤组织的贴壁细胞组成。
在预定培育时间(例如，6、12、24或48小时)之后，从所述板除去细胞。可以通过刮擦，通过化学法(例如，EDTA)或者通过酶促处理(例如，胰蛋白酶)来除去细胞。将所述细胞置于一个或多个扩散室中。在一些实施方式中，所述细胞在2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个扩散室之间***。通常，使用20个室。在一些实施方式中，每个扩散室含有相等数目的细胞。在一些实施方式中，第一扩散室含有多于第二室的细胞。
在一些实施方式中，在置于所述室之前，对所述细胞进行分选。在一些实施方式中，在置于所述室之前，通过对一种或多种细胞标志物进行选择来富集细胞。可以(例如)使用珠或者通过本领域技术人员已知的细胞分选技术来进行选择。在一些实施方式中，将置于所述室中的细胞对一种或多种标志物进行富集。
在一些实施方式中，将所述生物扩散室植入治疗有效的时间以降低或消除所述受试者中癌症的复发。在某些方面，所述生物扩散室的植入导致所述受试者中与癌症有关的肿瘤体积的减小。在其它实施方式中，将所述生物扩散室植入治疗有效的时间以在所述受试者中引起肿瘤的消除。在一些实施方式中，所述室的植入将肿瘤的再生长抑制至少3个月、至少6个月、至少12个月、至少36个月或者无限期抑制。
可以通过以下非限制性方式将所述生物扩散室植入受试者：皮下、腹膜内和颅内。在某些实施方式中，可以将所述扩散室植入具有优良淋巴引流和/或血管供给的身体接受位点，如腹直肌鞘(rectus sheath)。在其它实施方式中，可以使用可再填充室，从而所述扩散室可以重复用于治疗并在治疗后清空。在某些方面，可以在单一受试者中使用多个扩散室，优选地，5至20个之间。
在某些实施方式中，将至少约1，至少约2，至少约3，至少约4，至少约5，至少约10，至少约15，至少约20，至少约25，至少约30，至少约35，至少约40，至少约45或者至少约50个室植入所述受试者中。在一些实施方式中，将10-20个室植入所述受试者中。优选地，将约20个室植入所述受试者中。在某些实施方式中，在每个室中平分所述肿瘤细胞。
通常，在一段时间之后除去所述室。例如，可以将所述室植入受试者中约24小时、约48小时、约72小时或者约96小时。植入约48小时与有益的治疗结局有关。因此，优选的植入时间为约48小时。在某些实施方式中，每位患者实施一次疫苗接种程序。在其它实施方式中，每位患者实施多次疫苗接种程序。在实施方式中，在单一患者中实施2次、3次、4次、5次、6次、7次或8次疫苗接种程序。在实施方式中，在给定时间段内，每7、14或28天，或者每1、3或6个月重复疫苗接种。在其它实施方式中，周期性重复疫苗接种程序直至患者没有癌症。
不受理论束缚，认为所述生物扩散室的植入导致M2细胞在植入位点处或附近的消除或减少，从而实现了对从所述室中扩散出的肿瘤抗原的免疫应答。在某些方面，M2细胞在植入位点处的消除或减少导致了抗原呈递细胞(APC)的自体肿瘤抗原对CD4T细胞的增强呈递，从而导致干扰素-γ(IFNγ)的产生和1型肿瘤免疫的诱导。在某些方面，肿瘤抗原-特异性CD4T细胞的IFNγ产生和IGF-1R AS ODN的抗M2作用驱使1型抗肿瘤免疫以及来自循环和肿瘤微环境的抗炎M2细胞的丧失，从而间接干扰肿瘤生长。在一些方面，肿瘤抗原-特异性CD4T细胞的IFNγ产生和IGF-1R AS ODN的抗M2作用引起了效应因子-介导的对肿瘤细胞和肿瘤微环境(M2细胞)的损伤并引发了更长的程序性记忆T细胞识别肿瘤抗原的过程。在某些实施方式中，抗肿瘤适应性免疫应答保持了持续的肿瘤消退。
任选地，可以对某些细胞类型富集引入所述室中的细胞。巢蛋白(细胞骨架-相关VI类中间丝(IF)蛋白)通常以其作为神经干细胞标志物的重要性而著称。我们已发现在某些脑肿瘤样品中，与良性组织相比，巢蛋白阳性细胞(巢蛋白+细胞)富集，并且这与对应于改善的治疗反应有关。因此，在某些方面，可以对受试者肿瘤进行活组织检查以评价巢蛋白表达程度，并因此，在某些方面，与良性组织相比，所述室细胞是富集的巢蛋白-阳性(“+”)细胞。不受理论束缚，认为巢蛋白提供了与适合在产生抗肿瘤免疫应答中使用的抗原有关的标志物。因此，与当从受试者中提取时作为整体的肿瘤细胞群体相比，植入所述室中的细胞可以富集巢蛋白+细胞。图30显示了当用于刺激应答的肿瘤样品对巢蛋白富集时所获得的提高的免疫应答。
全身施用
作为所述室的植入的替代方法或者补充，可以全身施用IGF-1R AS ODN。因此，在实施方式中，在用于全身施用的药物组合物中提供了IGF-1R AS ODN。除IGF-1R AS ODN之外，所述药物组合物可以包含(例如)盐水(0.9％的氯化钠)。所述组合物可以包含磷脂。在一些方面，所述磷脂在生理学pH是不带电的或者具有中性电荷。在一些方面，所述磷脂是中性磷脂。在某些方面，所述中性磷脂是磷脂酰胆碱。在某些方面，所述中性磷脂是二油酸磷脂酰胆碱(DOPC)。在一些方面，所述磷脂基本不含胆固醇。
在一些方面，所述磷脂与寡核苷酸以约5:1至约100:1的摩尔比，或者以其中可获得的任何比例存在。在多个方面，所述磷脂与寡核苷酸以约5:1、10:1、15:1、20:1、25:1、30:1、35:1、40:1、45:1、50:1、55:1、60:1、65:1、70:1、75:1、80:1、85:1、90:1、95:1或100:1的摩尔比存在。在一些方面，所述寡核苷酸与磷脂形成寡核苷酸-脂质复合物，如(例如)脂质体复合物。在一些方面，至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％的所述脂质体的直径小于5微米。在多个方面，所述组合物还包含至少一种表面活性剂，如(例如)聚山梨醇酯20。在一些方面，至少约5％的总脂质体反义药物产物由表面活性剂组成并且至少约90％的所述脂质体的直径小于5微米。在一些方面，至少约15％的总脂质体反义药物产物由表面活性剂组成并且至少约90％的所述脂质体的直径小于3微米。在一些方面，将所述寡核苷酸群体引入所述脂质体群体。
在一些方面，所述药物组合物是液体药物组合物。在其它方面，所述药物组合物是固体药物组合物。
在人受试者中所述反义分子的全身施用剂量可以为约0.025g/kg、约0.05g/kg、约0.1g/kg、约0.15g/kg或者约0.2g/kg。在某些实施方式中，所述全身施用剂量可以为0.025g/kg至0.2g/kg。在一些实施方式中，所述剂量为约0.2g/kg。在其它实施方式中，所述剂量为0.004g/kg至0.01g/kg。在其它实施方式中，所述剂量小于0.01g/kg。在其它实施方式中，所述剂量不在0.01g/kg至0.2g/kg之间。在某些方面，作为冷冻干燥粉末提供所述反义分子并在施用之前再混悬。当再混悬时，所述反义分子的浓度可以为约50mg/ml、约100mg/ml、约200mg/ml、约500mg/ml、约1000mg/ml或者那些量之间的范围。
在某些实施方式中，可以手术前全身施用AS ODN；例如，在手术之前以减少肿瘤负荷。例如，可以在手术之前最长达24小时、最长达36小时、最长达48小时或最长达72小时施用AS ODN。在具体的方面，可以在手术之前约48至约72小时施用所述药物组合物。典型地，在这些情况下，通过静脉内推注施用。
组合疗法(联合疗法)
在历史上，癌症疗法已包括用辐射，用化疗或者用两者治疗受试者。这些方法具有公认的问题。然而，有利地，本文所公开的室植入法可以作为单一疗法用于治疗患有癌症的受试者。因此，优选地，本文所公开的方法不包括化疗或放射疗法。尽管在本文中通过单一疗法方法实现了优良的效果，然而，在某些情况下，将所述室方法与其它疗法；例如，放射疗法组合可以是有益的。在某些实施方式中，所述放射疗法包括(但不限于)内源放射疗法、外束放射疗法和全身性放射性同位素放射疗法。在某些方面，所述放射疗法是外束放射疗法。在一些实施方式中，所述外束放射疗法包括(但不限于)γ幅射疗法、X射线治疗、调强放射治疗(IMRT)和影像引导放射治疗(IGRT)。在某些实施方式中，所述外束放射疗法是γ辐射疗法。可以在室植入之前或植入之后；例如，作为挽救疗法施用辐照。典型地，直至确定癌症复发才实施这些挽救治疗方法。
因此，在某些组合方法中，可以在相同受试者中单独或与辐照或化疗组合使用本文所述的室方法和全身性方法和组合物两者。在本文所述的组合方法中，将所述室植入法优选地用作一线疗法。首先使用所述室植入法是所期望的，因为其它疗法可抑制受试者的免疫***，从而降低所述室植入法的治疗益处。
任选地，在室植入之前，可以进行全身施用。这种方法可以作为预激方法(前感方法、增强方法，priming approach)用于增强受试者的免疫***。在在先疗法已导致受试者免疫***受损的情况下，所述预激方法可以是特别有利的。
当组合使用全身施用时，可以在使用自体癌细胞疫苗治疗患者之前至少2周、至少1周、至少3天或者至少1天全身施用AS ODN。在其它实施方式中，可以在使用自体癌细胞疫苗；即所述室治疗患者之后至少1天、至少3天、至少1周或者至少2周全身施用AS ODN。
任选地，可以在首次接种疫苗之后，使用本文所述的方法用室对受试者再次接种疫苗。第二或其它额外的疫苗接种可以使用在组织去除期间从受试者采集和储存的肿瘤细胞。任选地，所述第二或其它额外的疫苗接种可以使用从受试者除去的并且如本文所述处理的新鲜肿瘤组织。保留在受试者中的任何肿瘤可以表达相同抗原并因此起到提供再刺激的贮存器的作用。然而，复发的肿瘤可以发展出新抗原，并因此提供刺激抗肿瘤应答的其它选择。后续疫苗接种可以在所述第一次治疗完成之后并且肿瘤已复发或者如果受试者未对所述第一次治疗应答而进行。
使用IGF-1R AS ODN治疗的受试者
适合的受试者是患有癌症的动物；典型地，所述受试者是人。尽管脑癌，如胶质母细胞瘤特别受益于本文所公开的方法，但是所述方法一般地适用于癌症。因此，本发明公开提供了治疗癌症的方法，其包括选自下列的那些：神经胶质瘤、星形细胞瘤、肝癌、乳腺癌、头颈鳞状细胞癌、肺癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆囊癌、经典型霍奇金淋巴瘤、食道癌、子宫癌、直肠癌、甲状腺癌、黑素瘤、结肠直肠癌、***癌、卵巢癌和胰腺癌。在具体的实施方式中，所述癌症是神经胶质瘤。在某些方面，所述神经胶质瘤是复发性恶性神经胶质瘤。在一些实施方式中，所述癌症是星形细胞瘤。在某些实施方式中，作为治疗候选的受试者患有WHO II级、WHO III级或WHO IV级肿瘤。在一些方面，所述肿瘤是星形细胞瘤。在某些实施方式中，所述肿瘤选自II级星形细胞瘤、AIII(IDH1R132H突变体III级星形细胞瘤)、AIII-G(IDH1野生型III级，具有多形性胶质母细胞瘤星形细胞瘤特征)或者IV级星形细胞瘤。
IV级星形细胞瘤是最高级神经胶质瘤并且与胶质母细胞瘤(GBM)同义。GBM是成人中最常见的恶性原发性脑肿瘤，其年发病率为每100,000人中3或4人。护理疗法标准——通常，放射疗法和使用替莫唑胺的化疗的组合——效果不好，并且GBM患者结局仍较差，中值期望寿命为15-17个月。有利地，在本文中所述方法可以用于治疗新诊断的脑癌并且还可以用于治疗复发性胶质母细胞瘤；例如，在先前用护理疗法标准治疗的患者中。因此，在某些方面，所述受试者可以是新诊断的GBM受试者或者复发性GBM受试者。所述受试者优选地是先前未使用任何免疫抑制性治疗方法治疗过的受试者。在具体的方面，合格的受试者为超过18岁并且Karnofsky得分在60或更高。任选地，所述受试者未患有双侧半球疾病(bihemispheric disease)和/或未患有自身免疫病。
任选地，可以通过对受试者进行肿瘤活组织检查来鉴别作为治疗候选的受试者。在一些实施方式中，对来自所述受试者的肿瘤测定单核细胞的存在。在某些方面，所述单核细胞包括(但不限于)CD11b+、CD14+、CD15+、CD23+、CD64+、CD68+、CD163+、CD204+或者CD206+单核细胞。可以使用免疫组织化学测定肿瘤中单核细胞的存在。在某些实施方式中，作为治疗候选的受试者显示出大于约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％的受试者总外周血单核细胞(PBMC)的CD163+M2细胞。在某些方面，所述受试者显示出大于约20％的受试者总PBMC的CD163+M2细胞。
在其它实施方式中，通过受试者血清中一种或多种细胞因子的存在来鉴别作为治疗候选的受试者。这些细胞因子无限制地包括CXCL5、CXCL6和CXCL7、IL6、IL7、IL8、IL10、IL11、IFN-γ和HSP-70。
在其它实施方式中，通过受试者血清中一种或多种生长因子的存在来鉴别作为治疗候选的受试者。这些生长因子无限制地包括FGF-2、G-CSF、GM-CSF和M-CSF。
在一些实施方式中，通过测量特定细胞因子组的水平来鉴别作为通过生物扩散室治疗的候选的受试者。在一些实施方式中，与健康受试者相比，所述受试者的这些细胞因子水平升高。如本文所使用的，术语“健康受试者”是指未患有癌症或任何其它疾病并且无需使用生物扩散室治疗的受试者。
在具体的实施方式中，可以将所述细胞因子加入至所述室中以增强抗肿瘤免疫应答。例如，加入所述室中的细胞因子可以选自CCL19、CCL20、CCL21和CXCL12及其组合。
在某些实施方式中，与健康受试者相比，循环CD14+单核细胞具有升高的CD163水平。在一些方面，与健康受试者相比，循环CD14+单核细胞上的CD163水平升高至少约2倍，至少约3倍，至少约4倍，至少约5倍，至少约10倍，至少约20倍，至少约30倍，至少约40倍，至少约50倍，至少约60倍，至少约70倍，至少约80倍，至少约90倍或者至少约100倍。在具体的实施方式中，与健康受试者相比，所述循环CD14+单核细胞上的CD163水平升高约2倍。
在其它实施方式中，作为治疗候选的受试者具有使未分化的单核细胞向M2细胞极化的血清。在某些方面，受试者血清与未分化的单核细胞的培育引起了所述单核细胞上一种或多种细胞表面标志物的表达，其包括(但不限于)CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和/或CD206。在其它方面，与未与受试者血清一起培育的单核细胞相比，受试者血清与未分化的单核细胞的培育提高了所述单核细胞上一种或多种细胞表面标志物的表达。在某些方面，所述细胞表面标志物包括(但不限于)CD11b、CD14、CD15、CD23、CD64、CD68、CD163、CD204和/或CD206。在一些方面，与未与受试者血清一起培育的未分化的单核细胞相比，一种或多种表面标志物的水平升高了至少约1.3倍、至少约1.5倍、至少约1.8倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍。在具体的实施方式中，与未与受试者血清一起培育的未分化的单核细胞相比，所述一种或多种表面标志物的水平升高了约2倍。可以使用FACS测量通过受试者血清极化的单核细胞。
靶细胞
不受理论束缚，认为通过下调IGF-1R表达，AS ODN减少了受试者M2细胞和/或抑制细胞向M2细胞的极化。在一些实施方式中，与未用所述反义分子处理的细胞相比，M2细胞中的IGF-1R表达下调了至少约1％、至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者至少约95％。可以通过定量RT-PCR测量M2细胞中IGF-1R的表达。
在一些实施方式中，在接受一个剂量的所述反义分子之后，在所述受试者中M2细胞中的IGF-1R表达保持下调至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约3周、至少约4周、至少约5周或至少约6周。
在一些方面，与不表达IGF-1R的细胞相比，M2细胞中IGF-1R的表达的下调导致受试者中M2细胞的选择性减少。在某些实施方式中，与未用所述反义分子治疗的受试者相比，所述受试者中M2细胞减少了至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或者至少约95％。在其它实施方式中，消除了所述M2细胞群体。例如，在所述生物扩散室植入之后，所述M2细胞群体可以是植入所述生物扩散室之前的群体的约1％、约2％、约5％或者约10％。可以使用FACS测量受试者中的M2细胞。在某些方面，处理后消除了M2细胞；即，通过FACS不可检测。在其它方面，可以使用代用测定(proxy assay)测量M2细胞的减少；例如，可以在治疗前后从受试者获得血清以评价其使M2细胞极化的能力。在使用本文所公开的方法治疗之后，血清使M2细胞极化的能力降低了约80％至约100％，约20％至约60％或者约10％至约50％。
在一些实施方式中，靶向M2细胞中IGF-1R的表达导致M2细胞经历细胞死亡。在某些实施方式中，所述细胞死亡是坏死。在其它实施方式中，所述细胞死亡是细胞凋亡。出于本发明公开的目的，细胞凋亡的定义为程序性细胞死亡并且包括(但不限于)原发和转移性肿瘤的消退。细胞凋亡是程序性细胞死亡，它是在多种生理学和病理学过程中起关键性作用的普遍现象。相反，坏死是偶然细胞死亡，它是细胞对多种有害状况和有毒物质的应答。在其它实施方式中，靶向M2细胞中IGF-1R的表达导致M2细胞经历细胞周期阻滞。
试剂盒
完整的室的制备需要多种组分和多个步骤。在本发明公开的另一个方面，提供了含有用于实践本文所公开的方法的组分的试剂盒。在某些方面，所述试剂盒包含室体(室主体)，其可以以一个部分或以两个半部分存在。还可以包括密封所述室的物质(item)，其包括一个或多个膜、胶粘剂和溶剂(例如，乙醇(醇，alcohol)或2二氯乙烷)。任选地，所述膜可以通过声波结合至所述室以产生密封。所述试剂盒包括反义ODN。任选地，可以将所述ODN分成两个部分。第一部分用于在从受试者中手术去除之后处理细胞，并且第二部分用于当引入至受试者中时与细胞结合。其它任选的试剂盒物质(项目，item)包括用于培养细胞的培养基，和用于防止细菌在培养基中生长的抗生素。
任选地，所述试剂盒中的室可以使用附接到所述室并且适应于接纳连接材料的孔眼或其它装置彼此预连接(例如，通过缝合线)。有利地，通过预连接多个室，可以通过外科医生容易地引入和去除所期望数目的室。
实施例
实施例1
在患有复发性胶质母细胞瘤的患者中用自体肿瘤细胞和IGF-1R AS ODN进行疫苗接种
标准和研究目标
招募了12位标准疗法失败后的受试者进行治疗。每位患者满足以下标准：年龄>18岁，Karnofsky体力状况得分为60或更好，并且没有将妨碍择期手术再切除的共发病。以刺激肿瘤免疫为目标，通过在腹直肌鞘中植入10个含有辐照的自体肿瘤细胞和IGF-1R ASODN的生物扩散室24小时来治疗受试者。监测患者的安全性、临床和放射照相反应以及免疫应答。研究目标包括安全性和放射照相反应的评价以及检查免疫功能和应答的探索性目标。
表1招募患者的信息总结
Figure BDA0002200964950000291
1爱心再治疗(关怀再治疗，Compassionate retreatment)；*规程修正以包括填充磷酸盐缓冲盐水的对照室；S：手术；RT：放射疗法；TMZ：替莫唑胺化疗；Bev：贝伐单抗化疗；IDH-1：异柠檬酸脱氢酶-1；NA：不可获得；TNS：组织不足
实验规程
使用组织吸出器(NICO
Figure BDA0002200964950000292
)通过手术从患者除去肿瘤组织并将其置于无菌组织捕获器中。将无菌组织捕获器转移至指定的BSL-2机构，在此处理肿瘤组织并置于生物扩散室中。在植入之前辐照所述生物扩散室。
在除去肿瘤组织的手术之后一天，将10个辐照的生物扩散室植入受试者的腹直肌鞘。24小时之后，将它们除去。
所述生物扩散室含有在手术时除去的自体肿瘤细胞。在加入至所述生物扩散室之前，用第一量(4mg/ml)的具有序列5'-TCCTCCGGAGCCAGACTT-3'(NOBEL)的18-聚体IGF-1RAS ODN对所述细胞预处理过夜(约12-18小时)。基于显示AS ODN具有免疫调节性质的数据，将第二量(2μg)的外源NOBEL反义分子加入至所述室中(C-v)，并且随后辐照所述室。每位患者中植入10个室。还植入了含有PBS的第11对照室(C-p)。
放射性评价
在Philips 1.5T和3T MRI扫描仪以及GE 1.5T MRI扫描仪上进行连续成象评价。通过两位神经放射医生在全部12位患者中对常规解剖学MRI特征评分。还使用了动态磁敏感加权(DSC)MR灌注和15-方向弥散张量成象(DTI)的生理学MRI技术。在Nordic Ice工作站(v.2.3.14)上进行MR灌注和DTI后处理。相对于对侧正常大脑白质计算rCBV。根据DTI数据计算平均弥散系数(平均弥散性)。
免疫学评价
术前1周进行血浆白细胞去除术以用于免疫功能的基线评价。在疫苗接种之后的7、14、28、42、56天并且每个3月术后获得血液。通过离心分离血清和细胞部分并用红细胞裂解缓冲液处理细胞。通过流式细胞术定量白血球或者将其在-80℃保存在DMSO中。血清样品也储存在-80℃。使用EasyCyte 8HT(Millipore)和对人CD4、CD8、CD11b、CD14、CD16、CD20、CD45、CD56、CD80、CD83和CD 86(全部来自BD Biosciences)和CD163(R&D Systems)特异的荧光-结合的mAb进行流式细胞术。通过FlowJo软件(Tree Star Inc,Ashland,OR)进行收集后的分析。使用Luminex珠阵列(来自Millipore的人细胞因子/趋化因子I、II和III组)和HCMBMAG/MILLIPLEX Mag癌症多重测定(emdmillipore.com)定量血清细胞因子。这包括与干细胞功能有关的6个神经胶质瘤的血清标志物，其包括DKK-1、NSE、骨连接蛋白、骨膜蛋白(Periostin)、YKL-40和TWEAK。根据Greiss法(Green L.C.等人,1982,Anal Biochem 126:131-8)，测定血清硝酸盐水平。如先前所述(Verbrugge,I.等人,2012,Cancer Res,72:3163-74)，使用佛波醇12-豆蔻酸,13乙酸盐(PMA)和离子霉素进行T细胞刺激。
通过如以上所指明的Luminex试剂盒分析肿瘤细胞上清液(SN)和移植的室内容物中的细胞因子/趋化因子水平。将来自配对疫苗和对照室的膜包埋在石蜡中用于标准免疫组织病理学检查。
通过免疫组织化学对肿瘤组织切片评价GFAP(胶质原纤维酸性蛋白)、IGF-1R、CD163、CD14、VWF(血管假性血友病因子)、CD4和CD8或者使用Emoto,K.等人,2005,Histochem Cytochem 53:1311-21中所述的方法进行荧光免疫组织化学评价。使用Aperio定量计数免疫阳性细胞，或者通过有经验的神经病理学家(LCK)使用从0(无染色)至6(强弥漫性染色)的顺序量表定性地将染色强度评价为低、中和强并将染色模式描述为集中或弥散。死后尸检限于脑部检查，并且将发现结果与尸检时诊断的先前治疗或未治疗的胶质母细胞瘤的归档石蜡块相比较。如先前所述(Harshyne,LA等人,2015,Neuro Oncol 18(2):206-15；Solinas,G.等人,2010,J Immunol 185:642-52)，实施初始(naive)单核细胞的典型体外极化或者包括与招募时来源于试验受试者的血清共培育的初始单核细胞的混合实验两者。
统计分析
通过双尾非配对t检验或配对t检验，以p<0.05确定不同样品中定量测量间的统计显著性水平。通过Kaplan-Meier分析进行存活分析并通过对数秩比较建立显著性。使用JMPv.11软件(SAS,北卡罗来纳州)进行全部统计分析，包括混合判别分析。
安全性评价和临床过程
仅有一个严重不良事件(SAE)与所述规程有关(白细胞去除术之后的股静脉血栓形成)。9位患者死于肿瘤发展，而3位患者死于其它原因。进行了5次尸检。
初始诊断的中值总生存期为91.4周(图2a)，其与其它复发性神经胶质瘤免疫疗法试验相比有利。将48.2和10周的两个显著不同的规程存活组分别鉴别为长和短存活组(图2b)。排除一个离群值(患者TJ03)，我们记录了规程存活和招募时淋巴细胞减少程度之间的显著相关性(图2c)。初始诊断时和规程招募时的CBC值之间的比较表明在标准疗法之后，平均淋巴细胞计数显著降低(65％)(N＝8，p＝.012，配对t检验)。
放射照相反应
通过两位神经放射医生(K.S.T.和A.E.F.)对常规MRI特征进行评价和评级。在长存活组中，在原发肿瘤位点观察到了增强和FLAIR包膜(enhancement and FLAIRenvelope)尺寸的减小以及较缓慢的发展。在图3a和3b中显示了两个组中的解剖反应实例。生理学MRI测量增强了这些解剖学观察。在7位患者中进行了顺序DSC MR灌注，包括相对脑血容量(rCBV)反常增加同时临床改善的3位长期存活者(患者TJ03、TJ06和TJ09)；然而，这种影响是暂时的并且存在更持续的rCBV减少。连续15方向DTI数据包括2位长期存活者(患者TJ03和TJ06)，其在受影响的大脑半球中显示出表观扩散系数(ADC)值增加，从而反映了与疾病消退有关的肿瘤细胞性的丧失。我们注意到在短存活组中未观察到反常rCBV反应和ADC升高之间的强相关性(图3c和3d)。长存活组中相应的血清硝酸盐水平反映了已引起炎症反应的可能性(数据未显示)。
通过存活组对移植室v.围术期血清的检查
移植室结构完整且无活细胞。来自C-p和C-v室两者的膜的外表面覆盖了CD15+和CD163+细胞，但是C-v膜上的数量显著提高(图4a)。
对于整个研究组，室可溶性内容物的分析显示一些生长因子和细胞因子/趋化因子的显著升高强于围术期血清水平，其中多个在神经胶质瘤肿瘤微环境(TME)中有良好记录。所测试的78种细胞因子/趋化因子中的32个相对于血清显著升高，并且配对分析显示细胞因子显著升高，如下表2中所提及的。
表2：通过存活组的室的值。
Figure BDA0002200964950000331
将这些升高理解为通过包封肿瘤细胞所产生的细胞因子/趋化因子或者扩散到所述室中的通过局部先天性免疫应答所产生的因子。
存活组之间的室中因子分析显示在长存活组中VEGF、PDGF-α、IL-11、CCL5、MCP-3和MIP-1d显著室升高，而一些可溶性癌症标志物在短存活组中显著升高，包括NSE、骨连接蛋白和YKL40。混合判别分析独立鉴别了这些组的差异(图4b)。
对于两个组，室(C-v)中的骨膜蛋白和CCL2水平两者均显著低于血清或SN值，表明所述室中产生这些趋化因子的细胞的去除(图4c)
通过存活组的疫苗接种后的血清细胞因子/趋化因子和PBMC
与短存活组相比，在来自长存活组的血清中所评价的78种细胞因子/趋化因子中的24种的水平显著较高，如下表3所示。
表3：所述组的血清值
Figure BDA0002200964950000332
手术后出现血清CCL2的峰值(spike)，但是在2位患者中，在再次手术时未出现。在短存活组中，在整个术后期间，CCL2水平保持显著较高。这些术后峰值与TNF-α峰高度相关(图5和6)。
在长存活组中，实际的CD4和CD8T细胞计数以及树突状细胞(DC)计数显著更高，并且与短存活组相比，围术期CD14+16-计数显著较低。仅在长存活组中，在CD4和DC细胞之间以及在CD4和CXCL12之间存在显著相关性。在用PMA和离子霉素刺激之后，与短存活组相比，来自长存活受试者的第14天的PBMC显示出显著更高的Th-1细胞因子产生，包括IFNγ(数据未显示)。在4位受试者中的3位中观察到疫苗接种后T细胞、单核细胞和促炎趋化因子/细胞因子循环水平之间的协同变化。在总单核细胞计数和CD14+16-单核细胞水平之间注意到了最高的相关性(图5b和5d)。在长存活组中(图5)也注意到了循环T细胞和单核细胞数目之间的反比关系，在短存活组中无显著差异(图6)。免疫抑制和促炎细胞群体之间可预测的倒数(reciprocal)关系以及单核细胞-趋化因子关系表明了长存活组中更好的免疫适应度(fitness)。
石蜡切片的检查
通过尸检来自手术干预的石蜡切片可用于4个病例中的分析，从而使我们能够检查疫苗接种后的TME。我们将试验尸检与来自再次手术和未处理的GBM患者的尸检相比较(图7)。免疫染色显示在配对检验中，在疫苗接种之后，IGF-1R阳性细胞显著减少，这通过荧光免疫组织化学证实(图7a和7g)。对复发性或未处理的神经胶质瘤尸检的定性比较在两者中显示了大量的CD163TAM和IGF-1R+细胞，从而减少了作为尸检假象的任何细胞损失问题(图7g)。
在与初始手术和尸检两者的配对比较中，在复发时出现了CD163TAM峰值(图7c和7g)。患者TJ06和TJ10通过所有治疗阶段的可评价样品支持这些趋势(图7b和7d)。就TJ06来说，在第二次疫苗接种之后，CD163细胞减少并且持续至尸检。这种降低与rCBV和ADC值以及血清硝酸盐水平负相关，它们全部均在每次疫苗之后升高(参见图7f)。
通过研究与外周单核细胞的关系，在短存活组中在外周CD163+单核细胞和CD163TAM之间观察到强相关性(图7e)，但在长存活组中未观察到(图7f)。
在任一个组中，我们未观察到在疫苗接种之后在TME中T细胞群体的出现。
受试者血清与未分化的单核细胞的共培育
为了研究患者中循环CD163+单核细胞的发生，我们首先分别用典型的M1和M2细胞因子IFN-γ和IL-4使初始单核细胞极化。我们观察到仅通过M2极化使IGF-1R上调(图8a)。当与IGF-1R AS ODN培育时，M2极化的CD163+群体被选择性敲低(图8b)。
随后，我们将初始单核细胞与获自全部研究受试者的血清共培育并记录了共表达IGF-1R和PDL-1两者的CD163+细胞的出现(图8c)。当用IGF-1R AS ODN处理时，表达IGF-1R、PD-L1和CD163的细胞以平行且剂量-依赖性的方式被显著敲低(图8c)，其总结在图8d中。
讨论
修正的自体细胞/室基多形性胶质母细胞瘤(GBM)疫苗接种试验不会引起任何显著安全问题。
我们鉴别了对该疫苗范式(vaccine paradigm)具有不同应答的两个显著不同的存活组。参见图5和6。长存活组受试者通常在手术和疫苗接种后显示出肿瘤-特异性抗体同种型和通常与Th1免疫性有关的细胞因子/趋化因子(包括IgG1、IgG3、IL12、CXCL10、CXCL12、CCL7、CCL19和CCL21)水平的升高。在短存活组中未观察到这些细胞因子/趋化因子水平的升高。因此，可以在手术/疫苗接种之后评价通常与Th1免疫性有关的细胞因子/趋化因子(例如，IgG1、IgG3、IL12、CXCL10、CXCL12、CCL7、CCL19、CCL21)的水平以预测存活并通知进一步的治疗策略。使人感兴趣的是，CCL21和CXCL12与CpG佐剂一起增效并提高了疫苗接种范式中DC的迁移能力和T细胞刺激能力。另外，长存活组中所注意到的GM-CSF、IL-6、Flt-3L和SCF的升高可以提高DC增殖，并且可以有助于接种疫苗之后pDC 76％的显著升高。CD4细胞的显著升高以及CD4细胞、pDC和细胞因子CXCL12之间的相关性还表明在免疫突触期间成功诱导了通过CXCL12辅助的T细胞增殖。
在疫苗接种之前，短存活组中的患者通常经受更长的疗程，从而导致了淋巴细胞减少症。因此，当施用于具有正常淋巴细胞水平的患者，即非淋巴细胞减少患者时，疫苗接种最有效。治疗-引起的淋巴细胞减少和较低的CD4：CD8比还可以归因于替莫唑胺。(标准护理包括适形放疗并伴随替莫唑胺，然后在术后6周起始维持替莫唑胺)。更长的总生存期的结果将包括长期暴露于肿瘤抗原和导致T细胞耗竭的持续神经胶质瘤抑制信号。类似地，单核细胞/巨噬细胞具有明显缺少的反应性，其在疫苗接种之后仅具有少量波动，但是在外周CD14+16-细胞和TAM之间具有显著的相关性。TAM已相关于CCL2的产生，并且这种相关性可以反映促进肿瘤生长的闭环放大(closed loop amplification)。作为对此的支持，在短存活组中发现的血清CCL2水平的升高已与神经胶质瘤患者中的间质基因表达谱和不良预后相关联。
所述移植的室提供了包封TME的独特快照(snapshot)及其从初始免疫应答的开始。长存活组的室中细胞因子的升高总体上表明疫苗接种引起Th1应答，并且来自该组的血清含有与Th1免疫性有关的肿瘤-特异性抗体同种型。混合判别分析建立了与IFN-γ、TNF-α和IL12产生的关联性。
相反，短存活组的室的癌症标志物的升高更大，从而反映了在标准疗法之后，神经胶质瘤干细胞(GSC)-相关耐受性的出现。一个明显的例外是与配对血清值相比，所有室中骨膜蛋白的水平均显著较低。神经胶质瘤中的促肿瘤细胞群体包括TAM和GSC，前者在相同血管周微环境中支持后者(Zhou,W.,等人,2015,Nat Cell Biol 17:170-82)并且两者均代表了治疗策略靶标。GSC-分泌的骨膜蛋白所招募的M2巨噬细胞在肿瘤生长中起重要作用，并且它们的消除将具有治疗优势。含有处理的肿瘤细胞的室中骨膜蛋白水平的降低表明分泌这种因子的GSC本身是IGF-1R AS ODN的靶标。
值得注意地，尽管有预存免疫抑制(由于根据标准护理的在先治疗)，但是我们在12位患者中的4位中记录了疫苗接种之后通过促炎反应所支持的放射照相和临床改善。这些患者还在规程方面具有显著存活优势。进一步研究这种存活差异，我们注意到了长存活组中更高的免疫适应性水平。
在一些受试者中，疫苗接种之后的IGF-1R减少与更长的规程存活有关。不受任何具体理论的束缚，由于通过疫苗接种范式在这些个体中所促进的1型免疫机制，IGF-1R+细胞群体敲低是有可能的。
如我们体外所显示的，IGF-1R AS ODN使疫苗制剂中所含的CD163+细胞失活，借此消除了它们的免疫调节因子并促进了1型免疫性。此外，从所述疫苗室中扩散出的任何IGF-1R AS ODN对它所触及的M2巨噬细胞具有类似的影响。这代表了其中靶向表达多种促肿瘤配体和因子，包括PDL-1、其它免疫调节因子、血管生成因子、营养支持和肿瘤侵袭性的细胞的新型平台。
长存活患者组和短存活患者组之间的放射照相观察中的差异提供了对疫苗接种范式对更广泛的神经胶质瘤TME具有影响的概念的进一步支持。更高的rCBV值通常与肿瘤发展有关，并且在长存活组中MR灌注仅瞬时升高，这是先前未描述过的发现。ADC测量将肿瘤发展(较低的值)与我们理解为细胞损失的情况(较高的值)相区分。由于这种疫苗接种范式与IGF-1R细胞和CD163+TAM群体两者的损失有关，因此有可能的是ADC值升高是对此的反映。
总之，我们已建立了改善的组合神经胶质瘤疫苗产品的安全性谱并且记录了与临床和放射照相改善有关的免疫参数的变化。具有敲低促进肿瘤生长的特异性单核细胞群体(例如，共表达IGF-1R的CD163+细胞)的希望，该范式提供了不导致免疫损害的治疗方案。
结果总结
不存在与规程治疗有关的3级毒性，并且来自初始诊断的整体中值存活期为91.4周(图2a)。鉴别了两个规程存活组，其中值存活期为48.2(“长”)和10周(“短”)(图2b)。长存活受试者具有以下成像发现，包括理解为瞬时充血和细胞损失的大脑血容量(rCBV)瞬时升高和表观扩散系数(ADC)值持续升高。疫苗疗法导致促肿瘤CD163+M2和IGF-1R+细胞群体从肿瘤微环境(TME)中持续损失。实施体外实验以研究CD163+T细胞的来源，并且这些实验确认受试者血清通过IGF-1R和PDL-1两者上调使未成熟的单核细胞分化为CD163+细胞。与IGF-1R AS ODN的连续培育导致该M2群体的剂量-依赖性敲低，其对于所述疫苗室中用IGF-1RAS-ODN处理的包封的TME(肿瘤微环境)的免疫原性具有意义。所述疫苗范式是良好耐受的且具有良好的中值存活期。
实施例2
新诊断的胶质母细胞瘤受试者的疫苗接种
我们证明了包括作为包括植入的生物扩散室的配制组合产品的一部分递送的自体细胞疫苗的疫苗规程在标准疗法失败的患有复发性恶性神经胶质瘤的患者中的生物有效性。
实施例2描述了将疫苗施用于新诊断的神经胶质瘤患者的反应，包括将20个室植入24或48小时，和将10个室植入24或48小时。在每种情况下，将2μg NOBEL在每种情况下在辐照之前加入所述室中。当与第一次期中分析中的标准护理相比时，无进展生存期和总生存期两者显著改善(图9)。这最明显地是由于疫苗接种之后高剂量组的表现。我们首先注意到与复发时治疗的患者相比，在新诊断的患者中在疫苗接种之后显著更高的峰和平均干扰素-γ水平。在招募新诊断的神经胶质瘤患者的试验中，当测量聚集血清测量(aggregateserum measurements)时，我们注意到通过每个疫苗剂量递增，IFN-γ突出且显著升高。具有更长植入时间的更高的干扰素-γ水平与反义分子从所述生物扩散室中扩散出的速率大致相关。
图10中总结的这些数据显示自体室疫苗在新诊断的胶质母细胞瘤患者中引起抗肿瘤应答。我们还注意到提高的IFNγ水平可能代表患者对肿瘤抗原的应答，并且如果是这样的话，则它可以是抗肿瘤免疫性和结局改善的预测因子。最终，相对于复发性患者，在新诊断的GBM患者中获得的更稳健的应答显示了受试者免疫***的影响并且支持患者疫苗接种作为一线疗法。
实施例3
完全配制的室具有更大的佐剂性(佐剂作用)
所述完全配制的室包括自体肿瘤细胞和包含在植入之前用4mg/ml IGF-1R ASODN处理6小时的肿瘤微环境(TME)中的其它细胞。然后，通过外源添加至少2μg IGF-1R ASODN包封所述处理的TME，接着用5Gy的γ-辐射辐照所述室。
我们提高了所述室的个数，表示与上述研究相比，每位患者所接受的IGF-1R ASODN的剂量升高。例如，两倍的所植入的室个数导致了两倍的所植入并且能够从所述室中扩散出的反义分子的量，表示在20个室之间分开的AS ODN的剂量为约40μg。
所述反义序列，具体地其回文CpG基序以及与神经胶质瘤细胞的直接混合物有效地原位引起了抗肿瘤免疫性。值得注意地，具有相同回文CpG基序的正义序列在疫苗范式中是无效的。另外，所述反义序列必须与肿瘤接种物直接混合以观察到令人满意的应答。将抑制M2单核细胞极化的IGF-1R AS ODN的剂量比下调IGF-1R表达所必需的剂量低至少一个数量级。
在临床前动物模型中，我们评价了多种抗原制剂在疫苗接种之后在重新刺激来自已排斥植入其大脑皮层的同基因GL261神经胶质瘤细胞的C57B6小鼠的治疗性IFN-γ产生CD4T细胞中的效力。使用常规方法从这些动物的脾脏中分离CD4T细胞，并将其加入至已用多种GL261抗原制剂培育的来自首次用抗原实验的小鼠的骨髓-来源的树突状细胞。从包括自体肿瘤细胞、外源反义分子和辐照的完全配制的疫苗室的可溶性部分中回收的抗原引起了比不完全制剂显著更多的IFN-γ-产生CD4T细胞个数。
在C57BL/6小鼠侧腹植入24小时的含有不同GL261制剂的室的分析还提供了所述完全配制的室的免疫原性最强的证据。尽管IGF-1R AS ODN和辐照分别单独导致细胞因子高于PBS对照升高，但是当与IGF-1R AS ODN组合时，32种细胞因子中的16种显著高于所有其它变量，包括单独辐照。其中，至少11种细胞因子与炎症反应有关，包括IL-1β、IL-6和TNF-α，它们通常是通过辐照诱导的促炎细胞因子网络所产生的。
在我们对复发性胶质母细胞瘤患者的第二次1期人体试验中验证了对所述完全配制的室的促炎反应。我们在疫苗接种之后注意到两个完全不同的存活组并且在免疫适应性、疫苗接种之后的促炎反应和更长的存活期(未公布的观察结果)之间建立了关系。具体地，我们在长存活组中注意到在疫苗接种之后CD4:CD8之比的升高，我们将其理解为将CD4+细胞导向Th1表型的局部TLR9DC激活，其可能通过所述室中肿瘤细胞的辐照进一步增大。
实施例4
初始小鼠(首次接受实验的小鼠、空白小鼠)中的完全配制的室
在初始C57B6小鼠中，对于引起初始免疫应答，完全配制的疫苗室的植入比部分配制的室明显更有效。用1个室在小鼠侧腹接种24小时。在无内容物(PBS)、部分配制的室(单独的GL261神经胶质瘤细胞，GL261和AS ODN或者GL261和5Gy辐照)和完全配制的室(GL261、AS ODN和辐照)中，室的内容物是不同的。
如图11所示，与植入部分配制的疫苗室(即疫苗室含有肿瘤细胞，但是不含反义分子)的小鼠相比，在植入完全配制的疫苗室的小鼠中促炎细胞因子的产生量更大。
实施例5
正常样品中通过IGF-1R AS ODN的剂量-依赖性树突状细胞激活
将来自两个正常供体来源的PBMC用于评价通过NOBEL反义分子以及先前所使用的序列(DWA，NOBEL序列上游两个密码子的18-聚体，并且描述于Andrews等人(2001)“Resultsof a pilot study involving the use of an antisenseoligodeoxynucleotidedirected against the insulin-like growth factor type Ireceptor in malignant astrocytomas.”J Clin Oncol 19:2189–2200)的剂量-依赖性DC激活。
将PBMC与所述反义序列以及NOBEL反义分子的正义序列一起培育过夜，然后通过流式细胞术分析，从而对CD123+、CD68+激活的DC群体选通(gate)。如图12所示，NOBEL反义分子获得了显著不同于未刺激的对照或者NOBEL正义序列的剂量-依赖性DC激活，并且比DWA序列更有效。这些数据表明即使与其它IGF-1AS相比，NOBEL序列也是特别有效的。
实施例6
使用来源于接种疫苗小鼠的T细胞，来自完全配制的室的内容物的体外T细胞应答
我们假设考虑到所述扩散室的小孔径(100nm)，外来体是植入期间扩散通过所述室膜的肿瘤抗原的可能来源。用包含GL261神经胶质瘤细胞和IGF-1R AS ODN的侧腹注射接种的C57B6小鼠对于后续脑实质内肿瘤激发受到了完全保护。我们使用以下抗原来源，通过对于IFNγ的Elispot测定评价了对于所述完全配制室内容物的来源于这些小鼠的接种疫苗的肿瘤治疗性T细胞免疫反应性：1/来自加载了GL261细胞和辐照的IGF-1R AS ODN并且在小鼠侧腹中植入24小时的室的离心上清液；2/来自在等渗PBS培养基中，在37℃培育过夜的类似制备的室的离心上清液；3/从GL261细胞制备的外来体。将这些抗原制剂加入至来自首次用肿瘤抗原实验的小鼠的树突状细胞中，然后加入至从GL261免疫小鼠的脾脏分离的CD4T细胞中或者在加入至所述T细胞之前培育过夜以允许抗原加工和呈递。在T细胞抗原与树突状细胞24小时共培养之后，在Elispot测定中定量IFNγ-产生CD4T细胞的数目。在多个稀释度，将室内容物与GL261外来体相比较。Elispot结果显示通过抗原呈递测定，仅使用从24小时PBS培育回收的室内容物产生了稳健的IFN-γ应答。植入的室和其中所包括的树突状细胞未进行预培育的对照Elispot测定均未获得与外来体显著的差异。这些数据显示来源于TME的抗原在本质上不是外来体并且在含有肿瘤细胞和IGF-1R AS ODN的辐照的室中最大量地产生，它们在植入期间消耗，并且它们需要通过DC抗原呈递。图13中总结了结果。
实施例7
对M2单核细胞/巨噬细胞极化的双相剂量反应
为了确定NOBEL IGF-1R AS-ODN体内抑制M2极化的最优剂量，用106个GL261细胞注射C57BL/6小鼠的侧腹。20天后，对小鼠腹膜内施用单次0.75或0.075mg剂量的NOBELIGF-1R AS-ODN。然后，追踪小鼠的肿瘤发展。
NOBEL反义分子对M2体内产生的剂量滴定获得了反常双相反应。尽管剂量-选择滴定(dose-seeking titration)的任一端的剂量导致了M2单核细胞的敲低，但是中间剂量实际上刺激了M2单核细胞的产生。在US 2017/0056430中，已表明在类似的实验中，4mg的单次剂量是非常有效的。在本实验中，0.075mg的单次剂量是非常有效的，然而0.75mg的中间剂量是意外地不太有效的。(图17)。不受任何具体理论或作用机制的限制、控制或束缚，我们假设双相作用可能是NOBEL序列的免疫刺激性质的结果。
通过AS ODN抑制单核细胞极化的有效剂量显著低于根据沃森-克里克碱基配对原则下调IGF-1R翻译所必需的剂量。值得注意地，相当于0.075mg剂量/只小鼠的体外剂量对已表达IGF-1R的细胞无影响。使用人单核细胞的体外滴定实验显示与极化的M2单核细胞的表型或功能的影响相反，IGF-1R AS-ODN处理以防止极化的能力差异显著。
如图14所示，最低剂量实现了与最高剂量相同的效力，这表明了NOBEL反义分子与M2产生之间复杂的动态。基于对DC激活的单相反应，理想的室剂量将是最大DC激活的点。
实施例8
通过NOBEL抑制单核细胞极化的剂量反应曲线
我们将NOBEL反义分子滴定实施至将可能从所植入的室中局部扩散出的浓度聚集范围中的水平。
如图15所示，将来自三个正常PBMC集合的同种异体初始单核细胞在存在或不存在不同浓度的IGF-1R特异性AS-ODN(NOBEL)的情况下与获自胶质母细胞瘤患者的6种不同血清培育过夜。每个彩色点代表来自单个胶质母细胞瘤患者的血清。通过流式细胞术评价标志物，包括CD163的表达。作为用荧光结合CD163抗体染色的细胞的平均荧光指数提供CD163表达水平。
每位患者的血清导致M0单核细胞分化为M2CD163表型且IGF-1R和PDL-1两者上调。在不存在患者血清的情况下(对照)培养的M0细胞维持了极低水平的CD163，而血清中的过夜培育强烈诱导了该M2标志物的表达(未处理的)。IGF-1R特异性AS-ODN向培养基中的添加抑制了M0-M2极化，如通过CD163的表达以剂量-依赖性方式升高所指示的。我们注意到从100pg开始并且在1μg达到显著抑制水平的下降趋势。这些数据确认从所述室中扩散出的过量反义分子可以有利于先天免疫初期阶段中Th1应答的起始。
实施例9
在植入CL261神经胶质瘤细胞的小鼠中防止抗炎M2单核细胞的出现
植入GL261神经胶质瘤细胞的C57BL/6小鼠出现肿瘤，同时表达CD163的循环M2单核细胞的数目升高。我们假设神经胶质瘤细胞产生了导致单核细胞招募和向M2极化的因子。然后，这些细胞浸润肿瘤组织，其中它们的产物促进肿瘤发展。使用IGF-1R AS-ODN的全身治疗可以防止M2细胞的出现并借此抑制肿瘤形成。
在C57BL/6小鼠侧腹植入106个GL261细胞，并在20天后腹膜内或静脉内施用4mg单次剂量的NOBEL IGF-1R AS-ODN。在14天后，从所述动物获得外周血，并通过流式细胞术评价循环单核细胞的CD163表达。图18显示了表达CD163(右侧峰)的细胞个数的柱状图，其中“媒介物”标记的线表示用PBS媒介物处理的所植入的小鼠，“AS-ODN”标记的线表示用AS-ODN处理的所植入的小鼠。数据显示CD163+细胞显著减少。类似地，抑制了表达CD204或CD206的细胞的出现(数据未显示)。来自正常、非植入的小鼠的外周血不含具有高CD163、CD204或CD206水平的细胞(数据未显示)。
实施例10
在侧腹植入神经胶质瘤细胞的小鼠的全身IGF-1R AS-ODN治疗防止肿瘤发展。
在循环CD163-阳性单核细胞出现之前，在C57BL/6小鼠侧腹植入106个GL261细胞，并在20天后腹膜内或静脉内施用4mg单次剂量的NOBEL IGF-1R AS-ODN。作为对照，用PBS注射另一组C57BL/6小鼠。然后，追踪两组小鼠的肿瘤发展。如图19所示，治疗和未治疗组之间的肿瘤发病率具有显著差异(*＝p<0.05)，其中NOBEL-治疗的小鼠明显更可能保持无肿瘤。
实施例11
侧腹神经胶质瘤肿瘤生长的全身性IGF-1R AS-ODN抑制与抗肿瘤免疫无关。
Tbet是T细胞相关转录因子，并且Tbet缺陷型小鼠缺乏产生抗神经胶质瘤免疫性的能力。为了测试侧腹神经胶质瘤肿瘤生长的IGF-1R AS-ODN抑制是否与抗肿瘤免疫无关，对C57BL/6背景的Tbet缺陷型小鼠在侧腹植入106个GL261细胞，并在20天后腹膜内或静脉内施用4mg单次剂量的NOBEL IGF-1R AS-ODN。然后，追踪小鼠的肿瘤发展。
如图20所示，用PBS处理的小鼠和用NOBEL IGF-1R AS-ODN处理的小鼠之间的肿瘤发病率具有显著差异(*＝p<0.05)，尽管Tbet缺陷型小鼠不能产生治疗性抗神经胶质瘤免疫性。
实施例12
用NOBEL靶向室中的巢蛋白+干细胞
我们已显示可以通过NOBEL反义分子以剂量-依赖性方式体外敲低巢蛋白+干细胞，并且进一步在自体细胞疫苗之后，从TME中消除了这些细胞(试验14379-101，未公开的观察结果)。由于干细胞是神经胶质瘤肿瘤微环境(TME)的一部分，因此将它们选择性敲除具有明显的治疗益处。通过支持胚胎辐射状胶质细胞的形态，这些细胞可以通过它们的设计和长突起(long processes)用作支架，从而使得神经胶质瘤细胞能够在整个脑中展开。将它们与CD163TAM一起除去可以逆转这些肿瘤的侵袭性以及肿瘤生长本身。作为所述室中可靶向的细胞，来自这些细胞的抗原可以具有非常高的免疫原性和肿瘤-特异性，因为它们将是胚胎来源的。巢蛋白主要在神经祖细胞/干细胞中表达并且作为VI型中间丝位于细胞质中。还将其鉴别为神经胶质瘤干细胞的表面蛋白和生物标志物。因此，将有可能珠-选择和富集该群体，借此提高所述室的促炎滴度。参见Jin等人,“Cell surface Nestin is abiomarker for glioma stem cells,”Biochem Biophys Res Commun.2013Apr 19；433(4):496-501。
实施例13
辐照对所述室制剂的影响
在所述完全配制的室的制备期间，将自体肿瘤细胞(即新鲜切除的肿瘤组织)在无血清培养中涂板，任选地用第一量的IGF-1R AS ODN处理并且随后用离体辐照处理(图1f和1g)。在辐照之前，将第二量的IGF-1R AS ODN加入至所述室。
由于自体的疫苗接种包括在植入之前，在远离肿瘤的位点辐照所述组合产品并且我们的数据支持具有肿瘤消退的免疫应答，因此这些数据支持新型的远位效应。通常，远位效应归因于靶向肿瘤原位辐照之后的抗肿瘤免疫的激活作用，其导致在远离辐照的位点肿瘤消退。在该具体制剂中，具有CpG基序的外源反义分子向所述室的添加以及使用γ-辐射的后续处理已显示上调参与记忆T细胞的激活、增殖和存活的基因。这种制剂还防止参与Tregs的产生和免疫耐受性的诱导的基因的激活。另外，IGF-1R的下调使过表达该表面受体的细胞辐射敏化。与IGF-1R AS ODN共培育还促进了靶向肿瘤细胞(仅体内)和肿瘤-相关M2巨噬细胞的细胞凋亡。用5Gy辐照导致所有包封细胞死亡，并且导致增大从将死的肿瘤细胞释放的肿瘤抗原的呈递的被称为危险/损害-相关分子模式(或者DAMPS)的内源危险信号的释放。
实施例14
作为鉴别用于未来室制剂的促炎剂的手段的移植室
在其作为抗原贮存装置应用之后回收的所述移植的生物扩散室还用作记录在临床前小鼠模型和人体试验中证实的初始免疫应答的资源库。用适当PBS(假)室对照对室内容物的表征提供了对宿主免疫应答(高于假对照的细胞因子/趋化因子的内扩散)以及所述室内细胞的细胞因子/趋化因子/DAMPS的产生(在所述假室中不可检测)两者的理解。一系列细胞因子的一致存在提示将这些细胞因子外源添加至未来制剂。作为实例，相对于PBS室，CCL21和CXCL两者在所述疫苗室中均升高，其与CpG佐剂一同增效并且提高了疫苗接种范式中DC的迁移能力和T细胞刺激能力。参见图16和17。这些细胞因子向所述室制剂中的外源添加可以提高初始Th-1应答。
实施例15
室中细胞与IGF-1R AS ODN的最优比导致产生了更高的细胞因子值
用20个分别含有辐照的肿瘤细胞和AS NOBEL ODN(2μg)的室对患者接种疫苗48小时。在每种情况下，患者还接受了强制性Thomas Jefferson University Hospital(TJUH)标准护理(SOC)疗法。追踪患者，从而在特定时间点确定无进展生存期(P-FS)(即存活且显示癌症未发展或症状缓解的那些患者)和总生存期(OS)。图21a-c显示了特定时间点的反应。图24-27显示了患者结局并且将所治疗(“接种疫苗”)的那些患者相对于历史标准护理(“SOC”)相比较。为了确定所述室中细胞与IGF-1R AS ODN的最优比，我们在疫苗接种之后测量了患者血清中的促炎细胞因子水平并将这些细胞因子水平与从每位患者中除去的肿瘤组织的细胞个数相比较。
开始，如图21a-c所示，在患者血清中观察到了促炎细胞因子的显著剂量-依赖性升高。对于最高剂量组，IFN-γ的整体水平升高相当显著。在该组中，IL12和TNFa的水平也升高。
将每位患者第14-42天的三个细胞因子值中的每一个混合并对IFNγ、IL12和TNFa平均值作图。具有类似的4次和5次拟合度的两个多项式图显示了峰值促炎细胞因子值(图21d-f)。
图24a和24b显示了Kaplan-Meier曲线，其显示了意向处理组中作为整体的无进展生存期和总生存期。在接种疫苗的患者中，超过约35％的患者存活并且在20个月无进展。相反，小于10％的SoC-治疗的患者在20个月显示出无进展生存期。类似地，大幅改善了总生存期，其中约40％的患者存活超过25个月，然而SOC-治疗在该时间点显示出约5％的存活。图24b。
图25a和25b显示了中值年龄61.5岁并且匹配以使得两组中女性/男性数量为12/18的患者的存活数据。再次，所述数据显示在多个时间点显著改善的存活。
在试验期间，一些患者从规程中退出并且其它患者死于无关原因。图26a和26b显示了来自那些退出患者或者死于其它原因的患者的存活数据的缺失数据。再次，接种疫苗的患者的表现显著更好。某些患者不能完成标准护理。在图27a和27b中显示了排除那些患者的数据。这些数据确认当不遵循标准护理规程时，疫苗接种方法是有效的。
图28a和28b显示了细胞个数对患者反应的剂量施用影响。IFN-γ水平对应于受试者的反应。较高的IFN-γ水平与更好的患者免疫应答相关，并因此与抗肿瘤应答相关。在本文中，我们通过确定细胞的正确滴度优化了所述应答。峰值应答为在20个室之间分布的约20马克(mark)，即2000万个细胞。因此，峰值应答为约1百万个细胞/室，而通过约1500至2500万个细胞获得优良应答，其分别分布和植入到20个室；即每个室750,000个细胞至1,250,000个细胞的范围。这些数据表明了优化的疫苗接种规程的效力。
实施例16
通过使用对巢蛋白表达富集的细胞群体疫苗接种介导的提高的抗肿瘤应答
使用分离自用所述室范式免疫并且用同类系GL261细胞颅内激发的C57BL/6小鼠的神经胶质瘤-免疫T细胞离体测试通过所述室中IGF-1R-处理的神经胶质瘤细胞的抗原产生以检测抗原的存在。如下所示，使用作免疫T细胞供体的小鼠免疫：将用GL261细胞和反义分子填充的完全配制的室在侧腹中植入24小时。对于反义分子的活性，还作为对照植入了仅具有细胞但不具有反义分子的室。在整个实验期间，对小鼠放血并测试血清对GL261细胞的抗体反应性(图30c，30d)。在室植入后35天，用GL261细胞立体定位颅内激发小鼠。对于单独的小鼠组，在激发后监测存活和疾病临床症状至少40天。在图30a和30b中分别显示了存活和临床疾病得分。
使用磁珠从免疫小鼠脾脏分离CD4+T细胞。从自体的非免疫性C57BL/6小鼠的骨髓中分离用于向免疫CD4T细胞呈递抗原的初始树突状细胞(DC)。通过与在不同条件下在室中培养过夜的GL261细胞中所回收的GL261抗原培养过夜来攻击(脉冲，pulsed)DC，借此反映当将类似的室植入受试者中时，相对于抗原产生所发生的情况。所述室含有处于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的单独的GL261细胞或者GL261和3种不同剂量的反义分子。将不同剂量的反义分子加入至来自在不存在反义分子的情况下培养的G261细胞的抗原制剂以确定所述室中反义分子的含量或者反义分子的影响是否导致最优的抗原产生。如图29a所示，使用通过ELISPOT测定所定量的应答细胞的具体个数，将据信作为抗肿瘤细胞免疫性的关键手段的IFNγ的产生用于评价多个抗原制剂对T细胞激活的刺激作用。
为了刺激抗原产生，我们遵循了体外临床室范式。将约1百万个离体GL261肿瘤细胞单独或与指定的反义分子浓度一起注入所述室中并在置于PBS中的所述室中培育过夜。在随后的几天，提取室内容物并用于攻击初始树突状细胞。将未用反义分子处理过夜的室内容物加入至具有指定量的NOBEL的树突状细胞中。将树突状细胞保持未接受实验以用作对照。在用抗原攻击过夜后，收集树突状细胞并与来自免疫动物的T细胞在用细胞因子IFNγ的ELIPSPOT检测抗体涂覆的细胞培养板中培育过夜。在培育过夜之后，对所涂覆的板进行处理并显色以对于对每个抗原应答的产生IFNγ的T细胞的数目进行计数。
如图29b所示，在从含有GL261细胞加反义分子的室所回收的材料中检测到肿瘤抗原，但是即使在攻击DC时将反义分子加入至所述材料，在来自单独与细胞培养的室的材料中未检测到肿瘤抗原。这表明需要在所述室中反义分子与神经胶质瘤细胞的存在来产生免疫刺激性肿瘤抗原。
为了测试用反义分子处理过夜的影响，我们还在将所述细胞添加至所述室中之前，将细胞与4mg反义分子培育过夜。将GL261细胞在培养皿中涂板，并用4mg NOBEL每1百万个细胞处理过夜或者保持未处理。然后，收集细胞并将其以1百万个细胞和2μg NOBEL每室置于室中。然后，将所述室在PBS中培育过夜并在随后一天提取内容物。然后，用所述室内容物攻击树突状细胞，并如上所述测量IFNγ的分泌。
如图29c所示，用反义分子过夜处理GL261细胞提高了通过这些细胞所产生的抗原的量，如当用4mg反义分子过夜处理的GL261细胞攻击DC时，产生IFNγ的肿瘤-免疫T细胞的数目的增加所检测的。
为了确定表达巢蛋白的神经胶质瘤肿瘤细胞亚型是否与免疫原性提高有关，用含有在相对于较低水平的蛋白巢蛋白导致产生较高水平蛋白的条件下生长的GL261细胞、具有或不具有IMV-001(NOBEL)反义分子的室免疫小鼠。评价了对于GL261神经胶质瘤细胞的后续颅内植入的长期保护(图30a，30b)以及小鼠的GL261抗体的产生(图30c，30d)。
含有具有高巢蛋白水平的GL261细胞和反义分子的室所引起的免疫保护显著优于具有类似细胞、但无反义分子的室，或者不考虑是否包含反义分子、具有低-巢蛋白GL261的室。室中表达高巢蛋白水平的GL261细胞还在诱导小鼠中GL261-特异性抗体产生方面优于含有低巢蛋白水平的那些。然而，对于抗体产生，反义分子的包含具有最小影响。
作为参考并入
在本文中参考的所有专利和专利公开以其全部内容作为参考并入本文。
序列表
<110> 大卫·W·安德鲁斯
道格拉斯·C·霍普尔
<120> 使用反义分子治疗癌症的方法和组合物
<130> IMVX-005/02WO 327398-2026
<150> US 62/629,972
<151> 2018-02-13
<150> US 62/469,003
<151> 2017-03-09
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NOBEL硫代磷酸酯AS ODN
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 可以通过硫代磷酸酯键连接
<400> 1
tcctccggag ccagactt 18
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 2
ttctccactc gtcggcc 17
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 3
acaggccgtg tcgttgtc 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 4
gcactcgccg tcgtggat 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
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cggatatggt cgttctcc 18
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<212> DNA
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<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 6
tctcagcctc gtggttgc 18
<210> 7
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<212> DNA
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<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 7
ttgcggcctc gttcactg 18
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<212> DNA
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反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 8
aagcttcgtt gagaaact 18
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<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 9
ggacttgctc gttggaca 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 10
ggctgtctct cgtcgaag 18
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<212> DNA
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<220>
<223> IDT1220硫代磷酸酯AS ODN
<220>
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<222> (1)..(20)
<223> 可以通过硫代磷酸酯键连接
<400> 11
cagatttctc cactcgtcgg 20
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<212> DNA
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<220>
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<400> 12
ccggagccag acttcat 17
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 13
ctgctcctcc tctaggatga 20
<210> 14
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 重组***受体（IGF-1R）
反义寡脱氧核苷酸（AS-ODN）
<400> 14
ccctcctccg gagcc 15
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWA硫代磷酸酯AS ODN
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 可以通过硫代磷酸酯键连接
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ggaccctcct ccggagcc 18
<210> 16
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<212> DNA
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<220>
<223> DWA锁定的核酸AS ODN
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(6)
<223> 可以通过锁定的核酸键合连接
<220>
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<222> (6)..(13)
<223> 可以通过磷酸二酯键连接
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(18)
<223> 可以通过锁定的核酸键合连接
<400> 16
ggaccctcct ccggagcc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DWA磷酸二酯AS ODN
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(18)
<223> 可以通过磷酸二酯键连接
<400> 17
ggaccctcct ccggagcc 18
<210> 18
<211> 927
<212> RNA
<213> 智人
<400> 18
cuuuguuuuc uuuucuuccu cacagaccuu cgggcaagga ccuucacaag ggaugcagua 60
caugcucugg cugccguugc ggaugaagcc cgaggggcac uccugcaugc acucgccguc 120
guggaucaca aaccccucgg agucgcugcu cucggcgcug aggauguugg cgcagaaguc 180
acgguccaca cagcgccagc ccucaaaccu guagguguug ggcgggcagg caggcacaca 240
gacaccggca uaguaguagu ggcggcaagc uacacaggcc gugucguugu caggcgcgcu 300
gcagcugccc aggcacucgg gguggcagca cucauuguuc ucggugcacg cccgcuuccc 360
acacgugcuu gggcacauuu ucuggcagcg guuugugguc cagcagcggu aguuguacuc 420
auuguugaug guggucuucu cacacaucgg cuucuccucc auggucccug gacacagguc 480
cccacauucc uuugggggcu uauuccccac aauguaguua uuggacaccg cauccaggau 540
cagggaccag uccacagugg agagguaaca gaggucagca uuuuucacaa uccugauggc 600
cccccgagua auguuccuca gguuguaaag cccaauaucc uugagauugg ucaucucgaa 660
gaugaccagg gcguaguugu agaagaguuu ccagccgcgg augaccguga gguuggggaa 720
gaggucuccg aggcucucga ggccagccac ucggaacagc agcaaguacu cgguaaugac 780
cgugagcuug gggaagcggu agcugcggua guccucggcc uuggagauga gcaggaugug 840
gagguagccc ucgaucaccg ugcaguucuc caggcgcuuc agcugcugau agucguugcg 900
gaugucgaug ccuggcccgc agauuuc 927
<210> 19
<211> 4104
<212> DNA
<213> 智人
<400> 19
atgaagtctg gctccggagg agggtccccg acctcgctgt gggggctcct gtttctctcc 60
gccgcgctct cgctctggcc gacgagtgga gaaatctgcg ggccaggcat cgacatccgc 120
aacgactatc agcagctgaa gcgcctggag aactgcacgg tgatcgaggg ctacctccac 180
atcctgctca tctccaaggc cgaggactac cgcagctacc gcttccccaa gctcacggtc 240
attaccgagt acttgctgct gttccgagtg gctggcctcg agagcctcgg agacctcttc 300
cccaacctca cggtcatccg cggctggaaa ctcttctaca actacgccct ggtcatcttc 360
gagatgacca atctcaagga tattgggctt tacaacctga ggaacattac tcggggggcc 420
atcaggattg agaaaaatgc tgacctctgt tacctctcca ctgtggactg gtccctgatc 480
ctggatgcgg tgtccaataa ctacattgtg gggaataagc ccccaaagga atgtggggac 540
ctgtgtccag ggaccatgga ggagaagccg atgtgtgaga agaccaccat caacaatgag 600
tacaactacc gctgctggac cacaaaccgc tgccagaaaa tgtgcccaag cacgtgtggg 660
aagcgggcgt gcaccgagaa caatgagtgc tgccaccccg agtgcctggg cagctgcagc 720
gcgcctgaca acgacacggc ctgtgtagct tgccgccact actactatgc cggtgtctgt 780
gtgcctgcct gcccgcccaa cacctacagg tttgagggct ggcgctgtgt ggaccgtgac 840
ttctgcgcca acatcctcag cgccgagagc agcgactccg aggggtttgt gatccacgac 900
ggcgagtgca tgcaggagtg cccctcgggc ttcatccgca acggcagcca gagcatgtac 960
tgcatccctt gtgaaggtcc ttgcccgaag gtctgtgagg aagaaaagaa aacaaagacc 1020
attgattctg ttacttctgc tcagatgctc caaggatgca ccatcttcaa gggcaatttg 1080
ctcattaaca tccgacgggg gaataacatt gcttcagagc tggagaactt catggggctc 1140
atcgaggtgg tgacgggcta cgtgaagatc cgccattctc atgccttggt ctccttgtcc 1200
ttcctaaaaa accttcgcct catcctagga gaggagcagc tagaagggaa ttactccttc 1260
tacgtcctcg acaaccagaa cttgcagcaa ctgtgggact gggaccaccg caacctgacc 1320
atcaaagcag ggaaaatgta ctttgctttc aatcccaaat tatgtgtttc cgaaatttac 1380
cgcatggagg aagtgacggg gactaaaggg cgccaaagca aaggggacat aaacaccagg 1440
aacaacgggg agagagcctc ctgtgaaagt gacgtcctgc atttcacctc caccaccacg 1500
tcgaagaatc gcatcatcat aacctggcac cggtaccggc cccctgacta cagggatctc 1560
atcagcttca ccgtttacta caaggaagca ccctttaaga atgtcacaga gtatgatggg 1620
caggatgcct gcggctccaa cagctggaac atggtggacg tggacctccc gcccaacaag 1680
gacgtggagc ccggcatctt actacatggg ctgaagccct ggactcagta cgccgtttac 1740
gtcaaggctg tgaccctcac catggtggag aacgaccata tccgtggggc caagagtgag 1800
atcttgtaca ttcgcaccaa tgcttcagtt ccttccattc ccttggacgt tctttcagca 1860
tcgaactcct cttctcagtt aatcgtgaag tggaaccctc cctctctgcc caacggcaac 1920
ctgagttact acattgtgcg ctggcagcgg cagcctcagg acggctacct ttaccggcac 1980
aattactgct ccaaagacaa aatccccatc aggaagtatg ccgacggcac catcgacatt 2040
gaggaggtca cagagaaccc caagactgag gtgtgtggtg gggagaaagg gccttgctgc 2100
gcctgcccca aaactgaagc cgagaagcag gccgagaagg aggaggctga ataccgcaaa 2160
gtctttgaga atttcctgca caactccatc ttcgtgccca gacctgaaag gaagcggaga 2220
gatgtcatgc aagtggccaa caccaccatg tccagccgaa gcaggaacac cacggccgca 2280
gacacctaca acatcaccga cccggaagag ctggagacag agtacccttt ctttgagagc 2340
agagtggata acaaggagag aactgtcatt tctaaccttc ggcctttcac attgtaccgc 2400
atcgatatcc acagctgcaa ccacgaggct gagaagctgg gctgcagcgc ctccaacttc 2460
gtctttgcaa ggactatgcc cgcagaagga gcagatgaca ttcctgggcc agtgacctgg 2520
gagccaaggc ctgaaaactc catcttttta aagtggccgg aacctgagaa tcccaatgga 2580
ttgattctaa tgtatgaaat aaaatacgga tcacaagttg aggatcagcg agaatgtgtg 2640
tccagacagg aatacaggaa gtatggaggg gccaagctaa accggctaaa cccggggaac 2700
tacacagccc ggattcaggc cacatctctc tctgggaatg ggtcgtggac agatcctgtg 2760
ttcttctatg tccaggccaa aacaggatat gaaaacttca tccatctgat catcgctctg 2820
cccgtcgctg tcctgttgat cgtgggaggg ttggtgatta tgctgtacgt cttccataga 2880
aagagaaata acagcaggct ggggaatgga gtgctgtatg cctctgtgaa cccggagtac 2940
ttcagcgctg ctgatgtgta cgttcctgat gagtgggagg tggctcggga gaagatcacc 3000
atgagccggg aacttgggca ggggtcgttt gggatggtct atgaaggagt tgccaagggt 3060
gtggtgaaag atgaacctga aaccagagtg gccattaaaa cagtgaacga ggccgcaagc 3120
atgcgtgaga ggattgagtt tctcaacgaa gcttctgtga tgaaggagtt caattgtcac 3180
catgtggtgc gattgctggg tgtggtgtcc caaggccagc caacactggt catcatggaa 3240
ctgatgacac ggggcgatct caaaagttat ctccggtctc tgaggccaga aatggagaat 3300
aatccagtcc tagcacctcc aagcctgagc aagatgattc agatggccgg agagattgca 3360
gacggcatgg catacctcaa cgccaataag ttcgtccaca gagaccttgc tgcccggaat 3420
tgcatggtag ccgaagattt cacagtcaaa atcggagatt ttggtatgac gcgagatatc 3480
tatgagacag actattaccg gaaaggaggg aaagggctgc tgcccgtgcg ctggatgtct 3540
cctgagtccc tcaaggatgg agtcttcacc acttactcgg acgtctggtc cttcggggtc 3600
gtcctctggg agatcgccac actggccgag cagccctacc agggcttgtc caacgagcaa 3660
gtccttcgct tcgtcatgga gggcggcctt ctggacaagc cagacaactg tcctgacatg 3720
ctgtttgaac tgatgcgcat gtgctggcag tataacccca agatgaggcc ttccttcctg 3780
gagatcatca gcagcatcaa agaggagatg gagcctggct tccgggaggt ctccttctac 3840
tacagcgagg agaacaagct gcccgagccg gaggagctgg acctggagcc agagaacatg 3900
gagagcgtcc ccctggaccc ctcggcctcc tcgtcctccc tgccactgcc cgacagacac 3960
tcaggacaca aggccgagaa cggccccggc cctggggtgc tggtcctccg cgccagcttc 4020
gacgagagac agccttacgc ccacatgaac gggggccgca agaacgagcg ggccttgccg 4080
ctgccccagt cttcgacctg ctga 4104

Claims (51)

1.一种制备用于植入患有癌症的受试者中的生物扩散室的方法，所述方法包括：
(a)将获自所述受试者的肿瘤细胞在存在IGF-1R AS ODN的情况下包封到所述生物扩散室中，其中所述室中肿瘤细胞与IGF-1RAS ODN的比在约3.75×105：1μg至约6.25×105：1μg的范围内；
其中使用组织粉碎器从所述受试者获得所述肿瘤细胞，和
(b)辐照所述生物扩散室。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述肿瘤细胞包封到所述室中之前，使所述肿瘤细胞分散。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在从所述受试者中除去期间，所述细胞未暴露于高于体温的温度。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在从所述受试者中除去期间，所述细胞未暴露于高于37℃的温度。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述组织粉碎器包括无菌捕获器。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述组织粉碎器包括位于固定外套管内的高速往复内套管。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述外套管包含侧孔，并且进一步其中，通过电子控制的可变吸力将所述肿瘤细胞吸入所述侧孔中。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中在将所述肿瘤细胞置于所述生物扩散室中之前，对于巢蛋白表达富集所述肿瘤细胞。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中与获自所述受试者的肿瘤细胞相比，对于贴壁细胞富集所述室中的所述肿瘤细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述肿瘤细胞基本由贴壁细胞组成。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中在包封到所述室中之前，用IGF-1RAS ODN处理所述细胞。
12.根据权利要求11所述的方法，其中在包封之前的处理期间，所述IGF-1R AS ODN以约2mg至约6mg每百万细胞存在。
13.根据权利要求12所述的方法，其中在包封之前的处理期间，所述IGF-1R AS ODN以约4mg每百万细胞存在。
14.根据权利要求11所述的方法，其中在包封之前使用IGF-1R AS ODN处理最长达约18小时。
15.根据权利要求11所述的方法，其中在包封之前使用IGF-1R AS ODN处理约12小时至约18小时。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述IGF-1R AS ODN具有SEQ IDNO：1所示的序列。
17.根据权利要求1所述的室，其中所述室中的所述IGF-1R AS ODN以约2μg存在。
18.根据权利要求1所述的方法，其中辐照的肿瘤细胞以约750,000至约1,250,000个每室的范围存在。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述辐照的肿瘤细胞以约1,000,000个每室存在。
20.一种治疗患有癌症的受试者的方法，包括将两个或更多个根据权利要求1所述的生物扩散室植入所述受试者中。
21.根据权利要求20所述的方法，其中将约10至约30个生物扩散室植入所述受试者中。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将约10至约20个生物扩散室植入所述受试者中。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中将所述扩散室在所述受试者中植入约48小时。
24.根据权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述癌症是脑癌。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述脑癌选自II级星形细胞瘤、AIII级星形细胞瘤、AIII-G级星形细胞瘤和IV级星形细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述脑癌是IV级星形细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)。
27.根据权利要求20-26中任一项所述的方法，其中在不进行化疗、不进行放射疗法或者不进行两者的情况下实施所述方法。
28.根据权利要求20所述的方法，其包括在第一次植入后第二次植入室。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二次植入使用与获自第一次施用的那些细胞同时获自所述受试者的肿瘤细胞。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述第二次植入使用在完成第一次处理并且所述肿瘤复发或对第一次处理不起反应之后获自所述受试者的肿瘤细胞。
31.一种对患有脑癌的受试者接种疫苗的方法，包括：
(i)从所述受试者获得粉碎的肿瘤组织；
(ii)在无菌捕获器中收集粉碎的组织；
(iii)从所述粉碎的组织收获贴壁细胞；
(iv)将收获的细胞与具有SEQ ID NO：1所示的序列的***受体-1反义寡脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)一起包封在生物扩散室中；其中所述室含有约750,000至约1,250,000个肿瘤细胞；
(v)辐照所述室，和
(vi)在所述受试者中植入所述室，
其中获得对所述脑癌的免疫应答。
32.根据权利要求31所述的方法，其包括在包封之前使用IGF-1R ASODN处理所述贴壁细胞最长达18小时的步骤。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中对所述受试者接种20个室约48小时。
34.根据权利要求31-33中任一项所述的方法，其中所述室中肿瘤细胞与AS ODN的比在约3.75×105个细胞：1μg AS ODN至约6.25×105个细胞：1μg AS ODN的范围内。
35.根据权利要求31-34中任一项所述的方法，其中所述IGF-1R ASODN以约1μg至约5μg存在。
36.根据权利要求31-35中任一项所述的方法，其中所述IGF-1R ASODN以约2μg存在。
37.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述肿瘤细胞未暴露于高于体温的温度。
38.根据权利要求31-36中任一项所述的方法，其中约106个肿瘤细胞存在于所述室中。
39.根据权利要求31所述的方法，其中所述脑癌选自II级星形细胞瘤、AIII级星形细胞瘤、AIII-G级星形细胞瘤和IV级星形细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述脑癌是IV级星形细胞瘤(多形性胶质母细胞瘤)。
41.一种用于植入到患有脑癌的受试者中的生物扩散室，所述生物扩散室包括：
(a)辐照的肿瘤细胞，
其中所述肿瘤细胞包括获自所述受试者的肿瘤组织的贴壁细胞；
其中，在包封在所述室中之前，将所述肿瘤细胞与***受体-1反义寡脱氧核苷酸(IGF-1R AS ODN)预培育；和
(b)辐照的IGF-1R AS ODN，其中所述IGF-1R AS ODN具有SEQ ID NO：1所示的序列；
其中，所述室中肿瘤细胞与IGF-1R AS ODN的比在约3.75×105个细胞：1μg AS ODN至约6.25×105个细胞：1μg AS ODN的范围内。
42.根据权利要求41所述的生物扩散室，其中所述IGF-1R AS ODN以约1至约5μg存在。
43.根据权利要求41所述的生物扩散室，其中所述IGF-1R AS ODN以约2μg存在。
44.根据权利要求41-43中任一项所述的生物扩散室，其中与获自所述受试者的肿瘤组织相比，所述室中的所述肿瘤细胞富含巢蛋白-阳性细胞。
45.根据权利要求41-44中任一项所述的生物扩散室，其中约106个肿瘤细胞存在于所述室中。
46.根据权利要求41-45中任一项所述的生物扩散室，其中使用组织粉碎器从所述受试者获得所述肿瘤细胞。
47.根据权利要求46所述的生物扩散室，其中所述组织粉碎器包括位于固定外套管内的高速往复内套管。
48.根据权利要求47所述的生物扩散室，其中所述外套管包含侧孔，并且进一步其中，通过电子控制的可变吸力将所述肿瘤细胞吸入所述侧孔中。
49.根据权利要求46所述的生物扩散室，其中当从所述受试者获得所述肿瘤组织时，所述组织粉碎器不产生热。
50.根据权利要求41-48中任一项所述的生物扩散室，其中所述肿瘤细胞以约750,000至约1,250,000个的范围存在于所述室中。
51.根据权利要求41-49中任一项所述的生物扩散室，其中所述室中肿瘤细胞与AS ODN的比为约5.0×105个细胞：1μg。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112204140A (zh) * 2018-01-24 2021-01-08 托马斯杰弗逊大学 生物扩散室

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10206942B2 (en) 2015-04-10 2019-02-19 Thomas Jefferson University Methods and compositions for treating cancers and enhancing therapeutic immunity by selectively reducing immunomodulatory M2 monocytes
KR20190053905A (ko) 2016-09-16 2019-05-20 바이오-패쓰 홀딩스 인크. 리포솜 안티센스 올리고뉴클레오타이드와의 병용 요법
SG11201908054XA (en) 2017-03-09 2019-09-27 Univ Jefferson Methods and compositions for treating cancers using antisense
WO2020069087A1 (en) * 2018-09-26 2020-04-02 Thomas Jefferson University Neoantigen compositions; and methods of preparation and use thereof
AU2019374061A1 (en) * 2018-11-02 2021-06-03 Thomas Jefferson University Methods and compositions for treating hepatocellular carcinoma using antisense
MX2021005168A (es) * 2018-11-02 2021-08-24 Univ Jefferson Metodos y composiciones para el tratamiento de cancer de mama usando antisentido.
WO2020198587A1 (en) * 2019-03-28 2020-10-01 Thomas Jefferson University Methods for treating cancers using antisense
WO2024077130A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-11 Thomas Jefferson University Methods and compositions for treating bladder cancer

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541036B1 (en) * 1997-05-29 2003-04-01 Thomas Jefferson University Treatment of tumors with oligonucleotides directed to insulin-like growth factor-I receptors (IGF-IR)
US20150320409A1 (en) * 2014-05-07 2015-11-12 Boehringer Laboratories Inc. Entrapment and containment system for use with a morcellator and method of entrapping and containing material produced during morcellation procedure
US20170056065A1 (en) * 2015-04-23 2017-03-02 Applied Medical Resources Corporation Systems and methods for tissue removal
US20170056430A1 (en) * 2015-04-10 2017-03-02 Thomas Jefferson University Methods and Compositions for Treating Cancers and Enhancing Therapeutic Immunity by Selectively Reducing Immunomodulatory M2 Monocytes

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0750516A4 (en) 1993-03-26 1998-07-01 Univ Jefferson METHOD FOR INHIBITING CELL PROLIFERATION AND TRIGGERING CELL DIFFERENTIATION USING TYPE 1 GROWTH FACTOR RECEPTOR OLIGONUCLEOTIDES
US6340674B1 (en) 1993-03-26 2002-01-22 Thomas Jefferson University Method of inhibiting the proliferation and causing the differentiation of cells with IGF-1 receptor antisense oligonucleotides
US5714170A (en) 1994-11-16 1998-02-03 Thomas Jefferson University Method of inducing resistance to tumor growth
CA2339858A1 (en) * 1998-08-13 2000-02-24 Thomas Jefferson University Treatment of tumors with oligonucleotides directed to insulin-like growth factor-i receptor
US6144553A (en) 1998-09-09 2000-11-07 Sun Microsystems, Inc. Refrigeration cooled disk storage assembly
US7037335B2 (en) 2002-11-19 2006-05-02 Eagle Vision, Inc. Bulbous scleral implants for the treatment of eye disorders such as presbyopia and glaucoma
US7468356B2 (en) 2003-02-11 2008-12-23 Antisense Therapeutics Ltd. Modulation of insulin like growth factor I receptor expression
US7846906B2 (en) 2003-02-28 2010-12-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of growth hormone receptor expression and insulin-like growth factor expression
US20050043233A1 (en) 2003-04-29 2005-02-24 Boehringer Ingelheim International Gmbh Combinations for the treatment of diseases involving cell proliferation, migration or apoptosis of myeloma cells or angiogenesis
CA2447400A1 (en) * 2003-09-12 2005-03-12 The Hospital For Sick Children Brain tumor stem cells
US7361168B2 (en) 2004-04-21 2008-04-22 Acclarent, Inc. Implantable device and methods for delivering drugs and other substances to treat sinusitis and other disorders
US20130210893A1 (en) * 2010-10-27 2013-08-15 Curna, Inc. Treatment of interferon-related developmental regulator 1 (ifrd1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to ifrd1
CN110101485B (zh) 2013-09-24 2021-07-06 吉纳生命科学公司 用于细胞植入物的气体处理的***
SG10202104058XA (en) 2015-10-14 2021-05-28 Bio Path Holdings Inc P-ethoxy nucleic acids for liposomal formulation
SG11201908054XA (en) 2017-03-09 2019-09-27 Univ Jefferson Methods and compositions for treating cancers using antisense
US20210052875A1 (en) 2018-01-24 2021-02-25 Thomas Jefferson University Biodiffusion chamber

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6541036B1 (en) * 1997-05-29 2003-04-01 Thomas Jefferson University Treatment of tumors with oligonucleotides directed to insulin-like growth factor-I receptors (IGF-IR)
US20150320409A1 (en) * 2014-05-07 2015-11-12 Boehringer Laboratories Inc. Entrapment and containment system for use with a morcellator and method of entrapping and containing material produced during morcellation procedure
US20170056430A1 (en) * 2015-04-10 2017-03-02 Thomas Jefferson University Methods and Compositions for Treating Cancers and Enhancing Therapeutic Immunity by Selectively Reducing Immunomodulatory M2 Monocytes
US20170056065A1 (en) * 2015-04-23 2017-03-02 Applied Medical Resources Corporation Systems and methods for tissue removal

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDREWS MD ET AL.: "Phase 1 Trial of Vaccination with Autologous Tumor Cells and Antisense Directed Against the Insulin Growth Factor Type 1 Receptor (IGF-1RAS ODN) in Patients with Recurrent Glioblastoma", 《JHN JOURNAL》, 31 January 2018 (2018-01-31), pages 7 - 13 *
D W ANDREWS ET AL.: "Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotide directed against the insulin-like growth factor type I receptor in malignant astrocytomas", 《J CLIN ONCOL.》 *
D W ANDREWS ET AL.: "Results of a pilot study involving the use of an antisense oligodeoxynucleotide directed against the insulin-like growth factor type I receptor in malignant astrocytomas", 《J CLIN ONCOL.》, 15 April 2001 (2001-04-15), pages 2189 - 2200, XP055501062, DOI: 10.1200/JCO.2001.19.8.2189 *
LARRY A HARSHYNE ET AL.: "Glioblastoma exosomes and IGF-1R/AS-ODN are immunogenic stimuli in a translational research immunotherapy paradigm", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER.》 *
LARRY A HARSHYNE ET AL.: "Glioblastoma exosomes and IGF-1R/AS-ODN are immunogenic stimuli in a translational research immunotherapy paradigm", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER.》, 14 November 2014 (2014-11-14), pages 299 - 309, XP035456949, DOI: 10.1007/s00262-014-1622-z *
MÉLANIE MORIN-BRUREAU ET AL.: "Enhancement of glioma-specific immunity in mice by "NOBEL", an insulin-like growth factor 1 receptor antisense oligodeoxynucleotide", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER.》 *
MÉLANIE MORIN-BRUREAU ET AL.: "Enhancement of glioma-specific immunity in mice by "NOBEL", an insulin-like growth factor 1 receptor antisense oligodeoxynucleotide", 《CANCER IMMUNOL IMMUNOTHER.》, 30 April 2015 (2015-04-30), pages 447 - 457, XP055614295, DOI: 10.1007/s00262-015-1654-z *
周良辅: "《胶质瘤毛颖2016观点》", 科学技术文献出版社, pages: 204 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112204140A (zh) * 2018-01-24 2021-01-08 托马斯杰弗逊大学 生物扩散室

Also Published As

Publication number Publication date
US20190365794A1 (en) 2019-12-05
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US20180201939A1 (en) 2018-07-19
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