CN110824162A - 一种四环素类抗生素六联检测卡 - Google Patents
一种四环素类抗生素六联检测卡 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种四环素类抗生素六联检测卡，包括平板和位于平板的上表面的胶体金试纸条组，胶体金试纸条组包括第一至第六胶体金试纸条，通过将待测样品溶液滴加至样品垫上进行6种四环素类抗生素的检测。本发明提出的四环素类抗生素六联检测卡能够同时检测6种常见的四环素类抗生素，特异性强，灵敏度高，检出限低，不仅可以应用在动物组织上，也可以对禽蛋类进行检测。
Description
技术领域
本发明涉及抗生素检测领域，具体涉及一种四环素类抗生素六联检测卡。
背景技术
四环素类(tetracyclines,TCs)抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金霉素、土 霉素、四环素及半合成衍生物甲烯土霉素、强力霉素、二甲胺基四环素(米诺环素)等，其 结构均含并四苯基本骨架。四环素类抗生素能够抑制细菌蛋白质的合成，因此被广泛应用于 细菌感染疾病的治疗。在实际工作中，由于随意加大使用剂量和不遵守休药期，造成四环素 类药物在动物源性组织中的残留。四环素类药物长期残留在动物组织中，间接导致耐药性在 人类之间传播，严重损害人体健康。
目前在动物性食品中四环素类药物的常用的分析检测方法包括色谱法，微生物法和酶联 免疫法。但是这些方法主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、分析时间长和不能现 场操作等缺陷，所以应用受到限制。近年来，胶体金层析技术由于简便快捷，特异性强，灵 敏度高，可肉眼判断，无需特殊仪器设备等优点，在分析检测领域得到广泛关注。胶体金试 纸条一般包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品垫；硝酸纤维素膜粘结在底板 的中部，其一端粘贴有结合垫，另一端粘贴有吸水纸，结合垫上粘贴有样品垫；硝酸纤维素 膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线、测试线；样品垫上滴加待测液体后会向另一端渗透， 通过抗原抗体结合，并利用胶体金呈现颜色反应实现检测的目的。
目前，利用胶体金试纸检测四环素类抗生素的研究不多，能够同时检测6种四环类抗生素 的胶体金层析技术也未出现过，因此，提供一种胶体金层析技术同时检测6种四环类抗生素十 分具有意义。
发明内容
本发明提供了一种四环素类抗生素六联检测卡，所述检测卡包括平板和胶体金试纸条组， 所述胶体金试纸条组位于平板的上表面，所述胶体金试纸条组包括第一胶体金试纸条、第二 胶体金试纸条、第三胶体金试纸条、第四胶体金试纸条、第五胶体金试纸条和第六胶体金试 纸条；
所述第一胶体金试纸条的测试线处喷洒有金霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠金 霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的金霉素抗体；所述第二胶体金试纸条的测试线处喷 洒有土霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠土霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的 土霉素抗体；所述第三胶体金试纸条的测试线处喷洒有四环素-BSA全抗原，控制线处喷洒有 羊抗鼠四环素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的四环素抗体；所述第四胶体金试纸条的测 试线处喷洒有甲烯土霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠甲烯土霉素二抗，结合垫上固 定有胶体金标记的甲烯土霉素抗体；所述第五胶体金试纸条的测试线处喷洒有强力霉素-BSA 全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠强力霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的强力霉素抗体； 所述第六胶体金试纸条的测试线处喷洒有米诺环素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠米诺 环素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的米诺环素抗体。
主要通过抗生素与检测线上包被的抗原竞争结合吸附在结合垫上的胶体金标记的抗体的 原理进行检测。当抗生素阳性样本滴加到样品垫后，先与结合垫上的胶体金标记的抗生素抗 体特异性结合形成胶体金-抗生素抗体-抗生素，再通过检测线，检测线上附着的抗原可竞争 结合抗体表面有限的抗原位点。样品中抗生素越多，结合的胶体金标记抗体越多，导致检测 线上的抗原无法结合到胶体金标记抗生素抗体。当检测线上的胶体金标记抗生素抗体少到一 定程度时，此时检测线呈淡色或无色。剩余的胶体金标记抗生素抗体继续层析，由于控制线 上的羊抗鼠抗生素二抗与抗生素不存在竞争位点关系，当胶体金-抗生素抗体-抗生素到达控 制线时，与质控线上包被的羊抗鼠抗生素二抗特异性结合，控制线显色。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的胶体金的粒径为10～15nm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品 垫的长度均为17～19mm，结合垫的长度为8～10mm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品 垫的长度均为18mm，结合垫的长度为9mm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜、样品 垫和结合垫之间的重叠部分的总长度为1.5～2mm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的控制线和测试线之间的距离为 9～11mm。
优选地，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的控制线和测试线之间的距离为 10mm。
有益效果：本发明提出的四环素类抗生素六联检测卡能够同时检测6种常见的四环素类 抗生素，特异性强，灵敏度高，最低检出限可达到金霉素5μg/kg，土霉素6μg/kg，四环素4μg/kg， 甲烯土霉素7μg/kg，强力霉素5μg/kg和米诺环素残留6μg/kg，不仅可以应用在动物组织上， 也可以对禽蛋类进行检测。
附图说明
图1为本发明的胶体金试纸条组中的胶体金试纸条的结构示意图；
图2为本发明的四环素类抗生素检测卡的结构示意图。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地 理解本发明的目的、方案和效果。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及 实施例中的特征可以相互组合。
实施例1：制备胶体金标记的抗体溶液
(1)制备胶体金AuNP溶液：在200mL的圆底烧瓶中加入50mL 1.2mM的氯金酸溶液，边加热边搅拌；待溶液沸腾后，向上述沸腾溶液中加入5mL 1％柠檬酸钠，溶液变为酒红色后，继续煮沸一段时间后，停止加热，继续搅拌，自然冷却，得到胶体金AuNP溶液，4℃避 光保存。
(2)取六只离心管，分别加入10mL的步骤(1)制得的胶体金溶液，调节pH值为5～9，分别加入金霉素抗体、土霉素抗体、四环素抗体、甲烯土霉素抗体、强力霉素抗体和米诺环素抗体至每个离心管，搅拌1h，然后向每只离心管中分别加入3mL 10％PEG20000溶液，搅拌30min，向每只离心管分别加入BSA溶液进行封闭，继续搅拌过夜；将经过封闭后的溶液进行离心，加入缓冲溶液重悬，得到制备胶体金标记的抗体溶液(粒径为10～15nm)。
实施例2：构建一种检测金霉素的胶体金试纸条
一种检测金霉素的胶体金试纸条，如图1所示，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸 水纸以及样品垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm；其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有金霉素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊抗鼠 金霉素二抗；结合垫上固定胶体金标记的金霉素抗体(由实施例1制得)。
实施例3：构建一种检测土霉素的胶体金试纸条
一种检测土霉素的胶体金试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品 垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm； 其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有土霉素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊抗鼠 土霉素二抗；结合垫上固定胶体金标记的土霉素抗体(由实施例1制得)。
实施例4：构建一种检测四环素的胶体金试纸条
一种检测四环素的胶体金试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样品 垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm； 其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有四环素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊抗鼠 四环素二抗；结合垫上固定胶体金标记的四环素抗体(由实施例1制得)。
实施例5：构建一种检测甲烯土霉素的胶体金试纸条
一种检测甲烯土霉素的胶体金试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及 样品垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm；其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有甲烯土霉素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊 抗鼠甲烯土霉素二抗；结合垫上固定胶体金标记的甲烯土霉素抗体(由实施例1制得)。
实施例6：构建一种检测强力霉素的胶体金试纸条
一种检测强力霉素的胶体金试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样 品垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm；其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有强力霉素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊抗 鼠强力霉素二抗；结合垫上固定胶体金标记的强力霉素抗体(由实施例1制得)。
实施例7：构建一种检测米诺环素的胶体金试纸条
一种检测米诺环素的胶体金试纸条，包括底板、硝酸纤维素膜、结合垫、吸水纸以及样 品垫，吸水纸、硝酸纤维素膜、结合垫和样品垫的长度分别为18mm、18mm、9mm和18mm；其制备方法如下：
将样品垫、硝酸纤维素膜、结合垫和吸水纸依次粘结在所述底板上，重叠部分为1.5～2mm， 然后切成3mm宽的条带；硝酸纤维素膜上自靠近吸水纸端依次设有控制线和测试线，控制线 与测试线之间的距离为10mm；测试线上喷洒有米诺环素-BSA全抗原，控制线上喷洒有羊抗 鼠米诺环素二抗；结合垫上固定胶体金标记的米诺环素抗体(由实施例1制得)。
实施例8：构建一种四环素类抗生素六联检测卡
一种四环素类抗生素六联检测卡，如图2所示(T表示测试线，C表示控制线)，包括一 个平板以及位于平板上表面的实施例2～7所制得的胶体金试纸条。通过将待测样品溶液滴加 至样品垫，从而对待测样品中的六种常见的四环素类抗生素(金霉素、土霉素、四环素、甲 烯土霉素、强力霉素和米诺环素)进行检测。
使用方法为(以肉类食品为例)：称取100g待测样品(肉类)，用4mL甲醇震荡2min，过滤，滤液用PBS缓冲液稀释100倍，得待测液，备用。将所述待测液滴加至所述样品垫上，5min后，观察结果。
阴性结果：测试线不显色，控制线显红色，表明试纸条测试结果为阴性。
阳性结果：测试线显红色，控制线显红色，表明试纸条测试结果为阳性。
无效：若控制线不显色，不论测试线显色与否，测试结果都无效。
最低检出限可达到金霉素5μg/kg，土霉素6μg/kg，四环素4μg/kg，甲烯土霉素7μg/kg， 强力霉素5μg/kg和米诺环素残留6μg/kg，不仅可以应用在动物组织上，也可以对禽蛋类进行 检测。
Claims (8)
1.一种四环素类抗生素六联检测卡，其特征在于，包括平板和胶体金试纸条组，所述胶体金试纸条组位于平板的上表面，所述胶体金试纸条组包括第一胶体金试纸条、第二胶体金试纸条、第三胶体金试纸条、第四胶体金试纸条、第五胶体金试纸条和第六胶体金试纸条；
所述第一胶体金试纸条的测试线处喷洒有金霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠金霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的金霉素抗体；所述第二胶体金试纸条的测试线处喷洒有土霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠土霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的土霉素抗体；所述第三胶体金试纸条的测试线处喷洒有四环素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠四环素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的四环素抗体；所述第四胶体金试纸条的测试线处喷洒有甲烯土霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠甲烯土霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的甲烯土霉素抗体；所述第五胶体金试纸条的测试线处喷洒有强力霉素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠强力霉素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的强力霉素抗体；所述第六胶体金试纸条的测试线处喷洒有米诺环素-BSA全抗原，控制线处喷洒有羊抗鼠米诺环素二抗，结合垫上固定有胶体金标记的米诺环素抗体。
2.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的胶体金的粒径为10～15nm。
3.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条的宽度为2.5～3.5mm。
4.根据权利要求1所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫的长度均为17～19mm，结合垫的长度为8～10mm。
5.根据权利要求4所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜和样品垫的长度均为18mm，结合垫的长度为9mm。
6.根据权利要求5所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的吸水纸、硝酸纤维素膜、样品垫和结合垫之间的重叠部分的总长度为1.5～2mm。
7.根据权利要求6所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的控制线和测试线之间的距离为9～11mm。
8.根据权利要求7所述的检测卡，其特征在于，所述胶体金试纸条组中的各个胶体金试纸条中的控制线和测试线之间的距离为10mm。
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