CN110819604B

CN110819604B - 脱氧核糖转移酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN110819604B
Application number: CN201911236804.0A
Authority: CN
Inventors: 陈丽; 姚峰
Original assignee: Shanghai Zhaowei Bioengineering Co ltd; Shanghai Zhaowei Technology Development Co ltd
Current assignee: Shanghai Zhaowei Bioengineering Co ltd; Shanghai Zhaowei Technology Development Co ltd
Priority date: 2019-12-05
Filing date: 2019-12-05
Publication date: 2021-07-27
Anticipated expiration: 2039-12-05
Also published as: CN110819604A

Abstract

本发明公开了一种脱氧核糖转移酶突变体及其应用，涉及酶催化技术领域。本发明公开的脱氧核糖转移酶突变体其氨基酸序列由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第15位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列，其中，X选自T、D、E、G、A、S、C和N中的任意一种。该脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性，可用于生产3’修饰性脱氧核糖核苷，简化现有的生产步骤，有利于降低生产成本。

Description

脱氧核糖转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶催化技术领域，具体而言，涉及一种脱氧核糖转移酶突变体及其应用。

背景技术

脱氧核糖转移酶(Nucleoside 2’-deoxyribosyltransferases)可以催化脱氧核糖在不同碱基之间的转移，根据底物特异性的不同可以分为两类：N-脱氧核糖转移酶I(Nucleoside 2’-deoxyribosyltransferase I，PDT)，只能催化脱氧核糖在嘌呤之间转移；N-脱氧核糖转移酶II(Nucleoside 2’-deoxyribosyltransferase II，NDT)，催化脱氧核糖在嘌呤和嘧啶之间的转移。

现有的N-脱氧核糖转移酶大部分只能对糖基上未带有修饰的脱氧核糖核苷底物有催化反应活性，但对糖基上带有修饰基团(例如第3位碳原子带有氨基或叠氮基修饰)的脱氧核糖核苷则不能催化脱氧核糖在不同碱基间的转移。现有技术为了实现糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷的脱氧核糖转移需要多个反应步骤。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脱氧核糖转移酶突变体及其应用，以克服上述技术问题。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种脱氧核糖转移酶突变体，其氨基酸序列如下(1)或(2)所示：

(1)：由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第15位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列，其中，X选自T、D、E、G、A、S、C和N中的任意一种；

(2)：与(1)中所述突变序列具有相同的突变和至少80％以上优选为95％以上的同源性，且具有与(1)中所述突变序列相同生物活性的衍生序列。

SEQ ID NO：1为现有的脱氧核糖转移酶，其仅能实现对糖基上未带有修饰基团的脱氧核糖核苷的脱氧核糖转移，其对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷则没有催化脱氧核糖转移的活性。但本发明的研究发现，将SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第15位氨基酸残基突变为T、D、E、G、A、S、C或N后，得到的脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团(如糖基第3位碳原子(C3位)带有修饰基团)的脱氧核糖核苷(3’修饰性脱氧核糖核苷)有催化其脱氧核糖转移的活性。

基于此，本发明提供的脱氧核糖转移酶突变体可以作为催化剂，用于催化底物即3’修饰性脱氧核糖核苷(其自身的碱基类别与底物碱基类别不同)与碱基的脱氧核糖转移的反应，生产一种新的3’修饰性脱氧核糖核苷。

需要说明的是，在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员在不付出创造性的情况下，容易在此基础上进行常规的一个或多个氨基酸替换、增加以及缺失等以得到具有与前述突变序列至少80％以上、优选为95％以上、进一步优选为98％以上、更进一步优选为99％以上的同源性，且具有相同的生物活性(即对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性)的衍生序列，这些衍生序列均属于本发明的保护范围。

第二方面，本发明实施例提供一种分离的核酸分子，其编码前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体。

需要说明的是，根据密码子的简并性，本领域技术人员在本发明公开了脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，容易得到编码这些突变体的核苷酸序列，无论何种核苷酸序列，只要其编码前述的脱氧核糖转移酶突变体均属于本发明的保护范围。

需要说明的是，本发明提供的核酸分子的长度并不限于仅具有前述编码脱氧核糖转移酶突变体的核酸序列长度。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在核酸分子的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，这种情形的核酸分子也是属于本发明的保护范围。

第三方面，本发明实施例提供一种表达盒，其含有前述实施方式所述的核酸分子。

本发明提供的表达盒是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得。

第四方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式所述的核酸分子，或前述实施方式所述的表达盒。

所述的核酸分子或前述实施方式所述的表达盒置于载体的适当位置，使得上述核酸分子或表达盒能够正确地、顺利地复制、转录或表达。

在可选的实施方式中，所述载体为质粒载体，优选为重组质粒表达载体。

优选地，所述重组质粒表达载体选自pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19；优选地，所述重组质粒表达载体为pET-22b(+)。

需要说明的是，本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，可以是重组表达质粒，也可以是原核表达质粒，还可以是真核表达质粒。无论何种形式的质粒载体，只要其含有前述的核酸分子或表达盒，其均属于本发明的保护范围。

第六方面，本发明实施例提供一种宿主细胞，其含有前述实施方式所述的载体。

需要说明的是，适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞、酵母或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞。无论何种形式的宿主细胞，只要其含有前述的核酸分子、表达盒、或者载体，其均属于本发明的保护范围。

第七方面，本发明实施例提供一种制备如前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体的方法，其包括：培养前述实施方式所述的宿主细胞。

需要说明的是，在本发明公开了前述脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列的前提下，本领域技术人员容易想到通过基因工程技术手段(例如培养前述实施方式所述的宿主细胞，从培养产物中分离纯化得到前述的脱氧核糖转移酶突变体)或其他手段(如化学合成手段)等制备或生产得到本发明的脱氧核糖转移酶突变体，无论以何种方法制备或生产本发明的脱氧核糖转移酶突变体，其均属于本发明的保护范围。

第八方面，本发明实施例提供前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体、前述实施方式所述的宿主细胞、或者该宿主细胞的培养物在制备3’修饰性脱氧核糖核苷中的应用。

需要说明的是，基于前述的脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到将含有脱氧核糖转移酶突变体的混合物(例如含有该脱氧核糖转移酶突变体的宿主细胞，或细胞的培养物)用于制备3’修饰性脱氧核糖核苷，也就是说，只要是利用前述脱氧核糖转移酶突变体的所具有的催化活性来制备3’修饰性脱氧核糖核苷，无论以何种形式将脱氧核糖转移酶突变体添加到反应体系中，均属于本发明的保护范围。

第九方面，本发明实施例提供一种催化3’修饰性脱氧核糖核苷的3’修饰性脱氧核糖转移至碱基的方法，其包括：将底物与前述实施方式所述的脱氧核糖转移酶突变体、前述实施方式所述的宿主细胞、或者该宿主细胞的培养物接触进行催化反应；

所述底物包括3’修饰性脱氧核糖核苷和碱基。

本发明提供的催化方法利用前述脱氧核糖转移酶突变体对糖基上带有修饰基团的脱氧核糖核苷有催化其脱氧核糖转移的活性，将其催化3’修饰性脱氧核糖核苷和碱基的反应，一步即可完成脱氧核糖糖基在碱基与碱基间的转移(该脱氧核糖转移反应也可以简单理解为是进行了碱基的交换)，生成另一种3’修饰性脱氧核糖核苷，相比于现有的需要多步骤化学反应完成的脱氧核糖转移步骤，大大地节约了反应步骤，也节省了相应的原料成本。

在可选的实施方式中，所述3’修饰性脱氧核糖核苷的C3位的修饰基团选自氨基和叠氮基中的一种。

需要说明的是，C3位的修饰基团并不限于氨基和叠氮基，其也可以是其他的修饰基团，例如甲氧基、氟代修饰等。

在可选的实施方式中，所述3’修饰性脱氧核糖核苷选自3’氨基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷、3’氨基尿嘧啶脱氧核糖核苷、3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷和3’叠氮基尿嘧啶脱氧核糖核苷中的一种。

在可选的实施方式中，所述碱基选自腺嘌呤、2,6氨基嘌呤和胞嘧啶中的一种。这种情况下，可生成的物质可以是3’氨基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，3’氨基2，6氨基嘌呤脱氧核糖核苷酸，3’氨基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸，3’叠氮基腺嘌呤脱氧核糖核苷酸，3’叠氮基2，6氨基嘌呤脱氧核糖核苷酸或3’叠氮基胞嘧啶脱氧核糖核苷酸。

在可选的实施方式中，所述3’修饰性脱氧核糖核苷为3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷，所述碱基为腺嘌呤。在这两种底物存在的条件下，生成的物质是3’叠氮基腺嘌呤脱氧核糖核苷和胸腺嘧啶。

在可选的实施方式中，在pH5.8-6.2、45-55℃条件下进行所述催化反应。

在pH5.8-6.2和45-55℃条件下，前述的脱氧核糖转移酶突变体具有较好的催化活性，产物的产率较高。

需要说明的是，进行催化反应的pH和温度并不限于上述条件，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到在其他pH和温度下进行反应，无论何种条件，其均属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，进行所述催化反应时，反应体系含有28-32mM3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷和45-55mM腺嘌呤。

需要说明的是，进行催化反应时，底物的含量可以根据情况调整，本领域技术人员在不付出创造性劳动的前提下，容易想到采用合适浓度的底物和脱氧核糖转移酶突变体，这些物质无论以何种浓度进行催化反应，均属于本发明的保护范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为质粒pET-22b(+)-NDT的图谱。

图2为实施例3中的脱氧核糖转移酶突变体催化3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷脱氧核糖转移至腺嘌呤的反应方程式。

图3为实施例4中的脱氧核糖转移酶突变体催化反应方程式。

图4为实施例3中的脱氧核糖转移酶突变体T15A的反应产物的HPLC图谱。

图5为实施例4中的脱氧核糖转移酶突变体T15A的反应产物的HPLC图谱。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

构建表达载体

(1)以野生型脱氧核糖转移酶基因(SEQ ID NO：2，其编码的野生型脱氧核糖转移酶序列如SEQ ID NO：1所示)为模板，采用8对定点突变引物(T15D，T15E，T15G，T15A，T15S，T15C和15N)，利用定点突变手段，以pET-22b(+)为表达载体，获得带有突变基因的突变质粒。

其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除以及点突变等。

利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模板质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模板延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模板质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。

具体的突变引物序列如下：

T15D：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGgatACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTatcCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15E：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGgaaACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTttcCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15G：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGggcACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTgccCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15A：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGgcgACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTcgcCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15S：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGagcACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTgctCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15C：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGtgtACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTacaCGTCAGGTAGATCTTCG。

T15N：

F(正向引物)：CGAAGATCTACCTGaatACGAGCTTCTTCAACG；

R(反向引物)：CGTTGAAGAAGCTattCGTCAGGTAGATCTTCG。

PCR的体系以及条件如下，采用toyobo KOD NEO聚合酶进行：

单个PCR反应液体积：50μL；其含有如下组分：KOD NEO Buffer10x:5μL，20mMdNTPs:5μL，MgSO₄:3μL，正反向(10pm)/反向引物(10pm)：1.5μL+1.5μL，野生型质粒(含有SEQ ID NO：2的pET-22b(+)质粒，质粒结构见图1，10ng/μL)：1μL，KOD NEO聚合酶(1U/μL)：1μL，水：33μL；

PCR反应条件：94℃2min，98℃10s、68℃3min30s，35cycles，68℃6mins，4℃forever。

PCR结束后，往上述PCR反应液加入2.5μL Dpn I(20U/μL)，37℃，2h。

(2)将得到的突变质粒转入大肠杆菌，转化方法如下：

将DH5a/BL21 DE3感受态细胞于冰上融化；

将2μL质粒加入感受态细胞，轻轻混匀，培养30分钟；

42℃热激40s后放置冰上2分钟；

加入1ml SOC培养基37℃培养1h；

涂布于卡纳抗性(60μg/ml)的平板上，过夜挑单克隆，备用。

实施例2

大肠杆菌工程菌的摇瓶发酵

所有的单克隆菌体培养都先在LB培养基中培养过夜(8种菌体分别培养)，之后第二天转入2×YT培养基中。

LB培养基配方：0.5％酵母提取物、1％蛋白胨和1％氯化钠。

2×YT培养基配方：1％酵母提取物、1.6％蛋白胨和0.5％氯化钠。

抗生素工作浓度：卡那霉素60ug/ml。

培养条件：

于LB培养基中过夜培养，培养以1％(体积比)的接种量接入800ml 2×YT培养基，37℃培养至对数生长期(OD600 0.4-0.6)后，降温至20℃并且加入终浓度为0.5mM的IPTG进行过夜诱导。

将所有发酵液离心，称取2g菌体。

加入20ml pH6.0 20mM磷酸钾，高速分散。

每管加入10mg溶菌酶，超声2s，120次，5s间隔，得到含有脱氧核糖转移酶的细菌培养物。

实施例3

野生型和突变脱氧核糖转移酶的催化活性检测

反应体系为20mM pH6.0磷酸钾缓冲溶液体系2ml，底物为30mM的3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷以及50mM的腺嘌呤，加入实施例2的含有脱氧核糖转移酶或其突变体的细菌培养物约0.1g，50℃反应72h后，98℃水浴2分钟使酶失活后使用高效液相色谱法进行检测，根据产物3’叠氮基腺嘌呤脱氧核糖核苷出峰，判断反应的进行，反应方式见图2(E1代表脱氧核糖转移酶突变体)。结果见下表1和图4。

表1

图4显示了T15A的反应产物的HPLC图谱，结合表1结果，显示，脱氧核糖转移酶突变体可以催化3’叠氮基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的3’修饰性脱氧核糖转移至腺嘌呤，生产新的3’修饰性脱氧核糖核苷即3’叠氮基腺嘌呤脱氧核糖核苷。相较于野生型脱氧核糖转移酶，本发明实施例提供的脱氧核糖转移酶突变体T15G和T15A对3’修饰性脱氧核糖核苷有稍高的催化脱氧核糖转移的活性，转化率在6％-10％。

实施例4

野生型和突变脱氧核糖转移酶的催化活性检测

反应体系为20mM pH6.0磷酸钾缓冲溶液体系2ml，底物为30mM的3’氨基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷以及50mM的胞嘧啶，加入实施例2的含有脱氧核糖转移酶或其突变体的细菌培养物约0.1g，50℃反应72h后，98℃水浴2分钟使酶失活后使用高效液相色谱法进行检测，根据产物3’氨基胞嘧啶脱氧核糖核苷出峰，判断反应的进行，反应方式见图3(E1代表脱氧核糖转移酶突变体)。结果见下表2和图5。

表2

脱氧核糖转移酶	产物	产率
			野生型脱氧核糖转移酶	无	0％
T15D	有	2％
			T15E	有	1％
T15G	有	16％
			T15S	有	2％
T15C	有	25％
			T15N	有	1％
T15A	有	12％

图5显示了T15A的产物的HPLC图谱，结合表2结果，显示，脱氧核糖转移酶突变体T15C、T15G和T15A可以催化3’氨基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷的3’修饰性脱氧核糖转移至胞嘧啶，生产新的3’修饰性脱氧核糖核苷即3’氨基胞嘧啶脱氧核糖核苷。相较于野生型脱氧核糖转移酶，本发明实施例提供的脱氧核糖转移酶突变体T15C、T15G和T15A对3’修饰性脱氧核糖核苷有较高的催化脱氧核糖转移的活性，转化率在12％-25％。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海兆维科技发展有限公司

上海兆维生物工程有限公司

<120> 脱氧核糖转移酶突变体及其应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 168

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Lys Asn Thr Asp Pro Val Ala Asn Thr Lys Ile Tyr Leu Thr Thr

1 5 10 15

Ser Phe Phe Asn Glu Glu Gln Arg Ala Arg Ile Pro Gln Ala Leu Ala

20 25 30

Gln Leu Glu Ala Asn Pro Thr Val Gly Val Val His Gln Pro Phe Asp

35 40 45

Phe Gln Tyr Lys Asp Ala Arg Val Asp Ser Asp Pro Ala Gly Val Phe

50 55 60

Gly Ser Leu Glu Trp Gln Ile Ala Thr Tyr Asn Asn Asp Leu Asn Ala

65 70 75 80

Val Gly Thr Ser Asp Val Cys Val Ala Leu Tyr Asp Met Asp Gln Ile

85 90 95

Asp Glu Gly Ile Cys Met Glu Ile Gly Met Phe Val Ala Leu His Lys

100 105 110

Pro Ile Val Leu Leu Pro Phe Thr Lys Lys Asp Lys Ser Ala Tyr Glu

115 120 125

Ala Asn Leu Met Leu Ala Arg Gly Val Thr Thr Trp Leu Glu Pro Asn

130 135 140

Asp Phe Ser Pro Leu Lys Asp Phe Asn Phe Asn His Pro Met Ala Gln

145 150 155 160

Pro Phe Pro Pro Phe Lys Val Phe

165

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgaagaata ccgatccagt ggcgaacacg aagatctacc tgacgacgag cttcttcaac 60

gaggaacagc gtgcgcgtat tccgcaggcg ctggcacagc tggaggcgaa cccgaccgtg 120

ggcgtggtgc atcaaccgtt tgacttccag tacaaagacg cccgtgtgga tagcgatccg 180

gcaggcgtgt ttggcagcct ggagtggcag attgcgacct ataacaacga tctgaacgca 240

gtgggcacca gcgatgtgtg cgttgcgctg tatgacatgg accagatcga tgaaggcatc 300

tgcatggaaa tcggcatgtt tgtggcgctg cacaaaccga tcgtgctgct gccatttacc 360

aaaaaggata aaagcgcgta cgaagcgaat ctgatgctgg cgcgtggcgt taccacctgg 420

ctggaaccga atgatttcag cccgctgaaa gattttaact tcaaccaccc gatggcccag 480

ccatttccgc cgtttaaagt gttttaa 507

Claims

1.一种催化3’修饰性脱氧核糖核苷的3’修饰性脱氧核糖转移至碱基的方法，其包括：将底物与脱氧核糖转移酶突变体接触进行催化反应；所述脱氧核糖转移酶突变体的氨基酸序列是指：由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的第15位氨基酸残基突变为X所得到的突变序列，其中，X为C；

所述底物包括3’氨基胸腺嘧啶脱氧核糖核苷和胞嘧啶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在pH5.8-6.2、45-55℃条件下进行所述催化反应。