CN110819581B - 一种提高动物繁殖力的amh-gnih双表达dna疫苗及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高动物繁殖力的AMH‑GNIH双表达基因疫苗及其工程菌的制作方法。该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018542。将该工程菌直接免疫动物或与DNA疫苗佐剂混合后免疫动物，可有效提高动物的繁殖力。其双表达基因为抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒，可以直接免疫动物，通过喷鼻、口服、拌饲等方式，经黏膜免疫产生抗体。由于不含抗性基因，不须引入外源抗生素进行筛选，所以不产生抗生素残留。相对于其它基因疫苗需要质粒提取、纯化，生产成本较高，肌肉注射麻烦，并使动物产生应激反应，该疫苗生产成本低，使用方便，而且无抗性和注射应激反应。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高动物繁殖力的 AMH-GNIH双表达基因疫苗及其制备方法与应用。
背景技术
卵泡发育是一个周期性的过程，受多种激素的综合调控，即有促进卵泡发育的激素，如***、***释放激素，也有抑制卵泡发育的激素，如抗穆勒氏管激素(Anti-Müllerian hormone， AMH)、卵泡抑制素(inhibin，INH)和***释放抑制激素(Gonadotropin inhibiting hormone,GnIH)等。
AMH是参与调节生长和分化的糖蛋白转化生长因子-β(TGF-β) 超家族成员，对卵泡发育有抑制作用。敲除AMH能够解除其对原始卵泡的募集作用，使有腔卵泡数量增加。AMH能削弱生长因子Kit配体(KL)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和角化细胞生长因子(KGF)对原始卵泡发育的刺激作用，提示AMH能减少原始卵泡向初级卵泡的转变，抑制原始卵泡的基础性和刺激性发育。对山羊卵巢进行免疫组化分析，发现AMH定位于***和颗粒细胞(原始卵泡到有腔卵泡阶段)。与阴性对照相比，阳性对照(在培养基中培养或加入Kit配体)的原始卵泡百分率降低，生长卵泡的百分率升高，原始卵泡被激活。但是，在培养基中添加AMH表现出与阴性对照相似的原始卵泡和生长卵泡百分比。这些结果表明，AMH阻碍原始卵泡的启动。
GnIH是日本学者于2000年最先从鹌鹑脑内成功分离、纯化得到的RF(精氨酸-苯丙氨酸)酰胺肽(RFRP)，生物学作用与GnRH相反，主要抑制垂体前叶分泌FSH(促卵泡素)和LH(促黄体素)。随后，从哺乳动物脑中鉴定的GnIH直系同源物命名为RFamide (RFRP)相关肽，包含：RFRP-1，RFRP-2，RFRP-3。其中，RFRP-3 是生殖的主要调节因子，类似于体内抑制素的生理功能。GnIH及其类似物不仅能通过GPR147作用于下丘脑的垂体和GnRH神经元，而且还能抑制***的合成和释放以及性腺的发育和维持。在哺乳动物生殖的不同发育阶段，包括初情期前、初情期、发情周期、妊娠、泌乳、绝经和卵巢疾病中，RFRPs已被证实是卵巢发育的关键介质、GnRH释放的潜在抑制调节因子，可能通过GnRH的上游调节因子间接发挥其对卵泡发育的影响，或直接通过GnRH神经元的子集发挥作用。除了调节***分泌外，GnIH通过改变脑中神经类固醇生物合成进一步调节生殖行为。GnIH能抑制鸡和鹌鹑脑垂体释放 LH和FSH。静脉给予RFRP-3可降低性腺切除雄性大鼠外周血***水平，抑制成年小鼠睾丸类固醇激素生成和***发生，绵羊LH 脉冲幅度，抑制LH和FSH分泌。此外，也有研究表明，GnIH抑制鸡的卵泡发育和类固醇生成。以上研究提示，GnIH可能直接或间接抑制卵泡发育和***。
发明内容
本发明的目的，是提供一种具有提高动物繁殖力作用的 AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌。本发明的另一个目的是提供一种非抗性筛选的抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素的共表达质粒；该质粒可作为DNA疫苗免疫动物，提高动物的繁殖能力，克服了一些技术难题。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种具有提高动物繁殖力作用的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉，保藏编号：CCTCC M2018542，分类命名为猪霍乱沙门式菌C500/PVAX-SAMH-2A-SRFRP-asd(Salmonellaenterica C500/PVAX-SAMH-2A-SRFRP-asd)。
由上述工程菌株制备的AMH-GNIH双表达基因疫苗工程菌，通过SDS碱裂解法抽提即可得到AMH-GNIH双表达基因质粒(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒)。
一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗，其特征在于，其依次包括tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因。
如上所述的AMH-GNIH双表达基因疫苗，所述tPA-SRFRP的基因序列如SEQ ID NO.2所示，所述tPA-SAMH的基因序列如SEQ ID NO.1所示。
如上所述的AMH-GNIH双表达基因疫苗，所述tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因之间连接有2A肽，所述2A肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示。
一种如上所述提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的制备方法，其包括如下步骤：
S1、将质粒PVAX-tPA-SAMH-asd和PVAX-tPA-SRFRP-asd进行 PCR扩增，获得tPA-SAMH、tPA-SRFRP扩增产物片段；所述 tPA-SAMH扩增产物片段含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述 tPA-SRFRP扩增产物片段含如SEQ ID NO.2所示的序列；
S2、将pVAX-asd和tPA-SRFRP PCR扩增产物进行EcoR I和XhoI 酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd；
S3、将PVAX-tPA-SRFRP-asd和tPA-SAMH PCR产物进行Hind III 和Kpn I酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd；
S4、2A肽拼接头经上海生工合成并克隆于PUC57载体上；其中，所述2A肽含如SEQID NO.3所示的序列；
S5、将PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A质粒进行Kpn I和BamH I酶切，连接，获得质粒 PVAX-tPA-SINH-2A-tPA-SRFRP-asd。
S6、将PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，引入酶切位点BamH I和Xho I(置换酶切位点)，获得tPA-SRFRP扩增产物片段；将S4 获得的PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd和tPA-SRFRP扩增产物片段进行BamH I和Xho I酶切，连接，获得质粒 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。
如上所述的提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗或上述所述的制备方法制备的疫苗在制备提高动物繁殖力药品中的应用。
将含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)直接免疫动物或与DNA 疫苗佐剂混合后免疫动物，能够提高动物繁殖力。
本发明的有益效果在于：
本发明提供的一种非抗性筛选的抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素的共表达质粒，具有如下优点：
1、抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd，能够表达免疫原性较强的抗穆勒氏管激素(AMH)和***释放抑制激素(RFRP) 两种蛋白，刺激小鼠产生较高的抗体水平。
2、含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌C500(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)通过灌胃免疫小鼠后，产生抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素抗体，中和内源性激素，减弱这两种激素对***的抑制作用，进而促进小鼠繁殖，其产仔数(15.9±1.90)显著高于PBS对照组(13.6±1.72)和空质粒对照组(13.66±2.30)，也高于AMH单表达组(14.35±2.43)、 RFRP单表达组(14.26±1.37)，促繁殖效果明显。
3、含抗穆勒氏管激素和***释放抑制激素的双表达非抗性DNA质粒的工程菌C500(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)，可以直接免疫动物，通过喷鼻、口服、拌饲等方式，经粘膜免疫产生抗体。由于不含抗性基因，不须引入外源抗生素进行筛选，所以不产生抗生素残留。相对于其它基因疫苗需要质粒提取、纯化，生产成本较高，肌肉注射麻烦，并使动物产生应激反应，该疫苗生产成本低，使用方便，而且无抗性和注射应激反应。
附图说明
图1为tPA-SRFRP PCR扩增产物电泳；M：Marker DL 2000；泳道1-9：tPA-SRFRP PCR产物。
图2为tPA-SRFRP PCR产物、PVAX-asd载体双酶切后图谱，其中，M1：Marker DL2000，泳道1和2：PVAX-asd载体双酶切；泳道4-6：tPA-SRFRP PCR产物双酶切；M2：Marker 3。
图3为PVAX-tPA-SRFRP-asd质粒双酶切后图谱，其中，M： Marker 3；泳道1-5：单菌落PVAX-tPA-SRFRP-asd酶切图。
图4为tPA-SAMH PCR扩增产物电泳；其中，M：AL5000 DNA Marker；泳道1-4：tPA-SAMH PCR产物。
图5为PVAX-tPA-SRFRP-asd质粒以及tPA-SAMH PCR产物酶切图；其中，M：AL5000DNA Marker；泳道1-4：PVAX-SRFRP-asd 质粒双酶切；泳道5-7：tPA-SAMH PCR产物的酶切产物。
图6为PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd双酶切鉴定图谱；其中，M：Marker 3，泳道1-3：单菌落PVAX-SAMH-SRFRP-asd双酶切酶切图，经过Hind III和Xho I双酶切；泳道4-6：单菌落 PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd双酶切酶切图，经过Hind III和 EcoR I双酶切。
图7为PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A质粒酶切；其中左边为PUC57-2A'-2A酶切图，M：50bp DNA marker，泳道1-5：PUC57-2A'-2A质粒酶切图；右边为PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd酶切图，M：DS10000 Marker，泳道1-3：PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd质粒酶切图。
图8为转化后单菌落PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd酶切图谱；其中，M：50bpDNA marker，泳道1-6：转化后单菌落 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd酶切图谱，酶切2A。
图9为PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd C500的PCR鉴定；其中，M：Marker III；泳道1-2：InvA阴性；泳道3-4：Crp阴性；泳道5-6：Asd阴性；泳道7-8：AMH-RFRP阴性；泳道9-10：AMH-INH 阴性；泳道11-12：InvA；泳道13-14：Crp；泳道15-16：Asd；泳道 17-18：AMH-RFRP片段；泳道19-20：AMH-INH对照。
图10为PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒纯化后酶切图谱；其中，M：MarkerIII；泳道1-4： PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒HindIII/XhoI双酶切。
图11为PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd转染HELA细胞转录水平图谱；其中，M：Marker III；泳道1：AMH-RFRP阴性；泳道2：AMH-RFRP无处理；泳道3：AMH-RFRP转染空载；泳道 4：AMH-RFRP转染双表达。
图12为不同疫苗免疫小鼠后初次免疫后第8周的抗AMH抗体水平。
图13为不同疫苗免疫小鼠后初次免疫后第8周的抗RFRP抗体水平。
具体实施方式
现有的研究表明GnIH可能直接或间接抑制卵泡发育和***。而本发明人经过大量实验用GnIH基因疫苗免疫绵羊和小鼠，发现均可刺激卵泡发育和***，并提高产仔数与产羔数。AMH能降低原始卵泡向初级卵泡的转变，抑制原始卵泡的基础和刺激发育，敲除AMH的雌鼠卵巢会显示出原始卵泡存量耗尽。AMH和GnIH对卵泡发育的抑制作用机制不同，前者直接抑制小卵泡发育，后者通过抑制垂体 FSH的分泌而抑制大卵泡发育。
本发明人分别构建了抗穆勒氏管激素(AMH)、***释放抑制激素(RFRP)的单表达DNA疫苗PVAX-tPA-SAMH-asd、 PVAX-tPA-SRFRP-asd，虽在小鼠上表现出了较好的提高繁殖力的效果，鉴于这两种激素均与卵泡发育相关，推测将此两种激素联合表达的效果会优于单表达。本发明采用2A肽的基因序列为连接位点，上下游几乎等摩尔表达，使下游基因跟单表达几乎等摩尔表达，等同于双单表达同时免疫，使成本降低。
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的前提下，对本发明所作的修饰或者替换，均属于本发明的范畴。
若未特别指明，下列实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1真核单表达***释放抑制激素PVAX-SRFRP-asd的构建
1、***释放抑制激素PCR扩增、序列分析和酶切根据华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖***重点实验室 (繁殖课题组)提供的质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，获得牛(bovine)源的RFRP融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽基因片段，具体如下：设计的引物两端连接酶切位点为EcoRⅠ和Xho I，***到PVAX-asd载体中，获得能够表达牛(bovine)源 RFRP融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽质粒 PVAX-tPA-SRFRP-asd，其牛(bovine)源的RFRP融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽cDNA开放阅读框为840(bp)，编码280 个氨基酸。
将PVAX-tPA-SRFRP-asd，使用高保真酶进行PCR扩增，反应体系总体积50μl，其中含：
tPA-SRFRP上下游引物为：
SRFRPF：(SEQ ID NO.4)含EcoRI位点：
5'CCGGAATTCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGC 3'
tPA-SRFRPR：(SEQ ID NO.5)含XhoI位点：
5'CCGCTCGAGTTAAATGTATACAAACCTCTGGGGC 3'
PCR反应步骤：1.预变性94℃4min，2.变性94℃40sec，3.退火58℃30sec，4.延伸72℃50sec，2-4步35循环，5.保温72℃ 10min。
tPA-SRFRP PCR扩增产物，序列如SEQ ID NO.2所示，电泳结果如图1所示，其中，M：Marker DL 2000；泳道1-9：tPA-SRFRP PCR 产物。
tPA-SRFRP PCR产物、PVAX-asd载体用EcoRⅠ和Xho I酶切，获得片段tPA-SRFRP(852bp)和PVAX-asd片段(3741bp)，反应体系总体积20μl，其中含：
37℃水浴锅反应1h；
最后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，以Marker III作为分子量标准，观察电泳结果，如图2所示，其中，M1：Marker DL 2000，泳道1和2：PVAX-asd载体双酶切；泳道4-6：tPA-SRFRP PCR产物双酶切；M2：Marker 3。
2、连接
用胶回收试剂盒将酶切产物进行回收(参照OMEGA Gel Extraction Kit使用说明书)。回收后的产物，用Takara连接酶，连接目的片段和载体，连接体系总体积为10μl：
16℃过夜。连接产物PVAX-tPA-SRFRP-asd，直接用于转化或者 -20℃保存备用。
3、重组质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd转化感受态细菌
1)χ6097(由农业动物遗传育种与繁殖***重点实验室(繁殖课题组)保存)感受态细胞的制备(氯化钙法)
用无菌接种环挑取冻存的菌种χ6097于含有二氨基庚二酸(DAP) (50μg/ml)的LB平板上划线，同时在不加DAP的LB平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有 DAP(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃，220r/min振摇培养过夜。取lml活化后的培养物接种到200ml含有DAP(50μg/ml)的LB 液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使OD600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌大离瓶中，冰浴30min， 4℃5000rpm/min，离心10min，弃尽上清。再用10ml冰预冷的0.1M CaCl2温和悬起细菌沉淀，冰浴30min，4℃5000rpm/min，离心10min，弃上清，最后用1ml冰预冷的0.1MCaCl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为100μl/管，即获得感受态细菌χ6097，可直接用于转化或置于-80℃冰箱中保存备用。
2)用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：
(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组DNA (上述步骤制备的PVAX-tPA-SRFRP-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
(3)向每个离心管中加入900μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，220r/min培养45min，使细菌复苏。
(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。
(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至LB固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板， 37℃培养过夜。
4、阳性克隆的筛选、鉴定与测序
从上步的平板中挑取阳性克隆(PVAX-tPA-SRFRP-asd)，接种于LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶 EcoRⅠ和Xho I双酶切，鉴定片段tPA-SRFRP，37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，电泳条带与目的条带即852bp大小相符，结果如图3所示，选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体PVAX-tPA-SRFRP-asd。
实施例2：真核双表达抑制素、***释放抑制激素质粒 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd的构建
1、抑制素激素PCR扩增、序列分析和酶切
根据质粒PVAX-tPA-SAMH-asd【华中农业大学构建，具体操作见附录2】进行PCR扩增，获得羊(ovine)源AMH融合乙肝表面抗原以及人组织纤溶酶信号肽基因融合基因片段，设计引物两端的酶切位点为Hind III和Kpn I，酶切tPA-SAMH以及 PVAX-tPA-SRFRP-asd【华中农业大学构建，具体操作见附录1】，连接，转化，挑取单菌落，小提，酶切，从电泳条带与目的条带大小相符的质粒中，选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。
获得质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd，将 PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A质粒进行Kpn I 和BamH I酶切，连接，转化，挑取单菌落，小提，酶切2A片段，看是否连接2A，获得PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。
具体操作如下：
将PVAX-tPA-SAMH-asd，使用高保真酶进行PCR扩增，反应体系总体积50μl，其中含：
上下游引物为：
tPA-SAMH F：(SEQ ID NO.6)含Hind III位点：
5'CCCAAGCTTGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGC 3'
tPA-SAMH R：(SEQ ID NO.7)含Kpn I位点：
5'CGGGGTACCTTGCTGAAAGATGAGTGTCCCG 3'
PCR反应步骤：1.预变性94℃4min，2.变性94℃40sec，3.退火58℃30sec，4.延伸72℃50sec，2-4步35循环，5.保温72℃ 10min。
tPA-SAMH扩增产物是在SEQ ID NO.1所示的两端增加Hind III 和Kpn I的酶切位点，其序列如SEQ ID NO.1所示，进行电泳扩增，结果如图4所示。其中，在图4中，M：AL5000DNA Marker；泳道 1-4：tPA-SAMH的PCR扩增产物。
tPA-SAMH PCR产物和PVAX-tPA-SRFRP-asd用Hind III和Kpn I酶切，获得片段tPA-SAMH(825bp，不算两端酶切位点)以及 PVAX-tPA-SRFRP-asd(4593bp)，反应体系总体积20μl，其中含：
37℃水浴锅反应1h；
最后，将酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，结果如图5所示，图5为tPA-SAMH PCR产物和PVAX-tPA-SRFRP-asd 载体双酶切后图谱，其中，M：AL5000 DNAMarker，泳道1-4： PVAX-tPA-SRFRP-asd质粒；泳道5-7：tPA-SAMH PCR扩增产物酶切。
2、连接
用胶回收试剂盒将上述酶切产物进行回收(参照OMEGA Gel Extraction Kit使用说明书)。回收后的产物，用Takara连接酶，连接目的片段和载体，连接体系总体积为10μl：
16℃过夜。连接产物PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd，直接用于转化或者-20℃保存备用。
3、重组质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd转化感受态细菌
1)χ6097(由农业动物遗传育种与繁殖***重点实验室(繁殖课题组)提供)感受态细胞的制备(氯化钙法)
用无菌接种环挑取冻存的菌种χ6097于含有DAP(50μg/ml)的 LB平板上划线，同时在不加DAP的LB平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有DAP(50μg/ml) 的LB液体培养基中，37℃，220r/min振摇培养过夜。取lml活化后的培养物接种到200ml含有DAP(50μg/ml)的LB液体培养基中， 37℃振摇培养2.5-3H，使OD600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌大离瓶中，冰浴30min，4℃5000rpm/min，离心10min，弃尽上清。再用10ml冰预冷的0.1M CaCl2 温和悬起细菌沉淀，冰浴30rnin，4℃5000rpm/min，离心10min，弃上清，最后用1ml冰预冷的0.1M CaCl2再次重悬沉淀，加入终浓度为15％的灭菌甘油，混匀后分装为100μl/管，即获得感受态细菌χ6097，可直接用于转化或置于-80℃冰箱中保存备用。
2)用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：
(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组DNA (PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置 30min。
(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
(3)向每个离心管中加入900μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，220r/min培养45min，使细菌复苏。
(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。
(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至LB固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板， 37℃培养过夜。
4、PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd阳性克隆的筛选、鉴定与测序
从上步的平板中挑取阳性克隆 (PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd)，接种于LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶Hind III和Xho I双酶切以及Hind III和EcoR I双酶切，鉴定片段tPA-SAMH-tPA-SRFRP， 37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，电泳条带与目的条带大小相符，选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体 PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd(图6)。
5、***2A片段
1)PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A酶切
将质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A用Kpn I和BamH I酶切，获得片段2A(63bp，不算酶切位点)以及 PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd(5412bp)，反应体系总体积20μl，其中含：
37℃水浴锅反应1h；
最后，PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳，PUC57-2A'-2A用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离2A，以50bp DNA marker以及DS10000Marker作为分子量标准，观察电泳结果，结果如图7所示，其中，左边为PUC57-2A'-2A酶切产物，M：50bp DNA marker，泳道1-5：PUC57-2A'-2A质粒酶切图；右边为PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd酶切图，M：DS10000 Marker，泳道1-3：PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd质粒酶切产物。
2)连接
用胶回收试剂盒将上述酶切产物进行回收(参照OMEGA Gel Extraction Kit使用说明书)。回收后的产物，用Takara连接酶，连接目的片段和载体，连接体系总体积为10μl：
16℃过夜。连接产物PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd，直接用于转化或者-20℃保存备用。
3)重组质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd转化感受态细菌
用热休克法将连接产物转化感受态细菌χ6097，方法如下：
(1)取100μl冰浴上融化的感受态细胞，加入10μl重组DNA (上述连接产物PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
(2)42℃水浴中热90sec，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
(3)向每个离心管中加入900μl无菌的LB培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃,220r/min培养45min，使细菌复苏。
(4)1000rpm，5min离心，吸弃上清液，留适量上清液。
(5)将沉淀轻轻吹起，混匀，转移至LB固体培养基(不含抗生素)，将细胞均匀涂开。将平板置于37℃恒温箱，30min后倒置平板， 37℃培养过夜。
4)PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd阳性克隆的筛选、鉴定与测序
从上步的平板中挑取阳性克隆 (PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)，接种于LB液体培养基培养，用质粒小量试剂盒抽提质粒(参照天根生化科技(北京)有限公司的质粒提取试剂盒使用说明书)，限制性内切酶Kpn I和BamH I 双酶切，鉴定是否***2A片段，用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE) 分离2A，观察酶切结果，电泳条带与目的条带(63bp，不算酶切位点大小)大小相符，结果图8所示，其中，M：50bp DNA marker，泳道1-6：转化后单菌落PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd酶切产物，酶切2A。选取其中一个质粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得真核表达质粒载体 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。
5)PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd置换酶切位点
将PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，引入酶切位点BamH I 和Xho I，获得PCR片段，将上一步4)构建的 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd和扩增的tPA-SRFRP PCR产物进行BamH I和Xho I酶切，回收PVAX-tPA-SAMH-2A-asd的黏性载体以及tPA-SRFRP的黏性产物，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。
实施例3：真核双表达抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd C500感受态工程菌的制备
1.感受态的制备用无菌接种环挑取冻存的菌种C500(由农业动物遗传育种与繁殖***重点实验室(繁殖课题组)提供)于含有 DAP(50μg/ml)的LB琼脂平板上划线，同时在不加DAP的LB琼脂平板上划线做对照，37℃培养过夜。次日挑取生长良好的单个菌落于5ml含有DAP(50μg/ml)的LB液体培养基中，37℃振摇培养过夜。取3ml活化后的培养物接种到300ml含有DAP(50μg/ml)的 LB液体培养基中，37℃振摇培养2.5-3h，使OD600值达到0.5左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入预冷的无菌离心瓶，冰浴30min，4℃ 5000rpm/min离心10min，弃尽上清，再用10ml冰预冷的10％甘油溶液温和悬起细菌沉淀，冰浴10min，4℃5000rpm/min离心10min，弃上清，重复用10ml冰预冷的10％甘油溶液温和悬起细菌沉淀，冰浴10min，离心10min后，弃上清，最后用1.5ml冰预冷的10％甘油重悬，悬浮的感受态细胞按80μl分装，立刻用于电转化或置于-80℃冰箱中保存备用。
2.质粒电转化C500
取20μl小提的质粒，加入到新鲜的80μl上述感受态细胞中，混合后放冰上预冷30min。设置电转仪参数：电压1.8KV，时间 4ms-6ms。将冷却的混合物加入电转杯中，把杯外面的水擦干净后电击，立刻加入SOC培养基于37℃摇床复苏45min。8000rpm/min，离心1min，吸弃1ml上清液，剩余的涂布于预先在培养箱中预热的麦康凯固体平板，37℃培养过夜。
3.PCR鉴定
从麦康凯平板中挑取单菌落于不添加任何抗生素的LB培养基中，采用PCR法鉴定筛选阳性克隆，InvA、Crp、Asd检验是否为目的菌；AMH-RFRP、AMH-INH检测目的菌中是否转染目的质粒进去。 20μl PCR反应体系中含上、下游引物各1μl，2×Taq PCR Mix 10μl，模板2μl，ddH2O 6μl。反应程序为：94℃预变性4min，然后94℃变性40sec，58℃退火30sec，72℃延伸50sec，共35个循环，最后 72℃延伸10min。其中，所用的各扩增引物如下表1所示，将PCR 产物进行电泳扩增，结果如图9所示，M：Marker III；泳道1-2：InvA 阴性；泳道3-4：Crp阴性；泳道5-6：Asd阴性；泳道7-8：AMH-RFRP 阴性；泳道9-10：AMH-INH阴性；泳道11-12：InvA；泳道13-14： Crp；泳道15-16：Asd；泳道17-18：AMH-RFRP片段；泳道19-20： AMH-INH对照。
表1
4.碱裂解法提取质粒
(1)从麦康凯平板中挑取单菌落于5ml不添加任何抗生素的 LB培养基中，37℃，220rpm/min震荡培养过夜。
(2)取2ml菌液转入2ml EP管中，13000rpm离心lmin,弃上清。
(3)将沉淀重悬于100μl冰预冷的SolutionⅠ,涡旋震荡至菌体充分悬浮。
(4)加入200μl新配制的SolutionⅡ，立即颠倒混匀，冰浴 5min。加入150μl冰预冷的SolutionⅢ，轻轻的上下颠倒混匀后,冰浴5min。
(5)13000rpm离心5min，将上清转移至新的EP管中。
(6)加入等体积苯酚:氯仿:异戊醇(按体积比为25:24:l),充分混匀。
(7)13000rpm离心5min，小心吸取上层水相,转移至新的 PE管中,加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀30min。
(8)13000rpm离心10min，弃上清，用75％乙醇洗沉淀一次。
(9)13000rpm离心5min，弃上清。
(10)将EP管室温静止几min，加入适量的TE，重悬沉淀，56℃作用30min。
5.DNA产物纯化(参照天根说明书操作)
(1)向吸附柱CB2中加入500μl的平衡液BL，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
(2)加入所需纯化的质粒，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀。
(3)将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管中)，室温放置2min，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800 μl，若样品体积大于800μl可分批加入。
(4)向吸附柱CB2中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，静置2-5min再离心，13,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(5)重复操作步骤4。
(6)将吸附柱CB2放回收集管中，13,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数min，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。
(7)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min。13,000rpm离心2min收集DNA溶液。
6.DNA产物纯化后酶切
限制性内切酶HindIII和XhoI双酶切，37℃，反应1h，1.0％琼脂糖凝胶电泳，观察酶切结果，结果如图10所示，其中，M：Marker III；泳道1-4：HindIII/XhoI。结果说明菌液中含有目的片段，质粒成功转染C500中。
将该工程菌株保藏于2018年8月15日在中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武汉大学，保藏编号：CCTCC M 2018542，保藏日期为：2018年8月15日。
实施例4：真核双表达抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒在体外表达的检测 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd质粒转染细胞后转录水平的检测：
用质粒提取试剂盒(购自天根生化科技(北京)有限公司)抽提实施例3中制备的质粒，待Hela细胞(人子***细胞的细胞系)单层长至60％-70％时按Lipofectamine 3000脂质体转染试剂盒(购自 Invitrogen公司)说明书进行转染。转染Hela细胞48h后，用胰酶消化并收集细胞。按照Trizol(购自Invitrogen公司)使用说明书提取细胞的mRNA，反转录获得cDNA，根据抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素基因引物(见实施例3中的AMH-RFRP)。进行扩增。
以反转录得到的cDNA为模板，用AMH-RFRP的primers进行 AMH-RFRP目的片段的扩增。经1％琼脂糖电泳检测可发现1002bp (AMH-RFRP)左右的片段结果如图11所示，其中，M：Marker III；泳道1：AMH-RFRP引物扩增阴性；泳道2：AMH-RFRP无处理；泳道3：AMH-RFRP转染空载；泳道4：AMH-RFRP转染双表达。结果说明质粒能够在真核细胞中表达。
实施例5：一种抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素双表达的非抗性DNA质粒在促进动物繁殖中的应用
经大量实验研究证明用已经构建好的非抗性筛选疫苗 (PVAX-tPA-SAMH-asd、PVAX-tPA-SRFRP-asd)免疫小鼠，其能够提高小鼠的产仔数。因此本实验采用非抗性筛选抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素基因疫苗C500(PVAX-tPA-SAMH-asd、 PVAX-tPA-SRFRP-asd)作为阳性参照物，来比较新型的实施例3制备的双表达抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素基因疫苗 PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd是否能够达到提高小鼠产仔数的效果，鉴定疫苗的免疫效果，试图推动新型的双表达抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素基因疫苗在生产中的应用。
1.材料和方法
1.1质粒和菌株
质粒pVAX-tPA-SAMH-asd、pVAX-tPA-SRFRP-asd均由本实验室构建与保存；双表达抗穆勒氏管激素、***释放抑制激素菌株猪霍乱沙门氏菌C500(PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd)成功构建并保存于-80℃。
1.2实验动物饲养管理
自湖北省疾控中心购自5周龄的SPF级雌性昆明小鼠，预饲1 周后，随机分组，进入试验期，饲养于实验室专门的动物房，控制饲养温度在25℃左右，标准饲料和常规饮水饲养。实行笼养，每笼5 只，每周进行一次卫生清洁，每天观察采食饮水是否正常，是否出现由于肌肉注射或采血应激而死亡现象。免疫后观察小鼠的体重增长情况。
1.3疫苗免疫小鼠试验分组
将预饲1周后的昆明雌鼠随机分20只/组。试验分组如下表2：
表2
1.4小鼠免疫方式
根据试验分组对小鼠进行免疫，免疫前4H移除小鼠的水和鼠料，采取灌胃方式，免疫前30min灌胃200μl的碳酸氢钠(7.5％)，之后灌胃200μl的疫苗。2周后按同样方式加强免疫一次，免疫后连续一周观察小鼠的精神和身体状况。
1.5小鼠的称重和血液采集
在免疫前、免疫后1W，2W同一时间段对小鼠进行称重并记录体重数据。0W、8W尾静脉采血，将血液收集于有20μl肝素钠抗凝剂/管的1.5mlEP管中，3000r/min离心10min，小心吸取上层血浆，置于-20保存备用。
1.6小鼠交配后的产仔数、产子窝重统计
疫苗加强免疫后2W，将所有母鼠分笼(每笼2只)，标记。健康雄性小鼠与雌鼠合笼，直至雌鼠全部怀孕。记录小鼠产仔数，产子窝重，仔鼠重。
1.7 AMH/RFRP抗体的检测
用间接ELISA方法检测免疫后小鼠体内AMH/RFRP抗体的生成情况，具体步骤如下：
(1)96孔板酶标板每孔包被AMH/RFRP抗原50ng/100μl，4℃孵育过夜。
(2)弃反应液，PBST洗涤3次，300μl/孔，每次3min。
(3)加封闭液(即1％BSA溶液)200μl/孔，37℃孵育1h。
(4)弃反应液，PBST洗涤3次，300μl/孔，每次3min。
(5)加稀释待测血浆，100μl/孔，同时设置阴性对照孔、非特异性吸附孔(及PBST代替血浆)以及零调控，37℃孵育90min。
(6)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次3min。
(7)加山羊抗鼠IgG-HRP(谷歌，1:3000稀释)100μl/空，37℃反应1h。
(8)弃反应液，PBST洗涤5次，300μl/孔，每次3min。
(9)加TMB底物显色液150μl/孔，避光反应15min。
(10)加2mol/L H2SO4终止液50μl/孔，终止反应，15min内在 450nm波长处测定各孔的OD值。
2结果与分析
2.1免疫反应
2.1.1不同疫苗免疫小鼠后抗AMH抗体水平
将分别包含质粒pVAX-asd、pVAX-tPA-SAMH-asd以及 pVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd的减毒沙门氏菌C500菌液，按照1010CFU/ml的剂量免疫小鼠，初免免疫8W采集血液检测抗AMH 抗体。结果如图12可见，实验组均产生了抗AMH抗体，且各实验组之间差异不显著(P>0.05)。
2.1.2不同疫苗免疫小鼠后抗RFRP抗体水平
将分别包含质粒pVAX-asd、pVAX-tPA-SRFRP-asd以及 pVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd的减毒沙门氏菌C500菌液，按照1010CFU/ml的剂量免疫小鼠，初免免疫8周采集血液检测抗 RFRP抗体。由图13可见，实验组均产生了抗RFRP抗体，且各实验组之间差异不显著(P>0.05)。
2.2不同疫苗免疫鼠后产仔数及出生重的比较
统计不同疫苗免疫小鼠后产仔数及出生重，结果如表3所示。
表3不同疫苗免疫鼠后的产仔数及窝重比较
注：同一列中数据上标有的小写字母完全不相同表示差异显著(P ＜0.05)，反之，表示差异不显著(P＞0.05)，所有数据为均值±标准差表示。
结果表明产仔数：PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd组产仔数显著高于PBS组、pVAX-asd组，高于单表达PVAX-tPA-SAMH-asd 组、PVAX-tPA-SRFRP-asd组。出生重：统计各组的出生重，结果显示，不同疫苗免疫母鼠不影响仔鼠的出生重，各组之间差异不显著 (P>0.05)。
结果说明：本发明构建的PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd 的DNA疫苗可有效提高动物的繁殖能力。
附录1载体PVAX-tPA-SRFRP-asd的构建
1.1.1 tPA-SRFRP片段的扩增
以pIRES-tPA-SINH-tPA-SRFRP质粒为模板进行PCR扩增(淡新刚，GnIH对小鼠繁殖的调控及其分子机制和基因免疫技术研究， 2015)，具体PCR体系和程序如1.1.2。tPA-SRFRP上游引物带有 KpnI酶切位点，下游引物带有EcoRI酶切位点，引物序列如下：
1.1.2 tPA-SRFRP片段与pMD19T(Simple)连接
电泳结束后在紫外灯下从凝胶上切下tPA-SRFRP片段的琼脂糖凝胶，并按照TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒说明书操作规程进行回收，具体步骤如下：1％琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下从琼脂糖胶上切取单一的目的DNA条带，放入一个干净的1.5mL的EP管中，加入3倍质量体积(100mg＝100μL) Buffer GM，混合均匀后于室温溶解胶块，其间轻弹EP管，使凝胶完全融化。然后将融化的液体转至一吸附柱，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，加入500μLBuffer WB，12000rpm离心30s，洗涤两次；最后12000rpm离心1min，除去吸附柱内痕量液体。将吸附柱转移至一干净的1.5mLEP管中，加入30μLElution Buffer，于室温放置2min，12000rpm离心1min洗脱DNA。电泳检测回收纯度，并测浓度，收集的DNA溶液用于下一步实验或-20℃保存备用。
将tPA-SRFRP片段与pMD19T-simple载体连接，具体步骤如下：根据回收后的DNA浓度计算出载体和目的片段的连接体积比，使用 SolutionI连接pMD19T和tPA-SRFRP片段，连接体系如下：
混匀，短暂离心，16℃水浴连接过夜。
1.1.3细菌的转化
(1)将感受态细胞DH5α从-80℃中取出冰浴解冻，加入10μL 连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(2)转至42℃热激90sec，然后迅速取出放在冰上2min，该过程不能摇动离心管。
(3)加入400μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃， 200r/min振荡培养1h。使细菌复苏。
(4)3000r/min离心5min，弃去400μL上清。
(5)轻轻混匀剩余液体，使用涂布器均匀涂于含Amp抗生素 (50μg/mL)的LB固体培养基上，37℃恒温培养12-14h，观察是否有转化菌落长出。
1.1.4阳性克隆筛选与鉴定
挑取单菌落于含Amp抗生素(50μg/mL)的LB液体培养基中， 37℃200r/min振荡培养12h左右，使用天根试剂盒进行质粒小提， pMD19T-tPA-SRFRP质粒经过KpnI和EcoRI进行双酶切鉴定。酶切体系如下：
混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。
将10μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出疑似 pMD19T-tPA-SIRFRP的质粒，送到武汉擎科创新生物科技有限公司测序，将序列比对正确的质粒所对应的菌液扩大培养，提取质粒， -20℃保存备用。
1.1.5载体pVAX-asd和质粒pMD19T-tPA-SINH的酶切与回收
参照Thermo说明书稍作改动，具体步骤如下：用限制性内切酶 KpnI和EcoRI双酶切pVAX-asd质粒和pMD19T-tPA-SRFRP质粒，露出两端的粘性末端，酶切体系分别如下：
混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。
酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳分离出目的条带，使用TaKaRa MiniBEST AgaroseGel DNA Extraction Kit Ver.4.0试剂盒回收 tPA-SRFRP和线性pVAX-asd片段，回收后电泳检测回收纯度，并测浓度。
1.1.6目的基因连接
按照Thermo T4连接酶说明书操作规范进行，具体步骤如下：根据回收后检测的DNA浓度计算出载体和目的片段的链接比，使用T4 DNA Ligase连接pVAX-asd和tPA-SRFRP片段，连接体系如下：
混匀，短暂离心，16℃水浴连接过夜。
1.1.7细菌的转化
(1)将感受态细胞χ6097从-80℃中取出冰浴解冻，加入10μL 连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。
(2)转至42℃热激90sec，然后迅速取出放在冰上2min，该过程不能摇动离心管。
(3)加入400μL不含抗生素的LB液体培养基，混匀后置于37℃， 200r/min振荡培养1h。使细菌复苏。
(4)3000r/min离心5min，弃去400μL上清。
(5)轻轻混匀剩余液体，使用涂布器均匀涂布不含任何外源物质的LB平板，37℃恒温培养18-20h，观察是否有转化菌落长出。
1.1.8阳性克隆的筛选与鉴定
挑取单菌落于不含任何外源物质的LB液体培养基中，37℃ 200r/min振荡培养12h左右，使用天根试剂盒进行质粒小提， pVAX-tPA-SRFRP-asd质粒经过KpnI和EcoRI进行双酶切鉴定。酶切体系如下：
混匀，短暂离心，37℃水浴反应过夜。
将10μL酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出疑似 pVAX-tPA-SRFRP-asd的质粒，送到武汉擎科创新生物科技有限公司测序，将序列比对正确的质粒所对应的菌液扩大培养，提取质粒， -20℃保存备用。
附录2载体PVAX-tPA-SAMH-asd的构建
1.2.1 tPA-SAMH片段合成
在NCBI上查找筛选得到的对应的AMH表位抗原编码基因的碱基序列，将其***乙肝表面抗原的5’端，在乙肝表面抗原3’端***tPA信号肽，并在整个片段的上游和下游分别添加BamH I和 EcoR I两个酶切位点，构成tPA-SAMH片段，送至生工公司合成。
1.2.2载体pVAX-asd和质粒pUC-tPA-SAMH酶切与回收
具体过程参照1.1.5。
1.2.3目的基因连接
具体步骤参照1.1.2。
1.2.4细菌转化
具体步骤参照1.1.7。
1.2.5阳性克隆筛选与鉴定
具体过程参照1.1.8。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种提高动物繁殖力的AMH-INH-GNIH三表达基因疫苗、其制备方法与应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 837
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(2 Ambystoma laterale x Ambystomajeffersonianum)
<400> 1
aagcttgcca ccatggatgc aatgaagaga gggctctgct gtgtgctgct gctgtgtgga 60
gcagtcttcg tttcgcccag catggagagc acaacatcag gattcctagg acccctgctc 120
gtgttacagg cggggttttt cttgttgaca agaatcctca caataccaca gagtctagac 180
tcgtggtgga cttctctcaa ttttctaggg ggagcaccca cgtgtcctgg ccaaaattcg 240
cagtccccaa cctccaatca ctcaccaacc tcttgtcctc caatttgtcc tggctatcgc 300
tggatgtgtc tgcggcgttt tatcatattc ctcttcatcc tgctgctatg cctcatcttc 360
ttgttggttc ttctggacta ccaaggtatg ttgcccgttt gtcctctact tccaggaaca 420
tcaactacca gcacgggacc atgcaagacc tgcacgattc ctgctcaagg aacctctatg 480
tttccctctt gctgctgtac aaaaccttcg gacggaaact gcacttgtat tcccatccca 540
tcatcctggg ctttcgcaag attcctatgg gagtgggcct cagtccgttt ctcctggctc 600
agtttactag tgccatttgt tcagtggttc gtagggcttt cccccactgt ttggctttca 660
gttatatgga tgatgtggta ttgggggcca agtctgtaca acatcttgag tcccttttta 720
cctctattac caattttctt ttgtctttgg catatgaggg aagaggtctc caatacctca 780
gcctcgccca gggagcaggc cacaggcagc gggacactca tctttcagca aggtacc 837
<210> 2
<211> 864
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 2
gaattcgcca ccatggatgc aatgaagaga gggctctgct gtgtgctgct gctgtgtgga 60
gcagtcttcg tttcgcccag cgtcgacatg gagagcacaa catcaggatt cctaggaccc 120
ctgctcgtgt tacaggcggg gtttttcttg ttgacaagaa tcctcacaat accacagagt 180
ctagactcgt ggtggacttc tctcaatttt ctagggggag cacccacgtg tcctggccaa 240
aattcgcagt ccccaacctc caatcactca ccaacctctt gtcctccaat ttgtcctggc 300
tatcgctgga tgtgtctgcg gcgttttatc atattcctct tcatcctgct gctatgcctc 360
atcttcttgt tggttcttct ggactaccaa ggtatgttgc ccgtttgtcc tctacttcca 420
ggaacatcaa ctaccagcac gggaccatgc aagacctgca cgattcctgc tcaaggaacc 480
tctatgtttc cctcttgctg ctgtacaaaa ccttcggacg gaaactgcac ttgtattccc 540
atcccatcat cctgggcttt cgcaagattc ctatgggagt gggcctcagt ccgtttctcc 600
tggctcagtt tactagtgcc atttgttcag tggttcgtag ggctttcccc cactgtttgg 660
ctttcagtta tatggatgat gtggtattgg gggccaagtc tgtacaacat cttgagtccc 720
tttttacctc tattaccaat tttcttttgt ctttggcata tggcgatggc ccacctgcct 780
ctgagactcg gaaaaaatag agaggacagc ctctccagat gggtcccaaa tctgccccag 840
aggtttgtat acatttaact cgag 864
<210> 3
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 3
ggtaccggca gtggagaggg cagaggaagt ctgctaacat gcggtgacgt cgaggagaat 60
cctggcccag gatcc 75
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 4
ccggaattcg ccaccatgga tgcaatgaag agagggc 37
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 5
ccgctcgagt taaatgtata caaacctctg gggc 34
<210> 6
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgaagcttg ccaccatgga tgcaatgaag agagggc 37
<210> 7
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgggtacct tgctgaaaga tgagtgtccc g 31
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 8
ccgggatccg ccaccatgga tgcaatgaag agagggc 37
<210> 9
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 9
ccgctcgagt taaatgtata caaacctctg gggc 34
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 10
tacgcgcata caacaaaagt cgc 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 11
gccattctga cggaattaac ggg 23
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 12
ttgctttcca actgctgagc 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 13
tcctatctgc gtcgtcctac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 14
caggatacct atagtgctgc 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcaccgtca aaggaaccgt 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 16
atgagggaag aggtctccaa ta 22
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 17
aatgtataca aacctctggg gca 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 18
atgagggaag aggtctccaa ta 22
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 19
tcttgtctgt ggcagtcggc 20
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 20
cggtaccccg atggatgcaa tgaagag 27
<210> 21
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)(Artificial Sequence)
<400> 21
gaattcgcgg ccgcttaaat gtatacaaac c 31
Claims (9)
1.一种含有提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的工程菌，其特征在于，该工程菌于2018年8月15日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018542。
2.由权利要求1所述工程菌株制备的AMH-GNIH双表达基因疫苗。
3.一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗，其特征在于，其包括tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因，所述tPA-SAMH的基因序列如SEQ ID NO.1所示，所述tPA-SRFRP的基因序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求3所述的双表达基因疫苗，其特征在于，所述tPA-SAMH基因和tPA-SRFRP基因之间连接有2A肽，所述2A肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示，所述AMH-GNIH双表达基因疫苗的基因序列是SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.2所示序列依次连接。
5.一种提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗的制备方法，其特征在于如下操作步骤：
S1、将质粒PVAX-tPA-SAMH-asd和PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，获得tPA-SAMH、tPA-SRFRP扩增产物片段；所述tPA-SAMH扩增产物片段含如SEQ ID NO.1所示的序列，所述tPA-SRFRP扩增产物片段含如SEQ ID NO.2所示的序列；
S2、将pVAX-asd和tPA-SRFRP PCR扩增产物进行EcoR I和XhoI酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd；
S3、将PVAX-tPA-SRFRP-asd和tPA-SAMH PCR产物进行Hind III和Kpn I酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd；
S4、2A肽拼接头经上海生工合成并克隆于PUC57载体上；其中，所述2A肽含如SEQ IDNO.3所示的序列；
S5、将PVAX-tPA-SAMH-tPA-SRFRP-asd和PUC57-2A'-2A质粒进行Kpn I和BamH I酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SINH-2A-tPA-SRFRP-asd；
S6、将PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增，引入酶切位点BamH I和Xho I(置换酶切位点)，获得tPA-SRFRP扩增产物片段；将S4获得的PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd和tPA-SRFRP扩增产物片段进行BamH I和Xho I酶切，连接，获得质粒PVAX-tPA-SAMH-2A-tPA-SRFRP-asd。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，所述对质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增的引物对如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。
7.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，将质粒PVAX-tPA-SAMH-asd进行PCR扩增的引物对如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。
8.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1中，将质粒PVAX-tPA-SRFRP-asd进行PCR扩增的引物对如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
9.如上所述的提高动物繁殖力的AMH-GNIH双表达基因疫苗或上述所述的制备方法制备的疫苗在制备提高动物繁殖力药品中的应用。
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| Construction and evaluation of the novel DNA vaccine harboring the inhibin α (1–32) and the RF-amide related peptide-3 genes for improving fertility in mice;Xingang Dan等;《Exp Anim》;20151002;第65卷(第(1)期);摘要，材料和方法部分 * |
| INH和AMH对小鼠卵泡发育的协同调控作用及机制研究;李赞等;《中国奶牛》;20180430;第 4卷;摘要，第26页第1段 * |
| New approaches to non-surgical sterilization for dogs and cats:Opportunities and challenges;Linda Rhodes VMD;《reproduction in domestic animals》;20171231;第52卷;第327–331页 * |
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