CN108841793B - 抗鸭Mx-A单克隆抗体及其在检测鸭Mx蛋白的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗鸭Mx‑A单克隆抗体及其在检测鸭Mx蛋白中的应用。本发明以含有鸭Mx基因的重组质粒为模板，设计1对特异性引物扩增得到编码鸭Mx N端1‑100aa的基因片段Mx‑A。构建其重组原核表达载体pET‑30a‑Mx‑A和pET‑32a‑Mx‑A，采用大肠杆菌原核表达技术表达鸭Mx‑A，得到重组蛋白rDupET‑30a‑Mx‑A和rDupET‑32a‑Mx‑A。以重组蛋白rDupET‑30a‑Mx‑A为免疫原，免疫小鼠，经筛选获得1株稳定分泌抗鸭Mx‑A的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4B6，保藏号是：CGMCC NO.15287。研究表明，该单克隆抗体能与原核表达的重组鸭Mx‑A蛋白反应，同时也能够与转染真核表达载体pcDNA3.1‑Mx的鸡胚成纤维细胞表达的鸭Mx蛋白及感染DHAV‑3后鸭胚不同组织表达的鸭Mx蛋白发生特异性反应。因此，本发明的提出为检测鸭Mx蛋白提供了一种新的、有效的技术手段。

Description

抗鸭Mx-A单克隆抗体及其在检测鸭Mx蛋白的应用
技术领域
本发明涉及一种单克隆抗体及其应用，特别涉及一种抗鸭Mx-A单克隆抗体及其在检测鸭组织中的Mx蛋白的应用，本发明属于生物技术领域。
背景技术
Mx是最为重要的抗病毒蛋白之一，它能通过抑制病毒的核酸转录和其蛋白质的输入与输出以达到抗病毒的作用。Mx蛋白抗病毒效果广泛，其主要作用是目标RNA病毒。
Mx蛋白具有GTPase蛋白酶家族的共同特征，可进行自我组装，形成高度有序的多聚体后具备协同水解GTP的能力。种属之间Mx蛋白的结构相对来说比较保守，有三个稳定的结构域。N端结构为GTP结合结构域(GTP binding Domain)，此结构具有GTPase活性三联体，包含一个动力蛋白信号(LPRXXGXXTR)以及三联体GTP结合区域(GDXXSGKS、DLPG和TKPD)，前端两个GTP结合序列同动力蛋白信号连接在一起，位于侧方；第三个GTP结合序列对于结合鸟苷来说具有重要的作用，动力蛋白信号区域包含的残基与维持GTP酶效应区的活性和功能都有不可分割的关系，同时Mg2+的协调功能也与此处具有关联，GTP酶超家族中的其他蛋白与Mx 30％～40％相似序列都在此处；C端包括有GTP酶效应结构域(CED)以及一个中间结构域(CID)，末端具有一个亮氨酸(Leu)拉链区域结构，这个结构与GTP酶效应区的活化和功能协调密不可分，介导Mx聚合形成多聚体使得Mx蛋白行使其作用，并且与Mx蛋白定位有关的定位信号也在C端。
鸭Mx基因于1993年Bazzigher从鸭胚成纤维细胞(DEF)中被克隆出来，且发现Mx有两个可变剪接体，分子量不等的编码产物和分别定位于细胞质和细胞核的Mx蛋白，将其转染DEF后能表达Mx蛋白，经免疫荧光检测发现其在细胞核和细胞质内均有分布，呈颗粒状，并且在他的研究里得出了鸭的流感抗性不依赖于干扰素诱导的Mx蛋白这样的结论。在此后关于鸭Mx蛋白抗病毒性的研究便一直很少，直到近些年来，才又开始了对鸭Mx蛋白抗病毒活性研究的关注。有研究结果表明，鸭Mx存在多态性且不同亚型流感病毒诱导鸭Mx的程度强弱也不一致。
单克隆抗体的研制为基础和临床免疫学的研究创造了有利条件。针对Mx蛋白的单克隆抗体可检测病毒感染后鸭不同组织表达Mx蛋白的情况，以及Mx的结构及其在鸭体内的抗病毒活性。
本发明首次利用原核表达***表达鸭Mx-A基因片段，以重组蛋白为免疫原制备鸭Mx-A的单克隆抗体，建立了可检测鸭Mx蛋白的western blot方法，为揭示鸭Mx蛋白在抗病毒中的作用提供理论依据及物质基础。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种能够稳定分泌抗鸭Mx-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及由该杂交瘤细胞株分泌所产生的单克隆抗体。
本发明所要解决的技术问题之二是提供所述单克隆抗体在制备检测鸭Mx蛋白试剂中的应用。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
本发明以本实验室构建好的携带鸭Mx-A(1-100aa)的pMD19-T Simple-Mx载体为模板，利用Primer premier5.0分子生物学软件辅助设计了1对特异性扩增引物(Mx-A-S和Mx-A-A)扩增得到鸭Mx-A基因。构建重组原核表达载体pET-30a-Mx-A和pET-32a-Mx-A，采用大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS表达鸭Mx-A得到重组蛋白rDupET-30a-Mx-A和rDupET-32a-Mx-A。以重组蛋白rDupET-30a-Mx-A为免疫原，免疫三次BALB/c小鼠，再加强免疫一次，取BALB/c小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合，经筛选获得1株稳定分泌抗鸭Mx蛋白1-100aa片段的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4B6，分类命名为抗鸭Mx-A单克隆抗体杂交瘤细胞，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号是：CGMCC NO.15287，保藏时间是：2018年1月17日。
进一步，本发明还提出了由保藏号为CGMCC NO.15287的杂交瘤细胞株分泌产生的抗鸭Mx-A单克隆抗体。经抗体亚类试剂盒鉴定，杂交瘤细胞株4B6所产生的单克隆抗体为IgG1型。试验结果显示，所述单克隆抗体能与纯化的重组鸭Mx-A蛋白rDupET-32a-Mx-A反应，同时也能够与真核表达的鸭Mx蛋白及鸭组织中的Mx蛋白发生反应。
更进一步，本发明还提出了所述的抗鸭Mx-A单克隆抗体在制备检测鸭Mx蛋白试剂中的应用。
附图说明
图1为鸭Mx-AN端1-100aa与其他物种Mx同源性分析；
图2为Mx-A抗原性分析；
图3为鸭Mx-A基因片段的扩增
M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.PCR扩增产物；
图4为重组质粒pET-30a-Mx-A的酶切鉴定；
M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.pET-30a-Mx-A BamH I单酶切；2.pET-30a-Mx-A BamHI、Xho I双酶切；3.pET-32a-Mx-A单酶切；4.pET-32a-Mx-A双酶切；
图5为重组质粒pET-32a-Mx-A的酶切鉴定；
M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.pET-32a-Mx-A BamH I单酶切；2.pET-32a-Mx-A BamH I、Xho I双酶切；
图6为重组质粒pET-30a-Mx-A的PCR鉴定；
M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.PCR扩增片段；2.阴性对照；
图7为重组质粒pET-32a-Mx-A的PCR鉴定；
M.Trans 2K PlusⅡDNA Marker；1.PCR扩增片段；2.阴性对照；
图8为重组蛋白rDupET-30a-Mx-A的SDS-PAGE鉴定；
M.蛋白质分子质量标准；1-4.Rosetta-pET-30a空载体蛋白、Rosetta-pET-30a-Mx-A菌体诱导后、超声上清、超声沉淀；
图9为重组蛋白rDupET-32a-Mx-A的SDS-PAGE鉴定；
M.蛋白质分子质量标准；1-4.Rosetta-pET-32a空载体蛋白、Rosetta-pET-32a-Mx-A菌体诱导后、超声上清、超声沉淀；
图10为纯化的rDupET-30a-Mx-A和rDupET-32a-Mx-A重组蛋白SDS-PAGE；
M.蛋白质分子质量标准；1.纯化的rDupET-30a-Mx-A重组蛋白；2.纯化的rDupET-32a-Mx-A重组蛋白；
图11为细胞株染色体计数；A.SP2/0细胞株；B.4B6杂交瘤细胞株；
图12为4B6杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析；
图13为4B6杂交瘤细胞株单抗腹水效价的测定；
图14为4B6杂交瘤细胞株制备腹水的纯化；
M.蛋白质分子质量标准；1.腹水；2.纯化腹水；
图15为4B6单克隆抗体的间接免疫荧光鉴定(200×)结果；
A.空载体pcDNA3.1(+)质粒对照；B.质粒pcDNA3.1-Mx转染的鸡胚成纤维细胞与纯化的4B6单克隆抗体的间接免疫荧光分析；
图16为4B6细胞上清与重组蛋白rDupET-32a-Mx-A的Western blot鉴定；
图17为4B6细胞上清与pcDNA3.1-Mx转染的鸡胚成纤维细胞表达的鸭Mx蛋白的Western blot鉴定；
图18为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭胚心脏组织中鸭Mx蛋白的Westernblot检测；
图19为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭肝脏组织中鸭Mx蛋白的Western blot检测；
图20为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭胚脑组织中鸭Mx蛋白的Western blot检测；
图21为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭胚肌肉组织中鸭Mx蛋白的Westernblot检测；
图22为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭胚肌胃组织中鸭Mx蛋白的Westernblot检测；
图23为4B6细胞上清与DHAV-3攻毒后鸭胚肠组织中鸭Mx蛋白的Western blot检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所涉及的材料与试剂：
1试验材料
1.1试验动物
BALB/C小鼠，SPF级6周龄，购自长春亿斯实验动物技术有限责任中心；SPF鸭胚鸭购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2细胞、菌株及质粒
SP2/0骨髓瘤细胞由本实验室保存；感受态细胞TG1和RosettaTM(DE3)pLysS均由本实验室制备保存；pET-30a(+)质粒、pET-32a(+)质粒购自Invitrogen(北京)生物技术有限公司；重组质粒pMD19-T Simple-Mx和pcDNA3.1-Mx(均携带鸭MxCDS序列)由本实验室构建并保存。
1.3主要试剂
1.3.1工具酶等
Pfu高保真DNA聚合酶(2.5U/μL)购自TIANGEN(北京)公司；rTaq DNA聚合酶(5U/μL)、限制性内切酶、dNTP、DNA标准Marker、蛋白标准Marker购自TaKaRa(大连)公司；T4DNA连接酶(350U/μL)购自NEB公司；小量质粒提取和胶回收试剂盒购于BioTeck (哈尔滨)生物工程有限公司。
1.3.2蛋白表达及纯化试剂等
IPTG购自北京索莱宝科技有限公司；DAB显色试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；Ni-NTA亲和层析纯化试剂盒、Protein G亲和层析纯化试剂盒购自GenScript(南京)生物技术有限公司公司；弗氏佐剂(FA)、PEG3350购自SIGMA公司；
1.3.3抗体制剂
辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG抗体均购自北京博奥森公司；异硫氰荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司；鼠源GAPDH单克隆抗体购自北京中杉金桥生物技术有限公司；小鼠单抗Ig类鉴定试剂盒(C060102)由洛阳佰奥通实验材料中心研制。
1.3.4细胞类制剂
秋水仙素、人淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；HAT、HT选择性培养基及RPMI1640培养基购自GIBCO公司；
Figure BDA0001689658390000051
LTX转染试剂购自美国Invitrogen公司。青霉素、链霉素购自哈尔滨三精制药厂；胎牛血清购自浙江天杭生物科技有限公司。
实施例1鸭Mx-A (1-100aa)基因片段的克隆及重组蛋白的表达
方法：
1鸭Mx-A基因片段的克隆与原核表达载体的构建
1.1引物设计
以本实验室构建的pMD19-T Simple-Mx为模板，利用Primer premier5.0软件设计特异性引物(Mx-A-S和Mx-A-A)，表1所示，其中上下游引物分别引入BamHⅠ、XhoⅠ限制性内切酶位点，用于扩增鸭Mx-A胞外区N端1-100aa编码基因，引物由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。
表1扩增鸭MX-A的引物
Figure BDA0001689658390000061
1.2鸭Mx-A基因的扩增
以阳性质粒pMD19-T Simple-Mx为模板，建立50μL PCR反应体系:
模板pMD19-T Simple-Mx 1μL
上游引物(l0uM) 1μL
下游引物(l0uM) 1μL
dNTP(2.5mM) 4μL
10×Pfu Buffer 5μL
Pfu酶(2.5U/μL) 0.5μL
灭菌去离子水 37.5μL
PCR反应条件:
Figure BDA0001689658390000062
利用0.8％琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果，根据BioTeke多功能DNA纯化回收试剂盒说明书纯化PCR产物。
1.3目的片段、表达载体的酶切与连接
将1.2的PCR扩增产物、pET-30a(+)质粒、pET-32a(+)质粒酶切，30μL体系:
Figure BDA0001689658390000063
37℃作用90min，对酶切产物按1.2的方法回收。回收后将目的片段与表达载体连接，10ul体系:
Figure BDA0001689658390000071
16℃金属浴连接12-16h，连接产物命名为pET-30a-Mx-A、pET-32a-Mx-A。连接产物转化至TG1感受态细胞。转化方法参照《分子克隆实验指南》转化步骤如下：从-70℃冰箱中取出TG1感受态细胞，放置于冰盒上，待其融化后，在超净工作台中将上述连接产物加入到感受态细胞中，并轻轻旋转混匀，冰浴30min；再将其放入42℃恒温水浴中，热激90s后，快速转移至冰盒上冰浴3～5min；加入200μL高温灭菌的LB培养基，37℃恒温摇床培养60min，取出全部的转化产物，在含有抗生素的平板上均匀的涂布菌液，将平板正置于37℃恒温培养箱中，待10min后，倒置平板，培养12～16h。
1.4重组质粒的提取
挑取生长圆滑的单个菌落于含相应抗生素的LB液体培养基中扩大培养，应用百泰克高纯质粒小量制备试剂盒提取重组质粒，步骤如下：取1.5-4.5mL过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，弃上清；加入250μL P1溶液，用枪重悬菌体沉淀并彻底混匀；加250μL P2溶液，温和地混匀，直至菌体完全裂解；加400μL P3溶液，温和地混匀后放置3min。室温13000rpm离心10min，取上清；将离心后上层液体加入到吸附柱中，12000rpm离心1min，弃滤液；加入去蛋白液500μL，12000rpm离心60s，弃滤液；加入漂洗液500μL，12000rpm离心60s，弃滤液；重复一次步骤7，12000rpm离心60s，弃滤液；将吸附柱放入灭菌的EP管中，加60-100μL Elution Buffer室温放置1min，12000rpm离心1min，收集流出液。
1.5重组质粒的鉴定
(1)重组质粒的酶切鉴定
对于提取的重组质粒pET-30a-Mx-A、pET-32a-Mx-A进行BamHⅠ单酶切(表2)和BamHⅠ、XhoⅠ双酶切(表3)，10μL体系:
表2单酶切体系
Figure BDA0001689658390000072
表3双酶切体系
Figure BDA0001689658390000081
单酶切时37℃作用60min,双酶切时37℃作用90min，经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。
(2)重组质粒的PCR鉴定
PCR鉴定，10μL体系:
Figure BDA0001689658390000082
PCR反应条件:
Figure BDA0001689658390000083
扩增基因经0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
2鸭Mx-A的原核表达及抗原性鉴定
2.1鸭Mx-A的诱导表达
将阳性重组质粒pET-30a-Mx-A、pET-32a-Mx-A转化至RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞中，方式同1.4。次日37℃培养至菌液OD600nm的值达到0.4～0.6，按0.1％加入IPTG至终浓度为1mmol/L，37℃继续培养4h。收获诱导后菌液，4℃、5000rpm离心15min，弃上清，0.01mol/L PH＝7.2PBS重悬菌体。将重悬的菌液利用超声波裂解细胞，4℃、5000rpm离心15min，分别收集超声上清及沉淀，经12％SDS-PAGE分析重组蛋白的表达量及表达形式，结果均为包涵体表达，重组蛋白分别命名为rDupET-30a-Mx-A及rDupET-32a-Mx-A。
2.2重组蛋白的纯化
将获得的包涵体蛋白分别与3mL Buffer B(100mM NaH2PO4；10mM Tris-Cl；8MUrea pH 8.0)混合加至已再生好的Ni-NTA柱中，4℃结合4h；收集流出液，然后分别用2ml含10mmol、5mmol、100mmol等浓度咪唑的Buffer B洗脱目的蛋白，每个梯度洗涤柱子5～6次，收集洗涤液，而后进行SDS-PAGE分析。
将纯化后的目的蛋白装入透析袋中，放于含5％甘油的PBS透析液中于4℃透析，每隔4～6h换液一次，除去尿素。透析后浓缩蛋白样品并利用Bradford蛋白测定试剂盒测定纯化后蛋白浓度，其余加入20％甘油后，分装保存于-20℃。
结果：
1鸭Mx-A基因片段的克隆与原核表达载体的构建
1.1鸭Mx-A基因片段的扩增
分析Mx-A基因的同源性及Mx-A的抗原性，如图1、图2所示，可见鸭Mx-AN端1-100aa与其他物种相比同源性不高，但该段蛋白免疫原性较好。根据设计的特异性引物Mx-A-S和Mx-A-A，以阳性质粒pMD19-T Simple Mx为模板，PCR扩增得到目的基因片段，大小与预期结果相符约300bp，如图3所示。
1.2鸭Mx-A 1-100aa基因原核表达载体构建
将PCR扩增产物与pET-30a(+)、pET-32a(+)空质粒同时进行BamHⅠ及XhoⅠ双酶切，之后连接并转化至TG1感受态细胞中，提取质粒后，经BamHⅠ单酶切分别得到5.6Kb、6.1Kb片段，BamHⅠ、XhoⅠ双酶切分别获得5.7Kb、300bp及5.9Kb、300bp的目的片段，与预期相符，如图4、图5。进一步进行PCR鉴定，鉴定结果如图6、图7所示，鉴定结果出现与预期大小相符的目的条带，送阳性质粒去测序，测序结果正确，命名阳性质粒为pET-30a-Mx-A、pET-32a-Mx-A。
2鸭Mx-A的原核表达
2.1鸭Mx-A重组蛋白的诱导表达
将阳性重组质粒pET-30a-Mx-A、pET-32a-Mx-A转化至RosettaTM(DE3)pLysS感受态细胞中，经IPTG诱导表达后，获得重组蛋白，重组蛋白rDupET-30a-Mx-A大小约为21KDa，rDupET-32a-Mx-A大小约为29KDa，均与预期大小相符，表达方式均为可溶性表达，如图8、图9。
2.2重组蛋白的纯化
重组蛋白rDupET-30a-Mx-A和rDupET-32a-Mx-A均可被纯化出来，且纯化后的产物与预期目的蛋白大小相符，结果如图10。
实施例2抗鸭Mx-A单克隆抗体的制备
方法：
1动物免疫
将纯化后的重组蛋白rDupET-30a-Mx-A作为免疫原，首免时与等体积的弗氏完全佐剂乳化，其余免疫时与弗氏不完全佐剂乳化，经背部皮下多点注射6周龄BALB/C小鼠(50ug/只)，免疫间隔时间为2周，加强免疫3d后无菌取小鼠脾脏用于细胞融合，收集阴性、阳性血清用于建立筛选阳性杂交瘤细胞株的I-ELISA。
2单克隆抗体的制备
2.1单克隆抗体I-ELISA检测方法的建立
取健康的BALB/c小鼠，作为阴性对照鼠，与免疫小鼠在相同条件下饲养，融合前分别将免疫小鼠和对照小鼠眼球采血，分离血清，-20℃保存备用。
将纯化的rDupET-32a-Mx-A作为检测原。利用ELISA包被液将rDupET-32a-Mx-A检测原分别包被为40ng/孔、20ng/孔、10ng/孔、5ng/孔；每孔100μL，4℃包被8-12h；弃去包被液，PBST洗涤3次，拍干孔内液体，加入5％脱脂乳，300μL/孔，进行封闭，37℃孵育2h；弃去脱脂乳，PBST洗涤3次，拍干孔内液体，用PBST稀释对照血清，分别做1:500、1:1000等倍比稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；弃去孔内溶液，PBST洗涤3次，将HRP标记的羊抗鼠IgG用PBST以1:5000倍进行稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；弃去孔内溶液，PBST洗涤3次，拍干孔内液体，加入TMB显色液，100μL/孔，暗室显色10min，加入终止液50μL/孔终止反应，终止液为H2SO4(1M)，检测OD450nm。判定标准以阳性血清OD450nm≥1.0，阴性血清OD450nm≤0.2，P/N>2.0时，抗原、阳性血清及阴性血清的最大稀释度为最佳工作浓度。
2.2饲养层细胞的制备
在融合前一天，将未进行免疫的BALB/c小鼠眼球采血，分离血清作为阴性血清，颈椎脱臼处死，75％酒精消毒5min后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的解剖板上，用灭菌剪刀剪开皮肤，同时用镊子钝性剥离使腹膜充分暴露。用l0ml一次性注射器吸取含20％胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，全部注入后，再用注射器抽出腹腔内的培养液，加入到准备好的HAT培养液中，调整细胞浓度在2×105个/mL，将细胞悬液混匀后加入到96孔细胞培养板中，100μL/孔，置于37℃5％CO2培养箱中培养。
2.3骨髓瘤细胞的准备
融合前2天对于生长状态良好的骨髓瘤细胞扩大培养，融合当天，将处于生长旺盛期的细胞收集至50ml离心管中，1000r/min离心15min，弃去上清，用不完全1640培养液洗涤一次后，将细胞悬浮，计数，用于融合。
2.4脾淋巴细胞的制备
加强免疫后3天的BALB/c小鼠，眼球采血，颈椎脱臼处死，浸入75％酒精中消毒5min，放入超净工作台中的解剖台上。用灭菌剪刀剪开小鼠皮肤，同时用镊子将小鼠的皮肤拉向两侧，暴露腹膜，换一套剪镊剪开腹膜，即可看到脾脏。取出脾脏，放入装有不完全1640培养液的无菌培养皿中，小心剥离附着在脾脏表面的***和脂肪等。再将脾脏置于另一无菌培养皿中，加入1640不完全培养液，用镊子在灭菌后的200目的铜网上对脾脏进行研磨。研磨充分后，收集培养液并转移至50mL离心管中，1000rpm离心15min，重悬细胞，计数。
2.5细胞融合
将制备好的脾细胞和骨髓瘤细胞悬液，按脾细胞:SP2/0≈8:1～10:1之间的比例混合，加于50mL离心管中，1000r/min离心15min，弃上清，轻弹离心管底，使细胞沉淀充分混匀成糊状，将离心管垂直置于盛有37℃预热的蒸馏水的烧杯中。吸取1mL 37℃预热的融合剂PEG3350，边滴入细胞中边轻轻摇动离心管，轻轻混匀，1min内加完。静置90s，在1min内缓慢滴入37℃预热的不完全1640培养液1mL，边滴边轻轻转动离心管，再重复一次，随后在30s内加入1mL不完全1640培养液，2min内加完7ml预热的不完全1640，1000r/min离心10min离心，弃上清。HAT选择培养液将沉淀细胞悬起，混合均匀。将细胞悬液接种于已加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，每孔100μL，将培养板移至37℃5％CO2培养箱中培养。
2.6阳性杂交瘤细胞株的筛选
每5～7天，采用半换液方式对融合后的细胞进行培养液的更换。待杂交瘤细胞长满孔底1/3～1/2时，取出细胞培养上清100uL，用建立的I-ELISA筛选方法对上清进行检测，同时用SP2/0上清作阴性对照，并设阴阳性鼠血清对照，以P/N≥2.0为判定标准，对阳性孔进行克隆。
2.7杂交瘤细胞的克隆、冻存与复苏
将I-ELISA检测为阳性孔的杂交瘤细胞集落悬起混匀，采用有限稀释法，吸取一定量细胞至无菌小青瓶中进行稀释，稀释至10mL含100个细胞，将稀释好的细胞悬液以每孔100μL加入到含有饲养细胞的96孔细胞培养板中培养。经过2～4次克隆，直至所有克隆化细胞孔阳性率为100％时，即可确定已获得分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
阳性杂交瘤细胞株冻存时，将培养瓶中生长旺盛的杂交瘤细胞利用吸管进行反复吹打、分散均匀后，置于10mL离心管中，1000rpm离心5min，弃掉培养液，收集细胞，用1.5mL细胞冻存液将细胞重悬，加入到细胞冻存管中，做好标记后直接放入细胞程序冻存盒中，先放于-70℃冰箱中，而后投入液氮容器中。
杂交瘤细胞复苏时，从液氮容器中取出冻存管，迅速放入37℃水浴中，摇动使其在1min内迅速融化，而后500rpm离心5min，弃掉冻存液，用完全1640培养液将细胞沉淀悬起，加入到事先盛有适量培养液的细胞培养瓶中，37℃5％CO2恒温培养箱内培养，4h～12h内观察培养瓶中有部分细胞贴壁后，对其进行换液即可。
2.8腹水的制备及纯化
不完全弗氏佐剂，腹腔注射8～12周龄BALB/c小鼠，0.5mL/只，注射后7-10天注射扩大培养的杂交瘤细胞。利用不完全1640培养液将生长旺盛的杂交瘤细胞吹下来，1000rpm离心5min，弃去上清。用不完全1640培养液洗涤细胞一次，重悬细胞并计数，调整细胞浓度为1～2×106个/mL，腹腔注射，0.5mL/只，注射后7～10天密切观察小鼠的生长状态及腹水产生情况，当发现小鼠腹腔有流动性腹水时，及时收集腹水，并以10000rpm离心10min，弃去油脂和细胞沉淀，吸取澄清液体，分装-70℃保存。
腹水纯化，将Protein G填料注入柱子中，轻柔的混合2次，用Binding Buffer A(Na2HPO4 20mM，NaCl 0.15，pH 7.0)平衡柱子2～3次；再加入Binding Buffer A稀释300μL腹水约2ml，4℃结合30min，期间每隔10min转动一下柱子，使目的蛋白与填料充分结合；之后用Elution Buffer B(critric acid 0.1mol，pH 2.0)洗脱目的蛋白，洗脱几次，每次洗脱后收集的流出液立即用等体积的1mol的Tris base(pH10.3)中和成pH8.0，最后经SDSPAGE检测纯化效果。
3分泌抗鸭Mx-A单克隆抗体杂交瘤细胞株的鉴定
3.1杂交瘤细胞株染色体计数分析
在生长旺盛的杂交瘤细胞中加入秋水仙素，使其终浓度为0.5μg/mL，继续培养4～6h。吹下培养瓶中的细胞，将细胞悬液以1000rpm离心10min，弃上清液，加入37℃预热的5mL0.075mol/L KCl低渗液，混悬细胞，37℃处理15-20min；加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3:1混合)1mL，边滴边混匀细胞悬液，1000rpm离心10min，弃上清液；再加入固定液5ml将细胞沉淀重新悬浮并混匀，静置30min后，1000rpm离心10min，弃上清液；重复操作一次后小心吸出上清，保留少许固定液与细胞混匀后吸取1～2滴悬液加至载玻片上；干燥后吉姆萨染色10min；选择染色体分散良好、无重叠、失散的细胞进行镜检观察并计数。
3.2杂交瘤细胞株的稳定性分析
对杂交瘤细胞进行体外多次传代，收集每次传代的细胞上清，用建立的I-ELISA检测方法检测上清OD450nm值，分析杂交瘤细胞株分泌单克隆抗体的稳定性。
4抗鸭Mx-A单克隆抗体的特性鉴定
4.1单克隆抗体亚类鉴定
利用单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，操作步骤参见试剂盒说明书进行。
4.2腹水效价的测定
根据建立好的I-ELISA检测方法，取抗鸭Mx-A单克隆抗体的腹水以1:15、1:30、1:60、1:120、1:240等2倍倍比稀释后作为一抗进行检测，测定OD450nm值，以P/N≥2.0腹水的最大稀释倍数作为其效价值。
4.3单抗的Western blot鉴定
4.3.1原核表达蛋白Western Blot鉴定
将rDupET-32a-Mx-A进行SDS-PAGE处理后半干法转印，将蛋白转印至NC膜上，转印结束后，以5％脱脂乳室温摇床封闭2h；PBST洗膜3次，加入1:100稀释的4B6单克隆抗体，4℃孵育过夜；PBST洗膜5次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温孵育1h；PBST洗膜5次，加入发光液ECL STAR作用1min，将此NC膜置于Western Blot自动曝光仪进行曝光，获取图像。
4.3.2真核表达蛋白western鉴定
将本发明发明人构建的真核质粒pcDNA3.1-Mx，转染鸡胚成纤维细胞(DEF)。常规方法制备CEF，铺制48孔板，培养过夜，待细胞生长至60％-70％时备用。利用脂质体介导的方法进行质粒的转染，转染的方法详见转染试剂LTX说明书。转染后4h，弃去培养液，加入含10％胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h。之后用PBS洗涤细胞3次，每孔加入200μL细胞裂解液(M-PER Mammalian ProteinExtraction Reagent)，并加入终浓度1mM的PMSF，置于冰盒上，不断用枪头吹打细胞，以使蛋白充***解，裂解时间为20min～30min；将六孔板内蛋白悬液移入1.5ml EP管内，4℃，12000rpm离心5min，收取上清，并进行蛋白定量，加入5×蛋白上样缓冲液，煮沸处理10min。作为Western的蛋白样品，保存于-70℃冰箱内备用，转染pcDNA3.1(+)空质粒的对照组进行相同的处理。将蛋白样品进行SDS-PAGE后转印，以5％脱脂乳室温封闭2h；PBST洗膜3次，加入1:100稀释的4B6单克隆抗体，4℃孵育过夜；PBST洗膜4-5次，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温作用1h；PBST洗膜5次，加入适量ECL STAR发光液作用1min，使用Western Blot自动曝光仪进行曝光，曝光图像成功获取后，将此NC膜用PBST洗涤10-15min，再加入20mL碧云天Western Blot一抗二抗去除液，震荡15min后，PBST洗膜5次，重新以5％脱脂乳进行封闭，室温2h；再以鼠源GAPDH单抗为一抗，1:1000稀释使用，HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗，1:5000稀释孵育，进行内参的曝光。
4.4单抗的IFA鉴定
将本发明发明人构建的真核质粒pcDNA3.1-Mx转染鸡胚成纤维细胞(CEF)。转染方法及转染后处理同4.3.2。培养48h之后用PBS洗涤细胞3次，加入适量4％的多聚甲醛固定30min，PBS洗3次；加入4B6单克隆抗体为一抗，以pcDNA3.1(+)空质粒转染孔做阴性对照，37℃作用2h，PBS洗3次；加入1:50倍稀释的FITC标记的山羊抗鼠IgG抗体为二抗，37℃避光作用1h，PBS洗3次，荧光显微镜下观察荧光情况。
结果：
1抗鸭Mx-A单克隆抗体的制备
1.1单克隆抗体I-ELISA检测方法的建立
采用方阵法确定蛋白的最佳包被浓度及阳性血清的最佳稀释倍数，根据棋盘I-ELISA阳性血清孔的OD450nm值接近1.0，阴性血清OD450nm值小于0.2，P/N＞2.0，确定抗原抗体最佳稀释度，重组蛋白rDupET-32a-Mx-A最佳包被量为20ng/孔，阴阳性血清最佳稀释度为1:2000，如表4，I-ELISA试验各影响因素条件的确定，如表5。
表4抗原抗体最佳反应条件的确定
Figure BDA0001689658390000141
Figure BDA0001689658390000151
表5间接ELISA各个影响因素最佳反应条件的确定
Figure BDA0001689658390000152
1.2杂交瘤细胞株的建立
免疫的BALB/c小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合后，经HAT培养液选择性培养，在第3天开始出现融合细胞。选择经几次特异性检测并且OD450nm值持续上升的4B6株杂交瘤细胞株。经3～4次亚克隆，获得能稳定分泌抗鸭MX-A蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为4B6，将该杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号是：CGMCC NO.15287。
2分泌抗鸭Mx-A单克隆抗体杂交瘤细胞株(CGMCC NO.15287)的鉴定
2.1杂交瘤细胞株染色体计数分析
骨髓瘤细胞染色体数目为55～65条，正常小鼠脾细胞的染色体数目为40条，本试验得到4B6株杂交瘤细胞株的染色体数目为100条左右，在正常范围90～110条之间，SP2/0为55条左右在正常范围55～65之间。该值大于脾细胞染色体数目的2倍，表明杂交瘤细胞确为脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成，如图11。
2.2杂交瘤细胞株分泌抗体稳定性分析
将筛选的阳性杂交瘤细胞株扩大培养并传16代，收集每代的细胞上清，通过建立的I-ELISA方法检测细胞上清的OD450nm值，结果发现4B6分泌抗体的稳定性均较好，如图12。
3抗鸭Mx-A单克隆抗体的特性鉴定
3.1单克隆抗体亚类鉴定
根据单抗Ig类/亚类鉴定用试剂盒进行鉴定，4B6单克隆抗体亚类为IgG1。
3.2单克隆抗体效价的测定
根据建立好的I-ELISA方法，将抗鸭Mx-A单抗4B6腹水按2倍倍比稀释测效价，鼠阴阳性血清1:100稀释作对照，4B6腹水效价为1:15728640，如图13，将腹水进行纯化，如图14。
3.3单抗特异性的IFA鉴定
4B6单克隆抗体与转染真核表达质粒pcDNA3.1-Mx的鸡胚成纤维细胞反应，产生较强的绿色荧光信号，而pcDNA3.1(+)空质粒转染的鸡胚成纤维细胞与单抗并未产生荧光信号，表明4B6单克隆抗体可特异性识别真核细胞表达鸭Mx蛋白，如图15，说明制备的4B6单抗可特异性检测鸭Mx蛋白。
3.4单克隆抗体特异性的Western Blot鉴定
将重组蛋白rDupET-32a-Mx-A及真核表达Mx蛋白作为抗原，4B6单抗细胞上清作为一抗，结果发现4B6能与重组蛋白发生良好的反应，如图16；4B6单抗细胞上清作为一抗也可以与转染真核表达质粒pcDNA3.1-Mx的鸡胚成纤维细胞表达的鸭Mx蛋白产生特异性反应，如图17，上述结果同样证实制备的4B6单抗可特异性检测鸭Mx蛋白。
实施例3抗鸭Mx-A单克隆抗体在检测鸭胚组织中的Mx蛋白的应用
方法：
1鸭胚接毒
取15日龄的SPF级鸭胚，通过尿囊腔的方式接毒，每枚接103ELD50DHAV-3，接毒后的检测时间点为0h、6h、12h、24h、48h、96h，分别在这6个时间点收取鸭胚的心肌组织、肝脏组织、脑组织、肌肉组织、肌胃组织、肠组织，每个时间点取3枚胚，保存于-70℃备用；在接毒的同时，取3枚未作处理的SPF鸭胚做为0h空白对照，同样取上述组织备用。
2 Western blot方法检测组织内Mx蛋白的表达情况
取鸭胚组织100mg于-20℃冰箱预冷的研钵中，加入200μL RIPA裂解液，使用前5min加入PMSF蛋白酶抑制剂至终浓度1mM，将全部组织磨碎(此过程注意不要使温度过高)，收集研钵内全部混合液于1.5mL EP管中，用涡旋振荡器震荡10s后，,将EP管放入4℃冰箱内，将组织裂解30min，进行离心：12000rpm，15min，收取上清，与等量2×SDS与DTT进行混合；将样品煮沸处理15min离心，12000rpm，5min，收集的上清就是最后蛋白上样的样品。将鸭胚的6种组织蛋白进行凝胶电泳后，转印至NC膜上，5％脱脂乳于室温封闭2h，以制备的Mx-A蛋白单抗的4B6杂交瘤细胞上清作为一抗，以HRP标记的山羊抗兔IgG作为二抗，1:5000倍稀释使用；加入ECL STAR发光液作用，1min后，使用Western Blot自动曝光仪进行曝光。获得图像后，用PBST洗涤NC膜10-15min，再加入20mL碧云天Western Blot一抗二抗去除液，震荡20min，PBST洗膜5次，每次5min，重新以5％脱脂乳室温封闭2h，再以鼠GAPDH单抗为一抗,1:1000稀释；山羊抗鼠IgG为二抗，1:5000稀释，进行内参的曝光。使用Photo shop及GraphPad Prism 5软件进行Mx蛋白相对表达量(Mx/GAPDH)的灰度分析及计算。
结果：
鸭胚感染103ELD50DHAV-3后，分别于不同时间点采取不同鸭胚组织，经处理后利用本发明制备的抗鸭Mx-A单克隆抗体检测鸭Mx蛋白的表达情况，结果见图18-23，所以结果均进一步证实制备的4B6单抗可特异性检测鸭不同组织表达的Mx蛋白。
鸭胚感染103ELD50DHAV-30h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blo检测心肌组织表达Mx蛋白含量，结果见图18A，从图中可以看出从6h可以检测到心肌组织鸭Mx蛋白的表达；心肌组织Mx蛋白的相对表达情况见图18B，6h表达量最大，24h次之，48h最低。
鸭胚感染103ELD50DHAV-30h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blot检测肝脏组织表达Mx蛋白含量，结果见图19A，从图中可以看出从6h可以检测到肝脏组织鸭Mx蛋白的表达，且0hMx蛋白有本底表达；Mx蛋白的相对表达情况见图19B，12h表达量最大，48h次之，6h、24h和96h较低。
鸭胚感染103ELD50DHAV-3 0h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blot检测脑组织鸭Mx蛋白含量，结果见图20A，从图中可以看出从6h可以检测到脑组织鸭Mx蛋白的表达；Mx蛋白的相对表达情况见图20B，48h表达量最大，96h表达量次之，6h、12h、24h表达量大致相近。
鸭胚感染103ELD50DHAV-3 0h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blot检测肌肉组织鸭Mx蛋白含量，结果见图21A，从图中可以看出从6h可以检测到肌肉组织鸭Mx蛋白的表达；Mx蛋白的相对表达情况见图21B，96h表达量最大，12h次之，24h表达量较低。
鸭胚感染103ELD50DHAV-3 0h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blot检测肌胃组织鸭Mx蛋白含量，结果见图22A，从图中可以看出从6h可以检测到肌胃组织鸭Mx蛋白的表达；Mx蛋白的相对表达情况，见图22B，48h表达量最大，6h表达量次之，24h表达量较低。
鸭胚感染103ELD50DHAV-3 0h、6h、12h、24h、48h、96h后，Western Blot检测肠组织鸭Mx蛋白含量，结果见图23A，从图中可以看出从6h可以检测到肠组织鸭Mx蛋白的表达；Mx蛋白的相对表达情况，见图23B，6h表达量最大，12h表达量次之，24h表达量较低。

Claims (3)

1.一种分泌抗鸭Mx-A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为4B6，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCCNO.15287。
2.由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌产生的抗鸭Mx-A单克隆抗体。
3.权利要求2所述的抗鸭Mx-A单克隆抗体在制备检测鸭Mx蛋白试剂中的应用。
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