CN110804582A - 一种体细胞重编程的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种体细胞重编程的方法，包括以下步骤：准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c‑Myc的一种或多种；配置编程用培养基：在基础培养基中添加有代血清添加剂、生长因子及小分子化合物；然后往基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，得到诱导多能干细胞。本发明所述方法，极大提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。利用本发明所述方法可以在无血清的培养基中促进体细胞间充质向上皮转变，从而提高不同来源体细胞的重编程效率，为今后诱导多能干细胞在再生医学的应用提供技术支撑。

Description

一种体细胞重编程的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体的，本发明涉及一种体细胞重编程的方法及其应用。
背景技术
随着干细胞研究的深入，科学家们发现终末分化的哺乳动物细胞也是具有全能性的，成体细胞可以被重编程，改变基因表达谱从而改变它的命运，重新拥有多能性或者直接转分化变成另一种细胞。早期体细胞重编程的方法主要有两种：核移植和细胞融合，但是这两种方法仍然需要涉及到胚胎，在伦理方面受到极大的限制。2006年，日本Yamanaka实验室在重编程领域获得了突破性的研究成果，发现通过外源表达四个转录因子Sox2,Oct4,Klf4和c-Myc可以使小鼠成纤维细胞重编程为多能干细胞(iPSC)，为干细胞研究开拓了一个新的方向，并因此获得诺贝尔奖。随后的短短几年间，体细胞重编程领域的进展异常迅猛。虽然诱导多能干细胞研究初期遇到许多问题，包括外源癌基因***，效率低下，甚至还有自体免疫反应等问题，但是各种改进方法的提出大大促进了重编程技术的机制及应用研究。通过方法改进使重编程的体细胞不仅仅是小鼠成纤维细胞，重编程技术被应用到各种物种及细胞中。科学家们还筛选出各种重编程因子组合，不仅提高了重编程效率与质量，而且还避免了癌基因的***，并且还发展了蛋白诱导，小分子化合物诱导等方法。
重编程技术的目标就是在临床上解决病人特异的多能细胞的大量获得的难题。科学家已经在实验室成功用重编程技术和基因修复技术治疗了镰刀型贫血的小鼠。虽然这个技术离临床还很遥远，但是科学家们已经成功诱导出许多单基因突变疾病的病人iPS细胞，用作药物筛选和基因修复。重编程和发育分化一样是细胞命运的改变。但是在细胞向其他细胞转变的过程中发生了什么，也是人们迫切想知道的。
然而，目前如何改变细胞命运尤其是促进体细胞的重编程，仍有待进一步研究。
发明内容
本发明目的之一在于提供一种体细胞重编程的方法，该方法能够有效提高体细胞重编程的效率。
实现上述目的的技术方案如下。
一种体细胞重编程的方法，包括以下步骤：
准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种；
配置编程用培养基：在无血清成分的基础培养基中添加有代血清添加剂、生长因子及小分子化合物，得到无血清基础培养基；然后往无血清基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；得到配置好的编程用培养基；
将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，约2天后即可使细胞发生间质向上皮转变，约8-10天后即得到诱导多能干细胞。
在其中一些实施例中，所述代血清添加剂是N2、B27、KSR中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述N2的浓度为0％-1％，所述B27的浓度在0％-2％，所述KSR的浓度在0-15％，三者不同时为0。
在其中一些实施例中，所述生长因子包括bFGF和Lif中的至少一种，所述小分子化合物包括维生素C。
在其中一些实施例中，所述bFGF的浓度为0-10ng/ml，所述Lif的浓度为500-2000units/ml；更优选地，包括有bFGF和Lif，所述bFGF的浓度为5ng/ml，所述Lif的浓度为2000units/ml。
在其中一些实施例中，所述维生素C的浓度为10-200μg/ml，更优选地，维生素C的浓度为50μg/ml。
在其中一些实施例中，所述化合物是乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，CDP-乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，磷脂酰乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，其中三者不同时为0。
在其中一些实施例中，所述乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述CDP-乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述磷脂酰乙醇胺的浓度为1mg/ml。
在其中一个实施例中，所述代血清添加剂是的浓度为1％的N2。
在其中一些实施例中，所述的基础培养基为Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM)，Minimal Essential Medium(MEM)，Basal Medium Eagle(BME)，F-12，RPMI1640，αMinimal Essential Medium(αMEM)中的一种或两种以上的混合物。
在其中一个实施例中，基础培养基为DMEM。
在其中一些实施例中，所述体细胞表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc中一种或多种。
在其中一些实施例中，所述体细胞表达Sox2，Klf4，和Oct4，不表达c-Myc。
本发明的另一目的是提供由上述体细胞重编程的方法制备得到的诱导多能干细胞。
本发明的发明人，在不同来源的表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种体细胞配合添加乙醇胺、CDP-乙醇胺、磷脂酰乙醇胺，并进一步结合优选的代血清添加剂、生长因子及小分子化合物和体细胞的特点，提供了所述体细胞重编程的方法，该方法可以很好的促进所述不同来源体细胞重编程的效率。本发明向无血清基础培养基中添加一种或多种化合物，可以极大提高体细胞重编程为诱导多能干细胞的效率。利用本发明所述方法可以在无血清的培养基中促进体细胞间充质向上皮转变，从而提高不同来源体细胞的重编程效率，为今后诱导多能干细胞在再生医学的应用提供技术支撑。
附图说明
图1在N2含量为1％的基础无血清培养基中添加乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率和免疫荧光及嵌合鼠实验鉴定重编程得到的诱导多能干细胞克隆具有多能性的结果示意图。
图2在N2含量为1％的基础无血清培养基中添加乙醇胺可以提高小鼠尾尖成纤维细胞的重编程效率和在KSR含量为15％的基础无血清培养基中添加乙醇胺可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率的结果示意图。
图3添加乙醇胺可以促进小鼠成纤维细胞间质上皮转变，促进上皮细胞标志基因表达，降低***标志基因表达的结果示意图。
具体实施方式
下列实施例举例了发明人的标准实验室实践，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技术。
定义和技术
1.除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、微生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel等人编著(1987))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press，Inc.)：PCR 2：A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编著，(1995))，Harlow和Lane编著，(1988)ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL and ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编著，(1987))；W.French Anderson等人，HANDBOOK OF STEM CELLS，卷2。
2.除非另外说明，本文中所用的术语均具有本领域技术人员常规理解的含义，为了便于理解本发明，将本文中使用的一些术语进行了下述定义。
所有的数字标识，例如pH、温度、时间和浓度，包括范围，都是近似值。要了解，虽然不总是明确的叙述所有的数字标识之前都加上术语“约”。也要了解，虽然不总是明确的叙述，本文中描述的试剂仅仅是示例，其等价物是本领域已知的。
本发明所用的术语“基础培养基”是指任何能够支持细胞生长的培养基。基础培养基提供了标准的无机盐例如锌、铁、镁、钙和钾，以及维生素、葡萄糖、缓冲***以及关键的氨基酸。可以用于本发明的基础培养基包括但不限于Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium(DMEM),Minimal Essential Medium(MEM),Basal Medium Eagle(BME),F-12,RPMI1640,αMinimal Essential Medium(αMEM)。本领域的技术人员已知如何选择适用于所培养的细胞的基础培养基。在以下具体的实施方案中，基础培养基是单独使用DMEM。
本发明所用的术语“代血清添加剂”是指在细胞培养中，用于加入到基础培养基中，以部分或全部替代血清在支持细胞生存生长作用方面作用的添加剂，一般包括胰岛素、转金属蛋白、微量元素、维生素等因子，这些因子一般并不包含于基础培养基中，而是由通常培养细胞使用的血清所提供。代血清添加剂包含支持细胞生长的至少一种或多种以下组分：一个或多个胰岛素及胰岛素替代物、一个或多个转金属蛋白及转金属蛋白替代物、一个或多个微量元素、一个或多个维生素、一个或多个氨基酸、一个或多个激素及类激素化合物、血清白蛋白或血清白蛋白替代物、以及一个或多个脂类等。已知多种商业化的代血清添加剂，例如KonckOut Serum Replacement(KSR)，N2，B27，Insulin-Transferrin-SeleniumSupplement(ITS)，G5等，这是本领域技术人员容易获得的。优选地，本文中所用的代血清添加剂由N2，B27和/或KSR按一定比例混合得到的混合添加剂，更优选地，N2的浓度在0％-1％之间，B27的浓度在0％-2％之间，KSR的浓度在0-15％之间；最优选的方案是在最终培养基中N2的浓度为1％。以上％均指体积浓度。
本发明所用的生长因子包括bFGF，Lif，或者是bFGF和Lif的混合物；优选地，在最终培养基中bFGF的浓度在0-10ng/ml之间，Lif的浓度在500-2000units/ml之间；更优选地，在最终培养基中bFGF的浓度为5ng/ml，Lif的浓度为2000units/ml。
本发明所用的小分子化合物是指维生素C。在本发明的培养基中，优选培养基中添加的维生素C的浓度可以在10-200μg/ml之间，更优选地，维生素C的浓度为50μg/ml。
本发明在基础无血清培养基中添加的化合物包括乙醇胺，CDP-乙醇胺和磷脂酰乙醇胺，或者是它们的混合物；优选地，在最终培养基中乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，CDP-乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，磷脂酰乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，但乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺不同时为零。更优选地，在最终培养基中乙醇胺的浓度为1mg/ml，不包含CDP-乙醇胺和磷脂酰乙醇胺。
根据本发明的无血清的基础培养基是通过本领域技术人员已知的常规技术制备的，如Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验指南，第3版(2002)中所述的混合配制血清的技术和条件。
本发明中所用的术语“体细胞”是相对于“生殖细胞”以及“胚胎干细胞”而言的概念，其是由“胚胎干细胞”分化或内细胞团继续发育产生的不再具备多能性，一般具有具体功能的细胞，其一般从发育阶段位于囊胚期(在小鼠中具体为受精后3.5天)之后的胎鼠或成鼠取材，取材时一般避免取到可能具有多能性的生殖细胞及其来源(如精原干细胞、生殖嵴干细胞等)。本文中所用的体细胞优选来源于人、大鼠或小鼠，更优选地，来源于小鼠。本文中的体细胞可以是机体内任何类型的体细胞，优选为成纤维细胞。所述体细胞可以是以下任一种：成纤维细胞、尾尖成纤维细胞、骨髓衍生的单核细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞、外周血单核细胞、巨噬细胞、肝细胞、角质细胞、口腔角质细胞、头发毛囊真皮细胞、胃上皮细胞、肺上皮细胞、滑膜细胞、肾细胞、皮肤上皮细胞、成骨细胞、神经干细胞和真皮细胞。上述体细胞使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种。使细胞表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc蛋白的方法不受特别限制，例如可以向细胞中引入能够表达这些蛋白的基因即可。本发明以下具体实施例中，所述体细胞为成纤维细胞，表达Sox2，Klf4，和Oct4，不表达c-Myc。
本文所述的术语“体细胞重编程”是指一种分化完全的细胞丢失其原有表型而转变为多能干细胞的现象，即从体细胞向多能干细胞的转变。
本文所述的术语“间质向上皮转变”是指间充质样的细胞转变为上皮样细胞的现象。
诱导多能干细胞：iPS细胞，induced pluripotent stem cell，为分化细胞经过重编程因子处理回复为多能干细胞的状态。
除了特别说明，本文中提及的各种试剂均来自英杰生命科学公司(Invitrogen)或者西格玛公司(Sigma)。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
1.小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的分离与培养
取孕龄13-14天的小鼠，颈椎脱臼处死，浸泡在0.5％新洁尔灭中30s，取出后，将其固定在无菌的铺有吸水纸的解剖盘上，腹面向上。用75％的乙醇清洁孕鼠腹部，防止腹毛黏附在子宫及其他腹腔脏器上，造成污染。用无菌手术器械剖开孕鼠腹部皮肤层，肌肉层，暴露小鼠腹腔。用新的无菌手术器械去除黏连到子宫上的脂肪和***，迅速将小鼠子宫取出。将其放入预装有含双抗的PBS的10cm培养皿中。在超净工作台内，用含双抗的PBS洗涤小鼠子宫3次。用无菌眼科剪剪开包膜，将小鼠胚胎与胚外组织分离，将胚胎放置于新的预装有含双抗PBS的10cm培养皿中。用弯头眼科剪将小鼠胚胎剪至1-3mm3大小。向培养皿中加入适量0.25％和0.05％混合的胰蛋白酶，37℃条件下，消化10min，至溶液变浑浊，加入等体积MEF细胞培养基，终止消化。轻轻吹打混匀5-10次，静置。将细胞悬液转移至50ml离心管中，200g，离心5min。弃上清，向沉淀中加入MEF细胞培养基，轻轻吹打重悬，将细胞分种到15cm培养皿中，补充适量培养基，混匀，于37℃，5％CO2条件下培养。于第二天，观察细胞状态，更换新鲜培养基，标记细胞代数为P0。MEF细胞培养基(500ml)包含：高糖DMEM培养基430ml，FBS 60ml，GlutaMax和NEAA各5ml。
2.病毒包装及感染
转染所用的细胞为Plat-E病毒包装细胞系。Plat-E细胞接种到培养皿中：10厘米盘为800万；六厘米盘为320万；六孔板每孔150万。对应所需DNA量为10微克；4微克；2微克。
细胞接种12小时或过夜即可转染；转染前观察细胞密度达70％-90％均可。转染前换新鲜MEF培养基：10厘米盘为7.5毫升；六厘米盘为3毫升；六孔板每孔1.5毫升。
转染时，所用各种试剂的量如下表：
10厘米盘 6厘米盘 六孔板每孔
DNA 10微克 4微克 2微克
PEI 40微升 16微升 8微升
OPTI-MEM 1毫升 400微升 200微升
转染时，先将DNA和OPTI-MEM加好，混匀，接着加入PEI，混匀，剧烈颠倒混匀，然后静置13-15分钟，然后将混合液加入到已换液的Plat-E细胞中，做好标记。将培养皿轻轻摇晃，使其均匀。将细胞放入培养箱中。8-10小时后，给细胞换MEF培养基：10厘米盘为10毫升；六厘米盘为4毫升；六孔板每孔2毫升。
Plat-E细胞转染48小时后，即可包装出病毒。此时，用注射器收集上清，培养皿中再次加入适量新鲜培养基(10厘米盘为10毫升)。同时，收集到的上清用0.45微米的滤器过滤到离心管中，补加适量的新鲜培养基(总体积10厘米盘大概12毫升)，加入polybrene混匀，可保存在4℃，也可立即用作感染。再24小时后，按同样方法收集病毒，为二次感染。此时的细胞可丢弃。
将收集的病毒按实验需求，可感染预先准备的细胞。10厘米盘需病毒6毫升；六厘米盘3毫升，六孔板每孔2毫升。
3.培养基的配置：
无血清培养基包括基础培养基DMEM、代血清添加剂N2(含量为1％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)及化合物乙醇胺(1mg/ml)。
4.体细胞重编程
体细胞重编程主要是用外源带Sox2，Klf4，Oct4的病毒感染细胞。一般来说，所用的各种病毒用量相同。
二次感染后的MEF细胞换用各种诱导培养基，我们使用的是基础培养基DMEM加入代血清添加剂N2(含量为1％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)作为对照，添加乙醇胺(1mg/ml)，CDP-乙醇胺(1mg/ml)，磷脂酰乙醇胺(1mg/ml)作为处理组。之后，每天需要更换新鲜培养基，直到所需的天数(8-10天)。如果要计量iPS细胞的诱导效率，就要采用OG2-MEF。当iPSCs克隆有GFP荧光时，表明了内源Oct4的表达，是成功重编程的标志。此时可以在显微镜下数出GFP荧光阳性的克隆，即为iPS细胞的诱导效率。需要注意的是，GFP阳性克隆是指该克隆大部分或全部细胞都发出绿色荧光；同时，需要比较时，不同孔之间对GFP阳性克隆判断的标准要一致，并每次实验都需要3个副孔，以求平均减少误差。
免疫荧光、嵌合鼠、Western、荧光定量PCR等为本领域已知的常规技术，在此不再具体说明。
实施例1：乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺可以提高小鼠成纤维细胞重编程效率
如图1所述，在含有基础培养基DMEM、代血清添加剂N2(含量为1％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)的培养基中中分别添加乙醇胺(1mg/ml)，CDP-乙醇胺(1mg/ml)，磷脂酰乙醇胺(1mg/ml)培养8天后，都可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的重编程效率，使诱导多能干细胞克隆数大大提高(图1A)。利用免疫荧光和嵌合鼠的方法可以鉴定重编程得到的多能干细胞的多能性，免疫荧光实验结果显示对照组及乙醇胺组得到的诱导多能干细胞都表达多能性蛋白Oct4，Rex1及SSEA1(图1B)。嵌合鼠实验显示对照组及乙醇胺组得到的诱导多能干细胞都能产生有生殖传递能力的嵌合鼠，#标记为嵌合鼠，*标记为嵌合鼠后代(图1C)。
实施例2：乙醇胺可以提高小鼠尾尖成纤维细胞重编程效率，且可以在含KSR的基础无血清培养基中提高重编程效率。
如图2所述，在含有基础培养基DMEM、代血清添加剂N2(含量为1％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)的培养基中添加乙醇胺(1mg/ml)，培养小鼠尾尖成纤维细胞10天后，可以提高小鼠尾尖成纤维细胞的重编程效率，使诱导多能干细胞克隆数大大提高(图2A)。在含有基础培养基DMEM、代血清添加剂KSR(含量为15％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)的培养基中中添加乙醇胺(1mg/ml)，培养小鼠尾尖成纤维细胞10天后，可以提高小鼠尾尖成纤维细胞的重编程效率,使诱导多能干细胞克隆数大大提高(图2B)。
实施例3：乙醇胺可以促进小鼠胚胎成纤维细胞的间质上皮转变。
如图3所述，在含有基础培养基DMEM、代血清添加剂N2(含量为1％)、生长因子bFGF(浓度为5ng/ml)和Lif(浓度为2000units/ml)、小分子化合物维生素C(浓度为50μg/ml)的培养基中添加乙醇胺(1mg/ml)，培养小鼠胚胎成纤维细胞2天后，可以促进小鼠胚胎成纤维细胞发生间质上皮转变，利用荧光定量PCR技术发现乙醇胺促进上皮细胞标志基因表达，降低***标志基因表达(图3A)。利用Western技术发现乙醇胺可以提高小鼠胚胎成纤维细胞的上皮细胞标志蛋白表达(图3B)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种体细胞重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：
准备不同来源的体细胞，使之表达Sox2，Klf4，Oct4，c-Myc的一种或多种；
配置编程用培养基：在无血清成分的基础培养基中添加代血清添加剂、生长因子及小分子化合物，得到无血清基础培养基；然后往无血清基础培养基中添加化合物，颠倒混合均匀；得到配置好的编程用培养基；所述代血清添加剂是N2、B27、KSR中的至少一种，所述生长因子包括bFGF和Lif中的至少一种，所述小分子化合物包括维生素C；所述化合物是乙醇胺，CDP-乙醇胺，磷脂酰乙醇胺中的至少一种；
将所述体细胞于所述编程用培养基中进行培养，约2天后即可使细胞发生间质向上皮转变，约8-10天后得到诱导多能干细胞。
2.根据权利要求1所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述N2的浓度为0％-1％，所述B27的浓度在0％-2％，所述KSR的浓度在0-15％，三者不同时为0。
3.根据权利要求1所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述bFGF的浓度为0-10ng/ml，所述Lif的浓度为500-2000units/ml；更优选地，包括有bFGF和Lif，所述bFGF的浓度为5ng/ml，所述Lif的浓度为2000units/ml。
4.根据权利要求1所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述维生素C的浓度为10-200μg/ml，更优选地，维生素C的浓度为50μg/ml。
5.根据权利要求1-4任一项所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，CDP-乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，磷脂酰乙醇胺的浓度为0-2mg/ml，其中三者不同时为0。
6.根据权利要求5所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述CDP-乙醇胺的浓度为1mg/ml，所述磷脂酰乙醇胺的浓度为1mg/ml；优选地，所述代血清添加剂是浓度为1％的N2。
7.根据权利要求5所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述的基础培养基为DMEM培养基，MEM培养基、αMEM培养基中的一种；优选为，所述基础培养基为DMEM。
8.根据权利要求5所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述体细胞表达Sox2，Klf4，和Oct4，不表达c-Myc。
9.根据权利要求5所述的体细胞重编程的方法，其特征在于，所述体细胞是机体内任何类型的体细胞，优选成纤维细胞。
10.根据权利要求1-9所述体细胞重编程的方法制备得到的诱导多能干细胞。
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