CN110551644A - 通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种通过调控细胞壁组成蛋白合成构建的低产高级醇的酿酒酵母菌株及其应用。本发明为了解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母细胞壁组成蛋白的合成，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株，能够在保持良好发酵性能的前提下，达到了低产高级醇的效果，为酿造风味良好、口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。

Description

通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种通过调控细胞壁组成蛋白合成构建的低产高级醇的酿酒酵母菌株及其应用。

背景技术：

高级醇是啤酒酿造过程中，酿酒酵母产生的主要风味代谢产物之一。高级醇，俗称杂醇油，是指具有3个及3个以上碳链骨架的一类醇的统称，是形成啤酒风味和口感的重要的化学物质之一。啤酒中的高级醇类物质主要有正丙醇、正丁醇、2-甲基-1-丙醇(异丁醇)、3- 甲基-1-丁醇(异戊醇)、2-甲基-1-丁醇(活性戊醇)、2-苯乙醇、色醇、对羟基苯乙醇(酪醇) 等。适量的高级醇具有使啤酒口感协调、酒体丰满的作用，但高级醇含量过高，会导致啤酒形成异杂味，不仅影响啤酒的饮用口感和风味质量，而且饮用后还会产生口渴、头痛等症状，对饮用者的身体产生明显的副作用，不利于饮用者的身体健康。

成品啤酒中80％左右的高级醇是在啤酒主发酵阶段由酵母的生长和繁殖活动所产生的。酿酒酵母吸收麦芽汁中游离的氨基酸，并利用氨基酸中的氨基合成自身生长繁殖所需的蛋白质。当氨基酸中的氨基被利用后，剩下的α-酮酸经过一系列的非可逆性反应最后生成一种代谢副产物，即为高级醇。这一代谢途径最初是由德国化学家费利克斯·埃尔利希(Felix Ehrlish) 于1904年提出的，因此也被称为埃尔利希途径(Ehrlish pathway)，即分解代谢途径。此后，哈里斯研究糖代谢时发现，葡萄糖经EMP途径生成的代谢产物-丙酮酸，经系列反应后可以生成α-酮酸，因此在1953年提出了高级醇的合成代谢途径，也被称为哈里斯途径(Harris pathway)。综上所述，酿酒酵母合成高级醇的代谢途径主要有两条：一条是α-酮酸分解代谢途径，即氨基酸分解代谢途径；另一条为α-酮酸合成代谢途径，即高级醇合成代谢途径。

高级醇主要由酿酒酵母的代谢活动所产生的，在啤酒发酵过程中受酵母菌株和发酵原料组成、发酵工艺条件等外界条件的共同影响。酵母菌株对高级醇生成的影响，主要体现在酵母菌种类型和酵母细胞所处的生理状态。因为高级醇的生成与酵母菌株合成蛋白质的生命活动密切相关，在诸多影响高级醇生成的因素中，酵母菌株起着决定性的作用。一般来说，粉末性酵母比凝聚性酵母的高级醇生成量要高；同化率强、发酵度高的菌株倾向于形成更高浓度的高级醇。发酵原料是酵母生长繁殖、代谢发酵的营养基质，为酵母提供碳源、氮源、无机元素等所需的营养物质；而发酵原料的种类和配比决定着酵母的代谢反应，进而影响酵母在生长、繁殖过程中所产生的代谢产物，这些代谢产物的种类和浓度决定了成品啤酒的口感和风格。小麦芽、小麦、大米等含有丰富蛋白质的原料，在提高啤酒泡持性的同时也会提高啤酒中高级醇的含量。玉米、高粱、蔗糖和淀粉糖浆等含有可溶性氮很少的辅料，会降低麦芽汁的总氮含量，进而有利于降低高级醇的含量。发酵工艺对高级醇形成的影响，主要体现在发酵温度、麦芽汁充氧水平、麦芽汁pH值、发酵压力等方面。对发酵温度而言，发酵前期温度较高时，酵母代谢活性强、增殖速度快，酒液对流加剧，有利于高级醇生成，而较低的发酵温度对高级醇的产生有明显抑制作用。发酵温度为28℃时，高级醇的生成速度最大；20℃时，有最高的高级醇生成量。麦汁中的含氧量越高，酵母传代次数越多，形成高级醇的量将越多，反之则越少。麦芽汁充氧水平高于9mg/L，或采用纯氧通气，在发酵中通气搅拌，均会导致高级醇的增加，正丙醇增加最为剧烈。加压发酵，酵母繁殖代数减少、发酵速度减缓，高级醇的合成量则会降低。

针对啤酒中高级醇含量高的问题，科研工作者已采取多种措施来解决此问题。王国正等利用常温常压等离子体诱变技术得到一株高级醇生成量比亲本菌株降低了20％的酿酒酵母菌株；蔡洋等对经过航空诱变的上面发酵酵母303进行分离筛选得到1株性能优良的低产高级醇的上面发酵啤酒酵母；袁仲等将低能氮离子注入和超高压处理技术结合，获得一株高级醇合成量适宜的优质全小麦酿酒酵母。

近年来，有许多关于酿酒酵母高级醇代谢基因改造的研究报道。Park等以亮氨酸营养缺陷型LEU2基因缺失突变株为出发菌株，在敲除ALD6、BAT1基因的基础上过表达基因ILV2、 ILV3、ILV5、ARO10、ADH2、LEU2、LEU3、LEU4，构建的突变株异戊醇的生成量较出发菌株提高了34倍。Chen等研究发现通过同时过表达酿酒酵母缬氨酸代谢途径中的ILV2、ILV3、ILV5、BAT2基因可以提高异丁醇的生产量，而在此突变株的基础上过表达ILV6基因反而会降低异丁醇的生成量。张翠英等构建的BAT2部分缺失、ATF1过表达的酿酒酵母突变株，其高级醇的生成量分别比出发菌株降低了51％。所有这些大多是围绕下面发酵酵母进行的，而针对小麦啤酒所用的上面发酵酵母高级醇代谢相关基因的改造与育种却鲜有报道。

小麦啤酒以小麦芽为原料，采用上面发酵法酿制的啤酒，具有小麦芽特有的香气、细腻洁白的泡沫、浓郁醇厚的口感、强烈的杀口力等显著的风味特点。同时，小麦麦芽与大麦麦芽相比，具有以下优势：(1)小麦是第二大粮食作物，产量仅次于玉米，且种植地域广、价格便宜；(2)小麦麦芽淀粉含量高，浸出率高达83-85％；比大麦麦芽高出3至5个百分点，有利于降低生产成本；(3)小麦麦芽的粗、细粉差偏高，蛋白溶解度偏高，能赋予成品啤酒丰富细腻的泡沫，提高泡持性；(4)小麦芽中的α-淀粉酶等酶类含量高、活力强，有利于缩短液化、糖化时间，提高可发酵性糖的含量；(5)小麦芽花色苷含量低，利于啤酒的非生物稳定性，对降低口感涩味也有利。小麦啤酒由于其较高的发酵温度以及原料中丰富的蛋白质含量导致成品酒中高级醇含量高达300mg/L以上，而普通大麦啤酒的高级醇含量一般在100mg/L以下。较高的高级醇含量将导致饮用后产生口渴、头痛等症状，不利于饮用者的身体健康，严重制约了小麦啤酒的发展，因此选育低产高级醇的酿酒酵母对小麦啤酒的发展至关重要。

发明内容：

本发明的目的是解决酿酒酵母在啤酒生产中合成过多高级醇的问题，通过调控酿酒酵母细胞壁组成蛋白的合成，构建一种低产高级醇的酿酒酵母菌株。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

本发明提供一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的GPI-锚定蛋白基因构建的；

进一步地，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR1，其Gene ID为：856729，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ ID NO:1所示；

进一步地，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR3，其Gene ID为：854804，核苷酸序列见核苷酸序列表中SEQ ID NO:2所示；

进一步地，所述敲除为单敲除或双敲除；

优选地，所述酿酒酵母为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929；

更优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-Δtir1-k-p，是通过单敲除酿酒酵母S17中的TIR1基因获得的；

更优选地，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔtir3-k-p，是通过双敲除酿酒酵母S17中的TIR3基因获得的；

本发明还提供上述低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)敲除GPI-锚定蛋白基因的低产高级的醇酵母菌株的构建

1)以酿酒酵母基因组为模板，用引物分别PCR得到敲除GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂；以pUG6质粒为模板，用引物得到KanMX表达盒；

2)将整合片段敲除GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂及KanMX表达盒，利用醋酸锂转化到酿酒酵母宿主中，利用酵母体内同源重组的原理，筛选得到敲除重组菌株；

(2)KanMX筛选标记的去除及pSH-Zeocin质粒的丢弃

(3)当构建双敲除菌株时，设计新的GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂引物，并重复步骤(1)、(2)。

本发明还提供上述基因工程菌在酿酒中的应用。

采用上述基因工程菌酿制啤酒的方法如下：

将上述基因工程菌按照10％w/v的接种量接种于12°P麦汁中，在密闭条件下，20℃，静置发酵，每隔12h称重一次，当12h的失重量小于0.1g时，发酵即可结束。

发酵结束后S17-Δtir1-k-p和S17-DΔtir3-k-p高级醇生成的总量分别为226.45mg/L、213.28 mg/L，与原始菌株相比，同比下降了30.7％和38.8％。

有益效果：

1、本发明提供的酿酒酵母基因工程菌能够在保持良好发酵性能的前提下，达到了低产高级醇的效果，为酿造风味良好、口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。

2、本发明选育得到的酿酒酵母S17-tir1-k-p和S17-DΔtir3-k-p高级醇生成的总量明显降低：亲本菌S17高级醇生成的总量为296.01mg/L，而重组酿酒酵母S17-Δtir1-k-p和 S17-DΔtir3-k-p高级醇生成的总量分别为226.45mg/L、213.28mg/L，同比下降了30.7％和 38.8％。

附图说明：

图1单敲除TIR1上下同源臂及KanMX表达盒

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以酿酒酵母S17基因组为模板，T1A-F和T1A-R为引物对PCR扩增的结果(662bp单一条带)；2：以酿酒酵母S17基因组为模板，T1B-F和 T1B-R为引物对PCR扩增的结果(566bp单一条带)；3：以质粒pUC6基因组为模板，T1K-F 和T1K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。

图2单敲除TIR1验证图

其中，DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δtir1的基因组为模板，T1-1-F与T1-1-R 为引物对PCR扩增得到的片段(1687bp单一片段)；2：以重组菌株S17-Δtir1的基因组为模板， T1-2-F与T1-2-R为引物对PCR扩增得到的片段(1717bp单一片段)；3：以S17的基因组为模板，T1-1-F与T1-1-R为引物对PCR扩增得到的结果；4：以S17基因组为模板，T1-2-F与 T1-2-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图3剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δtir1的基因组为模板，K-F与K-R 为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-Δtir1-k基因组为模板，K-F与 K-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图4丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-Δtir1-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得。

图5单敲除TIR3上下同源臂及KanMX表达盒

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以酿酒酵母S17基因组为模板，T3A-F和T3A-R为引物对PCR扩增的结果(496bp单一条带)；2：以酿酒酵母S17基因组为模板，T3B-F和 T3B-R为引物对PCR扩增的结果(676bp单一条带)；3：以质粒pUC6基因组为模板，T3K-F 和T3K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。

图6单敲除TIR3验证图

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δtir3的基因组为模板，T3-1-F与 T3-1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1517bp单一片段)；2：以重组菌株S17-Δtir3的基因组为模板，T3-2-F与T3-2-R为引物对PCR扩增得到的片段(1204bp单一片段)；3：以S17 的基因组为模板，T3-1-F与T3-1-R为引物对PCR扩增得到的结果；4：以S17基因组为模板， T3-2-F与T3-2-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图7剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-Δtir3的基因组为模板，K-F与K-R 为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-Δtir3-k基因组为模板，K-F与 K-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图8丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-Δtir3-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图9双敲除TIR3上下同源臂及KanMX表达盒

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以酿酒酵母S17基因组为模板，DT3A-F和DT3A-R为引物对PCR扩增的结果(378bp单一条带)；2：以酿酒酵母S17基因组为模板，DT3B-F 和DT3B-R为引物对PCR扩增的结果(290bp单一条带)；3：以质粒pUC6基因组为模板， DT3K-F和DT3K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)。

图10双敲除TIR3验证图

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔtir3的基因组为模板，DT3-1-F 与DT3-1-R为引物对PCR扩增得到的片段(1444bp单一片段)；2：以S17-Δtir3-k的基因组为模板，DT3-1-F与DT3-1-R为引物对PCR扩增得到的结果；3：以重组菌株S17-DΔtir3的基因组为模板，DT3-2-F与DT3-2-R为引物对PCR扩增得到的片段(1491bp单一片段)；4：以S17-Δtir3-k因组为模板，DT3-2-F与DT3-2-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图11剔除KanMX抗性基因重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以重组菌株S17-DΔtir3的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2：以S17-Δtir3-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图12丢弃pSH-Zeocin质粒重组菌株的验证

其中，M：DL5000 DNA marker；1：以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2：以S17-DΔtir3-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果。

图13啤酒发酵实验中的高级醇测定。

图14小麦啤酒发酵工艺路线。

具体实施方式：

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的酿酒酵母是可以采用任何来源的酿酒酵母菌株，以下实施例仅以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929为例作进一步的解释说明。

表1本实施例的重组菌株

表2本实施例所用引物

实施例1：单敲除TIR1基因的酿酒酵母菌株的构建

菌株主要构建过程如下：

1)敲除TIR1一个等位基因所需片段的扩增

以酿酒酵母S17基因组为模板，T1A-F和T1A-R为引物对PCR扩增出TIR1基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为662bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，T1B-F和T1B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为566bp；以质粒pUC6基因组为模板，T1K-F 和T1K-R为引物对PCR扩增出TIR1基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp，如图1)。

2)敲除TIR11一个等位基因的重组酵母菌株的构建

将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株 S17中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

3)敲除TIR1一个等位基因的重组酵母菌株的验证

根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：T1-1-F，T1-1-R，T1-2-F，T1-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1687bp条带，下游验证得到1717bp条带(验证图见图2)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中TIR1的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δtir1。

4)重组菌株S17-Δtir1中KanMX抗性基因的剔除

将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL 的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带 (验证图见图3)。说明S17-Δtir1菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为S17-Δtir1-k。

5)重组菌株S17-Δtir1-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δtir1-k接种于装有新鲜YEPD液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证(验证图见图4)，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δtir1-k-p。

实施例2：双敲除TIR3基因的酿酒酵母菌株的构建

菌株主要构建过程如下：

1)敲除TIR3一个等位基因所需片段的扩增

以酿酒酵母S17基因组为模板，T3A-F和T3A-R为引物对PCR扩增出TIR3基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为496bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，T3B-F和T3B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为676bp；以质粒pUC6基因组为模板，T3K-F 和T3K-R为引物对PCR扩增出TIR3基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp (图5)。

2)敲除TIR13一个等位基因的重组酵母菌株的构建

将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株 (S17)中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

3)敲除TIR3一个等位基因的重组酵母菌株的验证

根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：T3-1-F，T3-1-R，T3-2-F，T3-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1517bp条带，下游验证得到1204bp条带(图6)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中TIR3的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δtir3。

4)重组菌株S17-Δtir3中KanMX抗性基因的剔除

将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到步骤3)得到的重组菌株中，涂布于含100μg/mL 的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并利用引物K-F和K-R通过PCR验证KanMX抗性基因无条带 (图7)。说明S17-Δtir3菌株剔除KanMX抗性基因成功。命名为S17-Δtir3-k。

5)重组菌株S17-Δtir3-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δtir3-k接种于装有新鲜YEPD液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取转接培养后的酵母基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证(图8)，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δtir3-k-p。

6)敲除TIR3两个等位基因所需片段的扩增

以酿酒酵母S17基因组为模板，DT3A-F和DT3A-R为引物对PCR扩增出TIR3基因敲除所需的上游同源序列片段，长度为378bp；以酿酒酵母S17基因组为模板，DT3B-F和 DT3B-R为引物对PCR扩增出下游同源序列片段，长度为290bp；以质粒pUC6基因组为模板，DT3K-F和DT3K-R为引物对PCR扩增出TIR3基因敲除所需的loxP-KanMX3-loxP片段，长度为1663bp(图9)。

7)敲除TIR3两个等位基因的重组酵母菌株的构建

通过醋酸锂化学转化法，将TIR3基因第二个等位敲除所需的上游同源序列片段、下游同源序列片段和loxP-KanMX3-loxP片段转化重组菌株S17-Δtir3-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

8)敲除TIR3两个等位基因的重组酵母菌株的验证

根据酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DT3-1-F，DT3-1-R，DT3-2-F，DT3-2-R，以生长较好转化子基因组为模板，PCR验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1444bp条带，下游验证得到1491bp条带(图10)，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δtir3-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中TIR3的两个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔtir3。

9)重组菌株S17-DΔtir3中KanMX抗性基因的剔除

利用Cre/loxP报告基因***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的酿酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔtir3中，按照步骤4)中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子(图11)，命名为S17-DΔtir3-k。

10)重组菌株S17-DΔtir3-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株 S17-DΔtir3-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，通过PCR 验证(图12)，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔtir3-k-p。

重组酿酒酵母菌株见表1。构建重组酿酒酵母菌株所用引物见表2。

实施例3：低产高级醇的重组菌株S17-Δtir1-k-p、S17-DΔtir3-k-p的小麦啤酒发酵实验

1)小麦啤酒发酵工艺路线如图14所示：

2)糖化工艺：称取粉碎后的小麦麦芽以料水比1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，30℃保持30min，以2.0℃/min升温至65℃，保持90min，迅速升温至78℃，保持10min。糖化过程中每隔5min充分搅拌一次。糖化后的小麦麦芽汁趁热过滤，并用75℃的热水洗糟3次。将过滤液放置于电磁炉上蒸煮，沸腾后40min加入3‰的苦味酒花(以麦芽重量计)，煮沸时间为70min。煮沸后自然冷却至室温，4000r/min离心 5min，离心后的麦汁调整糖度为12°P，115℃灭菌20min备用(12°P麦芽汁培养基)。

3)菌种的活化：酵母菌种转接至YEPD固体培养基斜面，于30℃培养48h。

4)一级种子培养：取活化菌种一环，接种于装液量为50mL浓度为12°P麦芽汁培养基的250mL广口三角瓶中，八层纱布封口，24℃培养36h。

按上述发酵工艺对酿酒酵母出发菌株S17和本发明构建的重组菌株小麦啤酒发酵实验，按照10％w/v的接种量接种于12°P麦芽汁培养基中，250mL广口三角瓶装液量为150mL，带孔橡胶塞封口。发酵温度为20℃，静置发酵，每隔12h称重一次，当12h的失重量小于 0.1g时，发酵即可结束。

发酵结束后计算发酵时间、二氧化碳累计排放量，并测定酒精度、发酵度、发酵液中还原糖含量、糖的种类及浓度、高级醇和酯的含量等指标，结果见表3及图13。

表3表明：小麦啤酒发酵实验时，本发明所获得的酿酒酵母菌株与初始的原菌相比，发酵性能没有太大变化。

表3重组菌株和亲本菌株基本发酵性能的比较

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值

图13表明：本发明选育得到的酿酒酵母S17-Δtir1-k-p和S17-DΔtir3-k-p高级醇生成的总量明显降低：亲本菌S17高级醇生成的总量为296.01mg/L，而重组酿酒酵母S17-Δtir1-k-p 和S17-DΔtir3-k-p高级醇生成的总量分别为226.45mg/L、213.28mg/L，同比下降了30.7％和 38.8％，这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上降低小麦啤酒中高级醇的含量，为丰富啤酒口感，提供了理论基础。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 通过调控细胞壁组成蛋白构建的低产高级醇酿酒酵母菌株

<130> 1

<141> 2019-07-19

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 765

<212> DNA

<213> 酿酒酵母S17()

<400> 1

atggcttaca ctaagatcgc tttattcgct gctattgctg ctttggcttc cgctcaaacc 60

caagatcaaa ttaacgaatt gaacgttatt ttgaacgatg tcaaatctca cttgcaagag 120

tacattagct tagcttctga ttcttcctct ggattttcct taagcagtat gccagctggt 180

gttttggata tcggtatggc tttagcttcc gccactgacg actcctacac tactttgtac 240

tctgaggttg actttgctgg tgttagcaag atgttgacca tggttccatg gtactcctct 300

agattggaac cagctttgaa gtctttgaat ggtgatgctt cttcttctgc tgccccaagc 360

tcttctgctg ctccaacttc ttctgctgcc ccaagctcat ctgctgcccc aacttcttct 420

gctgcctcaa gctcttctga agctaagtct tcttctgctg ccccaagctc ttctgaagct 480

aagtcttctt ctgctgcccc aagctcttct gaagctaagt cttcttctgc tgccccaagc 540

tcttctgaag ctaagtcttc ttctgctgct ccaagctcca ctgaagctaa gataacttct 600

gctgctccaa gctccactgg tgccaagacc tctgccatct ctcaaattac cgatggtcaa 660

atccaagcta ccaaggctgt ttctgagcaa actgaaaacg gtgctgctaa ggcctttgtt 720

ggtatgggtg ctggtgttgt cgcagctgcc gctatgttgt tataa 765

<210> 2

<211> 810

<212> DNA

<213> 酿酒酵母S17()

<400> 2

atgtctttca ctaaaatcgc tgccttatta gctgttgccg ctgcctccac tcaattggtt 60

tctgctgaag ttggacaata tgaaatcgtc gaatttgacg ctattttggc tgatgtcaag 120

gccaatttgg aacaatatat gtccttggca atgaataatc cagactttac cctaccatct 180

ggtgttttgg atgtttacca acatatgacc actgctactg atgattccta caccagttat 240

ttcaccgaaa tggactttgc tcaaatcacc actgccatgg ttcaagtgcc ttggtactct 300

tctagactgg aacctgaaat catcgctgct ttacaaagcg cgggtatcag tattacctcc 360

ttaggtcaaa ccgtttccga atctggttcc gaatctgcca ctgcttcctc agacgcttct 420

tctgcttctg aatcctcttc agctgcttct tcttctgctt ctgaatcctc ttcagctgcc 480

tcctcttctg cttctgaatc ctcttcagct gcttcttcct ctgcttcaga atcttcttct 540

gctgcctcct cttctgcttc tgaagctgct aagtcttcta gctctgccaa gtcttctggc 600

tcttctgctg cttcatctgc tgcttcatct gcttcttcca aggcctcttc tgcagcttcc 660

tcttctgcaa aggcctcctc ttctgcagaa aaatctacta atagctcctc ctctgctacc 720

tccaagaacg ctggtgcagc tatggacatg ggcttcttct ccgctggtgt tggtgccgct 780

attgccggtg ccgctgctat gctcttatga 810

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

aaaatgggaa ctgcttgt 18

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

cctgcagcgt acgaagcttc agctggcata caaacgcagt tca 43

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tgaactgcgt ttgtatgcca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 6

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aattcggtta atgttcaggt ctgcataggc cactagtgga tctgata 47

<210> 7

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tatcagatcc actagtggcc tatgcagacc tgaacattaa ccgaatt 47

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

cgaacaccag ccgataga 18

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

gaatcgtcag ataggtggta 20

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

cctgcagcgt acgaagcttc agctgtcaaa caaccagcaa gaa 43

<210> 11

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

ttcttgctgg ttgtttgaca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 12

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

atttcatgct cttgctcggc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 13

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tatcagatcc actagtggcc tatgccgagc aagagcatga aat 43

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ctcctagcaa cccaataa 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

attgttcaac cgcccaca 18

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

cctgcagcgt acgaagcttc agctgcagcg atgatttcag gtt 43

<210> 17

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

aacctgaaat catcgctgca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 18

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

ttcttggagg tagcagaggc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 19

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

tatcagatcc actagtggcc tatgcctctg ctacctccaa gaa 43

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

agccaagtgt acattacaag 20

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

cccacacacc atagcttca 19

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

<210> 25

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

tttacaaggg cgagtagct 19

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

tcattggcaa cgctacct 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

atttcgtctc gctcaggc 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

tgtgcgcttc tcggatag 18

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

cgcagcacaa tggagtaaa 19

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 30

cgatagattg tcgcacct 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 31

atgcgtcaat cgtatgtg 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 32

aatagtgccc gttctcaa 18

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 33

gaatcgtcag ataggtggta 20

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 34

cgatagattg tcgcacct 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 35

atgcgtcaat cgtatgtg 18

<210> 36

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 36

aatagtgccc gttctcaa 18

Claims (10)

1.一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，是通过敲除酿酒酵母宿主细胞中的GPI-锚定蛋白基因构建的。

2.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为单敲除或双敲除。

3.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR1，Gene ID为：856729，核苷酸序列如核苷酸序列表中SEQ IDNO:1所示。

4.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述GPI-锚定蛋白基因为TIR3，其Gene ID为：854804，核苷酸序列见核苷酸序列表中SEQ IDNO:2所示。

5.如权利要求1或2所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述宿主细胞为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，编号CICC1929。

6.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-Δtir1-k-p，是通过单敲除酿酒酵母S17中的TIR1基因获得的。

7.如权利要求1所述的一种低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株，其特征在于，所述酿酒酵母基因工程菌株为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17-DΔtir3-k-p，是通过双敲除酿酒酵母S17中的TIR3基因获得的。

8.权利要求1-7任意一项所述低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)敲除GPI-锚定蛋白基因的低产高级的醇酵母菌株的构建

1)以酿酒酵母基因组为模板，分别PCR得到敲除GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂；

2)将整合片段敲除GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂及KanMX表达盒，利用转化到酿酒酵母宿主中，利用酵母体内同源重组的原理，筛选得到敲除重组菌株；

(2)KanMX筛选标记的去除及pSH-Zeocin质粒的丢弃

(3)当构建双敲除菌株时，设计新的GPI-锚定蛋白基因的上同源臂和下同源臂引物，并重复步骤(1)、(2)。

9.权利要求1-7任意一项所述低产高级醇的酿酒酵母基因工程菌株在酿酒中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，酿制啤酒的方法如下：

将上述基因工程菌按照10％w/v的接种量接种于12°P麦汁中，在密闭条件下，20℃，静置发酵，每隔12h称重一次，当12h的失重量小于0.1g时，发酵即可结束。