CN110800760A - 一种蚯蚓水解液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种蚯蚓水解液及其制备方法和应用，属于生物肥料技术领域。所述蚯蚓水解液，包括如下原料：蚯蚓和尿素；所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1。本发明中，尿素作为一种变性剂，能使细胞质膜上非共价键结合的蛋白质(如外膜蛋白)变性失活，增加这些蛋白的可溶性。当尿素与蚯蚓混合后，蚯蚓细胞质膜结构遭到破坏，细胞内物质快速渗出，蛋白水解酶对蚯蚓本体蛋白进行有效水解，且无需活蚯蚓及为活蚯蚓提供适宜的生活条件，即可制备获得pH值近中性、抑菌活性高的水解液。同时，本发明采用的尿素为农业生产中常用的化学肥料，与蚯蚓混合，水解后形成有机无机复合肥，可直接用于水溶肥的制备，为植物提供更丰富的营养。

Description

一种蚯蚓水解液及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物肥料技术领域，具体涉及一种蚯蚓水解液及其制备方法和应用。

背景技术

化肥和农药是重要的农业生产资料。近年来，随着作物播种面积的增加和对农产品产量的过分追求，化肥和农药使用量总体呈上升趋势。化肥和农药的过量使用，不仅造成了生产成本的增加，也影响了农产品的质量安全和生态环境安全。因此，要大力推进化肥减量提效、农药减量控害，走环境友好的现代农业发展之路。推广水肥一体化、叶面喷施等施肥方式，用有机肥替代部分化肥，实现有机无机相结合等，是实现化肥减量增效的有效途径。而开发和推广新的环境友好型、高效低毒低残留的农药，提高防治效率、效果和效益，是实现农药使用量零增长、促进生态文明建设的重要举措。

蚯蚓俗称地龙，又名曲鳝，为环节动物门寡毛纲代表性动物，被达尔文称之为“世界上最有价值的动物”，具有适应性强、分布广、食性广泛、食量大、不易生病、繁殖率高等特点。蚯蚓富含蛋白质、氨基酸、维生素、矿物元素及抗氧化酶、溶栓酶、溶血素和抗肿瘤成分。其中，蛋白质含量约占蚯蚓干重的70％。同时，蚯蚓消化道内含有10多种活性蛋白水解酶，可以对蚯蚓本体蛋白质进行有效水解，水解液中富含18种必需氨基酸、抗菌肽、维生素及钾、锌、铁、锰等营养元素，可用于制备含氨基酸的农药、氨基酸水溶肥等，不仅可为植物生长提供丰富的营养，提高作物产量，同时能显著提高作物抵抗病虫害的能力，减少化学肥料和农药的使用，降低对环境的污染。

目前，蚯蚓水解液的制备多采用内源酶解法，即利用蚯蚓蛋白酶自溶水解本体蛋白质。如中国专利文献CN 103771925 A公开的《一种水稻叶面肥的制备方法》、CN107417401 A公开的《一种防治蔬菜白粉病的中草药叶面肥》、CN 108424205 A公开的《一种蚯蚓叶面肥及其制造方法》、CN 107311707 A公开的《一种富硒蚯蚓有机叶面肥的制备方法》、CN 107353122 A公开的《一种诱导瓜类蔬菜白粉病抗性的叶面肥及其制备方法》。这些方法都是通过将新鲜活体蚯蚓进行震荡或打浆处理获取蚯蚓浆液的。然而，蚯蚓是变温动物，温度是影响蚯蚓新陈代谢、生长发育的重要因素。一般而言，在环境温度20～27℃、湿度60～80％时，其新陈代谢最为旺盛。当露天条件不适宜时，就需要在简易大棚等室内环境条件下，人为控制温湿度培养，这无疑会增加蚯蚓的养殖费用，提高以蚯蚓为原料的有机肥料或农药的成本。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种蚯蚓水解液及其制备方法和应用，使蚯蚓水解液的制备成本大大降低，蚯蚓水解的速率加快，水解液抑菌活性提高。

为了解决上述问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种蚯蚓水解液，包括如下原料：蚯蚓和尿素；

所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1。

优选的，还包括防腐剂，所述防腐剂为山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸钠或苯甲酸钾。

优选的，所述防腐剂与蚯蚓的质量比为0.004～0.015:4～6。

优选的，所述蚯蚓为冷冻蚯蚓。

本发明提供了一种上述方案所述的蚯蚓水解液的制备方法，包括如下步骤：

1)将上述方案所述的原料混合，在40～50℃，60～150rpm的条件下水解24～28h，得到水解产物；

2)将所述步骤1)的水解产物过滤，将得到的滤液调节pH值至6～8，得到蚯蚓水解液。

优选的，步骤2)中所述调节pH值的调节液为酸溶液。

优选的，所述酸溶液为磷酸溶液或硝酸溶液。

优选的，所述酸溶液的摩尔浓度为0.15～0.25mol/L。

本发明提供了一种上述方案所述的蚯蚓水解液或上述所述方法制备得到的蚯蚓水解液在制备肥料和/或农药中的应用。

本发明提供了一种蚯蚓水解液，包括如下原料：蚯蚓和尿素；所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1。本发明中，尿素作为一种变性剂，能使细胞质膜上非共价键结合的蛋白质(如外膜蛋白)变性失活，增加这些蛋白的可溶性。当尿素与蚯蚓混合后，蚯蚓细胞质膜结构遭到破坏，细胞内物质快速渗出，蛋白水解酶对蚯蚓本体蛋白进行有效水解，获得pH值近中性的水解液，水解液中主要含18种氨基酸、抗菌肽、钾锌铁锰等营养元素以及维生素A、维生素B1、维生素B2、维生素E、维生素C等营养物质。

同时，本发明采用的尿素为农业生产中常用的化学肥料，与蚯蚓混合，水解后形成有机无机复合肥，可直接用于水溶肥的制备，为植物提供更丰富的营养。

进一步的，在原料中加入了防腐剂(山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸钠或苯钾酸钾)，能更大程度地保活其中的活性物质，使制备的水解液具有较高的抑菌活性。

本发明还提供了一种上述方案所述的蚯蚓水解液的制备方法，通过60～150rpm处理，使蚯蚓充分与尿素混合，增大接触面积，加快蚯蚓水解速率，同时在40～50℃蚯蚓蛋白水解酶的最适作用温度范围内进行水解，保证了水解酶具有较高的活性，使蚯蚓本体蛋白快速降解。

同时，采用本发明提供的尿素制备蚯蚓水解液时，无需活蚯蚓及为活蚯蚓提供适宜的生活条件，即可完成水解液的制备。解决了新鲜蚯蚓易受季节气候和区域等因素的限制、不易保存、原料成本较高等问题。而且该方法具有更高的水解效率、水解液具有更高的抑菌活性。

具体实施方式

本发明提供了一种蚯蚓水解液，包括如下原料：蚯蚓和尿素；所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1。

本发明提供的蚯蚓水解液，原料包括蚯蚓。本发明对所述蚯蚓的生理状况没有特殊限定，新鲜或冷冻的蚯蚓均可。本发明中优选为冷冻蚯蚓。本发明对所述蚯蚓的品种和来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可，本发明实施例中采用赤子爱胜蚓大平二号蚯蚓。

本发明提供的蚯蚓水解液，原料包括尿素。在本发明中，所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1，优选为5:1。

现有技术中利用蚯蚓制备生物有机肥，均需用到新鲜活蚯蚓。而蚯蚓生活条件较为苛刻，需要适宜的温度(5～30℃)、湿度(60～80％)和安静环境。北方寒冷的冬季和南方极热时，均无法实现自然条件下的人工培养，且运输较为困难，从而增加利用蚯蚓制备生物有机肥的成本。在本发明中，尿素作为一种变性剂，能使细胞质膜上非共价键结合的蛋白质(如外膜蛋白)变性失活，增加这些蛋白的可溶性。当尿素与蚯蚓混合后，蚯蚓细胞质膜结构遭到破坏，细胞内物质快速渗出，蛋白水解酶对蚯蚓本体蛋白进行有效水解，获得pH值近中性、抑菌活性更高的水解液。进一步的，当采用活蚯蚓时，尿素与蚯蚓混合，尿素会使蚯蚓细胞膜上的外周蛋白变性失活，蚯蚓受到外界刺激产生应激反应，分泌蛋白水解酶；同时，细胞质膜结构瓦解，蚯蚓水解；细胞内本体蛋白等渗漏到胞外，被水解酶降解。当采用冷冻蚯蚓时，蚯蚓在接收到冷冻刺激后，同样会分泌大量蛋白水解酶，且细胞质膜结构也会遭到破坏；当尿素再与冷冻蚯蚓混合后，被冷冻破坏的细胞质膜结构进一步破坏，细胞内物质(如蛋白质等)快速渗出，进一步加快了蚯蚓的水解速度；40-50℃为蛋白水解酶的最适作用温度范围，保证了对蚯蚓本体蛋白的快速水解，缩短了水解时间。且无需活蚯蚓及为活蚯蚓提供适宜的生活条件下即可完成水解，获得pH值近中性的水解液。而且，冷冻蚯蚓易于保存、不受季节气候和区域限制、原料成本大大降低(14元/公斤，活蚯蚓30元/公斤)。

在本发明中，所述蚯蚓水解液的原料中优选还包括防腐剂。所述防腐剂为优选山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸钠或苯甲酸钾，更优选为山梨酸。在本发明中，所述防腐剂与蚯蚓的质量比优选为0.004～0.015:4～6，更优选为0.01:5。本发明对所述防腐剂的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可。在本发明中，所述防腐剂能更大程度地保活其中的活性物质，使制备的水解液具有较高的抑菌活性。

本发明提供了一种上述方案所述的蚯蚓水解液的制备方法，包括如下步骤：

1)将上述方案所述的原料混合，在40～50℃，60～150rpm的条件下水解24～28h，得到水解产物；

2)将所述步骤1)的水解产物过滤，将得到的滤液调节pH值至6～8，得到蚯蚓水解液。

本发明将上述方案所述的原料混合，在40～50℃，60～150rpm的条件下水解24～48h，得到水解产物。在本发明中，当采用冷冻蚯蚓时，在水解前优选切割成小块。所述小块的大小优选为3～5cm×3～5cm×3～5cm。所述切割前优选对蚯蚓进行清洗。本发明对所述清洗的方式没有特殊限定，采用本领域常规清洗方式即可，本发明实施例中采用流水清洗。在本发明中，所述水解的温度为40～50℃，优选为45℃；所述水解的搅拌速度为60～150rpm，优选为100rpm；所述水解的时间为24～28h，优选为26h。在本发明中，将冷冻蚯蚓切割成小块，在搅拌或旋转条件下，使其充分与尿素混合，增大接触面积，加快蚯蚓水解速度。在本发明中，40～50℃是蚯蚓蛋白水解酶的最适作用温度范围，蛋白水解酶具有较高活性，在此条件下能够保证蛋白水解酶对蚯蚓本体蛋白的快速水解。在本发明中，所述水解优选在反应釜中进行。

得到水解产物后，本发明将所述水解产物过滤，将得到的滤液调节pH值至6～8，得到蚯蚓水解液。在本发明中，所述过滤的方式优选为采用纱布过滤。在本发明中，所述调节pH值的调节液优选为酸溶液。所述酸溶液优选为磷酸溶液或硝酸溶液；所述酸溶液的摩尔浓度优选为0.15～0.25mol/L，更优选为0.2mol/L。

本发明提供了一种上述方案所述的蚯蚓水解液或上述所述方法制备得到的蚯蚓水解液在制备肥料和/或农药中的应用。在本发明中，所述农药优选为抑制植物病原菌类农药。

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

称量经流水清洗过表面的冷冻赤子爱胜蚓大平二号1000g；将其切成5cm×5cm×5cm的小块，置于反应釜中，同时加入200g尿素、1g山梨酸钾，混匀；置于垂直混合仪上，调节运转速度60rpm，45℃反应26h；水解结束后，用医用纱布过滤，滤液用0.15mol/L的磷酸调节pH至6～8，得到蚯蚓水解液。

实施例2

称量经流水清洗过表面的冷冻赤子爱胜蚓大平二号1000g；将其切成3cm×5cm×5cm的小块，置于反应釜中，同时加入333g尿素、3.75g苯甲酸钾，混匀；置于垂直混合仪上，调节运转速度150rpm，40℃反应28h；水解结束后，用医用纱布过滤，滤液用0.25mol/L的硝酸调节pH至6～8，得到蚯蚓水解液。

实施例3

称量经流水清洗过表面的冷冻赤子爱胜蚓大平二号1000g；将其切成3cm×3cm×3cm的小块，置于反应釜中，同时加入143g尿素、0.7g苯甲酸，混匀；置于垂直混合仪上，调节运转速度100rpm，45℃反应24h；水解结束后，用医用纱布过滤，滤液用0.2mol/L的硝酸调节pH至6～8，得到蚯蚓水解液。

对比例1

按中国专利文献CN 103771925 A公开的《一种水稻叶面肥的制备方法》，通过将新鲜的活体赤子爱胜蚓大平二号进行振荡、蚯蚓浸出、蚯蚓液搅拌和蚯蚓液过滤，获取蚯蚓水解液。

其中，蚯蚓的振荡频率为280rpm，振幅20mm，振荡时间3min；之后加入10倍蚯蚓体积的水于25℃浸泡60h；混合液置于2900rpm的搅拌器中搅拌10min；然后医用纱布过滤，滤液静置2h后取上清。

对比例2

选取经流水清洗过表面的冷冻赤子爱胜蚓大平二号1000g；将其切成5cm×5cm×5cm的小块，置于反应釜中，同时加入200mL蒸馏水、1g山梨酸钾，混匀；置于垂直混合仪上，调节运转速度60rpm，45℃反应26h；水解结束后，用医用纱布过滤，滤液用0.2mol/L的磷酸调节pH至6～8，得到蚯蚓水解液。

实施例4

本发明水解蚯蚓的效率。

试验样品：本发明实施例1,2,3和对比例1，2蚯蚓样品。

试验方法：分别记录本发明实施例1,2,3和对比例1，2实验中所用蚯蚓的质量(m0)、过滤完后残留在纱布上的固体质量(m)。蚯蚓水解率按下式计算：

蚯蚓水解率(％)＝(1-m/m0)×100。每处理重复三次。

试验结果如下表1所示。

表1蚯蚓水解率

试验样品	蚯蚓水解率(％)
		对比例1	96.7±2.1
对比例2	45.3±1.0
		实施例1	96.2±1.6
实施例2	95.6±0.3
		实施例3	92.1±0.7

由表1可以看出，采用实施例1,2,3和对比例1的方法水解蚯蚓的效率均较高，均达到了92％以上，而对比例2水解蚯蚓的效率不足50％，水解效果较差。同实施例1相比，实施例2所加尿素量较多，反应结束反应釜口周围有部分尿素结晶，造成尿素浪费、水解率不及实施例1高；实施例3因尿素添加量较少，水解率不及实施例1，2及对比例1高。同对比例1相比，本发明提供的方法具有蚯蚓水解时间短、效率高的特点，同对比例2相比，本发明提供的方法水解蚯蚓的效率高。

实施例5

蚯蚓水解液对常见植物病原菌的抑制作用

实验对象：灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、甘薯长喙壳菌(Ceratocystisfimbriata)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、大丽花轮枝孢菌(Verticilliumdahliae)均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号分别为CGMCC No.4584、CGMCC No.18340、CGMCC No.12196和CGMCC No.15299。

试验样品：实验样品-本发明实施例1,2,3、对比例1,2制备得到的蚯蚓水解液；参考对照组：酮康唑(用100％二甲基亚砜配成终浓度为1600μg/mL)试验方法：分别向灭菌并冷却至50℃左右的PDA培养基中加入试验样品0.25、0.5及1mL，充分摇匀，制成含蚯蚓水解液或药物的平板，每处理重复3次。其中，空白培养基中分别加入0.25、0.5及1mL质量浓度为16.7％的灭菌尿素水溶液；对比例和参考组空白培养基中分别加入0.25、0.5及1mL灭菌蒸馏水。用直径5mm的打孔器在生长良好的微生物平板上等距离打孔，并用灭菌镊子将菌饼菌丝朝下接种于含药平板和对照平板中央，28℃恒温培养，每天观察菌丝生长情况，待空白对照长满平皿后测量菌落直径，按下式计算抑菌率。具体检测结果如表2所示。

抑菌率(％)＝[(空白对照菌落直径-处理菌落直径)/(空白对照菌落直径-5)]×100。

表2蚯蚓水解液对常见植物病原菌的抑制作用

由表2可以看出：本发明实施例1制备的蚯蚓水解液在100mL培养基中添加1mL时，对灰葡萄孢菌、甘薯长喙壳菌和大丽花轮枝孢菌的抑菌率均达到95％以上，对尖孢镰刀菌的抑菌率为70.1±2.2％；实施例2和3对病原菌的抑菌率略低于实施例1。实施例1,2,3对病原菌的抑菌率均高于等量酮康唑、对比例1和对比例2对病原菌的抑菌率。实验结果表明：本发明制备的蚯蚓水解液对常见植物病原菌具有更强的体外抑制作用，且安全无环境污染，具有广阔的应用前景。

实施例6

蚯蚓水解液对番茄植株灰霉病的防治效果。

试验品种：大红-齐达利

试验样品：实验样品-本发明实施例1,2,3、对比例1,2制备得到的蚯蚓水解液；对照组：清水。

试验方法：用培养了4～7d的灰葡萄孢菌制备孢子悬浮液，使每毫升液体中的孢子浓度约为10⁵个以上。将本发明实施例1,2,3、对比例1,2制备的蚯蚓水解液分别用蒸馏水稀释10倍和100倍，采用喷雾法将以上稀释液和清水均匀喷洒于生长周期为一个月的番茄植株上，12h后用灭菌吸头吸取灰葡萄孢菌孢子悬液25μL滴于番茄植株大小、长势差不多的叶片上，并用灭菌毛刷均匀刷开。25℃保湿培养48h。每组10株，重复三次。之后，每24h统计一次不同处理植株的发病率和病情指数。具体检测结果如表3所示。

叶片发病分级标准按农业部农药检定标准判定。

发病率计算公式：I(％)＝(发病叶片数/接种总叶片数)×100；

平均严重度的计算公式：s(％)＝∑(si×xi)/∑xi×100，其中s为平均严重度；si为每一级严重度；xi为每一级调查值数目。

病情指数计算公式：DI＝I×s/100，其中DI为病情指数，I为发病率，s为平均严重度。

防治效果计算公式：防治效果(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100。

表3对番茄植株灰霉病的防治效果

由表3可以看出，清水对照组从接种番茄灰葡萄孢菌48h后，叶片上即可观察到零星病斑，120h后全部接种叶片均出现较严重的病斑，植株几近枯死，发病率100％，病情指数74.6±1.2。植株喷洒了对比例1,2和实施例1,2,3稀释100倍的水解液及对比例2稀释10倍的水解液后，均明显延缓了番茄灰霉病的发生，约在72h时才出现零星病斑，到120h时，病斑叶片数、发病级数和防治效果不同，发病率分别为66.7±1.2、100±0.5、33.3±1.3、38.7±1.5、46.7±2.4和60±0.8％；对应病情指数分别为25±1.1、61.9±1.1、18.3±0.9、20.5±0.5、24.2±0.8和38±0.7；防治效果分别为66.5、17.0、75.5、72.5、67.6和49.1％。喷洒了对比例1和实施例1,2,3稀释10倍的水解液后，植株发病时间进一步延迟，直到培养至96h时，才可在几片叶片上零星可见病斑，防治效果分别为82.2、91.0、85.3和83.0％。实施例1,2和3较对比例1的防治效果更好，实施例1,2和3以实施例1的防治效果最好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种蚯蚓水解液，其特征在于，包括如下原料：蚯蚓和尿素；

所述蚯蚓与尿素的质量比为3～7:1。

2.根据权利要求1所述的蚯蚓水解液，其特征在于，还包括防腐剂，所述防腐剂为山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸钠或苯甲酸钾。

3.根据权利要求2所述的蚯蚓水解液，其特征在于，所述防腐剂与蚯蚓的质量比为0.004～0.015:4～6。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的蚯蚓水解液，其特征在于，所述蚯蚓为冷冻蚯蚓。

5.权利要求1～4任意一项所述的蚯蚓水解液的制备方法，包括如下步骤：

1)将权利要求1～4任意一项所述的原料混合，在40～50℃，60～150rpm的条件下水解24～28h，得到水解产物；

2)将所述步骤1)的水解产物过滤，将得到的滤液调节pH值至6～8，得到蚯蚓水解液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述调节pH值的调节液为酸溶液。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述酸溶液为磷酸溶液或硝酸溶液。

8.根据权利要求6或7所述的制备方法，其特征在于，所述酸溶液的摩尔浓度为0.15～0.25mol/L。

9.权利要求1～4任意一项所述的蚯蚓水解液或权利要求5～8任意一项方法制备得到的蚯蚓水解液在制备肥料和/或农药中的应用。