CN110791558A - 一种人类白细胞抗原hla-e、-f、-g基因全长序列测定的相关引物、试剂盒、方法 - Google Patents

一种人类白细胞抗原hla-e、-f、-g基因全长序列测定的相关引物、试剂盒、方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种人类白细胞抗原HLA‑E、‑F、‑G基因全长序列测定相关的引物、试剂盒、方法。采用本发明的引物、方法对HLA‑E、‑F、‑G全基因进行扩增，条带清晰，扩增特异，测序结果峰图质量良好。步移引物测得的序列拼接后可得到HLA‑E、‑F、‑G全基因序列及分型结果。

Description

一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定的相关 引物、试剂盒、方法
技术领域
本发明涉及生物医学及免疫遗传学，特别是涉及一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定相关的引物、试剂盒、方法。
背景技术
人类白细胞抗原(Human Leukocyte Antigen，HLA)分子提呈抗原肽给T淋巴细胞识别,在适应性免疫应答中起着极其重要的作用。HLA基因同时又是人类重要的遗传结构，在法医鉴定、器官移植配型等领域应用广泛。HLA***分为3类：HLA-I、HLA-II及HLA-III类。HLA-I类基因又根据编码产物的组织分布，功能及多态性不同可分为经典MHC-I类(HLA-Ia)和非经典MHC-I类(HLA-Ib)基因。HLA-E、-F、-G基因都属于HLA-Ib类，它们在结构上十分相似，与HLA-Ia基因相比，HLA-E、-F、-G基因多态性及其有限，其抗原结构、表达、功能等也与HLA-Ia有较大差异。
众所周知，高度的多态性是HLA基因一个非常重要的特点。以往对人类白抗原基因多态性的研究主要是针对编码抗原结合肽的外显子。众多研究者对这些外显子的分型技术、多态位点的探测、疾病相关性以及进化分析研究做了大量工作。然而，越来越多的研究表明，HLA基因非编码区的多态位点及其功能也不容忽视。上世纪90年代，科学家们开始投入到对HLA基因的调控区特别是5’-启动子的多态性研究当中，并从进化、功能分析等多种角度揭示了这些位于调控区的SNPs在基因表达调控中的作用。大量研究表明，HLA基因调控区多态性蕴含了丰富的与基因进化、基因表达调控以及疾病相关联的信息。非编码区中除了调控区，内含子多态性也相当可观，它们对于测序分型试剂盒的开发及完善非常重要。HLA基因测序分型的PCR引物和测序引物，通常位于目的外显子的侧翼即调控区及内含子内。某些等位基因的调控区及内含子中存在未知的变异，可能刚好位于现有分型试剂盒的引物结合位点，导致分型时对该等位基因漏检和丢失现象(Allele dropout)。因此要开发一种长久行之有效的分型试剂盒必须要掌握尽可能丰富的非编码区多态信息。
目前，HLA-E、-F、-G是人类白细胞抗原***中被IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)公布的等位基因数目最少的功能基因。原因之一是其外显子多态性本身较其它经典的HLA-I类分子少，另一原因是非经典的HLA-I类分子在之前受关注较少，对其多态性的研究较为有限，基因分型也只是针对部分编码抗原肽结合槽的外显子进行，如针对HLA-E多态性研究较多的是区分HLA-E*01:01与HLA-E*01:03的第3外显子。我们前期对中国汉族群体经典的HLA-I类基因全长序列多态性研究发现，除了编码抗原肽结合区的外显子(HLA-I类第2-4外显子)具有丰富的单核苷酸多态性(SNPs)外,HLA基因全长其它区域包括外显子1、5、6、7，5’-启动子、3’-UTR甚至内含子区都具有高度的多态性。HLA-I类基因表达调控起关键作用的Enhancer A、ISRE(Interferin-stimulated responseelement)、Siteα、Ehancer B等调控元件，以丛集的方式存在于基因起始密码子的上游300bp以内(即5’-启动子的NT-300～NT-1)，协同进行转录活性的调控。IMGT/HLA数据库中公布的HLA基因全长数据包含了300bp调控功能比较清晰的近端启动子。近年来，HLA-I类基因3’-UTR的调控功能陆续报道，3’-UTR作为其靶标序列在基因表达调控中的地位进一步受到关注，3’-UTR中产生的新突变，有可能形成miRNA作用的靶基序。不仅如此，我们也在中国汉族群体中发现很多新的、中国人群所特有的SNPs。这些SNPs的发现将为清晰地揭示HLA表达的调控模式以及免疫疾病相关性的研究提供翔实的基础资料。
HLA-E分子能在细胞表面表达且发挥免疫抑制功能，其表达也有独特性，目前对该基因及其分子功能研究越来越深入。虽然已经研制出了多种HLA-F特异性抗体(FG1、3D11、4A11和3D12)，但均未商品化，这可能是限制HLA-F研究的因素之一，深入了解HLA-F分子结构、受体及其作用机制、潜在的生物学功能及恶性肿瘤组织表达情况，将有助于开拓对肿瘤进行基础研究和临床治疗的思路。HLA-G分子在母胎免疫、感染、自身免疫病及肿瘤的发生发展中发挥重要的作用。
完整的HLA-E、-F、-G基因的全长序列，应包含8个外显子、7个内含子、5’-启动子和3’-UTR。截止2017年4月世界卫生组织WHO(World Health Organization)的HLA因子命名委员会命名的HLA-E等位基因有25个，HLA-F等位基因有22个,HLA-G等位基因有54个(参见IMGT/HLA Database：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/align.html)，IMGT/HLA数据库中基本没有已公布包含5’-启动子和3’-UTR的HLA-E、-F、-G等位基因全长序列。缺乏完整的外显子、内含子特别是5’-启动子及3’-UTR两端调控区序列，难以进行***地HLA-E、-F、-G基因全长序列多态性分析和基因精确分型试剂盒的研发，大量HLA-E、-F、-G等位基因的全长序列有待填补。
以聚合酶链反应(PCR)为基础的HLA测序分型(PCR-SBT)方法，被誉为国际HLA基因分型的金标准。该方法首先对需要分型的外显子区域进行PCR扩增即首先扩增目的基因片段，然后对纯化的PCR扩增产物进行测序反应、电泳检测和序列分析。目前国内各HLA分型和临床组织配型工作中的HLA基因测序分型试剂普遍依赖于进口。但国际上不同厂家的测序分型试剂盒，扩增HLA基因目的片段的分子大小和策略有所不同。由于商品化试剂盒较为昂贵，限制了HLA基因测序分型在群体遗传学和骨髓库中的大规模应用。
发明内容
为实现上述目的,本发明利用中国汉族个体样本建立稳定可靠的HLA-E、-F、-G基因全长序列测序方法，并对HLA-E、-F、-G基因全长序列多态性进行初步分析，以便为中国群体HLA-E、-F、-G全长序列多态性及分子进化研究、基因的表达调控、疾病关联研究等领域提供广泛的应用基础。
本发明的目的还在于提供一种适合于中国人群的HLA-E、-F、-G基因的测序分型方法。以便***地对HLA-E、-F、-G基因的编码区进行测序分型。
为实现上述目的，本发明提供一种人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列测定方法，该方法包括：
各由一对位点特异性PCR扩增引物对HLA-E基因的3.8kb全长序列，HLA-F基因的3.5kb全长序列，HLA-G基因的3.1kb全长序列进行PCR扩增，扩增采用高保真的聚合酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，扩增区域包含三个基因的5’-启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’-UTR序列。
扩增HLA-E 3.8kb全长序列的PCR引物包括上游引物E-genome-F和下游引物E-genome-R，其中，上游引物E-genome-F的序列为：5'-GCCCAGCCAGGACTAATTTCT-3'(SEQ IDNO：1)，下游引物E-genome-R的序列为：5'-CACTCTGCCCAGGTTCTTATT-3'(SEQ ID NO：2)；
扩增HLA-F 3.5kb全长序列的PCR引物包括上游引物F-genome-F和下游引物F-genome-R，其中，上游引物F-genome-F的序列为：5'-GGRAGGCTCAGTATTGAGAAT-3'(SEQ IDNO：3)，下游引物F-genome-R的序列为：5'-CACCAAAATTGGGATCACCTA-3'(SEQ ID NO：4)；
扩增HLA-G 3.1kb全长序列的PCR引物包括上游引物G-genome-F和下游引物G-genome-R，其中，上游引物G-genome-F的序列为：5'-AGAACGCTTGGCACAAGAGTA-3'(SEQ IDNO：5)，下游引物G-genome-R的序列为：5'-CCTCAACAACCCACACACATC-3'(SEQ ID NO：6)。
所述HLA-E 3.8kb全长序列的PCR扩增引物、HLA-F 3.5kb全长序列的扩增引物以及HLA-G 3.1kb全长序列的扩增引物，扩增区域包含三个基因的5’-启动子序列，所有外显子，所有内含子，以及3’-UTR序列；上游扩增引物E-Genome-F、F-Genome-F及G-Genome-F分别位于HLA-E、-F、-G基因的5’-启动子上游，下游扩增引物E-Genome-R、F-Genome-R及G-Genome-R分别位于HLA-E、-F、-G基因的3’-UTR下游，将有多态性的碱基设计为简并碱基，可同时扩增HLA-E、-F、-G基因所有不同子系的等位基因全长序列。
所述测序引物，HLA-E基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)如下：
E-Genome-SF1:5'-AAGAGTGTGCAGAGATACCGA-3'，NT-246～NT-226；SEQ ID NO：7；
E-Genome-SF2：5'-CTTCATCTCTGTGGGCTACGT-3'，NT256～NT276；SEQ ID NO：8；
E-Genome-SF3：5'-CTACGACGGCAAGGATTATCT-3'，NT788～NT808；SEQ ID NO：9；
E-Genome-SF4：5'-AAGGAATCTAGTCTCGCTGGA-3'，NT1197～NT1217；SEQ ID NO：10；
E-Genome-SF5：5'-AGAGGAGCAGAGATACACGTG-3'，NT1814～NT1834；SEQ ID NO：11；
E-Genome-SF6:5'-ATTTTTAGTGGAGATGGGGTT-3'，NT2446～NT2466；SEQ ID NO：12；
E-Genome-SF7：5'-CACCCTATAATTCCTCCTGCA-3'，NT2940～NT2960；SEQ ID NO：13；
HLA-F基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下：
F-Genome-SF1:5’-GACTCATATTTTTCCCAGACG-3’，NT-35～NT-15；SEQ ID NO：14；
F-Genome-SF2：5’-AGTCTCCGGATCCGAAATCTA-3’，NT535～NT555；SEQ ID NO：15；
F-Genome-SF3：5’-GCCTTCCCTATCTCCTGTAGA-3’，NT1004～NT1024；SEQ ID NO：16；
F-Genome-SF4：5’-AGTGCAAAGTGCCTGAATTTT-3’,NT1533～NT1553；SEQ ID NO：17；
F-Genome-SF5：5’-CTTGTTGTCCTTGGAGCTGTG-3’,NT2031～NT2051；SEQ ID NO：18；
F-Genome-SF6:5’-TTTGCTCTAGGACCTTATGGC-3’,NT2483～NT2503；SEQ ID NO：19；
HLA-G基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下：
G-Genome-SF1:5’-ACAAGAGTAGCGGGGTCAG-3’，NT-282～NT-264；SEQ ID NO：20；
G-Genome-SF2：5’-CTCCCACTCCATGAGGTAT-3’，NT204～NT222；SEQ ID NO：21；
G-Genome-SF3：5’-ACCCTCCAGTGGATGATTG-3’，NT707～NT725；SEQ ID NO：22；
G-Genome-SF4：5’-CTTGGCACCAGGACTTTTC-3’,NT1253～NT1271；SEQ ID NO：23；
G-Genome-SF5：5’-CTGGAGAGGAGCAGAGATA-3’,NT1778～NT1796；SEQ ID NO：24；
G-Genome-SF6:5’-GTAGTGATGGGGACCTGAT-3’,NT2291～NT2309；SEQ ID NO：25。
所述HLA-E、-F、-G全长序列PCR扩增反应体系为：
Figure BDA0001750450530000041
HLA-E全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
Figure BDA0001750450530000052
HLA-F全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
Figure BDA0001750450530000053
HLA-G全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
Figure BDA0001750450530000054
本发明提供以下技术方案：
1、一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因全长序列测定的引物，所述引物选自E-genome-F和E-genome-R以及E-Genome-SF1至E-Genome-SF7，优选为E-genome-F和E-genome-R，或优选为E-Genome-SF1至E-Genome-SF7；
其中E-genome-F的序列如SEQ ID NO:1所示，E-genome-R的序列如SEQ ID NO:2所示；E-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:7所示；E-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:8所示；E-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:9所示；E-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:10所示；E-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:11所示；E-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:12所示；E-Genome-SF7的序列如SEQ ID NO:13所示。
2、一种用于人类白细胞抗原HLA-F基因全长序列测定的引物，所述引物选自F-genome-F和F-genome-R以及F-Genome-SF1至F-Genome-SF6，优选为F-genome-F和F-genome-R，或优选为F-Genome-SF1至F-Genome-SF6；
其中F-genome-F的序列如SEQ ID NO:3所示，F-genome-R的序列如SEQ ID NO:4所示；F-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:14所示；F-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:15所示；F-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:16所示；F-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:17所示；F-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:18所示；F-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:19所示。
3、一种用于人类白细胞抗原HLA-G基因全长序列测定的引物，所述引物选自G-genome-F和G-genome-R以及G-Genome-SF1至G-Genome-SF6，优选为G-genome-F和G-genome-R，或优选为G-Genome-SF1至G-Genome-SF6；
其中G-genome-F的序列如SEQ ID NO:5所示，G-genome-R的序列如SEQ ID NO:6所示；F-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:20所示；F-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:21所示；F-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:22所示；F-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:23所示；F-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:24所示；F-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:25所示。
4、一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因全长序列测定的引物，所述引物针对人类白细
胞抗原HLA-E基因中选自下述的位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)：
NT-246～NT-226、NT256～NT276、NT788～NT808、NT1197～NT1217、NT1814～NT1834、NT2446～NT2466和NT2940～NT2960；
所述引物优选选自SEQ ID NO：7-13。
5、一种用于人类白细胞抗原HLA-F基因全长序列测定的引物，所述引物针对人类白细胞抗原HLA-F基因中选自下述的位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)：
NT-35～NT-15、NT535～NT555、NT1004～NT1024、NT1533～NT1553、NT2031～NT2051、NT2483～NT2503；
所述引物优选选自SEQ ID NO：14-19。
6、一种用于人类白细胞抗原HLA-G基因全长序列测定的引物，所述引物针对人类白细胞抗原HLA-G基因中选自下述的位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)：
NT-282～NT-264、NT204～NT222、NT707～NT725、NT1253～NT1271、NT1778～NT1796和NT2291～NT2309；
所述引物优选选自SEQ ID NO：20-25。
7、一种用于人类白细胞抗原HLA-E、-F和/或-G基因全长序列测定的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种上述任一项中所述的引物。
8、上述项7所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含SEQ ID NO:1-2引物对、SEQ IDNO:3-4引物对和/或SEQ ID NO:5-6引物对。
9、上述项7或8所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自SEQ ID NO:7-13的一种或多种引物、选自SEQ ID NO:14-19的一种或多种引物、和/或选自SEQ ID NO:20-25的一种或多种引物，优选包含选自(1)SEQ ID NO:7-13的引物组、(2)SEQ ID NO:14-19的引物组和(3)SEQ ID NO:20-25的引物组的引物组。
10、一种用于人类白细胞抗原HLA-E、-F和/或-G基因全长序列测定的方法，所述方法包括应用上述项1-6中任一项所述的引物。
11、上述项10所述的方法，所述方法包括：
对选自HLA-E、-F和-G基因的基因进行全长扩增：以待测样本的DNA为模板，分别应用选自(i)SEQ ID NO:1-2引物对、(ii)SEQ ID NO:3-4引物对和(iii)SEQ ID NO:5-6引物对的引物对进行PCR扩增；和/或
测序：分别应用选自SEQ ID NO:7-13的一种或多种引物、选自SEQ ID NO:14-19的一种或多种引物和选自SEQ ID NO:20-25的一种或多种引物进行测序，
优选应用选自(1)SEQ ID NO:7-13的引物组、(2)SEQ ID NO:14-19的引物组和(3)SEQ ID NO:20-25的引物组的引物组进行测序。
12、上述项1-6中任一项所述的引物在制备用于人类白细胞抗原HLA-E、-F和/或-G基因全长序列测定的试剂盒中的应用。
本发明的贡献在于，其测定了中国汉族个体人类白细胞抗原HLA-E、-F、-G基因全长序列并***地开发适合于中国人群的HLA-E、-F、-G基因的测序分型方法。本发明所获得的HLA-E、-F、-G基因全长序列为HLA-E、-F、-G基因的表达、进化、疾病相关性、移植配型等研究提供宝贵数据。HLA-E、-F、-G基因的测序分型方法检测覆盖面广，该方法除了可进行HLA-E、-F、-G基因第2、3、4外显子常规测序分型外，还可进行第1、5、6、7外显子多态性检测，它有效解决了两个基因测序分型中出现的模棱两可的结果问题。由于所有的HLA-E、-F、-G扩增及测序引物设计时，充分考虑了全长序列的单核苷酸多态性(SNPs)，因而可长期有效地应用于检测工作当中。本发明适合于中国人群HLA-E、-F、-G基因的高分辨水平基因分型，以及HLA-E、-F、-G基因的临床移植组织配型、群体遗传学、人类学及进化学等应用和基础研究工作。
目前针对HLA-E基因分型的方法，仅仅针对第3外显子进行分型，仅能得出四位分型结果如HLA-E:01:01或HLA-E*01:03，而本发明方法通过对HLA-E两端调控区及全部外显子和内含子进行分型，可得出八位分型结果，如HLA-E*01:01:01:01.
图面说明
图1是HLA-E全长序列扩增电泳图。
图2是使用测序引物ESF1～ESF7对样本C2的HLA-E全长序列测序的测序峰图及Seqman序列拼接效果图。
图3是样本C2的HLA-E等位基因(HLA-E*01:01:01:01)序列图。其中序列核苷酸位置以起始密码子‘ATG’的‘A’为NT1，其上游5’端序列均为负数。
具体实施方式
下面参考附图详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不应理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
下列实施例是对本发明的进一步解释和说明，对本发明不构成任何限制。
本发明提供了一种HLA-E、-F、-G基因全长序列的测定方法。通过反复筛选扩增、测序引物、探索最佳退火温度及调节Mg2+离子和引物浓度等条件，本发明提供的引物和方法可稳定地对HLA-E、-F、-G基因进行高分辨水平测序分型。
本发明中DNA引物序列共25条，委托大连宝生物公司合成。HLA-E、-F、-G基因全长扩增酶采用Takara公司生产的GXL DNA聚合酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase)，HLA-E、-F、-G基因测序分型均采用ExoSap-IT消化酶。
实施例1
本实施例给出了HLA-E 3.8kb、HLA-F 3.5kb以及HLA-G 3.1kb等位基因全长序列的整套方案。
取本发明中的HLA-E基因全长扩增引物E-Genome-F以及E-Genome-R，HLA-F基因全长扩增引物F-Genome-F以及F-Genome-R，HLA-G基因全长扩增引物G-Genome-F以及G-Genome-R分别对8份亚洲人随机DNA标本进行HLA-E、-F、-G基因全长扩增，于ABI 9700型PCR仪进行，扩增反应体系组成为：
Figure BDA0001750450530000091
HLA-E全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
Figure BDA0001750450530000092
HLA-F全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
Figure BDA0001750450530000093
HLA-G全长序列扩增反应体系中，其循环参数为：
取2μL PCR产物，经cyber-greenI染色，于1.2％琼脂糖凝胶中电泳；对照TakaraDL5000DNA分子标记，在凝胶成像***中观察特异性PCR产物条带。采用HLA-E上下游引物的PCR产物长度为3.5kb，采用HLA-F上下游引物的PCR产物长度为3.8kb，采用HLA-G上下游引物的PCR产物长度为3.1kb，则进行下一步。
HLA-E、-F、-G基因全长扩增成功后，序列测定采用的是直接测序(SBT)的方法。测序前需进行三步操作。
第一步是使用ExoSAP-lT酶对扩增产物进行纯化：在每个扩增孔内加入4μLExoSAP-lT消化酶；盖好封口膜/管盖，离心轻甩，使所有液体都离心到管底；将反应混合液充分震荡混合均匀(vortex 10秒左右)；短暂离心，使混合物离心到管底或孔底；将反应板/离心管放到PCR仪运行消化程序。消化程序为：37℃20min，80℃20min，4℃Infinite。
第二步是测序反应：取本发明中的HLA-E、-F、-G基因全长测序引物分别对第一步纯化过的PCR产物进行测序反应，于ABI 9700型PCR仪进行。HLA-E、-F、-G基因全长测序引物如下所示：
HLA-E基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置(以基因的起始密码子‘ATG’中的‘A’为nt1)如下：
E-Genome-SF1:5'-AAGAGTGTGCAGAGATACCGA-3'，NT-246～NT-226；
E-Genome-SF2：5'-CTTCATCTCTGTGGGCTACGT-3'，NT256～NT276；
E-Genome-SF3：5'-CTACGACGGCAAGGATTATCT-3'，NT788～NT808；
E-Genome-SF4：5'-AAGGAATCTAGTCTCGCTGGA-3'，NT1197～NT1217；
E-Genome-SF5：5'-AGAGGAGCAGAGATACACGTG-3'，NT1814～NT1834；
E-Genome-SF6:5'-ATTTTTAGTGGAGATGGGGTT-3'，NT2446～NT2466；
E-Genome-SF7：5'-CACCCTATAATTCCTCCTGCA-3'，NT2940～NT2960；
HLA-F基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下：
F-Genome-SF1:5’-GACTCATATTTTTCCCAGACG-3’，NT-35～NT-15；
F-Genome-SF2：5’-AGTCTCCGGATCCGAAATCTA-3’，NT535～NT555；
F-Genome-SF3：5’-GCCTTCCCTATCTCCTGTAGA-3’，NT1004～NT1024；
F-Genome-SF4：5’-AGTGCAAAGTGCCTGAATTTT-3’,NT1533～NT1553；
F-Genome-SF5：5’-CTTGTTGTCCTTGGAGCTGTG-3’,NT2031～NT2051；
F-Genome-SF6:5’-TTTGCTCTAGGACCTTATGGC-3’,NT2483～NT2503；
HLA-G基因全长正向步移测序引物序列及其在基因组中的核苷酸位置如下：
G-Genome-SF1:5’-ACAAGAGTAGCGGGGTCAG-3’，NT-282～NT-264；
G-Genome-SF2：5’-CTCCCACTCCATGAGGTAT-3’，NT204～NT222；
G-Genome-SF3：5’-ACCCTCCAGTGGATGATTG-3’，NT707～NT725；
G-Genome-SF4：5’-CTTGGCACCAGGACTTTTC-3’,NT1253～NT1271；
G-Genome-SF5：5’-CTGGAGAGGAGCAGAGATA-3’,NT1778～NT1796；
G-Genome-SF6:5’-GTAGTGATGGGGACCTGAT-3’,NT2291～NT2309；
HLA-E、-F、-G基因全长测序测序反应组成均为：
Figure BDA0001750450530000111
HLA-E、-F、-G基因全长测序反应体系均为：
Figure BDA0001750450530000112
第三步是测序产物纯化：每人份加入2ul NaOAc/EDTA，并离心到管底，并混合均匀；每孔测序反应产物依次加入40ul无水乙醇；盖好封口垫/膜，进行至少1分钟的充分混匀；平板离心机2000g或更高离心力离心30分钟；倒置96孔板，垫上吸水纸，500g离心1分钟；每孔依次加入100ul75-80％的乙醇，不要混匀，2000g离心5分钟；倒置96孔板，垫上吸水纸，500g离心1分钟；让酒精在室温避光挥发干净；加入15ul甲酰胺溶解DNA，短暂离心；于PCR仪变性：95℃2min，4℃Infinite。
上机检测：使用3730测序仪对测序反应产物进行毛细管电泳。
数据分析：使用DNASTAR软件包中的SeqMan模块进行拼接(Lasergene version 5；DNA Star,Inc.,Madison,WI)，人工核查拼接的准确性。拼接后的序列由SeqMan输出为文本文档格式后复制到NCBI网站上的SBT Interpretation程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gv/mhc/sbt.cgi？cmd＝main&user_id＝0&probe_id＝0&sou rce_id＝0&locus_id＝0&locus_group＝1&proto_id＝0&kit_id＝0&dummy＝0)与NCBI数据库进行比对。最后得到的所有准确序列再与IPD-IMGT/HLA数据库(http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/align.html，Release 3.28.0,2017-04-13)上的已知序列进行核苷酸定位及多态性分析。
实施例2
本实施例给出了实施例1中涉及HLA-E全基因测序的实验结果。
2.1 HLA-E全基因PCR扩增产物的鉴定
采用本文设计的PCR扩增引物，成功的扩增出16份样本的HLA-E全基因片段，PCR产物长度为约为3.6Kb。取5μL于1.2％的琼脂糖凝胶中电泳，可见清晰的扩增条带，Marker为DL10000DNA Marker(Takara,大连宝生公司)。扩增结果参见图1。图1中上图分别显示Marker以及样本C1-C8的扩增产物电泳图，下图分别显示Marker以及样本C9-C16的扩增产物电泳图。
2.2测序峰图及拼接效果
采用本文设计的步移测序引物ESF1～ESF7，对所有研究对象的HLA-E基因3.6kb扩增产物进行测序，测序结果导入Seqman软件中拼接。图2给出了示例性结果，为样本C2的HLA-E全长序列测序的测序峰图及Seqman序列拼接效果图。
由示例性的图2结果可见，采用采用本文设计的引物，测序峰图质量良好，可拼接出全长。
图3是样本C2的HLA-E等位基因(HLA-E*01:01:01:01)序列图。其中序列核苷酸位置以起始密码子‘ATG’的‘A’为NT1，其上游5’端序列均为负数。
2.3 16个受检标本HLA-E全基因分型结果
用本研究建立的方法所得出的HLA-E序列包含HLA-E基因的5’-启动子区、编码区、内含子区以及下游3’-UTR区，经过与IMGT/HLA数据库中已有的HLA-E全基因序列数据比对，16个受检标本HLA-E全基因分型结果如表1所示。其中新等位基因用粗体表示。
表1 16个受检标本HLA-E全基因分型结果。
Figure BDA0001750450530000131
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不应理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。本文所述技术方案的等同技术方案也包括在本发明范围内。
Figure IDA0001930180330000011
Figure IDA0001930180330000021
Figure IDA0001930180330000031
Figure IDA0001930180330000041
Figure IDA0001930180330000061
Figure IDA0001930180330000071
Figure IDA0001930180330000081

Claims (8)

1.一种用于人类白细胞抗原HLA-E基因全长序列测定的引物，所述引物选自E-genome-F和E-genome-R以及E-Genome-SF1至E-Genome-SF7，优选为E-genome-F和E-genome-R，或优选为E-Genome-SF1至E-Genome-SF7；
其中E-genome-F的序列如SEQ ID NO:1所示，E-genome-R的序列如SEQ ID NO:2所示；E-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:7所示；E-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:8所示；E-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:9所示；E-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:10所示；E-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:11所示；E-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:12所示；E-Genome-SF7的序列如SEQ ID NO:13所示。
2.一种用于人类白细胞抗原HLA-F基因全长序列测定的引物，所述引物选自F-genome-F和F-genome-R以及F-Genome-SF1至F-Genome-SF6，优选为F-genome-F和F-genome-R，或优选为F-Genome-SF1至F-Genome-SF6；
其中F-genome-F的序列如SEQ ID NO:3所示，F-genome-R的序列如SEQ ID NO:4所示；F-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:14所示；F-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:15所示；F-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:16所示；F-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:17所示；F-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:18所示；F-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:19所示。
3.一种用于人类白细胞抗原HLA-G基因全长序列测定的引物，所述引物选自G-genome-F和G-genome-R以及G-Genome-SF1至G-Genome-SF6，优选为G-genome-F和G-genome-R，或优选为G-Genome-SF1至G-Genome-SF6；
其中G-genome-F的序列如SEQ ID NO:5所示，G-genome-R的序列如SEQ ID NO:6所示；F-Genome-SF1的序列如SEQ ID NO:20所示；F-Genome-SF2的序列如SEQ ID NO:21所示；F-Genome-SF3的序列如SEQ ID NO:22所示；F-Genome-SF4的序列如SEQ ID NO:23所示；F-Genome-SF5的序列如SEQ ID NO:24所示；F-Genome-SF6的序列如SEQ ID NO:25所示。
4.一种用于人类白细胞抗原HLA-E、-F和/或-G基因全长序列测定的试剂盒，其中所述试剂盒包含一种或多种权利要求1-3中任一项所述的引物。
5.权利要求4所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含SEQ ID NO:1-2引物对、SEQ ID NO:3-4引物对和/或SEQ ID NO:5-6引物对。
6.权利要求4或5所述的试剂盒，其中所述试剂盒包含选自SEQ ID NO:7-13的一种或多种引物、选自SEQ ID NO:14-19的一种或多种引物、和/或选自SEQ ID NO:20-25的一种或多种引物，优选包含选自(1)SEQ ID NO:7-13的引物组、(2)SEQ ID NO:14-19的引物组和(3)SEQ ID NO:20-25的引物组的引物组。
7.一种用于人类白细胞抗原HLA-E、-F和/或-G基因全长序列测定的方法，所述方法包括应用所述权利要求1-3中任一项所述的引物。
8.权利要求7所述的方法，所述方法包括：
对选自HLA-E、-F和-G基因的基因进行全长扩增：以待测样本的DNA为模板，分别应用选自(i)SEQ ID NO:1-2引物对、(ii)SEQ ID NO:3-4引物对和(iii)SEQ ID NO:5-6引物对的引物对进行PCR扩增；和/或
测序：分别应用选自SEQ ID NO:7-13的一种或多种引物、选自SEQ ID NO:14-19的一种或多种引物和选自SEQ ID NO:20-25的一种或多种引物进行测序，
优选应用选自(1)SEQ ID NO:7-13的引物组、(2)SEQ ID NO:14-19的引物组和(3)SEQID NO:20-25的引物组的引物组进行测序。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808970A (zh) * 2020-07-13 2020-10-23 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 用于扩增GYPA、GYPB、GYPE基因mRNA全长序列的试剂盒及方法
CN112662750A (zh) * 2021-01-29 2021-04-16 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 用于人类白细胞抗原hla-e基因调控区-26位碱基测定的相关引物、试剂盒和方法
WO2022075403A1 (ja) * 2020-10-08 2022-04-14 国立研究開発法人国立国際医療研究センター １種以上のｈｌａ遺伝子用プライマー
WO2023190248A1 (ja) * 2022-03-29 2023-10-05 合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所 対照ゲノム配列の生成方法、装置およびプログラム、ならびに目的アレル配列の解析方法、装置およびプログラム

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111808970A (zh) * 2020-07-13 2020-10-23 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 用于扩增GYPA、GYPB、GYPE基因mRNA全长序列的试剂盒及方法
WO2022075403A1 (ja) * 2020-10-08 2022-04-14 国立研究開発法人国立国際医療研究センター １種以上のｈｌａ遺伝子用プライマー
CN112662750A (zh) * 2021-01-29 2021-04-16 深圳市血液中心(深圳市输血医学研究所) 用于人类白细胞抗原hla-e基因调控区-26位碱基测定的相关引物、试剂盒和方法
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