CN110777152A

CN110777152A - 一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用

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Publication number: CN110777152A
Application number: CN201910899692.0A
Authority: CN
Inventors: 苏文炳; 林顺权; 杨向晖; 邵子坤; 甘小清
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2019-09-23
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2020-02-11
Anticipated expiration: 2039-09-23
Also published as: CN110777152B

Abstract

本发明公开了一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用，从‘早钟6号’中分离、克隆得到一个调控枇杷果实细胞膨大及果实生长的BES1/BZR1家族成员EjBZR1基因。其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，包含888bp的开放阅读框；编码295个氨基酸，其编码的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。该转录因子基因为调控枇杷果实细胞大小及果实大小提供了基因靶标，为改良果实及其他农作物籽粒等产品器官大小、保证作物产量提供理论基础，为减少生长调节剂在果品生产中的使用量提供新的分子育种基因资源，为环境友好型农产品生产提供新作的遗传资源。

Description

一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，更具体地，涉及一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用

背景技术

枇杷秋萌冬花、春实夏熟，是原产我国的特色名贵水果。普通枇杷果园亩产量在500kg左右，仅少数管理极好的果园的亩产量能达到1000kg，单产不到苹果和柑橘等树种的30％。目前单产低造成的高生产成本已成为枇杷产业发展的重要阻力。果实大小既是果品的重要品质性状，同时还是产量形成的重要基础。枇杷每个花序上有大量单花，虽然每个果穗可自然坐果10～20个，但这些果实生长参差不齐、商品性差；生产上一般必须通过疏果促进果实增大与品质提升。培育大果优质品种是提高产量和效益的重要途径，但目前枇杷果实生长调控的分子机制尚不清楚，品种遗传改良速度迟缓。

枇杷从开花到果实成熟历时4至5个月，果实生长发育经历幼果滞长期、细胞迅速***期、果实迅速膨大期和成熟期，但影响果实大小的细胞学基础一直不清楚。发明人前期分析主栽品种‘早钟6号’果实全发育期的细胞特征发现，开花后果实细胞***维持时间占果实发育的1/4，细胞层数增加不到一倍；而发育过程的3/4左右时间进行细胞膨大，成熟果实细胞面积相比开花期萼筒增大了40倍左右，暗示细胞大小对枇杷果实膨大的贡献更大。随后，分析了9份代表性资源的果实细胞学特征与果实大小的相关性，证实细胞大小对枇杷果实变大的贡献大于细胞数目。前期的综合结果表明细胞大小是枇杷果实大小的重要细胞学基础。但是一直未能寻找到调控枇杷果实大小的关键基因。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用。

本发明的第一个目的是提供一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR 1基因。

本发明的第二个目的是提供一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR 1。

本发明的第三个目的是提供所述转录因子EjBZR1基因或所述转录因子EjB ZR1任一在抑制植物器官和/或细胞膨大，或作为植物器官和/或细胞生长的靶点的应用。

本发明的第四个目的是提供所述转录因子EjBZR1基因抑制剂或所述转录因子EjBZR1抑制剂任一在调控植物器官和/或细胞膨大中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种增大枇杷果实的方法。

本发明的第六个目的是提供一种重组载体。

本发明的第七个目的是提供一种重组菌株。

本发明的第八个目的是提供所述重组载体或所述重组菌株任一在促进植物器官和/或细胞膨大中的应用。

本发明的第九个目的是提供所述重组载体或所述重组菌株任一在抑制植物器官和/或细胞膨大中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

通过对极端大/小果杂交姊妹系枇杷果实的细胞学和转录组分析，发现一个 BZR1转录因子，该基因在不同枇杷株系果实中的表达变化与细胞大小(及果实大小)显著负相关，抑制果实该基因表达可促进果实膨大；过表达该基因的拟南芥植株各器官均显著变小，细胞膨大受抑制，将该基因命名为EjBZR1。进一步从‘早钟6号’中分离、克隆得到一个调控枇杷果实细胞膨大及果实生长的 BES1/BZR1家族成员EjBZR1基因。其核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示，包含 888bp的开放阅读框；编码295个氨基酸，其编码的氨基酸序列为SEQ IDNo.2 所示。

因此本发明要求保护以下内容：

一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR1基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

克隆本发明所述EjBZR1基因cDNA序列的引物对，上游引物EjBZR1-F序列如SEQ IDNo.3所示，下游引物EjBZR1-R序列如SEQ ID No.4所示。

一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述转录因子EjBZR1基因或所述转录因子EjBZR1任一在抑制植物器官和/ 或细胞膨大，或作为制植物器官和/或细胞生长的靶点的应用，也属于本发明的保护范围。

所述转录因子EjBZR1基因抑制剂或所述转录因子EjBZR1抑制剂任一在促进植物器官和/或细胞膨大中的应用，也属于本发明的保护范围。

优选地，所述植物为枇杷。

优选地，所述器官包括但不限于果实、叶片等。

一种增大枇杷果实的方法，沉默枇杷中的所述的转录因子EjBZR1基因。

优选地，利用病毒诱导基因沉默技术沉默枇杷果实中的所述的转录因子 EjBZR1基因。

更优选地，包括以下步骤：

S1.将所述的转录因子EjBZR1基因亚克隆到TRV2载体上，得到重组载体；

S2.将上一步构建重组载体和辅助载体分别转入GV3101农杆菌，得到两种重组菌株；

S3.两种重组菌株混合孵育，于枇杷果实细胞膨大初期注射入果实中部。

一种重组载体，***有所述的转录因子EjBZR1基因的载体。

优选地，所述载体为过表达载体和基因沉默载体。

更优选地，所述过表达载体为pBI121，进一步优选地，基因的***位点为 BamH I和Sac I之间。

更优选地，所述基因沉默载体为TRV2，进一步优选地，基因的***位点为 Xho I和Xma I之间。

一种重组菌株，携带有所述的重组载体的菌株。

本发明还要求保护以下内容：

所述重组载体或所述重组菌株任一在促进植物器官和/或细胞膨大中的应用，其特征在于，所述重组载体为重组基因沉默载体。

所述重组载体或所述重组菌株任一在抑制植物器官和/或细胞膨大中的应用，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

1.本发明首次得到了转录因子EjBZR1，该转录因子基因为调控枇杷果实细胞大小及果实大小提供了基因靶标，为改良果实及其他农作物籽粒等产品器官大小、保证作物产量提供理论基础，为减少生长调节剂在枇杷果品生产中的使用量提供新的分子育种基因资源，为环境友好型农产品生产提供新作的遗传资源。

2.通过农杆菌介导遗传转化和基因沉默，获得过表达拟南芥植株和基因抑制枇杷果实，经生物学功能验证，表明本发明克隆的EjBZR1具有同时调控多个基因编码油菜素甾醇合成通路中的酶，从而抑制拟南芥和枇杷果实等器官细胞膨大的功能。EjBZR1具有同时调控多个基因的特性，可为果树分子育种提供更高效的靶标。

附图说明

图1为本发明PCR扩增后EjBZR1产物电泳图。其中，M为DNA Maker(条带从上往下分别为2000bp、1000bp、750bp、500bp)；A1和A2泳道中箭头标识条带为EjBZR1基因全长PCR扩增产物。

图2为本发明EjBZR1与其他植物的BES1/BZR1蛋白聚类及保守结构域分析；其中，图a为EjBZR1与其他植物的BES1/BZR1蛋白聚类；图b为EjBZR1 与其他植物的BES1/BZR1蛋白保守结构域分析。

图3为本发明杂交姊妹系ZP44与ZP65果实形态、细胞特征与EjBZR1基因表达的相关性；其中，图a为杂交姊妹系ZP44与ZP65果实形态；图b为杂交姊妹系ZP44与ZP65成熟果实细胞切片；图c为杂交姊妹系ZP44与ZP65果实直径动态变化；图d为杂交姊妹系ZP44与ZP65果肉厚度动态变化；图e为杂交姊妹系ZP44与ZP65果实细胞大小动态变化；图f为EjBZR1基因在杂交姊妹系ZP44与ZP65果实生长过程中的表达比较。

图4为本发明EjBZR1基因沉默对枇杷果实基因表达及果实大小的影响；其中，图a为EjBZR1基因沉默后果实生长情况；图b为EjBZR1基因沉默后果实重量变化；图c为EjBZR1基因沉默后果肉切片；图d为EjBZR1基因沉默后果实细胞大小变化；图e为农杆菌注射后的病毒衣壳蛋白PCR检测；图f为基因沉默后EjBZR1基因表达变化；图g为EjBZR1基因沉默后果实油菜素甾醇合成相关基因的表达变化。

图5为本发明EjBZR1过表达植株表型；其中，图a为EjBZR1过表达株系与对照植株在抽薹前后的植株大小比较；图b为EjBZR1过表达株系与对照植株开花后植株大小比较；图c为EjBZR1过表达株系与对照植株莲座叶比较；图d 为为EjBZR1过表达株系与对照植株花瓣大小比较；图eEjBZR1过表达株系与对照植株花瓣细胞观察；图f为EjBZR1过表达株系与对照植株花瓣细胞大小比较；图g为EjBZR1过表达株系与对照植株长角果比较；图h为EjBZR1过表达株系与对照植株比较EjBZR1基因表达半定量结果。

图6为本发明转基因植株中EjBZR1及拟南芥油菜素甾醇生物合成相关基因的表达分析。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1枇杷EjBZR1基因cDNA序列的克隆

一、实验方法

1、样本采集

‘早钟6号’4个发育时期果实样品采集于华南农业大学校内的枇杷属种质资源圃内种植的盛果期的‘早钟6号’生产树。新鲜果实样品迅速冻于液氮中，保存在-80℃冰箱中。

2、RNA的提取

研磨后的果实样品用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒(艾德莱)根据说明书方法提取RNA，具体如下：取1.0mL RLT裂解液加到1.5mL离心管中，加入100mg研磨好的果实样品粉末，剧烈震荡20s，之后在55℃裂解20min；将裂解物在13000rpm离心5-10min；取上清，转入新的离心管，并加入上清体积一半的无水乙醇，轻轻吸打混匀；将混合物加入到RA吸附柱中，静置30s 后13000rpm离心2min；弃废液，重复前一步操作，将所有混合物经RA吸附柱过滤；弃废液，往吸附柱中加入700μl去蛋白液RW1，静置1min，13000rpm 离心30s；弃废液，往吸附柱中加入500μl漂洗液RW，静置1min，13000rpm 离心30s；弃废液，加入漂洗液RW重复一遍；弃废液，将吸附柱放回空管中 13000rpm离心2～3min；取出吸附柱，放入一个新的RNase free离心管中，在吸附膜中间加入30～50μl RNase free water，室温静置1～2min，12000rpm离心1min；将洗脱的RNA吸回原来的吸附膜中间，室温静置1～2min，12000rpm 离心1min，获得RNA。

3、反转录合成cDNA

不同样品所获得的RNA测定浓度后，加水调整到相同浓度，随后按 PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(宝生公司)反转录***的说明书合成cDNA第一链。

4、BZR1同源基因的扩增

调取枇杷基因组注释的BZR1同源基因序列全长，用Primer Premier 5.0设计出引物，委托上海生物工程有限公司合成序列全长扩增引物对，扩增引物对：SEQ ID No.3和SEQID No.4。

EjBZR1序列克隆上游引物EjBZR1-F，SEQ ID NO.3： ATGACGTCTGATGGGGC；

EjBZR1序列克隆下游引物EjBZR1-R，SEQ ID NO.4： TTAAATCCGAGCCTTTCCATTC。

以4个时期‘早钟6号’果实合cDNAs为模板，用高保真酶HS DNAPolymerase(宝生公司)PCR扩增目标基因。PCR扩增程序完成后，往体系中加入0.2μl rTaq聚合酶，在72℃下继续延伸30min，以对PCR产物加A尾。反应结束后，PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳。

之后将扩增产物连接到pGEM-T载体(Promega,USA)上转入大肠杆菌感受态，大肠杆菌阳性克隆经PCR检测后交由金唯智生物公司进行Sanger测序、获得准确的目标基因序列。

二、实验结果

结果表明所设计的引物对可以在相应果实模板中扩增到特异的888bp(SEQ IDNo.1和图1)。该序列编码295个氨基酸残基(SEQ ID No.2)。

用MEGA5软件构建同源基因进化树，发现单子叶植物水稻的几个OsBZRs 与拟南芥BES1/BZR1家族中其他几个基因聚在一个分支。EjBZR1与双子叶植物秋子梨(PuBZR1)、番茄(SlBZR1)、大豆(GmBZR1)、巨桉(EgBZR1)和拟南芥(BZR1)的BZR1同源基因聚在另一个分支(图2a)；EjBZR1与拟南芥 BZR1氨基酸一致性为63％，但它与秋子梨PuBZR1都编码295个氨基酸(SEQ ID No.2)，二者氨基酸一致性为91.86％，亲缘关系最近。之后用ClustalX软件对这些基因编码氨基酸的保守结构域/基序进行分析，发现EjBZR1编码氨基酸与其他BES1/BZR1家族基因一样，拥有4个保守功能域(DNA-bing domain、14-3-3 binding site、PESTdomain和EAR motif)，其中DNA-bing domain包含一段核定位的氨基酸残基(图2b)。

实施例2 EjBZR1在ZP44和ZP65果实生长过程的表达模式分析

一、实验方法

在枇杷果实发育不同阶段采集枇杷果实样品和果实/花托直径、厚度和重量测定。在坐果后10个不同时期采集‘ZP44’和‘ZP65’果实样品，用于果实重量、细胞特征及基因表达水平比较，所有果实测量采取3个生物重复，每个重复取 10个果实。

表1基因表达分析引物对序列表

制作切片，具体如下：用FAA固定液固定各个时期果实的果肉小块，并置于真空泵中抽滤1小时左右至飘浮在固定液中的果肉小块沉到瓶底，确保细胞充分固定；取出样品块放入冲水笼利用慢速自来水冲洗24小时以上；采用15％、 30％、50％、70％、85％、95％、100％梯度酒精脱水(间隔时间1h～1.5h，其中70％酒精浸洗过夜，也可长期保存；100％酒精为1h浸洗两遍以保证样品块完全脱水)，除去材料中水分；之后用1/2无水酒精加1/2二甲苯的番红饱和溶液染色2-3h；1/2无水酒精加1/2二甲苯，100％二甲苯(两遍)透明0.5h；加二甲苯至小瓶一半处，加蜡填满，密封后在38-40℃恒温水浴锅中进行浸泡1～2天，也可多天存放，将材料移至铝片活套中，50％石蜡-50％二甲苯、75％石蜡-25％二甲苯、纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C分级浸蜡，操作于65℃恒温箱中进行；用过滤干净的纯蜡将材料包埋在小纸盒中；将凝固好的蜡块，修割成小块固定在小木块是哪个，使用切片机进行切片，厚度8～10μm，40℃水浴锅展开后将切片贴附到干净载玻片上，40℃恒温箱烘干；将烘干切片置于二甲苯中浸泡脱蜡，重复一次，每次30min左右，取出切片稍微晾干，用中性树胶封片。制作好的切片用 AxioVision LE64软件***(Carl Zeiss,German)进行观察拍照，转基因植株花瓣直接压片后于光学显微镜镜检、拍照；获取的细胞照片用Images J软件 (http://rsb.info.nih.gov/vj/)进行细胞大小分析。

各枇杷果实样品按照实施例1方法提取RNA并合成cDNA。按以上查找出来的基因设计荧光定量引物，所有引物经特异性和扩增效率检测，引物序列见表 1。以各个时期cDNA为模板，用iTaqTM universal

Green Supermix (Bio-Rad)，在LightCycler 480(Roche)荧光定量PCR仪上进行qPCR反应。扩增以EjACT作为枇杷基因表达的内参基因进行基因表达水平均一化。10.0μl混合液按95℃60s；95℃10s，60℃20s，72℃15s，重复39次；溶解曲线按试剂盒默认程序分析。以上实验都设计3次重复。

二、实验结果

结果表明ZP65的果实从坐果后即比ZP44大，随着果实生长这两个株系间的果实大小差异逐渐增大(图3a，c)；这两份材料间的果实大小差异变现在果实直径(图3c)、果肉厚度(图3d)和果肉细胞大小(图3b，e)等各方面。基因表达分析发现，ZP44各个时期果实中EjBZR1基因的表达水平均高于其在ZP65 (图3f)。基因表达模式和细胞膨大的动态相关性分析可见，EjBZR1基因的表达与细胞膨大和果实生长负相关。显示EjBZR1可能是一个果实生长的负调控因子。

实施例3 EjBZR1基因沉默载体构建及枇杷果实VIGS处理

一、实验方法

用表2中的引物将EjBZR1亚克隆到TRV2载体上，构建病毒诱导基因沉默载体TRV2-EjBZR1。载体构建具体为：利用Gibson

Master Mix和相应内切酶(购自NewEngland Bio labs)在37℃条件下对线性化的载体。采用凝胶DNA微量回收试剂盒(Magen)对酶切产物进行纯化。用ClonExpress一步法定向克隆无缝克隆试剂盒将纯化的酶切产物连接到目的载体上，反应体系包含1 μl纯化回收的PCR扩增产物，1μl线性化载体，2μl 5×CE II buffer，1μl Exnase^TMII 和4μl无菌水。反应体系于37℃反应半小时后先于冰上冷却5min,之后取5μl 连接产物转入50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，经PCR鉴定和Sanger测序获得含目的片段的TRV2-EjBZR1重组质粒。

表2植物过表达载体与病毒诱导基因沉默载体构建引物

构建好的表达载体和辅助载体(TRV1)分别转入GV3101农杆菌，加甘油 -80℃保存备用。VIGS处理前，先取甘油菌在含有抗生素的平板上划线活化；用 30mL MES(浓度为100mM)，30mL MgCl2(浓度为100mM)，加无菌水至150mL 并加入150μL乙酰丁香酮(浓度为100mM)，混均制成配制MCLS工作液，于4℃冰箱保存；取400-500μL新活化菌液接种到5～10mL含50μL Kan和100mL Rif的 YEP液体培养基中，摇24h至隔天上午(若已活化，振荡时间也可适当缩短)，菌液A₆₀₀值为0.8～1.0；取2mL菌液，于5000rpm离心10min；弃上清，向沉淀中加入2mL MCLS工作液，悬浮菌体；5000rpm，离心10min；弃上清，重复悬浮- 离心1次，加入到10～15mL试管中；加入工作液稀释至菌液A₆₀₀值在0.2左右(以工作液作空白对照)；将已经稀释好的含TRV1空载体的菌液与TRV2-EjBZR1(或 TRV2-Empty)菌液溶液等体积混合；混匀后避光在室温条件下孵育3小时左右；于枇杷果实细胞膨大初期(约花后42～60天)，用25ml注射器的针头预先在果实近赤道面做好标记，用Injex-30型注射器将TRV1+TRV2-EjBZR1混合菌液注射入果实中部，并用TRV1+TRV2-Empty混合菌液注射的果实作为对照。注射后7天，采集果实样品分析基因表达情况，参考实施例1提取RNA、合成cDNA参考，参考实施例2分析VIGS处理果实的EjBZR1及枇杷油菜素甾醇生物合成相关基因的表达情况，所有定量分析的引物对序列见表2。同时在果实成熟时分析果实果重变化，之后参考实施例2用FAA固定果实样品块制作切片，并进行细胞观测。

二、实验结果

以TRV1+TRV2-Empty作为对照，发现VIGS处理后TRV2-EjBZR1的果实明显变大(图4a，b)。切片分析发现基因沉默果实的细胞显著增大(图4c，d)。用未注射的果实做空白对照，PCR检测发现，空载体和TRV2-EjBZR1注射的果实中均可检测到病毒衣壳蛋白的转录本(图4e)，证明所用的VIGS体系可以在枇杷果实体内表达。检测TRV1+TRV2-Empty和TRV1+TRV2-EjBZR1果实中的 EjBZR1的表达水平发现，VIGS处理后可以使枇杷果实的EjBZR1表达水平显著下调(图4f)。伴随EjBZR1表达水平降低，多个油菜素甾醇合成相关基因，特别是EjCYP90A，在VIGS处理果实中的表达水平显著上调(图4g)。证明EjBZR1 是果实生长抑制因子，降低其表达量可以促进果实细胞膨大和果实生长。

实施例4植物过表达载体构建及拟南芥遗传转化功能验证

一、实验方法

RNA提取、cDNA合成参考实施例1，基因表达分析参考实施例2，用表2 中的引物对将EjBZR1亚克隆到pBI121质粒上，构建35S::EjBZR1过表达载体，载体构建及载体农杆菌转化具体操作步骤参考实施例3。

采用浸花法进行拟南芥遗传转化，具体操作如下：挑取经过检测的农杆菌单菌落接种于5mL YEP(含50μg/mL卡那霉素，50μg/mL利福平，25μg/mL庆大霉素和5μg/mL四环霉素)中，28℃，200rpm振荡培养过夜；按1/50(V/V) 将菌液转接入100mL含上述相应抗生素的YEP液体培养基中，28℃，200rpm 振荡培养至A₆₀₀为0.8左右；5000rpm离心10min收集菌体；配置100mL转化渗透液(5％蔗糖，0.05％Silwet L-77)，重新悬浮菌体；采用floral dip方法将拟南芥的花蕾浸入渗透液中，侵染过程中轻轻晃动花序；约1min后，取出植株横放在塑料盘中，遮光，于22℃培养24h；之后转入常规光照条件使其恢复正常生长；初次转化7d后，可重复侵染1-2次，以提高转化效率；转化后生长约 1个月、待种子成熟，收集种子，进行抗性筛选；用T3代植株进行表型比较分析。

遗传转化所用的拟南芥先于4℃春化，之后抗性植株及对照植株均种植在 22℃、16h/8h长日照条件的温室内。转基因拟南芥在抽薹前后(所有叶片完全展开时)拍照比较植株及叶片大小差异、在花开放当天采集花瓣用于花瓣面积和细胞大小比较。在播种后3周(植株叶片迅速膨大阶段)采集拟南芥植株，参考实施例1提取RNA、合成cDNA参考，参考实施例2分析过表达植株的EjBZR1 及拟南芥油菜素甾醇生物合成相关基因的表达情况，所有定量分析的引物对序列见表2。以AtUBQ10作基因表达的内参基因进行基因表达水平均一化。

二、实验结果

以野生型Col-0拟南芥做对照，发现3个EjBZR1过表达株系的植株大小、叶片、花瓣和果实都不同程度显著变小(图5a，b，c，d，g)；其中叶片和果实还表现不同程度的畸形、卷曲(图5c，d)。以2号转基因株系为例，分析花瓣表皮细胞特征与花瓣大小的相关性，发现过表达植株的花瓣细胞显著变小(图 5e)；最终，各过表达株系植株的花瓣也比野生型小(图5f)。用半定量(图5h) 和qPCR定量法分析基因表达，可知各株系中均有很高的EjBZR1基因表达水平而野生型植株中未检测到该基因表达(图6)。同时发现，这3个过表达拟南芥株系植株的8个油菜素甾醇生物合成相关基因都显著被抑制(图6)。拟南芥遗传转化证明EjBZR1是生长抑制转录因子，过表达抑制油菜素甾醇合成基因表达，限制细胞膨大和器官生长。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种抑制果实细胞膨大的转录因子EjBZR1及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 888

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica

<400> 1

atgacgtctg atggggcgac ttcagcggcg acgacggcgc ggaggaagcc gtcgtggcgg 60

gagagggaga acaaccggag gagagagcgg aggaggagag ccgtcgcggc gaagatattc 120

gccggcctcc gagctcaggg agacttcaat ttgcccaagc actgcgacaa caacgaggtc 180

cttaaagctc tctgcctcca ggccggctgg accgtagagg acgacggcac cacctaccgg 240

aagggattaa agccgattca aactgatacg ccgggcgcat caaccaagat cagcccgtac 300

tcgtcgctaa atccgagtcc aatcccgtcc taccaagtca gtccgtcgtc ttcgtcctat 360

cccagtccca cccgcttcga tcccgtctct aattcatcca atccaattca ctatctccgt 420

tctgcaatcc caccatctct tcctcccctg cgaatttcca acagtgcccc tgtaaccccg 480

ccgctctcct ccccgacctc cagacgcccc aacccaattc ccaactggga caccattgcc 540

aaacagtcca tggcctcttt cgattacccg ttttatgccg tctccgctcc agcgagcccg 600

acccgccaac accatcctca tcctacagct gccactatcc ccgaatgcga cgagtccgat 660

gcttccaccg tcgattccgg acaatgggta tgcttccaga gatttgctcc ttctctgtca 720

gcaatgccag cctctccgac ctttaatctt gtgaagcctg ctttccctca gcagaatatt 780

cccgcggatc aaatcccgga cgtaaagccg tggatcgggg agaagattca cgaggtggga 840

ttggatgact tggagctcac gcttgggaat ggaaaggctc ggatttaa 888

<210> 2

<211> 295

<212> PRT

<213> Eriobotrya japonica

<400> 2

Met Thr Ser Asp Gly Ala Thr Ser Ala Ala Thr Thr Ala Arg Arg Lys

1 5 10 15

Pro Ser Trp Arg Glu Arg Glu Asn Asn Arg Arg Arg Glu Arg Arg Arg

20 25 30

Arg Ala Val Ala Ala Lys Ile Phe Ala Gly Leu Arg Ala Gln Gly Asp

35 40 45

Phe Asn Leu Pro Lys His Cys Asp Asn Asn Glu Val Leu Lys Ala Leu

50 55 60

Cys Leu Gln Ala Gly Trp Thr Val Glu Asp Asp Gly Thr Thr Tyr Arg

65 70 75 80

Lys Gly Leu Lys Pro Ile Gln Thr Asp Thr Pro Gly Ala Ser Thr Lys

85 90 95

Ile Ser Pro Tyr Ser Ser Leu Asn Pro Ser Pro Ile Pro Ser Tyr Gln

100 105 110

Val Ser Pro Ser Ser Ser Ser Tyr Pro Ser Pro Thr Arg Phe Asp Pro

115 120 125

Val Ser Asn Ser Ser Asn Pro Ile His Tyr Leu Arg Ser Ala Ile Pro

130 135 140

Pro Ser Leu Pro Pro Leu Arg Ile Ser Asn Ser Ala Pro Val Thr Pro

145 150 155 160

Pro Leu Ser Ser Pro Thr Ser Arg Arg Pro Asn Pro Ile Pro Asn Trp

165 170 175

Asp Thr Ile Ala Lys Gln Ser Met Ala Ser Phe Asp Tyr Pro Phe Tyr

180 185 190

Ala Val Ser Ala Pro Ala Ser Pro Thr Arg Gln His His Pro His Pro

195 200 205

Thr Ala Ala Thr Ile Pro Glu Cys Asp Glu Ser Asp Ala Ser Thr Val

210 215 220

Asp Ser Gly Gln Trp Val Cys Phe Gln Arg Phe Ala Pro Ser Leu Ser

225 230 235 240

Ala Met Pro Ala Ser Pro Thr Phe Asn Leu Val Lys Pro Ala Phe Pro

245 250 255

Gln Gln Asn Ile Pro Ala Asp Gln Ile Pro Asp Val Lys Pro Trp Ile

260 265 270

Gly Glu Lys Ile His Glu Val Gly Leu Asp Asp Leu Glu Leu Thr Leu

275 280 285

Gly Asn Gly Lys Ala Arg Ile

290 295

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica

<400> 3

atgacgtctg atggggc 17

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Eriobotrya japonica

<400> 4

ttaaatccga gcctttccat tc 22

Claims

1.一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种抑制器官和/或细胞膨大的转录因子EjBZR1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.权利要求1所述转录因子EjBZR1基因或权利要求2所述转录因子EjBZR1任一在抑制植物器官和/或细胞膨大，或作为制植物器官和/或细胞生长的靶点的应用。

4.权利要求1所述转录因子EjBZR1基因抑制剂或权利要求2所述转录因子EjBZR1抑制剂任一在促进植物器官和/或细胞膨大中的应用。

5.一种增大枇杷果实的方法，其特征在于，沉默枇杷中的权利要求1所述的转录因子EjBZR1基因。

6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，利用病毒诱导基因沉默技术沉默枇杷果实中的权利要求1所述的转录因子EjBZR1基因。

7.一种重组载体，其特征在于，***有权利要求1所述的转录因子EjBZR1基因的载体。

8.一种重组菌株，其特征在于，携带有权利要求7所述的重组载体的菌株。

9.权利要求7所述重组载体或权利要求8所述重组菌株任一在促进植物器官和/或细胞膨大中的应用，其特征在于，所述重组载体为重组基因沉默载体。

10.权利要求7所述重组载体或权利要求8所述重组菌株任一在抑制植物器官和/或细胞膨大中的应用，其特征在于，所述重组载体为重组过表达载体。