CN110772550B - 一种从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药炮制及天然产物提取技术领域，具体涉及一种从砂烫炮制后的诃子肉中制备鞣花酸的方法及应用。所述的制备鞣花酸的方法包括以下步骤：将诃子置于220℃~260℃的河砂中，烫制5~9 min，剥取果肉。粉碎成药粉，通过乙醇回流提取，再经大孔吸附树脂法以不同浓度乙醇梯度洗脱，收集醇浓度为90%的洗脱液，回收乙醇，残渣减压干燥，即得鞣花酸产品。本发明通过对炮制方法及工艺参数进行优化，极大地提高了鞣花酸在原料中的含量，并通过乙醇回流提取，再经大孔吸附树脂法以乙醇溶液进行洗脱，有效降低成本，提高鞣花酸产品产率及纯度。本发明制得鞣花酸用于溃疡性结肠炎的治疗，安全有效，有助于提高患者生活质量。

Description

一种从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法及应用
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及中药炮制及天然产物提取技术领域，具体涉及一种从砂烫炮制后的诃子肉中制备鞣花酸的方法及应用。
背景技术
鞣花酸又名并没食子酸，是一种没食子酸的二聚衍生物，广泛存在于多种植物果实中。天然鞣花酸最先发现于树莓、栗子、石榴等植物中。现代药理学研究发现鞣花酸具有多种生物活性。首先，对化学物质诱导的癌变及其他多种癌变具有明显的抑制作用，特别是对结肠癌、食管癌、肝癌、肺癌、舌及皮肤癌症具有很好的抑制作用，被称为人体内的卫士，本世纪初美国布鲁金斯癌症研究所称“鞣花酸是近十年抗癌制品的唯一天然品种”；另外，鞣花酸具有较强的收敛作用，对多种细菌、真菌、酵母菌都有明显的抑制作用，能防止感染，抑制溃疡；鞣花酸还具有抗病毒作用，能够抑制人体免疫缺陷病毒的增殖；此外，鞣花酸具有抑制酪氨酸酶活性，阻断黑色素生成作用，具有美白及淡斑效果，是皮肤科医学公认的有效美白成分之一。鉴于鞣花酸的多种生物活性，目前在药品、食品、化妆品领域的开发和应用成为热点，具有广阔的发展空间。
诃子为使君子科植物诃子(Terminalia chebula Retz.)或绒毛诃子(Terminaliachebula Retz.var.tomentella Kurt.)的干燥成熟果实，具有涩肠止泻，敛肺止咳之功效，临床上存在生熟异用，《本草通玄》等本草古籍中多有记载：“生用则能清金行气，煨用则能暖胃固肠”，诃子经炮制后涩肠止泻作用增强，主要用于治疗气痢、肠风泻血，与现代临床的溃疡性结肠炎相对应。现代化学研究表明诃子所含的主要成分为鞣质类，以没食子鞣质和鞣花鞣质为主，含量可以达到23.60％～37.36％。经过加热炮制，诃子中的鞣质成分分别向没食子酸和鞣花酸进行转化，当炮制温度较高时，成分转化程度较大，产物以鞣花酸为主。
现有技术中提取得到的天然鞣花酸的纯度均较低，通常在20～30％左右，虽然只进行一次碱溶酸沉和一次水洗就可以使鞣花酸纯度达到40～50％，然而再增加碱溶酸沉或水洗步骤虽可以提高纯度，但产品质量却会所下降。目前，鞣花酸的制备多由植物中单宁经过氧化或酸水解的方法转化而成，酸水解方法，转化率低，副产物多，含量难以提高，低温氧化法，转化率较高，副产物少，纯度较易提高。一种高纯度鞣花酸制备方(CN101434608A)，采用酸水解法制备鞣花酸，使用硫酸及过氧化氢试剂，水解液含有大量酸剂过氧化氢，这些都会给环境造成严重污染，产品收率低，要求设备能够耐受强酸腐蚀，对设备要求较高，不适合推广生产。一种塔纳粉制备鞣花酸的方法(CN101759165A)，采用氧化法制备鞣花酸，虽然含量可以做到98％，但是氧化过程操做复杂，使用化学试剂多，精制过程使用吡啶毒性溶剂，对人体有巨大伤害，并会造成环境污染。一种以石榴皮为原料酶法制备鞣花酸的方法(CN101481714A)，采用生物酶转化法制备鞣花酸，该法操作复杂，条件控制严格，生产周期长，生产效率低下。大孔树脂法纯化丹宁制备高纯度鞣花酸的方法(CN201510156630.2)公开了大孔树脂法纯化制备高纯度鞣花酸的方法，该方法具体公开了利用大孔吸附树脂技术纯化丹宁，将丹宁在碱性环境下氧化产生鞣花酸，再经过精制制成纯度98％以上的鞣花酸产品。该方法虽然能制得高纯度的鞣花酸产品，但操作较为复杂，对树脂的技术要求较高。一种诃黎勒鞣花酸的制备方法(CN102020682B)，取诃子叶粗粉，通过微波萃取和多次离子交换树脂吸附和洗脱制备鞣花酸，操作方法复杂，产率低，生产周期长，不适合工业化生产。
因此，开发一种操作简便、收率高并且适合工业化生产的制备鞣花酸的方法具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种从砂烫炮制后的诃子肉中制备鞣花酸的方法及应用。本发明提供的炮制方法，使诃子中鞣质类最大程度向鞣花酸转化，而后对鞣花酸进行富集、制备，并将其用于溃疡性结肠炎的治疗。本发明通过对诃子进行砂烫炮制可以使鞣花酸在原料中的含量显著提高，通过乙醇提取、大孔吸附树脂法富集得到的鞣花酸产品纯度可达55％～65％，其收率可达50％～60％，本发明制备方法制得的鞣花酸产品具有较好的抗炎作用，可用于溃疡性结肠炎的治疗。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案。
一种烫诃子肉的炮制方法，包括以下步骤：将诃子置于220℃～260℃的河砂中，烫制5～9min，剥取果肉。
优选地，所述炮制温度为240℃，所述炮制时间为6min。
一种从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
S1粉碎：将烫诃子肉粉碎成药粉。
S2提取：取烫诃子肉药粉，加入乙醇溶液进行回流提取，回收乙醇，得浓缩液。
S3富集：将所得浓缩液加水稀释，上大孔吸附树脂，以不同浓度乙醇梯度洗脱，收集醇浓度为90％的洗脱液，回收乙醇。
S4制得：残渣减压干燥，即得鞣花酸产品。
其中，所述步骤S1中烫诃子肉的粉碎程度控制在10～24目。
优选地，所述步骤S1中烫诃子肉的粉碎程度控制在10目。
进一步地，所述步骤S2中对烫诃子肉药粉进行提取所用乙醇溶液浓度为40％～70％，料液比为1:(10～15)，提取时间为0.5～2h，提取次数为2～3次。
优选地，所述步骤S2中对烫诃子肉药粉进行提取所用乙醇溶液浓度为60％，料液比为1:10，提取时间为1h，提取次数为3次。
进一步地，所述步骤S3中对浓缩液稀释程度为生药:药液体积为1:(10～20)。
优选地，所述步骤S3中对浓缩液稀释程度为生药:药液体积为1:15。
进一步地，所述步骤S3中纯化所用大孔吸附树脂型号为NKA-9或HPD600。
进一步地，所述步骤S3中上样液体积与树脂体积比为1:(4～8)。
优选地，所述步骤S3中上样液体积与树脂体积比为1:6。
进一步地，所述步骤S3中洗脱醇浓度及用量为0％洗脱1～3个柱体积，60％洗脱1～3个柱体积，90％洗脱10～20个柱体积。
优选地，所述步骤S3中洗脱醇浓度及用量为0％洗脱3个柱体积，60％洗脱3个柱体积，90％洗脱15个柱体积。
一种从烫诃子肉中制备的鞣花酸在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
与现有技术比，本发明的有益效果如下。
1)目前对于鞣花酸的制备多是从石榴皮、板栗、树莓等植物中提取，其在原料中含量均不高。诃子中的鞣花酸含量约在1.31％～2.35％，经炮制后可增加至2.54％～3.82％。本发明通过对炮制方法及工艺参数进行优化，经砂烫炮制后，诃子肉中鞣花酸含量可高达8.0％，极大地提高了鞣花酸在原料中的含量，为提高鞣花酸产率奠定基础。
2)本发明通过乙醇回流提取，再经大孔吸附树脂法以乙醇溶液进行洗脱，操作简单，所得乙醇溶液经回收溶剂可循环使用，所涉及的大孔吸附树脂亦可重复使用多次，有效降低成本，提高鞣花酸产品产率及纯度。
3)溃疡性结肠炎病因复杂，至今尚不完全清楚，其发病环节多，治愈难度大，病程漫长，被世界卫生组织列为现代难治疾病之一。本发明所得鞣花酸用于溃疡性结肠炎的治疗，可以克服目前西药治疗副作用大的缺点。安全有效，提高患者生活质量，助力健康中国计划。
附图说明
图1是鞣花酸对照品液相色谱图。
图2是生品诃子中鞣花酸含量测定液相色谱图。
图3是砂烫诃子中鞣花酸含量测定液相色谱图。
图4是水洗脱液中鞣花酸含量测定液相色谱图。
图5是60％乙醇溶液洗脱液中鞣花酸含量测定液相色谱图。
图6是90％乙醇溶液洗脱液中鞣花酸含量测定液相色谱图。
图7是产品中鞣花酸含量测定液相色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细描述。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明内容所实现的技术均属于本发明的范围。实施例1从烫诃子肉中制备鞣花酸方法的工艺优化实验。
1.砂烫诃子肉的制备方法-炮制温度筛选实验。
一种砂烫诃子肉的制备方法，包括以下步骤。
(1)取诃子(含鞣花酸1.572％)9份，每份20g，分别置于180℃、190℃、200℃、210℃、220℃、230℃、240℃、250℃、260℃的河砂中，均烫制6min，剥取果肉。
(2)取各份砂烫诃子肉，粉碎，过60目筛，精密称取0.1g，加入25mL浓度为70％的甲醇水溶液，超声提取20min，滤过。
(3)取续滤液过0.45μm微孔滤膜，分别吸取10μL注入高效液相色谱仪，测定鞣花酸色谱峰面积，外标一点法计算鞣花酸含量，结果如表1所示。
表1不同温度炮制品中鞣花酸含量比较
Figure BDA0002306202680000041
从表1可以看出，本发明选取在220～260℃对诃子进行炮制，其产品中鞣花酸含量较生品提高3.8～5.0倍。炮制过程中其他成分向鞣花酸的转化率与温度有关，在220℃以上转化率显著高于低温。
2.砂烫诃子肉的制备方法-烫制时间筛选实验。
一种砂烫诃子肉的制备方法，包括以下步骤。
(1)取诃子(含鞣花酸1.572％)200g，置于240℃的河砂中，烫制过程中分别于4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min各取出约20g，剥取果肉。
(2)取各份砂烫诃子肉，粉碎，过60目筛，精密称取0.1g，加入25mL浓度为70％的甲醇水溶液，超声提取20min，滤过。
(3)取续滤液过0.45μm微孔滤膜，分别吸取10μL注入高效液相色谱仪，测定鞣花酸色谱峰面积，外标一点法计算鞣花酸含量。结果如表2所示。
表2不同时间炮制品中鞣花酸含量比较
Figure BDA0002306202680000051
从表2可以看出，本发明选取在240℃对诃子进行炮制5～9min，其产品中鞣花酸含量较生品提高4.2～5.0倍。其中炮制时间短，其他成分向鞣花酸的转化率低；炮制时间长，有机物在高温下发生碳化，鞣花酸一定程度被破坏，因此时间需进行合理控制。
由实验1和实验2所得结果可见，对诃子进行砂烫炮制的最优条件应是在240℃下炮制6min。
3.烫诃子肉中制备鞣花酸的方法-乙醇浓度筛选实验。
一种由砂烫诃子肉中提取鞣花酸方法，包括以下步骤。
(1)将诃子于240℃下砂烫炮制6min，粉碎，过60目筛。
(2)称取粉碎后的诃子肉10份，每份2g，分别加浓度为0％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的乙醇溶液各50mL，回流提取1h，滤过。
(3)取各续滤液适当稀释，稀释液过0.45μm微孔滤膜，吸取10μL注入高效液相色谱仪测定鞣花酸含量，结果如表3所示。
表3不同浓度溶剂提取鞣花酸含量比较
Figure BDA0002306202680000052
从表3可以看出，本发明选取以40％～70％的乙醇溶液对鞣花酸进行提取，其提取效率较高，其中以60％乙醇溶液提取效率最高，可确定为最优提取溶剂。
4.烫诃子肉中制备鞣花酸的方法-60％乙醇溶液提取鞣花酸的最优条件筛选实验。
一种由砂烫诃子肉中提取鞣花酸方法，包括以下步骤。
(1)将诃子在240℃的河砂中炮制6min，砸取果肉。
(2)以正交设计法选择60％乙醇溶液提取鞣花酸的最优条件，按表3所示L9(34)设计方案进行实验。
(3)取各份提取液进行HPLC法测定鞣花酸含量，结果如表4所示。
表4鞣花酸提取条件优化
Figure BDA0002306202680000061
从表4可以看出，将烫诃子肉粉碎为10～24目的药粉，以料液比1:10以上，提取2～3次，每次0.5h以上，提取所得鞣花酸含量均可超过7％，按最优炮制工艺下所得烫诃子肉中鞣花酸含量为8％计算，提取率可达85％以上。其中以粉碎粒度10目，料液比1:10，提取3次，每次1h，提取效率最高。
5.烫诃子肉中制备鞣花酸的方法-洗脱液体积筛选实验。
一种由砂烫诃子肉中富集、制备鞣花酸方法，包括以下步骤。
(1)将诃子在240℃的河砂中炮制6min，砸取果肉。
(2)将烫诃子肉粉碎，过10目筛，称取20g药粉，以料液比1:10加入60％乙醇溶液回流提取3次，每次1h，合并提取液，回收乙醇，将浓缩液以水定容至200ml容量瓶中(含鞣花酸浓度为7.14mg·ml-1)。
(3)取浓缩液2ml，按生药量:药液体积为1:15进行稀释，得稀释液3ml，以药液体积:树脂体积为1:6上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗5个柱体积(5BV)，接取每一柱体积的流份；再以60％乙醇溶液冲洗5个柱体积(5BV)，接取每一柱体积的流份；最后以90％乙醇溶液冲洗，至无鞣花酸流出，接取每一柱体积的流份。
(4)将接取的各溶液洗脱所得每一柱体积流份进行适当稀释，进行HPLC法测定其中鞣花酸的量，结果如表5所示。
表5各流份中鞣花酸含量
Figure BDA0002306202680000071
从表5可以看出，上样后以水冲洗，大极性成分首先被洗脱，鞣花酸有少量损失，当洗脱达到3倍树脂体积(3BV)时大极性成分已基本被洗脱完，为减少鞣花酸损失量，水洗体积不宜超过3BV；再以60％乙醇溶液除去中等极性成分，随着洗脱体积的增加中等极性成分逐渐被洗脱，但鞣花酸损失也累积增多，为兼顾制备鞣花酸的纯度和产率，60％乙醇洗脱体积不宜超过3BV；最后以90％乙醇溶液将吸附于大孔吸附树脂上的鞣花酸洗脱下来，当洗脱体积达到10BV以上，鞣花酸检出量逐渐减少，洗脱至20BV基本洗脱完全，无需加大洗脱剂体积，兼顾生产成本，洗脱15BV较为合适。
6.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例1中5中的浓缩液20ml，其生药量:药液体积为1:10，以药液体积:树脂体积为1:6上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
7.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例5中的浓缩液20ml，按生药量:药液体积为1:15进行稀释，得药液30ml，以药液体积:树脂体积为1:6上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
8.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例5中的浓缩液20ml，按生药量:药液体积为1:20进行稀释，得药液40ml，以药液体积:树脂体积为1:6上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
9.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例5中的浓缩液20ml，按生药量：药液体积为1:15进行稀释，得药液30ml，以药液体积:树脂体积为1:4上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
10.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例5中的浓缩液20ml，按生药量:药液体积为1:15进行稀释，得药液30ml，以药液体积:树脂体积为1:8上于处理好的NKA-9型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
11.从烫诃子肉中制备鞣花酸的方法，包括以下步骤。
(1)取实施例5中的浓缩液20ml，按生药量:药液体积为1:15进行稀释，得药液30ml，以药液体积:树脂体积为1:6上于处理好的HPD600型大孔吸附树脂顶端，首先以水冲洗3BV；再以60％乙醇溶液冲洗3BV；最后以90％乙醇溶液冲洗15BV，接取90％乙醇洗脱液，混合。
(2)回收溶剂，残渣减压干燥，得鞣花酸产品。
采用HPLC法测定实施例1中方法6～11中所得90％乙醇洗脱液和回收洗脱液后减压干燥所得产品中鞣花酸含量。具体实验条件如下：色谱柱：Ecosil C18柱(150mm×4.6mm，5μm)；流动相：0.3％磷酸水溶液(A)-甲醇(B)(0～8min：B％为5.0％→10.0；8～15min：B％为10.0％→25.0％；15～25min：B％为25.0％；25～30min：B％为25.0％→30.0％；30～50min：B％为30.0％→45.0％；50～55min：B％为45.0％)；检测波长270nm；流速为1ml·min-1；柱温30℃；进样量10μl，所得结果如表6所示。
表6产率及纯度效果比较
Figure BDA0002306202680000091
由方法6、7、8可见，大孔吸附树脂纯化前对提取液进行不同程度稀释，稀释比越大所得产品纯度越高，但相应的收率会有所降低，因此稀释比不宜过大，在1:(10～20)即可，1:15时收率和纯度均较高，为最优稀释比。
由方法7、9、10可见，上样量一定，大孔吸附树脂用量越大所得产品纯度越高，但相应的收率有所降低，由于树脂用量过大造成洗脱剂用量增大，耗费材料成本及工时，因此树脂用量不宜过大，药液体积:树脂体积在1:(4～8)即可，1:6时收率和纯度均较高，为最优树脂用量。
发明人在前期工作中对不同型号大孔吸附树脂对诃子中鞣质的吸附性能进行***考察，结果表明NKA-9和HPD600两种树脂对诃子鞣质的吸附及解吸附性能较好，因此在本发明中对两种树脂对鞣花酸的富集能力进行比较，结果由方法7和方法11可见，两者均能较好地对鞣花酸进行富集。
实施例2鞣花酸药理学研究实验-采用葡聚糖硫酸钠(DSS)造模法复制小鼠溃疡性结肠炎模型。
取小鼠90只，随机分为空白组、模型组、阳性药组及实施例1中方法6～11组，每组10只，在自由饮用4％DSS水溶液4天后(空白组饮水)，空白组和模型组灌胃给予生理盐水，阳性药组给予柳氮磺吡啶水溶液，各实施例组分别灌胃给予所得鞣花酸产品，将实施例1中方法6～11所制得鞣花酸产品配制成鞣花酸浓度约为1.7mg·ml-1的溶液，按每10g体重灌胃0.1ml计算给药量，给药7天。于末次给药4h后处死小鼠，剪取结肠部分。以ELISA法测定结肠组织中TNF-α、IL-1β的含量，结果如表7所示。
表7实施药理作用效果比较
Figure BDA0002306202680000101
Figure BDA0002306202680000102
注：采用LSD检验，与空白组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01。
由表7结果可见，服用鞣花酸产品后，溃疡性结肠炎模型动物的结肠中炎症因子TNF-α、IL-1β的含量降低，说明鞣花酸产品起到减轻炎症反应的作用。

Claims (9)

1.一种砂烫诃子肉的制备方法，其特征在于，将诃子置于220℃ ~ 260℃的河砂中，烫制5~9 min，剥取果肉。
2.一种从权利要求1所述的方法制备得到的烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1粉碎：将烫诃子肉粉碎成药粉；
S2提取：取烫诃子肉药粉，加入乙醇溶液进行回流提取，回收乙醇，得浓缩液；
S3富集：将所得浓缩液加水稀释，上大孔吸附树脂，以不同浓度乙醇梯度洗脱，收集醇浓度为90%的洗脱液，回收乙醇；
S4制得：残渣减压干燥，即得含鞣花酸提取物的产品。
3.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S1中对烫诃子肉的粉碎程度控制在10~24目。
4.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S2中对烫诃子肉药粉进行提取所用乙醇溶液浓度为40%~70%，料液比为1:（10~15），提取时间为0.5~2 h，提取次数为2~3次。
5.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S3中对浓缩液稀释程度为生药量:药液体积为1:（10~20）。
6.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S3中纯化所用大孔吸附树脂型号为NKA-9或HPD600。
7.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S3中上样液体积与树脂体积比为1:（4~8）。
8.如权利要求2所述的从烫诃子肉中制备含鞣花酸提取物的方法，其特征在于，S3中洗脱醇浓度及用量为0%洗脱1~3个柱体积，60%洗脱1~3个柱体积，90%洗脱10~20个柱体积。
9.一种从权利要求2-8任一项所述制备方法制备得到的含鞣花酸的提取物在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。
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