CN110760590A - 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 - Google Patents

一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用宿主外泌体检测日本血吸虫感染方法。血清外泌体miR‑223‑3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，并根据利用其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示引物建立了检测日本血吸虫感染的方法。本针对日本吸血虫的检测方法，检测快速、灵敏、特异及稳定好。本方法由于直接提取病人血清，减轻了病人创伤，创伤小；利用q‑PCR检测方法灵敏度高；q‑PCR检测方法灵敏度高；现在已经具备成熟的外泌体提取试剂盒，同时q‑PCR检测是实验室常用技术，相对简单。因此本方法值得推广，具有很好的临床应用价值。

Description

一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法
技术领域
本发明涉及寄生虫的分子检测技术领域，更具体地，涉及利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染。
背景技术
血吸虫病是由裂体吸虫属血吸虫引起的一种慢性寄生虫病，是一种严重危害社会，危害人类的人畜共患寄生虫病和公共卫生问题之一。血吸虫病对于对人体产生最主要的功能影响是血吸虫肝病，而血吸虫肝病的主要致病因素是虫卵引起的肉芽肿、纤维化。
外泌体(exosomes)是由活细胞分泌，直径在30～150nm之间，质量浓度为1.13～1.21g/ml，携带丰富的与其功能和来源细胞相关的亚细胞双层膜性分泌囊泡。外泌体作为一种新发现的细胞间交流途径，可以选择性的包裹蛋白质、核酸等生物活性物质，释放到细胞外环境发挥其生物学功能介导细胞与细胞间相互作用。
已有研究证实miRNA可以被外泌体膜包裹保护，在各种酸碱环境、高温、或者反复冻融等恶劣条件下仍不被降解，以外泌体转运的方式传递到靶细胞进而调节靶基因表达，以此调控靶细胞行为。
目前，检测日本血吸虫病的方法主要包括流行病学诊断、临床诊断和实验室诊断三大类。实验室诊断主要包括病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。病原学诊断方法主要包括粪便直接涂片法、定量透明厚涂片法、改良加藤厚涂片法、自然沉淀法、尼龙袋集卵法、毛蚴孵化法、直肠或乙状结肠黏膜活组织检查及病理检查。免疫学诊断方法主要有包括皮内试验、环卵沉淀试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、间接荧光抗体试验、免疫酶染色法和单克隆抗体-酶等。虽然这些方法也被广泛应用于临床诊断和流行病学调查，但同时也暴露出不少问题。病原学诊断方法易漏检，且常需重复多次。免疫学诊断并非直接检测病原体，敏感性较低且特异性不足。
因此，缺乏一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术缺乏一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法的不足，提供一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法。
本发明的第一个目的是提供血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用。
本发明的第二个目的是提供一对于用检测日本血吸虫感染的扩增引物。
本发明的第三个目的是提供血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种日本血吸虫感染诊断试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明的前期研究中，发现肝组织外泌体中miRNA-223-3p在日本血吸虫感染肝组织外泌体(图1，图2，图3)中显著高表达(图4，图5)，进一步确定其可以作为日本吸血虫诊断标志物，并以此建立日本吸血虫诊断试剂盒。
因此本发明要求保护血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用，所述血清外泌体miR-223-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1：TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA。
一条于用检测日本血吸虫感染的引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本发明利用市售试剂盒进行血清外泌体miR-223-3p的q-PCR检测试剂盒(加尾法)，下游引物为试剂盒内提供的通用引物，上游引物核苷酸如SEQ ID NO：2所示，
上游引物：TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA(SEQ ID NO：2)；
下游引物：TAKARA试剂盒(miRNA First Strand Synthesis Kit)通用下游引物。
血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
优选地，所述扩增引物为如SEQ ID NO：2所示引物。
一种日本血吸虫感染诊断试剂盒，含有检测血清外泌体miR-223-3p表达量的试剂。
优选地，所示试剂为血清外泌体miR-223-3p扩增引物。
更优选地，所述扩增引物为如SEQ ID NO：2所示引物。
优选地，还包括q-PCR的试剂。
优选地，所述q-PCR的试剂包括
Figure BDA0002181242050000031
Premix Ex TaqTM、ROX Dye(50×)和ddH2O。
优选地，还含有内参基因扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示。
SEQ ID NO：3：CTCGCTTCGGCAGCACA；
SEQ ID NO：4：AACGCTTCACGAATTTGCGT。
优选地，所述q-PCR的反应体系为：ddH2O 9μL，
Figure BDA0002181242050000032
Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Dye(50×)0.5μL，引物各0.5μL，cDNA 2.0μL，总体积25μL。
优选地，所述q-PCR的反应程序为：95℃10s；95℃5s，60℃20s，×40循环；熔解曲线反应参数为：95℃60s，60℃30s，95℃30s。
最优选地，一种日本血吸虫感染诊断试剂盒，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的血清外泌体miR-223-3p的引物、通用下游引物、核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示的内参基因U6扩增引物、Premix Ex TaqTM、ROX Dye(50×)和ddH2O
其使用方法为包括以下步骤：
(1)提取待检血清样本外泌体；
(2)提取待检血清样本外泌体总RNA；
(3)cDNA合成；
(4)q-PCR反应
q-PCR的反应体系为：ddH2O 9μL，
Figure BDA0002181242050000034
Premix Ex TaqTM 12.5μL，ROX Dye(50×)0.5μL，引物各0.5μL，cDNA 2.0μL，总体积25μL。
q-PCR的反应程序为：95℃10s；95℃5s，60℃20s，×40循环；熔解曲线反应循环参数为：95℃60s，60℃30s，95℃15s。
计算△△CT值；
(5)5、结果判读
待测样本血清外泌体miR-223-3p高于正常对照2倍以上，提示血吸虫感染阳性。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过检测宿主肝组织外泌体miRNA miR-223-3p的表达情况，建立了一种针对日本吸血虫的快速、灵敏、特异及稳定的检测方法。本方法由于直接提取病人血清，减轻了病人创伤，创伤小；利用q-PCR检测方法灵敏度高；q-PCR检测方法灵敏度高；现在已经具备成熟的外泌体提取试剂盒，同时q-PCR检测是实验室常用技术，相对简单。因此本方法值得推广，具有很好的临床应用价值。
附图说明
图1为日本血吸虫感染宿主肝组织外泌体负染透射电镜图。
图2为外泌体的粒径分布图中X轴为粒径大小，Y轴为颗粒浓度。
图3为Western blot检测正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV)表面标志蛋白CD9，CD63和CD81的表达情况。
图4为正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV)差异表达miRNA火山图：差异表达火山图中的每一个点表示一个miRNA，横坐标表示某一个miRNA在两样品中表达量差异倍数的对数值；纵坐标表示错误发现率的负对数值。横坐标绝对值越大，说明表达量在两样品间的表达量倍数差异越大；纵坐标值越大，表明差异表达越显著，筛选得到的差异表达miRNA越可靠。图中蓝色的点代表无差异表达的miRNA，红色的点代表上调miRNA，绿色的点代表下调的miRNA。
图5为差异表达miRNA聚类图，列分别代表正常肝组织外泌体(NL-EV)和感染肝组织外泌体(IL-EV)，行代表不同的miRNA，以log10(TPM+1)值进行聚类，红色表示高表达miRNA，绿色表示低表达miRNA。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1一种日本血吸虫感染诊断试剂盒
一、组成
血清外泌体miR-223-3p的扩增引物，内参基因U6扩增引物和q-PCR的试剂；
其中，血清外泌体miR-223-3p的上游引物核苷酸如SEQ ID NO：2所示(TGTCAGTTTGTCAAATACCCCA)，下游引物为市售microRNA定量(qRT-PCR)(加尾法)试剂盒内提供的通用引物；
内参基因U6扩增引物其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示，
SEQ ID NO：3：CTCGCTTCGGCAGCACA；
SEQ ID NO：4：AACGCTTCACGAATTTGCGT；
q-PCR的试剂为
Figure BDA0002181242050000051
Premix Ex TaqTM、ROX Dye(50×)和ddH2O。
二、使用方法
1、提取待检血清样本外泌体
使用市售的血清外泌体提取试剂盒。
2、提取待检血清样本外泌体总RNA
(1)将样本放于4℃解冻后，分别加入600l裂解液，用1ml注射器吹打5-10次，使其充分均匀裂解。
(2)裂解后混悬液转移至一新的无RNA酶EP管中，14,000×g离心2min。
(3)取裂解上清转移至一新的无RNA酶EP管中，加入与上清等体积量的70％乙醇，剧烈振荡混匀。
(4)将层析柱与废液收集管组装好，加入裂解液600l到柱子上，>3500×g离心1min，使裂解液全部滤过柱子，如果没有全部滤过，再次14,000×g离心1min。弃去滤过液，重新组装废液收集管。如果裂解液超过650 l，将剩余裂解液加入到同一柱子上，>3500×g离心1min。
(5)洗涤RNA：加入400 l清洗液到柱子上，14,000×g离心1min，弃去滤过液，重新组装收集管。重复该洗涤步骤2次，每次用清洗液400 l。
(6)14,000×g离心2min，使柱子内完全干燥，弃去收集管。
(7)将柱子安装在新的1.7ml洗脱管，加入50 l洗脱液到柱子上，200g离心2min紧接着14,000×g离心1min，RNA收集在洗脱管内。
(8)RNA浓度测定，使用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定细胞总RNA质量和浓度，RNA质量鉴定合格后，分装后保存于-80℃备用。
3、cDNA合成
按照Takara公司的miRNA FirstStrand Synthesis操作说明书进行逆转录。
4、定量PCR反应
以上一步合成的cDNA为模板，SYBR Green I为荧光染料，反应体系如下：
Figure BDA0002181242050000061
将上述反应体系加入Q-PCR96孔白色反应板上，封膜，4℃，1500rpm离心5min。将板放入实时荧光定量PCR仪上，设置扩增反应条件，如下：
Figure BDA0002181242050000062
每个样设置3个复孔，读取各个样本的CT值，按照2-ΔΔCT计算各样本对应miRNA表达水平，使用Graph Pad Prism7.0进行数据统计分析及绘图，判定日本血吸虫感染阳性或阴性。
△△CT计算公式：△△CT＝(CTtarget-CTU6)处理组-(CTtarget-CTU6)对照组。数据以均值±标准差(Mean±SEM)表示。
5、结果判读
待测样本血清外泌体miR-223-3p高于正常对照2倍以上，提示血吸虫感染阳性。
实施例2检测敏感性效果分析
一、实验方法
使用实施例1的试剂盒对血吸虫疫区来源的健康人群和血吸虫感染群血清外泌体miR-223-3p进行检测。
二、实验结果
血吸虫感染人群外泌体miR-223-3p表达量高于健康人群，高于2倍以上。
实施例3小鼠模型实验验证敏感性
一、实验方法
常规构建血吸虫感染小鼠模型，收集未感染对照组和感染组小鼠血清，提取外泌体。采用权利要求2的试剂盒对未感染对照组和感染组小鼠血清外泌体miR-223-3p进行检测。
二、实验结果
感染组小鼠血清外泌体miR-223-3p表达量高于未感染对照组，高于2倍以上。
序列表
<110> 中山大学
<120> 一种利用宿主外泌体miRNA-223-3p检测日本血吸虫感染方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> japonicum Schistosoma
<400> 1
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgtcagtttg tcaaataccc ca 22
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (9)

1.血清外泌体miR-223-3p作为日本血吸虫感染诊断标志物的应用，其特征在于，所述血清外泌体miR-223-3p的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一条于用检测日本血吸虫感染的引物，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
3.血清外泌体miR-223-3p的扩增引物在制备日本血吸虫感染诊断试剂盒中的应用。
4.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述扩增引物为权利要求2所述引物。
5.一种日本血吸虫感染诊断试剂盒，其特征在于，含有检测血清外泌体miR-223-3p表达量的试剂。
6.根据权利要求5所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒，其特征在于，所示试剂为血清外泌体miR-223-3p扩增引物。
7.根据权利要求6所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒，其特征在于，所述扩增引物为权利要求2所述引物。
8.根据权利要求7所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒，其特征在于，还包括q-PCR的试剂。
9.根据权利要求6所述的日本血吸虫感染诊断试剂盒，其特征在于，还含有内参基因扩增引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4～5所示。
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