CN110760546A - 制备心脏祖细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于内源基因转录激活的心脏祖细胞直接重编程方法。所述方法具有较好的操作可行性和理论创新性,首次通过CRISPR/Cas9***激活内源心脏发育相关转录因子GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1,诱导人***成纤维细胞重编程为具有向心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞分化潜能的心脏祖细胞,为心血管疾病模型构建、新药筛选与心肌再生提供种子细胞来源,同时丰富了新型表观细胞重编程理论和内涵。
Description
技术领域
本发明属于细胞生物学领域,特别涉及一种制备心脏祖细胞的方法。
背景技术
心肌细胞属于终末分化的细胞,再生能力有限。心脏急性心肌梗死后,内源性心肌细胞再生能力有限,不能有效阻止心脏疾病的进展。以干细胞为基础的再生医学为心肌再生开辟了一条新的途径。研究者开始利用细胞重编程技术诱导成纤维细胞转变为心脏祖细胞,为心肌再生提供丰富的种子细胞来源。
2010年,Ieda等首次报道,通过病毒携带心脏发育相关的三个转录因子GATA4、MEF2C和TBX5将小鼠心肌成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。Song等在GATA4、MEF2C和TBX5基础上添加HAND2,有效地诱导小鼠鼠尾成纤维细胞重编程为具有电生理特性且能够自发跳动的心肌样细胞。Nam等选取GATA4、HAND2、TBX5、MYOCD和miR-1、miR-133,在体外诱导人皮肤成纤维细胞直接重编程为心肌样细胞。Lalit等通过慢病毒携带转录因子MESP1、TBX5、GATA4、NKX2-5和染色质重塑因子BAF60C诱导小鼠心肌成纤维细胞和鼠尾成纤维细胞重编程为心脏祖细胞。上述例子是通过外源转基因过表达心脏发育相关转录因子诱导成纤维细胞重编程为心肌样细胞和心脏祖细胞。该技术需要将外源基因连接在相关病毒载体上进行过表达。然而,大片段基因序列难以进行分子克隆实验操作和病毒包装,且不能直接进入内源基因位点使染色质迅速重构。因此,通过外源转基因诱导细胞重编程制备心脏祖细胞的效率较低。
发明内容
基于此,本发明的目的在于提供一种基于内源基因转录激活、细胞重编程效率高的心脏祖细胞制备方法。
具体技术方案如下:
一种制备心脏祖细胞的方法,包括以下步骤:
诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5或MEIS1中的至少四种;
在其中一些实施例中,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5。
在其中一些实施例中,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1。
在其中一些实施例中,所述诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活,包括以下步骤:
针对每一种重编程因子,分别构建靶向sgRNA-MS2融合表达载体;
将所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体转导至稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞内。
在其中一些实施例中,所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体包括以下至少四种:
GATA4基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、HAND2基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、MEF2C基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、TBX5基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体、MEIS1基因的靶向sgRNA-MS2融合表达载体。
在其中一些实施例中,所述起始重编程对象细胞的制备方法包括以下步骤:
将能够表达所述dCas9-VP64融合蛋白的慢病毒和能够表达所述MS2-p65-HSF1融合蛋白的慢病毒同时感染细胞。
在其中一些实施例中,所述起始重编程对象细胞为人***成纤维细胞。
在其中一些实施例中,包括以下步骤:
取生长良好且稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞,以3000-5000个细胞/cm2接种于培养皿;
加入靶向sgRNA-MS2融合表达载体的慢病毒颗粒,培养20-28h后,弃去含有慢病毒颗粒的培养液,用诱导培养液培养,每隔20-28h更换一次诱导培养液。
在其中一些实施例中,用诱导培养液培养的时间为3-10天。
在其中一些实施例中,所述诱导培养液由以下组分组成:
8%-12%新生乳鼠心肌细胞培养液、8%-12%胎牛血清、4%-6%马血清、0.5%-1.5%青霉素与链霉素的混合物、0.5%-1.5%B-27、0.5%-1.5%必需氨基酸、0.5%-1.5%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.5%-1.5%非必需氨基酸、0.5%-1.5%维生素混合液、0.5%-1.5%丙酮酸钠和800-1200单位/mL LIF;
余量为DMEM培养基与Medium 199培养基以(3-5):1的体积比混合的混合培养基。
本发明还提供了一种制备心脏祖细胞的诱导培养液,具体技术方案如下:
一种制备心脏祖细胞的诱导培养液,由以下组分组成:
8%-12%新生乳鼠心肌细胞培养液、8%-12%胎牛血清、4%-6%马血清、0.5%-1.5%青霉素与链霉素的混合物、0.5%-1.5%B-27、0.5%-1.5%必需氨基酸、0.5%-1.5%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.5%-1.5%非必需氨基酸、0.5%-1.5%维生素混合液、0.5%-1.5%丙酮酸钠和700-1300单位/mL的LIF;
余量为DMEM培养基与Medium 199培养基以3-5:1的体积比混合的混合培养基。
在其中一些实施例中,所述青霉素与链霉素的混合物中,青霉素的工作浓度为80-120U/mL,链霉素的工作浓度为80-120μg/mL。
在其中一些实施例中,所述青霉素与链霉素的混合物中,青霉素的工作浓度为100U/mL,链霉素的工作浓度为100μg/mL。
在其中一些实施例中,所述胰岛素-转铁蛋白-硒中,胰岛素、转铁蛋白、硒的比例为:1:(0.5-0.6):(0.0006-0.0007)。
在其中一些实施例中,所述胰岛素-转铁蛋白-硒中,胰岛素、转铁蛋白、硒的比例为:1:0.55:0.00067。
在其中一些实施例中,所述必需氨基酸包括以下组分:L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸。
在其中一些实施例中,所述非必需氨基酸包括以下组分:甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。
在其中一些实施例中,所述维生素混合液包括:氯化胆碱、D-泛酸钙、维生素B、烟酰胺、盐酸吡哆醛、维生素B2、维生素B1、肌醇。
基于上述技术方案,本发明具有以下有益效果:
本发明以心脏发育相关转录因子GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1作为重编程因子,通过SAM内源基因转录激活***诱导人***成纤维细胞重编程为心脏祖细胞。CRISPR/Cas9***通过sgRNA序列准确识别基因组位点,诱导内源基因染色质重塑,启动基因表达。不同于外源转基因过表达转录因子,CRISPR/Cas9***靶向激活内源基因诱导细胞重编程在理论上更贴近胚胎发育时细胞命运转变,且能够避免传统方法中对大片段基因序列的合成、复杂的分子克隆实验操作,更有利于提高细胞重编程效率。该心脏祖细胞的制备方法为新型的表观细胞重编程技术,能够为心血管疾病模型构建、新药筛选与心肌再生提供丰富的种子细胞来源。
附图说明
图1为实施例1中SAM***诱导GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5同时转录激活的检测结果;
图2为实施例2中SAM***诱导人***成纤维细胞重编程为心脏祖细胞的检测结果;
图3为实施例3中在细胞重编程过程中,成纤维细胞标志物表达变化的检测结果;
图4为实施例4中心脏祖细胞诱导分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞的检测结果;
图5为实施例5中在细胞重编程过程中,MEIS1、MEIS2和MEIS3表达变化的检测结果;
图6为实施例6中不同组合的sgRNA慢病毒感染细胞后,cTNT、Tropomyosin和Tropomyosin 1阳性细胞比例的检测结果;
图7为实施例7中在细胞重编程过程中,细胞周期以及CHK1、p-CHK1和E2F1表达变化的检测结果。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解,下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中,各个重编程因子的编码基因的核苷酸序列如下:
GATA4:编码基因的核苷酸序列同NCBI的NM_002052所示;
HAND2:编码基因的核苷酸序列同NCBI的NM_021973所示;
MEF2C:编码基因的核苷酸序列同NCBI的NM_002397所示;
TBX5:编码基因的核苷酸序列同NCBI的NM_000192所示;
MEIS1:编码基因的核苷酸序列同NCBI的NM_002398所示;
具体地,构建每个基因的sgRNA-MS2融合表达载体的方法具体如下:
(1)根据Konermann等报道,sgRNA靶向序列位于转录起始位点+1~-200bp启动子区。本文对每个基因分别合成sgRNA序列,通过靶向基因位点区分不同的sgRNA。sgRNA序列如下表所示。
(2)用RNase-free water溶解单链oligo至终浓度100μM。按下表所列组分在PCR管配制混合液,进行退火反应。
混匀后,在PCR扩增仪进行退火反应:37℃10min,95℃5min;然后以4℃/min速率降温至25℃。在上述各管分别加入90μL RNase-free water稀释10倍。
(3)按下表所列组分在PCR管配制混合液,进行连接反应。
混匀后,在PCR扩增仪进行连接反应:37℃5min,20℃5min,一共15个循环。
(4)取连接反应液进行转化。
(5)挑取单克隆菌落进行扩增和测序验证。
本发明的实施例中所使用的慢病毒包装方法具体如下:
(1)转染前一天,取生长良好的HEK 293T细胞接种于75cm2细胞培养瓶,使转染时细胞密度达到80-90%。
(2)用750μL不含血清的Opti-MEM I培养基稀释6.6μg pMD2.G、8.8μg psPAX2和10.2μg目的质粒,轻轻混匀,室温孵育5min;用750μL不含血清的Opti-MEM I培养基稀释99μL plus reagent,轻轻混匀。然后将两者混合,室温孵育5min。
(3)用750μL不含血清的Opti-MEM I培养基稀释90μL Lipofectamine 3000,轻轻混匀,室温孵育5min。然后将(2)和(3)混合,室温孵育15min。弃去细胞培养液,加入12mL无抗生素培养液。将Lipofectamine 3000和质粒的混合液加入细胞培养瓶中,轻轻混匀。培养5h后,弃去上清,加入新鲜的细胞培养液。
(4)质粒转染48h后,收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液于50mL离心管中,室温600g离心10min。病毒上清液和Lenti-X病毒浓缩液按体积比3:1加入病毒浓缩液混合均匀,4℃孵育过夜。1500g 4℃离心45min,小心弃去上清,病毒上清液和PBS按体积比50:1加入适量PBS,轻轻吹打白色病毒颗粒沉淀,分装,-80℃保存。
(5)取生长良好的人***成纤维细胞接种于24孔板,使感染时细胞密度达到30-40%。从-80℃超低温冰箱取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以10倍梯度连续稀释。如下表所示:
(6)弃去细胞培养液,分别加入50μL病毒液和450μL DMEM培养液。48h后,弃去细胞培养液,分别加入500μL含1μg/mL Blasticidin S HCL、15μg/mLHygromycin B或900μg/mLZeocin的DMEM培养液,每隔3天更换一次新鲜药物筛选培养液。
(7)2周后,弃去细胞培养液,加入300μL 0.1%结晶紫溶液染色15min。结果显示,以1:10000稀释dCas9-VP64、MS2-p65-HSF1、GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1慢病毒颗粒,使人***成纤维细胞在药物最小致死浓度筛选2周后仍保持增殖能力。
本发明的实施例中所使用的诱导培养液组分如下:
DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF因子。使用该培养液,在细胞重编程早期,添加LIF激活胚胎发育早期心脏祖细胞形成相关的JAK/STAT信号通路,有利于诱导人***成纤维细胞重编程为心脏祖细胞。在细胞重编程后期,添加含胰岛素的B-27有利于心脏祖细胞分化为心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞。
其中,新生乳鼠心肌细胞培养液为:含10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、新生乳鼠心肌细胞分泌物的DMEM培养液。本发明的实施例中的获取途径为:用含10%FBS、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM培养液培养新生乳鼠心肌细胞后,收集该培养液得到。收集的培养液中含有新生乳鼠心肌细胞分泌物。
马血清购自美国Gibco公司(货号:26050088)。
青霉素/链霉素购自美国Gibco公司(货号:15140122)。
B-27购自美国Gibco公司(货号:A1895601/0080085SA)。
胰岛素-转铁蛋白-硒溶液购自美国Gibco公司(货号:41400045)。
必需氨基酸包括:L-精氨酸、L-半胱氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸。购自美国Gibco公司(货号:11130051)。
非必需氨基酸包括:甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸。购自美国Gibco公司(货号:11140050)。
维生素混合液包括:氯化胆碱、D-泛酸钙、维生素B、烟酰胺、盐酸吡哆醛、维生素B2、维生素B1、肌醇。购自美国Gibco公司(货号:11120052)。
丙酮酸钠溶液购自美国Gibco公司(货号:11360070)。
LIF购自美国Merck Millipore公司(货号:LIF1010)。
以下结合具体实施例对本发明进行进一步说明。
实施例1利用SAM***诱导GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5在人***成纤维细胞同时表达
(1)选取心脏发育相关转录因子GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5作为重编程因子,构建每个基因的sgRNA-MS2融合表达载体。
(2)慢病毒感染细胞前一天,取生长良好的人***成纤维细胞接种于75cm2细胞培养瓶,使感染时细胞密度达到30-40%。
(3)用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1慢病毒颗粒。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入15mL含慢病毒颗粒的DMEM培养液感染人***成纤维细胞。通过Blasticidin S HCL和Hygromycin B筛选稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞。
(4)sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
(5)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞接种于6孔板,使感染时细胞密度达到30-40%。待细胞贴壁后,用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的sgRNA慢病毒颗粒感染细胞。
(6)96h后收集细胞,通过qRT-PCR和western blot检测GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的表达。
实验结果:
如图1A所示,双脱氧链终止法测序结果显示,GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1的sgRNA序列与合成的寡核苷酸序列一致。如图1B和图1C所示,与未感染组相比,内源基因GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的mRNA和蛋白表达水平明显上调。
实施例2:SAM***诱导心脏祖细胞的形成
(1)将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
(2)细胞种板前,吸取312μL Matrigel hESC-qualified Matrix稀释于25mL预冷无血清DMEM/F-12培养基,然后取适量稀释后的Matrigel hESC-qualified Matrix分别加入激光共聚焦培养皿、60mm培养皿和100mm培养皿中,轻轻混匀,室温放置1h。
(3)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞以4000个/cm2接种于Matrigel hESC-qualified Matrix包被的培养皿。
(4)从-80℃取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入含慢病毒颗粒的DMEM培养液,轻轻混匀,放置37℃培养箱培养。
(5)24h后,弃去含病毒颗粒的细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入适量诱导培养液。按下列组分和比例配制诱导培养液:DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF因子。
(6)每隔1天更换一次新鲜的诱导培养液。
实验结果:
诱导培养7天后,收集细胞通过流式细胞术量化分析GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5(GHMT)阳性细胞比例。如图2A所示,内源基因GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5表达上调,至少77%细胞呈GHMT阳性。
在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过qRT-PCR检测中胚层标志物(EOMES和MESP1)和心脏祖细胞标志物(GATA4、HAND2、MEF2C和ISL1)的mRNA表达水平。如图2B所示,SAM***诱导GHMT转录激活,调控中胚层标志物和心脏祖细胞标志物时序性表达。
将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的sgRNA慢病毒同时感染细胞,诱导培养7-10天后,可见细胞聚集形成克隆团(每50000个细胞形成2-3个细胞克隆团)(图2C)。
在细胞重编程的第10天,通过细胞免疫荧光检测心脏祖细胞标志物GATA4、NKX2-5、HAND2和ISL1的表达。如图2D所示,GHMT感染的细胞表达心脏祖细胞标志物GATA4、NKX2-5、HAND2和ISL1(标尺:100μm)。
在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过western blot检测p-STAT3和STAT3蛋白表达水平。检测结果显示,胚胎发育早期心脏祖细胞形成相关的JAK/STAT信号通路p-STAT3蛋白表达水平明显上调(图2E)。
实施例3:在细胞重编程过程中成纤维细胞标志物表达逐渐下调
(1)首先通过流式细胞术分析成纤维细胞标志物FSP1和α-SMA的表达。
(2)将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
(3)细胞种板前,吸取312μL Matrigel hESC-qualified Matrix稀释于25mL预冷无血清DMEM/F-12培养基,然后取适量稀释后的Matrigel hESC-qualified Matrix分别加入激光共聚焦培养皿、60mm培养皿中,轻轻混匀,室温放置1h。
(4)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞以4000个/cm2接种于Matrigel hESC-qualified Matrix包被的培养皿。
(5)从-80℃取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入含慢病毒颗粒的DMEM培养液,轻轻混匀,放置37℃培养箱培养。
(6)24h后,弃去含病毒颗粒的细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入适量诱导培养液。按下列组分和比例配制诱导培养液:DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF。
(7)每隔1天更换一次新鲜的诱导培养液。收集不同时间点的细胞通过qRT-PCR和细胞免疫荧光检测成纤维细胞标志物的表达。
实验结果:
通过流式细胞术分析在THY1+细胞里,FSP1+细胞和α-SMA+细胞所占比例。同型IgG作为阴性对照。如图3A所示,在THY1+细胞里,FSP1+细胞所占比例为100%,α-SMA+细胞所占比例为95.8%。
在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过qRT-PCR检测FSP1、THY1、COL1A1和COL1A2的mRNA表达水平。如图3B所示,成纤维细胞标志物FSP1、THY1、COL1A1和COL1A2表达逐渐下调(*P<0.05,**P<0.01)。在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过细胞免疫荧光检测FSP1和α-SMA的表达。如图3C所示,在细胞重编程的第10天,GHMT感染的部分细胞不表达FSP1和α-SMA(标尺:50μm)。
实施例4:心脏祖细胞具有向心肌细胞、平滑肌细胞和内皮细胞分化的潜能
(1)将GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5的sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
(2)细胞种板前,吸取312μL Matrigel hESC-qualified Matrix稀释于25mL预冷无血清DMEM/F-12培养基,然后取适量稀释后的Matrigel hESC-qualified Matrix分别加入激光共聚焦培养皿、60mm培养皿中,轻轻混匀,室温放置1h。
(3)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞以4000个/cm2接种于Matrigel hESC-qualified Matrix包被的培养皿。
(4)从-80℃取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入含慢病毒颗粒的DMEM培养液,轻轻混匀,放置37℃培养箱培养。
(5)24h后,弃去含病毒颗粒的细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入适量诱导培养液。按下列组分和比例配制诱导培养液:DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF。
(6)每隔1天更换一次新鲜的诱导培养液。
实验结果:
诱导培养4周后,通过细胞免疫荧光检测心肌细胞标志物(cTNT和α-actinin)、平滑肌细胞标志物(SM-MHC)和内皮细胞标志物(CD34和CD31)的表达。如图4A所示,诱导分化的细胞表达心肌细胞标志物(cTNT和α-actinin)、平滑肌细胞标志物(SM-MHC)和内皮细胞标志物(CD34和CD31)(标尺:50μm)。
在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过qRT-PCR检测心肌细胞标志物MYOCD和TNNT2的mRNA表达水平。如图4B所示,在细胞重编程后期,MYOCD和TNNT2表达显著增强。
诱导培养4周后,通过细胞免疫荧光检测心肌细胞标志物cTNT、α-actinin和Tropomyosin与肌成纤维细胞标志物α-SMA的表达。如图4C所示,诱导分化的细胞表达cTNT、α-actinin和Tropomyosin,而α-SMA被抑制。
实施例5:MEIS1、MEIS2和MEIS3在细胞重编程过程中表达变化
GHMT感染细胞后,在细胞重编程过程中,收集不同时间点的细胞通过westernblot检测MEIS1、MEIS2和MEIS3蛋白表达水平。
如图5所示,MEIS1在细胞重编程的早期阶段表达显著上调,在重编程的第7天表达水平逐渐下调。MEIS2和MEIS3在细胞重编程后期表达明显上调。这提示MEIS1在SAM***诱导细胞重编程早期阶段中起着关键的作用,MEIS2和MEIS3可能参与调节心脏祖细胞向心肌细胞分化。
实施例6:转录因子MEIS1促进人***成纤维细胞向心脏祖细胞转变
(1)将不同组合(HMT、GHMT和GHMT+MEIS1)的sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
HMT:HAND2、MEF2C和TBX5;
GHMT:GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5;
GHMT+MEIS1:GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1。
(2)细胞种板前,吸取312μL Matrigel hESC-qualified Matrix稀释于25mL预冷无血清DMEM/F-12培养基,然后取适量稀释后的Matrigel hESC-qualified Matrix加入60mm培养皿中,轻轻混匀,室温放置1h。
(3)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞以4000个/cm2接种于Matrigel hESC-qualified Matrix包被的培养皿。
(4)从-80℃取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入含慢病毒颗粒的DMEM培养液,轻轻混匀,放置37℃培养箱培养。
(5)24h后,弃去含病毒颗粒的细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入适量诱导培养液。按下列组分和比例配制诱导培养液:DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF。
(6)每隔1天更换一次新鲜的诱导培养液。诱导培养14天后,通过流式细胞术量化分析cTNT和Tropomyosin 1阳性细胞比例。
实验结果:
将不同组合(HMT、GHMT和GHMT+MEIS1)的sgRNA慢病毒同时感染细胞,诱导培养14天后,通过流式细胞术量化分析cTNT和Tropomyosin 1阳性细胞比例。如图6A所示,感染HMT和GHMT的细胞,cTNT+细胞所占比例分别是0.86%和3.375%。在GHMT中添加转录因子MEIS1,cTNT+细胞所占比例增加到8.7%。感染HMT和GHMT的细胞,Tropomyosin 1+细胞所占比例分别是21.25%和27.85%。将转录因子MEIS1添加到GHMT中,显著提高了Tropomyosin1+细胞所占比例(62.95%)(图6B)。
实施例7:转录因子MEIS1通过阻滞细胞周期促进心脏细胞谱系重编程
(1)将不同组合(HMT、GHMT和GHMT+MEIS1)的sgRNA慢病毒感染细胞前两天,更换不含Blasticidin S HCL和Hygromycin B的DMEM培养液。
(2)细胞种板前,吸取312μL Matrigel hESC-qualified Matrix稀释于25mL预冷无血清DMEM/F-12培养基,然后取适量稀释后的Matrigel hESC-qualified Matrix分别加入激光共聚焦培养皿、60mm培养皿中,轻轻混匀,室温放置1h。
(3)取生长良好且稳定表达dCas9-VP64和MS2-p65-HSF1的人***成纤维细胞以4000个/cm2接种于Matrigel hESC-qualified Matrix包被的培养皿。
(4)从-80℃取出病毒液,置于冰上溶解,然后用含8μg/mL polybrene DMEM培养液以1:10000稀释。弃去细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入含慢病毒颗粒的DMEM培养液,轻轻混匀,放置37℃培养箱培养。
(5)24h后,弃去含病毒颗粒的细胞培养液,PBS轻轻冲洗细胞2次,加入适量诱导培养液。按下列组分和比例配制诱导培养液:DMEM/Medium 199(4:1)、10%新生乳鼠心肌细胞培养液、10%胎牛血清、5%马血清、1%青霉素/链霉素、1%B-27、1%必需氨基酸、1%胰岛素-转铁蛋白-硒、1%非必需氨基酸、1%维生素混合液、1%丙酮酸钠和1000units/mL LIF。
(6)每隔1天更换一次新鲜的诱导培养液。诱导培养6天后,收集细胞,通过流式细胞术检测细胞周期变化和通过western blot检测CHK1、p-CHK1和E2F1蛋白表达水平。
实验结果:
诱导培养6天后,HMT和GHMT组G2/M期细胞所占比例分别是9.55%和8.77%。在GHMT中添加转录因子MEIS1,G2/M期细胞所占比例增加到12.55%(图7A和图7B)。
诱导培养6天后,通过western blot检测MEIS1下游细胞周期调节因子p-Chk1和E2F1的蛋白表达水平。与未感染组相比,GHMT组p-Chk1和E2F1表达水平明显下调。将转录因子MEIS1添加到GHMT,p-CHK1和E2F1表达水平进一步下调(图7C)。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州医科大学
<120> 制备心脏祖细胞的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caccgcgccc agcggaggtg tagcc 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aaacggctac acctccgctg ggcgc 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caccggaggt agccaatcct ggaag 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaaccttcca ggattggcta cctcc 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
caccggaaga cggagcacga atggt 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacaccatt cgtgctccgt cttcc 25
<210> 7
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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caccggttct ccgtaatgtg ccttg 25
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<210> 9
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<212> DNA
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caccgcttgc aaagagggag agaga 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aaactctctc tccctctttg caagc 25
Claims (10)
1.一种制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5或MEIS1中的至少四种。
2.根据权利要求1所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C和TBX5。
3.根据权利要求2所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述重编程因子包括GATA4、HAND2、MEF2C、TBX5和MEIS1。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述诱导重编程因子在起始重编程对象细胞内转录激活,包括以下步骤:
针对每一种重编程因子,分别构建靶向sgRNA-MS2融合表达载体;
将所述靶向sgRNA-MS2融合表达载体转导至稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞内。
5.根据权利要求4所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述起始重编程对象细胞的制备方法包括以下步骤:
将能够表达所述dCas9-VP64融合蛋白的慢病毒和能够表达所述MS2-p65-HSF1融合蛋白的慢病毒同时感染细胞。
6.根据权利要求1-3、5任一项所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述起始重编程对象细胞为人***成纤维细胞。
7.根据权利要求1-3、5任一项所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:
取生长良好且稳定表达dCas9-VP64融合蛋白和MS2-p65-HSF1融合蛋白的起始重编程对象细胞,以3000-5000个细胞/cm2接种于培养皿;
加入靶向sgRNA-MS2融合表达载体的慢病毒颗粒,培养20-28h后,弃去含有慢病毒颗粒的培养液,用诱导培养液培养,每隔20-28h更换一次诱导培养液。
8.根据权利要求7所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,用诱导培养液培养的时间为3-10天。
9.根据权利要求7所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述诱导培养液由以下组分组成:
8%-12%新生乳鼠心肌细胞培养液、8%-12%胎牛血清、4%-6%马血清、0.5%-1.5%青霉素与链霉素的混合物、0.5%-1.5%B-27、0.5%-1.5%必需氨基酸、0.5%-1.5%胰岛素-转铁蛋白-硒、0.5%-1.5%非必需氨基酸、0.5%-1.5%维生素混合液、0.5%-1.5%丙酮酸钠和700-1300单位/mL LIF;
余量为DMEM培养基与Medium 199培养基以3-5:1的体积比混合的混合培养基。
10.根据权利要求9所述的制备心脏祖细胞的方法,其特征在于,所述LIF浓度为800-1200单位/mL。
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