CN107709544A - 使用合成转录因子的核重编程方法 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了通过调节内源细胞基因的表达来重编程哺乳动物体细胞的方法。通过激活胚胎干细胞相关基因(例如oct.3/4)的转录和抑制体细胞特异性和/或细胞死亡相关基因的转录，可以诱导体细胞的细胞重编程。可以使用合成转录因子(激活剂和抑制剂)来调节内源转录机制，以允许在适合临床和商业应用的条件下更快且更有效地核重编程。本公开进一步提供了从这样的方法获得的细胞，以及使用这些细胞治疗适合干细胞疗法的疾病的治疗方法，以及用于这样的用途的试剂盒。
Description
发明领域
本发明涉及哺乳动物体细胞的核重编程以产生诱导型多潜能干细胞(iPSC)的方法。
背景技术
细胞重编程也称为核重编程，是从体细胞产生干细胞例如iPSC的过程。从许多正常和患病的细胞来源衍生iPSC已经使得干细胞生物学发生了革命性的变化，并且已经使干细胞的生成最终用于细胞治疗和再生医学。
iPSC可以分化为许多细胞类型，避免了使用体外受精过程中丢弃的胚胎来产生胚胎干细胞(ESC)的必要，并最大程度地减少涉及的伦理问题。此外，ESC只能用于异体基因细胞治疗应用，但iPSC可应用于异体和自体细胞治疗应用。
Yamanaka及同事的开创性工作揭示了某些转录因子的异位表达可能在体细胞中诱导多潜能。这些诱导型多潜能干细胞自我更新并且分化成多种细胞类型。它们已经用于对人类疾病成功建模，并且具有用于药物筛选和细胞疗法的巨大潜力。然而，关于体细胞重编程为iPSC的背后机制仍有许多有待理解，并且在缺乏机制认知的情况下存在对潜在临床应用的担心。
用于将体细胞重编程为多潜能性的重编程因子(RF)包括Oct3/4、Sox2、c-Myc、Klf4,Lin28和Nanog。Oct3/4和Sox2是保持胚胎干细胞(ES)中多潜能性的转录因子，而认为Klf4和c-Myc是提高iPSC产生效率的转录因子。转录因子c-Myc被认为修饰染色质结构以使得Oct3/4和Sox2更高效地接触重编程所需的基因而Klf4增强了由Oct3/4和Sox2对某些基因的激活。Nanog，与Oct3/4和Sox2类似，是一种在ES细胞中保持多潜能的转录因子，而Lin28是被认为在分化期间影响特异性mRNA的翻译或稳定性的mRNA-结合蛋白质。还已经显示，Oct3/4和Sox2的逆转录病毒表达以及共同给予丙戊酸、染色质稳定剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂足以将成纤维细胞重编程为iPSC。
已经显示几种类型的载体在过表达必需基因组合时诱导多潜能。最早的载体依赖于DNA-整合逆转录病毒和用于核重编程的转座子。逆转录病毒介导的重编程具有合理的高重编程效率和高成功率的优点，但是它们本身产生对于由***诱变或致癌重编程因子的再表达产生的潜在致肿瘤性的担心。虽然已经使用Cre-LoxP位点基因递送或PiggyBac转座子方法来在基因递送之后从宿主基因组中切除外来DNA，但是两种策略都没有消除诱变的风险，因为它们留下了一小段***的残留外来DNA。
作为遗传修饰的替代，已经显示mRNA、附加型(episomal)DNA质粒、和细胞渗透蛋白(CPP)在重编程中有效。mRNA重编程具有高重编程效率，但方法稳健性(再现性)低。
开发基于DNA的附加型载体重编程以减轻载体整合的问题。在该方法中，体细胞用或编码重编程因子的附加型载体或附加型载体组转染。然而，这种重编程方法导致易变的重编程效率和iPSC集落出现动力学，这取决于体细胞类型。
当细胞重编程过程在无血清、无动物、限定的细胞培养条件下进行时，重编程效率进一步降低。在为临床应用优化的条件下(例如利用化学限定的无动物成分的细胞培养过程)，以足够的效率和适时的方式产生iPSC的能力对于使iPSC适用于治疗应用是必不可少的。
大多数重编程方法依赖于外源基因的异位表达。这种异位表达诱导了主要影响体细胞中内源转录机制的一系列事件。一旦产生iPSC，外源基因的表达不再需要，因为iPSC应该依靠内源基因的表达来维持自我更新和多潜能性。外源性重编程因子的持续表达可能会限制细胞的分化潜能。
因此，需要用于在体细胞中诱导细胞重编程的替代方法，而不必人工地和组成性地表达与细胞生长和多潜能性相关的基因的编码序列。
发明内容
本公开提供了通过调节内源细胞基因的表达来重编程哺乳动物体细胞的方法。通过激活胚胎干细胞相关基因(例如oct3/4)的转录和/或抑制体细胞特异性和/或细胞死亡相关基因的转录，可以诱导体细胞的细胞重编程。内源转录机制可以使用合成的转录因子(激活剂和抑制剂)进行调节。例如，可以使用CRISPR(成簇的规律间隔的回文重复)，TALE(转录激活物样效应物)或锌指技术来调节内源细胞基因的表达，以允许在适合临床和商业应用的条件下更快速且更有效的核重编程。
在一个例子中，使用基于CRISPR的技术来完成体细胞的核重编程。
CRISPR***首先在选定的细菌物种中被鉴定，并形成原核生物适应性免疫***的一部分。捕获来自入侵病毒或质粒DNA的DNA短区域并将其整合到基因组中，形成所谓的CRISPR阵列，其间通过来自CRISPR基因座的重复序列间隔开。DNA获取到CRISPR阵列之后进行转录和RNA处理。根据细菌种类的不同，CRISPR RNA加工过程会有所不同。在II型***(描述于细菌链球菌(Streptococcus pyogenes)中)，转录的RNA与反式激活RNA(tracrRNA)配对，然后被RNA酶III切割形成单个CRISPR-RNA(crRNA)。
crRNA在被Cas9核酸酶结合后进一步加工以产生成熟的crRNA。crRNA/Cas9复合物随后与含有与捕获区域(称为原始间隔物(protospacers))互补的序列的DNA结合。然后Cas9蛋白以位点特异性方式切割DNA的两条链，形成双链断裂(DSB)。这提供了基于DNA的记忆，导致重复暴露和/或感染时病毒或质粒DNA的快速降解。天然CRISPR***已被全面描述(参见例如Barrangou和Marraffmi，Molecular Cell 2014,54:234-244)。
许多小组确定了CRISPR***在基因编辑中的潜在应用(Jinek等，Science 2012,337:816-821；Le Cong等，Science 2013,339:819-823；Mali等，Science 2013,339:823-826)。这涉及利用Cas9蛋白以及围绕来自与tracrRNA融合的CRISPR阵列的单个单位设计的嵌合RNA。这形成单一RNA种类，称为小引导RNA(gRNA)，其中原始间隔区域中的序列的修饰可以位点特异性地靶向Cas9蛋白质。已经做了相当多的工作来理解嵌合RNA与靶位点之间的碱基配对相互作用的性质，以及其对错配的耐受性，这对于预测和评估脱靶效应是高度相关的(参见例如Fu等，Nature Biotechnology 2014,32(3)：279～284)和支持材料)。
CRISPR/Cas9基因编辑***已成功用于各种生物体和细胞系中，从而诱导用野生型Cas9蛋白形成DSB或从而用称为Cas9n/Cas9D10A的突变蛋白切割单个DNA链(参见例如Mali等，Science 2013,339：823-826；Sander和Joung，Nature Biotechnology 2014,32(4)：347-355)。尽管DSB形成导致产生可破坏基因功能的小***和缺失(“***缺失标记(indel)”)，Cas9n/Cas9D10A切口酶在刺激内源同源重组机制的同时避免了***缺失标记的产生(通过非同源末端连接机制修复)。后一种机制可用于高保真地将DNA区域***基因组。
关于其他已建立的基因编辑技术，如大范围核酸酶、转录激活物样效应核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和重组腺相关病毒(rAAV)，CRISPR/Cas9有许多优点，最值得注意的速度和易用性(参见例如Gaj等，Trends in Biotechnology 2013,31(7)：397-405)。通过RNA-DNA碱基配对相互作用而不是蛋白质-DNA相互作用实现靶向的事实使得该***在实验上更简单并适用于高通量应用。
CRJSPR/Cas9***的进一步发展是完全破坏Cas9蛋白的核酸酶活性，而将其仅用作DNA靶向机制。缺陷型Cas9突变体(dCas9)可以与来自多种蛋白质的功能域融合，例如激活或阻抑转录(Sander和Joung 2014)。就像这个***的易于使用便于基因编辑一样，它也允许快速产生CRISPR转录因子(CRISPR-TF)。合成转录因子具有多种用途，包括基因功能的研究和异源转录单元的构建。
产生CRISPR-TF的最初尝试利用dCas9的基因融合到单个反式激活或阻抑结构域，以及靶向感兴趣基因启动子中转录起始位点(TSS)附近的区域(Mali等，NatureBiotechnology 2013，31(9):833-8)。虽然这证明在调节转录方面是成功的，但是基因表达的大的倍数变化需要针对每个靶基因使用多个gRNA。使用dCas9的双N-和C-末端融合至多个不同的功能结构域域，以及通过使用修饰的gRNA(其本身结合调节蛋白)可以提高调节效率。参见例如Konermann等，Nature 2015,517：583-588(和支持材料)。在后一种情况下，使用三种分离的组分(修饰的gRNA，RNA结合功能结构域蛋白(例如MS2-VP64)和未融合的dCas9蛋白)实现调节。
使用CRISPR***也已经证明了多重基因调控。这允许构建复杂的调控网络和对基因途径功能的全面调查。特别是在这方面，从技术上区分了基于CRISPR的方法与备选方案。在一些实例中，通过使用合成转录因子(其各自包含转录调节剂(激活剂或抑制剂))与将转录调节剂靶向各种基因的特定的gRNA的组合来进行某些干细胞相关基因的激活和其它基因的伴随性阻抑，从而产生iPS细胞。
在一些实例中，使用合成的转录激活剂例如与特定的gRNA结合的dCas9-VP64来激活干细胞相关基因以靶向所需的基因。内源基因转录可以使用合成的转录抑制因子来抑制，例如dCas9-KRAB与靶向所需基因的特定gRNA。也可以使用基于CRISPR(参见例如Konermann等，Nature 2015,517：583-588(和支持材料)，Chavez(2015))或其他合成转录因子(例如，TALES/ZF)的替代转录调节剂。
在一些实例中，通过用编码转录调节剂(作为单个dCas9融合物或dCas9和单独的调节剂(例如，MS2-VP64))和gRNA的表达载体(例如质粒载体)转染，或通过用成熟转录调节剂多肽/蛋白质和核酸分子(gRNA)转导细胞，将合成的转录因子元件引入细胞中。
虽然转录调控将在体细胞中被人为诱导，但转录的基因将具有天然的调节元件，如5'和3'UTR。同样，编码合成转录因子元件的表达载体(附加型或其他)应该用细胞***稀释，并通过获得无载体iPSC的类似方法从细胞中清除，其中iPSC通过异位表达由附加型载体或仙台病毒传递的重编程因子而生成。
内源基因转录的直接调控可以提供以下一个或多个优点：(1)缩短从体细胞转染到iPSC集落外观的时间(例如，通过相关的内源基因的更精确和/或严格控制的表达来诱导重编程)；(2)确保新产生的iPSC依靠其内源转录机制维持自我更新和多潜能性；(3)消除验证外源基因沉默和/或清除的需要；(4)使编码序列(即在其天然基因组背景外取得的序列)的异位表达的可能“副作用”最小，如沉默和转录后调控；和(5)降低重编程效率的体细胞型依赖的变异性。
例如，通过以更受控制的方式开启/增加初始内源基因，而不是从瞬时转染的质粒任意过表达重编程因子，本文所述的表达***更接近地模拟天然细胞过程。
方法1
在一些方面，本公开提供了哺乳动物体细胞的核重编程的方法。所述方法包括在足以(a)将哺乳动物体细胞重编程为诱导型多潜能干细胞，或足以(b)将体细胞转分化成与起始细胞的细胞类型基本不同的靶细胞的条件和时间段下，使哺乳动物体细胞(起始细胞)的群与合成的转录因子接触。在一些实施方案中，该方法还包括培养重编程细胞以形成iPSC的集落。
在一些实施方案中，上述方法是体外方法。在其他实例中，该方法是体内或离体方法。
在一些实施方案中，通过将序列特异性gRNA与基于CRISPR的合成转录因子组合来激活或抑制用于转录调节的每个候选基因的转录。CRISPR调节可以与其他技术例如小干扰RNA(siRNA)组合以实现所需的转录输出。在一些示例中，ESC相关基因被激活。在其他示例中，与凋亡诱导相关的基因被抑制。在其他示例中，同时使用前述策略，即ESC相关基因被激活，并且与凋亡诱导有关的基因被抑制。
在上述方法的一些实施方式中，合成的转录因子包含(a)包含DNA结合片段和多肽结合区段的至少一种引导RNA(gRNA)，其中所述DNA结合片段结合多潜能因子基因(例如(i)胚胎干细胞(ESC)相关基因，或(ii)与细胞凋亡诱导有关的基因)的启动子区域；和(b)结合引导RNA的多肽结合区段的至少一种转录调节剂(例如dCas9-VP64)。
在其它实施方式中，合成的转录因子不包括引导RNA，但包含DNA结合结构域，其能够直接结合靶基因的调控DNA序列，例如(i)胚胎干细胞的启动子区域ESC)-相关基因(例如，oct3/4)的启动子区域，或(ii)与凋亡诱导相关的基因(例如p53)的启动子区域。
在一些示例中，根据上述实施例中的任一个，被激活的内源多潜能因子基因是重编程因子基因或至少两种重编程因子基因的组合。示例性重编程因子基因包括POU5F1(oct3/4)，sox2，klf4，c-myc，lin28和nanog。
在根据任何上述实施方式的其他示例中，被激活的多潜能因子基因是抗凋亡基因，例如bcl-2或bcl-x。在一些示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox-2，klf-4，c-myc，lin28和nanog中的至少两个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。
在根据任何上述实施方式的其他示例中，细胞重编程涉及对至少一个靶基因的阻抑，例如与上述基因激活中的任一种相组合。在一些示例中，被抑制的多潜能因子基因选自p53，p21，p19Arf和p16Ink4a。
在根据任何上述实施方式的其他示例中，被抑制的多潜能因子基因是编码促进细胞死亡和/或细胞周期停滞的信号转导蛋白的基因。在一些实例中，被抑制的靶基因选自ROCK，PKA/PKG/PKC家族激酶以及当被阻抑时将抑制mTOR途径的其它基因，
在根据任何上述实施方式的其他示例中，被抑制或激活的多潜能因子基因参与影响细胞的表观遗传状态，从而当被合成的转录因子靶向时染色质处于转录能力状态。
用于本发明方法的另一种多潜能因子基因是glis1。
在一些示例中，使用至少两种重编程因子基因(例如，oct3/4和sox2)的转录激活来诱导重编程。在其它示例中，使用至少三种重编程因子基因(例如，oct3/4，sox2和klf4)的激活来诱导重编程。在其他示例中，使用至少四种重编程因子基因(例如，oct3/4，sox2，c-myc和klf4)的激活来诱导重编程。
在根据方法1的其他示例中，使哺乳动物体细胞群与至少两种各自靶向不同的基因的合成转录因子接触。
方法2
在其他方面，本公开内容提供了用于鉴定候选多潜能因子基因的体外筛选方法。
例如，用基于CRISPR的转录激活物和候选gRNA文库转染体细胞，伴随缺乏至少一种重编程因子基因的附加型载体混合物，其在其他情况下对iPSC形成是必需的。用缺乏至少一种重编程因子基因的附加型混合物转染细胞应该导致0％或非常低的重编程效率。在加入基于Cas9的激活剂和gRNA文库后实现重编程表明至少一个参与重编程过程的基因被激活，并且该基因的激活能够补偿缺失的重编程因子。
示例性的筛选方法包括(a)使哺乳动物体细胞的群与：(i)包含DNA结合区段和多肽结合区段的至少一种候选gRNA；和(ii)结合候选gRNA的多肽结合区段的合成转录调节剂(由单个或者多个蛋白质组成)接触一段时间，并且所述接触在足以将哺乳动物体细胞重编程为诱导型多潜能干细胞(iPSC)的条件下，从而形成测试细胞的群。在一个实施方式中，该方法进一步包括(b)培养测试细胞，例如培养一段时间并且在足以形成IPS细胞集落的条件下进行培养。
在根据方法2的一些实施方式中，通过培养测试细胞群形成一个或多个iPSC集落来指示成功的重编程。在其他实施方式中，至少一个iPSC集落的形成表明候选gRNA/转录激活物复合物与随后在其宿主细胞中表达的多潜能因子基因的启动子区域杂交(即结合)，由此促进宿主细胞的重编程。
在根据方法2的一些实施方式中，使体细胞的群与代表各种不同DNA结合区段的候选gRNA文库接触。
在根据方法1和2的任何实施例的一些示例中，所述方法还包括测量重编程效率。
在根据任何上述实施方式的一些实施例中，转录调节剂包括RNA结合结构域和选自转录激活结构域(例如VP64或p65)和转录抑制剂结构域(例如KRAB)的功能结构域。
在一些示例中，dCas9多肽与转录激活结构域(例如，VP64或p65)融合。在其他示例中，dCas9多肽与转录阻抑物结构域(例如AB)融合。
在根据任何上述实施方式的其他实施例中，所述方法还包括使所述哺乳动物体细胞的群与编码所述合成转录因子组分的至少一个表达载体接触。因此，合成的转录因子的组分(例如，dCas9-VP64和gRNA)被克隆到合适的表达载体中。在用编码合成转录因子的至少一种表达载体转染靶细胞后，在体细胞中诱导细胞重编程。
在一些示例中，编码合成转录因子的表达载体是附加型载体(即质粒载体)。
在一个示例中，合成转录因子的组分被克隆到单一表达载体中。例如，将哺乳动物体细胞的群与编码至少一种引导RNA和至少一种转录调节剂(例如dCas9-VP64)的表达载体接触。在根据任何上述实施方式的其他实施例中，所述方法还包括使所述哺乳动物体细胞的群与编码所述合成转录因子组分的至少两个表达载体接触。在一些示例中，合成转录因子的组分被克隆到分开的载体中。例如，使哺乳动物体细胞的群与编码至少一种引导RNA的第一表达载体和编码至少一种转录调节剂(例如，dCas9-VP64)的第二表达载体接触。
在根据任何上述实施方式的一些示例中，转录调节物以多肽/蛋白质(例如dCas9-VP64多肽)的形式提供给细胞。因此，所述方法包括使哺乳动物体细胞的群与至少一种合成转录调节剂多肽接触。用于引入或促进多肽进入体细胞的方法是本领域技术人员已知的，
在一些实施方式中，转录调节剂多肽将包含多肽渗透结构域。许多渗透结构域，例如多肽、肽模拟物和非肽载体是本领域已知的并且可以用于本发明中。例如，渗透多肽可以源自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)转录因子触角足基因(Antennapaedia)的第三个α螺旋，称为穿刺素(penetratin)。
在其他示例中，将引导RNA作为分离的核酸分子提供给细胞。因此，本公开的方法可以包括使哺乳动物体细胞的群与至少一种分离的gRNA(核酸)接触。
在其它示例中，根据任何上述实施方式，将合成转录因子以多肽(例如dCas9-VP64多肽)形式提供给体细胞，并且将引导RNA作为核酸分子提供给细胞。因此，本公开的方法包括使哺乳动物体细胞的群与至少一种gRNA(核酸)和至少一种转录调节剂多肽接触。
在一些实施方式中，体细胞的群进一步与至少一种外源重编程因子接触。可以使用编码外源重编程因子的表达载体(例如附加型载体)将外源重编程因子导入细胞中，或者可以以多肽例如重组蛋白质形式引入靶细胞中。在一些实施方式中，重编程因子作为细胞渗透蛋白提供。在另一个实施方式中，外源重编程因子作为编码重编程蛋白的核酸提供。在一些示例中，外源重编程因子选自Oct3/4，Sox2，Klf-4，c-Myc，Lin28，Nanog，SV40大T-抗原及其组合。在一些示例中，外源重编程因子选自Sox2，Klf-4，c-Myc，SV40大T-抗原及其组合。在其他示例中，外源重编程因子选自Sox2，Lin28，Nanog及其组合。
在其他实施方式中，体细胞的重编程和iPS细胞的形成仅使用如本文所述的内源基因的激活/阻抑来实现，并且不涉及将外源重编程因子基因引入体细胞中。在一些示例中，重编程方法包括抑制体细胞中至少一个基因的表达。通常，所述方法将包括激活至少两种、至少三种或至少四种重编程因子基因的表达，并且还将包括阻抑至少一种基因(例如参与细胞凋亡的基因(例如，p53，p21或ROCK途径基因)。
在根据任何上述实施方式的一些示例中，哺乳动物体细胞是人类细胞。在根据任何上述实施方式的其他实施例中，哺乳动物体细胞是原代细胞(即从哺乳动物个体中分离)。在冷冻保存之前，可以将原代细胞培养有限数量的传代，例如一代或两代。在其他示例中，哺乳动物体细胞是血细胞(例如外周血单核细胞(PBMC)，脐带血单核细胞)或成纤维细胞。在一些示例中，哺乳动物体细胞是人原代细胞。在其他示例中，哺乳动物体细胞是原代人PBMC、原代人脐血单核细胞或原代人成纤维细胞。在其他示例中，哺乳动物体细胞不是细胞系。例如，根据本文描述的方法重新编程的细胞不是HEK 293T细胞。
本发明的其他方面涉及通过本发明的任意方法产生的诱导型多潜能干细胞的群。在一些实施方式中，诱导型多潜能干细胞是人类细胞。在其他实施方式中，iPSC基本上不含表达载体成分。表达载体组分的缺乏或存在可以使用任何本领域公认的方法来确定，例如利用载体特异性引物序列的PCR方法。
在其他方面，本公开内容提供了含有本公开的iPSC以及药学上可接受的运载体的药物组合物。
在进一步的方面中，本公开内容提供了治疗患者中疾病(例如适用干细胞疗法的疾病)的方法。该方法包括向有此需要的患者施用治疗有效量的根据本公开的药物组合物。
在其他方面，本公开内容提供了包含人原代细胞的群、本公开的至少一种分离的引导RNA和本公开内容的至少一种转录调节剂多肽(例如dCas9-VP64)的组合物，其中转录调节剂能够结合引导RNA。该组合物可以进一步包含外源重编程因子。
在进一步的方面，本公开提供了用于实践本文公开的方法的试剂盒。
附图简要说明
图1。与iPSC中的hOCT4水平相比，通过CRISPR载体在HEK293T细胞中上调内源hOCT4。转染后48小时的相对mRNA表达水平通过qRT-PCR测量。使用不含gRNA的dCas9-VPR载体的转染作为基线。数据代表平均值±标准差，n＝3个独立转染。
图2，在HEK293T细胞中通过瞬时和附加型CRISPR载体上调内源hOCT4。A.通过免疫荧光分析显示的瞬时dCas9-eGFP和附加型pCE-dCas9-eGFP载体的转染效率。B.转染后48小时的相对mRNA表达水平通过qRT-PCR测量。使用未转染的HEK293T细胞中的OCT4mRNA水平作为基线。数据代表平均值±标准差，n＝3个独立转染。
图3。在缺乏外源OCT4的情况下，通过CRISPR的内源OCT4激活可以“拯救”重编程。(A)显示了使用CRISPR技术重编程HFF和PBMNC产生的iPSC集落。核移植后20天和16天分别采集HFF-iPSC和PBMNC-iPSC集落的相差图像，然后采集集落。通过对HFF-iPSC的形态学或对PBMNC-iPSC的碱性磷酸酶染色计数iPSC集落的数量来确定重编程效率(B)。
图4。使用CRISPER技术的从重编程HFF和PBMNC衍生的iPSC的表征。A.分别在第5代和第6代取得的HFF-iPSC和PBMNC-iPSC的相差图像。通过OCT4，SSEA4，NANOG和TRA-1-81的免疫荧光染色检测HFF-iPSC和PBMNC-iPSC中多潜能标志物的表达。B.由HFF-iPSC产生的EB的相差图像。EB中的细胞代表Pax-6，SMA和Sox 17的免疫荧光染色检测到的三个胚层——外胚层、中胚层和内胚层谱系。
具体实施方式
本文描述了使用合成转录因子例如通过调节内源重编程因子/多潜能基因对哺乳动物体细胞进行核重编程的方法。示例性的方法包括在足以将哺乳动物体细胞重编程为诱导型多潜能干细胞的条件和一段时间下，将哺乳动物体细胞的群(起始体细胞)与合成的转录因子或合成的转录因子的组接触。或者，选择足以将体细胞转分化成与起始体细胞的细胞类型基本不同的靶细胞的条件。例如，血细胞可以转分化成神经元细胞。
这些方法可能涉及设计用于靶向特定感兴趣基因的一种或多种合成转录因子。
在一些实施方式中，合成转录因子不包括单独的gRNA，但包括能够直接结合调控DNA序列的DNA结合结构域，所述调控DNA序列例如多潜能因子基因的启动子序列，所述多潜能因子基因例如胚胎干细胞(ESC)相关基因或与诱导细胞凋亡有关的基因。
在其他实施方式中，合成转录因子包括至少一个(DNA结合性)引导RNA分子和包含功能结构域或调节结构域的RNA结合多肽。例如，每个合成的转录因子包括(a)包含DNA结合区段和多肽结合区段的至少一个引导RNA，其中所述DNA结合区段是序列特异性的并且特异性结合例如多潜能/重编程因子基因的启动子区域，所述多潜能/重编程因子基因例如与胚胎干细胞(ESC)相关的基因或与诱导细胞凋亡相关的基因。合成转录因子进一步包括至少一种转录调节因子，其结合引导RNA的多肽结合区段。基于引导RNA和合成转录因子之间的相互作用，包括功能结构域(例如转录激活结构域)的转录因子被靶向特定目的基因，细胞基因组内的DNA位置(例如，内源重编程因子基因的启动子区域)。随后，向调节基因序列募集转录调节剂调节内源目的基因的表达，例如驱动多潜能基因的表达，从而有助于细胞的重编程。使用多种合成转录因子，可以调节多种多潜能因子基因的表达。
在一些实施方式中，该方法还包括培养重编程细胞。在一些实施方式中，将重编程的细胞培养足够的时间或足够的细胞倍增数量以形成基本上不含表达载体组分的iPSC。
因此，本发明描述了核重编程的方法以及通过这类方法获得的细胞和使用这类细胞治疗可通过干细胞疗法治疗的疾病的疗法，以及用于这类用途的试剂盒。
应理解本发明不限于所述特定方法、方案、细胞系、动物种或属以及试剂，因为这些可能会有变化。还应理解，本文所用术语的目的仅是描述具体实施方式，不应用来限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
定义
术语“一种”或“一个”当与“包含”在权利要求和说明书中联用时，可表示“一个”，但也与“一个或多个”，“至少一个”和“一个或多于一个”的意思一致。
在整篇申请中，术语“约”用于表示包含用于测定数值的装置/方法的误差的固有差异或存在于研究对象中的差异的值。通常术语表示视情况而定包括大约或少于1％,2％,3％,4％,5％,6％,7％,8％,9％,10％,11％,12％,13％,14％,15％,16％,17％,18％,19％或20％可变性。
在权利要求中使用术语“或”表示“和/或”，除非特别指出仅替代方式，或替代方式互相排除，但公开内容支持仅指替代方式和“和/或”的定义。
如本说明书和权利要求中所使用的，术语“包含”(和任何形式的包含，例如“含有”和“含”)，“具有”(以及任何形式的“具有”，例如“有”和“拥有”)，“包括”(以及任何形式的“包括”，例如“囊括”和“括入”)或“含有”(以及任何形式的“含有”，例如“含入”和“包含”)都是纳入性或开放性的，并不排除额外的未提到的元素或方法步骤。考虑本说明书中所讨论的任何实施方式可以用任何本公开的方法或组合物实现，反之亦然。另外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。“体细胞”是指已经充分分化的生物体中的任何细胞，从而在没有实验操作的情况下，通常不会产生身体的所有三个胚层的细胞，即外胚层，中胚层和内胚层。“体细胞”包括“多能细胞(multipotent cell)”(即祖细胞)，但不包括“多潜能(pluripotent)”或“全能细胞(totipotent cell)”。例如，体细胞包括神经元和神经祖细胞，后者可能能够自然产生中枢神经***的全部或部分细胞类型，但不能产生中胚层或内胚层谱系的细胞。
本文在多能祖细胞的内容中提及“多能(multipotency)”，其有可能产生多种细胞类型，但与多潜能干细胞相比效力较弱(更有限的分化潜能)。例如，多能干细胞是造血细胞，其能发育成多种血细胞，但不能发育成脑细胞或其他类型的细胞。
本文所述“多潜能(pluripotent)”指具有分化成三个胚层中的任何一个的潜力的细胞/细胞类型的性质，所述三个胚层为：内胚层(例如内部胃内壁、胃肠道、肺)、中胚层(例如肌肉、骨、血液、泌尿生殖***)或外胚层(例如表皮组织和神经***)。
“多潜能干细胞”包括天然多能干细胞和诱导型多潜能干细胞。它们可形成任何胎儿或成人细胞类型。然而，它们单独并不能发育成胎儿或成年生物体，因为缺乏生成胚胎外组织(例如胎盘)的能力。
“诱导型多潜能干细胞”或(“iPSC”)与天然多潜能干细胞，例如胚胎干细胞在许多方面类似，例如表达一些干细胞基因和/或蛋白，染色质甲基化模式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，存活的嵌合体形成以及潜能和可分化性。诱导型多潜能干细胞可从例如成体胃、肝、皮肤细胞和血细胞中衍生。iPSC可通过将某些干细胞相关基因转染到非多潜能(例如体细胞)细胞中来衍生。在一些实施方式中，可通过病毒载体，例如逆转录病毒，和非病毒或附加型载体等实现转染。转染的基因可以包括但不限于重编程因子Oct3/4(Pou5f1)，Klf-4，c-Myc，Sox-2，Nanog和Lin28。转染细胞的亚群能开始变得与多潜能干细胞形态和生化上类似，可通过形态选择、倍增时间或通过报道基因和抗生素筛选分离。
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，并且是指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括编码和非编码氨基酸，化学或生物化学修饰或衍生的氨基酸和具有修饰的肽骨架的多肽。
本文所用的“结合”或“相互作用”(例如，述及与引导RNA的多肽结合区段结合的合成转录调节剂)是指大分子之间的非共价相互作用(例如在DNA和RNA之间，或在多肽和多核苷酸之间)。“结合”也可以被称为“关联”或“相互作用”。如本文所用，“结合”意指结合伙伴能够彼此结合(例如，不一定彼此结合)。结合相互作用的一些部分可以是序列特异性的，但不是结合相互作用的所有组分都需要是序列特异性的(例如与DNA骨架中的磷酸基团接触)。结合相互作用通常以解离常数(Kd)为特征，例如小于1mM，小于100μM，小于10μM，小于1μM，小于100nM，小于10nM。“亲合力”指结合的强度：提高的结合亲合力与较低的Kd关联。
如本文所用，“启动子”，“启动子序列”或“启动子区域”是指能够结合RNA聚合酶并涉及启动下游编码或非编码序列的转录的DNA调控区域/序列。在本公开的一些示例中，启动子序列包括转录起始位点并向上游延伸从而以高于背景的可检测水平包括起始转录所必需的最少数目的碱基或元件。在一些实施方式中，启动子序列包括转录起始位点以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合域。真核生物启动子通常，但不总是，包含“TATA”盒和“CAT”盒。包括诱导型启动子在内的各种启动子可用于驱动本发明的各种载体。
“载体”或“表达载体”是可以连接另一个DNA区段(即“***物”)从而引起所连接的DNA区段在细胞中复制的复制子，如质粒、噬菌体、病毒或粘粒。“载体”包括附加型(例如质粒)和非附加型载体。在本公开内容的一些实施方式中，载体是附加型载体，其在多个细胞世代之后(例如通过不对称分配)从细胞群中去除/丢失。
“表达盒”包含可操作地连接到启动子的DNA编码序列。“可操作地连接”表示并置位置，其中如此描述的组分的关系允许其以所需方式发挥功能。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至该编码序列。
术语“重组表达载体”或“DNA构建体”在本文中可互换使用，是指包含载体和至少一个***片段的DNA分子。通常为了表达和/或繁殖***片段或为了构建其他重组核苷酸序列而产生重组表达载体。***片段可以或不可以可操作地连接至启动子序列，并且可以或不可以可操作地连接至DNA调节序列。
术语“重编程效率”或“重编程效率”可以用于指细胞产生iPS细胞集落的能力，例如当与本公开的合成转录因子接触时。表现出提高的重编程为多潜能的效率的体细胞将表现出相对于对照产生iPSC的增强的能力。术语“重编程效率”也可指代体细胞重编程为基本不同的体细胞类型的能力，一种称为转分化的过程。使用本发明方法的重编程效率随着体细胞的特定组合、引入合成转录因子或重编程因子的方法、以及诱导重编程后的培养方法而变化。本公开的方法可以包括“测量重编程效率”。确定重编程效率可以涉及计数iPSC集落，或者可以包括测量多潜能标志物的表达，如重编程细胞的下述“关键多潜能标志物”。
本领域普通技术人员已知的一种或多种“关键的多能性标志物”包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42的基因和/或蛋白质表达。
“治疗”或“处理”在本文中指对对象施用一种物质(例如本发明的药物组合物)，以治愈、减轻、缓解、治疗、预防或改善疾病或紊乱、疾病症状、由疾病引发的疾病状态或发生疾病的倾向。“有效量”是能在经治疗对象中产生如本文所定义的医学上理想结果的物质量。医学上理想的结果可以是客观的(即通过一些测试或标志物而可测量的)或主观的(即治疗对象表示出迹象或感觉到效果)。
本文所述的“适合干细胞疗法治疗的疾病”表示能够通过给予干细胞如iPSC治疗的任何程序、病症、失调、微恙和/或疾病。这些疾病包括但不限于骨髓、皮肤、心脏和角膜移植，移植物抗宿主病，肝肾衰竭，肺损伤，类风湿性关节炎，自身免疫病的治疗(例如克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、多发性硬化、狼疮和糖尿病)；同种异体移植排斥的预防，神经疾病和心血管疾病；以及急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞性白血病(AML)、伯基特淋巴瘤、慢性髓细胞性白血病(CML)、幼年型粒单核细胞白血病(JMML)、非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、髓发育不良综合症(MDS)、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、骨髓衰竭综合征、低巨核细胞性血小板减少症、自身免疫性嗜中性白血球减少症(重症)、先天性红细胞生成障碍性贫血、周期性中性白细胞减少、戴-布二氏贫血、伊文综合征、范科尼贫血、血小板无力症、幼年型皮肌炎、Kostmann综合症、红细胞发育不全、施瓦赫曼综合征、严重再生障碍性贫血、先天性铁粒幼红细胞性贫血、血小板减少并桡骨缺乏(TAR综合征)、先天性角化不良、血液疾病、镰刀形细胞贫血(血色素SS)、HbSC病、βo镰刀形贫血、α-重型地中海贫血(胎儿水肿)、β-重型地中海贫血(库利(氏)贫血)、β-中间型地中海贫血、E-βo地中海贫血、E-β+地中海贫血、代谢疾病、肾上腺脑白质失养病(婴儿)、异染性脑白质病变、克拉伯病(球形细胞脑白质营养不良)、先天性红细胞生成性卟啉病、赫曼斯基-普德拉克综合征、赫尔利综合征、胡-射二氏综合征、亨特综合征、圣菲利波综合征、马-兰二氏综合征、II型、III型粘多糖症、α甘露糖苷贮积症、A型或B型尼曼-匹克综合征,桑德霍夫综合征、泰-萨克斯病、巴藤病(遗传样神经元腊样脂褐质症)、高原酸血症、免疫缺陷病、运动失调性毛细血管扩张症、慢性肉芽肿性疾病、迪格奥尔格综合征、IKK-γ缺陷、免疫失调性多内分泌病变、II型X-连锁粘多糖贮积症、先天性骨髓粒细胞缺乏症X-连锁免疫缺陷、重症联合免疫缺陷、腺苷脱胺酶缺陷、威斯科特-奥尔德里奇综合征、X-连锁血中丙球蛋白贫乏、X-连锁淋巴(细胞)增生症、Omenn综合征、网状结构发育不良、胸腺发育不全、白细胞粘附缺陷、其他骨硬化症、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、噬血细胞淋巴组织细胞增生症、急性和慢性肾病、阿尔茨海默氏病、抗衰老、关节炎、哮喘、心脏干细胞治疗、脑梗塞(中风)、脑瘫(中风)、慢性阻塞性肺疾患(COPD)、充血性心力衰竭、糖尿病(I型和II型)、纤维肌痛、免疫缺陷、缺血性心脏病、狼疮、多发性硬化、心肌梗塞、骨关节炎、骨质疏松、帕金森氏病、外周动脉疾病、类风湿性关节炎、整容手术中的干细胞治疗、创伤性大脑损伤和神经性疾病。
本文所用的“患者”指诊断或怀疑患有或发生适合干细胞疗法的疾病，例如心血管疾病的哺乳动物对象。示范性的患者可以是人、猿、犬、猪、牛、猫、马、山羊、绵羊、啮齿动物和其他哺乳动物，其可获益于干细胞治疗。
在此将“给予”称为向患者提供本公开的iPSC，例如通过注射。通过举例而不是限制，可通过静脉内(i.v.)注射，皮下(s.c.)注射，皮内(i.d.)注射，腹膜内(i.p.)注射，或肌肉内(i.m.)注射进行该给予。可采用一种或多种这样的途径。胃肠外施用可以是例如通过推注或逐渐随时间灌注。或者或同时，可通过口服途径给药。另外，也可通过手术放置大丸剂或细胞团块，或放置其中装载细胞的医疗装置例如支架来给药。优选的，在疾病的位点，例如疾病损伤(例如血管狭窄/堵塞，坏死组织或坏疽感染位点)处或附近(例如距离约或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50毫米处)给予本发明的组合物。
本文所述的“有此需要的患者”指诊断出或怀疑适合干细胞疗法的疾病的患者。多潜能因子和多潜能因子基因
本文使用的术语“多潜能因子基因”或“重编程因子基因”是指编码多潜能因子多肽的内源细胞基因(包括其启动子区域)。多潜能因子基因的表达的激活或阻抑有助于体细胞的核重编程，例如多能或多潜能，“多潜能因子基因”包括可用于本发明方法的任何靶基因。示例性多潜能因子基因包括ESC相关基因，例如重编程因子基因(其通常在本公开内容的方法中被激活)和参与启动细胞凋亡的基因(其在本公开的方法中通常被抑制)。
如本文所用的“多潜能因子”或“重编程因子”是指上述“多潜能因子基因”或“重编程因子基因”的相应基因产物，
术语“候选多潜能因子基因”是指可能涉及哺乳动物体细胞的细胞核重编程的基因，其使用候选引导RNA(例如候选引导RNA的文库)使用本公开的体外筛选方法鉴定。此类基因的表达的激活或阻抑导致iPSC的形成，例如在经历如本文所概述的合适的重编程过程时形成至少一个iPSC集落。iPSC的形成可以表明，候选引导RNA已经与候选基因的启动子区域杂交，并且已经将转录调控物靶向到该候选基因的调控区域。随后，候选基因的表达已经被调节，因此可能有助于宿主细胞的重编程。“候选多潜能因子基因”的鉴定可以进一步涉及将候选引导RNA的DNA结合序列与内源基因序列进行匹配。可以进一步验证候选基因在重编程中的参与，例如通过使用具有鉴定的DNA结合区段的其他候选gRNA与本公开的一种或多种转录调节剂的组合来重复哺乳动物体细胞的重编程。
示例性重编程因子基因包括POU5F1(oct3/4)，sox2，klf4，c-myc，lin28和nanog。在一些示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、klf-4、c-myc、lin28和nanog中的至少两个。在一些示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、lin28和nanog中的至少两个。在其他示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、c-myc、lin28和klf4中的至少两个。在一些示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、lin28和nanog中的至少三个。在其他示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、c-myc、lin28和klf4中的至少三个。在一些示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、lin28和nanog。在其他示例中，被活化的重编程因子基因是oct3/4、sox-2、c-myc、lin28和klf4。
在根据任何上述实施方式的其他示例中，被激活的基因是抗凋亡基因，例如bcl-2或bcl-x。在一些示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox-2，klf-4，c-myc，lin28和nanog中的至少两个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在一些示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox-2，lin28和nanog中的至少两个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在其他示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox-2，c-myc和klf4中的至少两个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在一些示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox-2，lin28和nanog中的至少三个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在其他示例中，重编程因子基因是oct3/4，sox-2，c-myc和klf4中的至少三个，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在一些示例中，被激活的重编程因子基因是oct3/4，sox2，klf-4，lin28和nanog，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。在其他示例中，重编程因子基因是oct3/4，sox-2，c-myc和klf4，以及至少一个抗凋亡基因(例如bcl-2和bcl-x中至少一个)。
传统上使用转录因子(例如，Oct3/4，Sox2，Klf4，Nanog，c-Myc和Lin28)与编码作为凋亡阻抑物起作用的蛋白质的基因的组合来实现细胞重编程。这些基因的示例是SV-40大T-抗原和肿瘤抑制蛋白p53的显性阴性形式。由于这些细胞凋亡阻抑物的基因不能在人类细胞基因组中内源存在，所以在CRIPR方法中，应当抑制在细胞重编程过程中可能被激活的凋亡途径。
因此，在根据任何上述实施方式的其他示例中，细胞重编程涉及阻抑至少一个靶基因，例如与上述基因激活中的任一种组合。在一些示例中，被阻抑的靶基因是凋亡促进基因或细胞周期抑制剂。示例包括p53及其靶基因p21，细胞周期抑制剂。阻抑其他细胞周期抑制剂可以抵消由细胞重编程过程触发的细胞凋亡途径。一些候选物质是p19Arf(其稳定了p53)和p16Ink4a(其防止pRb被细胞周期蛋白D磷酸化，因此诱导细胞周期停滞)。Ink4/Arf基因座在iPSC中表观遗传沉默，但在体细胞中上调，表明Ink4a/Arf基因座作为重编程的表观遗传屏障的重要作用(H.Li，M.Collado，A.Villasante等，“Ink4/Arf基因座是iPS细胞重编程的屏障(The Ink4/Arf locus is a barrier for iPS cell reprogramming)”，Nature2009,460(7259)：1136-1139)。因此，在一些示例中，被抑制的靶基因选自p53，p21，p19Arf和p16Ink4a。
在根据任何上述实施方式的其他示例中，被抑制的多潜能因子基因是编码促进细胞死亡和/或细胞周期停滞的信号转导蛋白的基因。示例包括Rho相关蛋白激酶(ROCK)和属于丝氨酸-苏氨酸激酶的AGC(PKA/PKG/PKC)家族的激酶。ROCK主要通过作用于细胞骨架来参与对细胞的形状和运动的调节。已显示ROCK抑制通过阻止解离诱导的细胞凋亡来促进作为单细胞的多潜能干细胞的细胞存活。而且，阻抑ROCK将潜在地抑制mTOR途径。例如，雷帕霉素抑制mTOR途径，显著提高重编程效率(T.Chen，L.Shen，J.Yu等，“雷柏霉素和其他长寿促进化合物增加小鼠诱导型多潜能干细胞的产生(Rapamycin and other longevitypromoting compounds enhance the generation of mouse induced pluripotent stemcells)”，Aging Cell 2011，10(5)：908-911)。因此，在一些实例中，被抑制的多潜能因子基因选自ROCK，PKA/PKG/PKC家族激酶以及当被阻抑时将抑制mTOR途径的其它基因，
用于本发明方法的另一种多潜能因子基因是glis1。
感兴趣的重编程因子也包括可用于转分化的因子，其中体细胞被再编程成不同的体细胞。出于使一种体细胞转分化成另一种基本不同的体细胞类型的体细胞的目的，发现不同组的重编程因子的用处。例如，为了将成纤维细胞转分化成心肌细胞，可使用细胞穿透肽Gata4、Mef2c和Tbx5(Leda等，Cell 2010,142(3):375-386，其通过引用具体纳入本文)。
在本公开的一些实施方式中，使哺乳动物体细胞与外源重编程因子接触。向细胞提供外源重编程因子作为分离的多肽的组合物，即以生物活性无细胞形式，或作为编码其的外源核酸(例如DNA，RNA)，其在递送至细胞或表达时，重编程或有助于将体细胞重编程为例如多能或多潜能。在一些实施方式中，重编程因子可以是非整合的，即以不导致外源DNA整合到受体细胞的基因组的形式向受体体细胞提供。
可由具体DNA结合试验，或通过确定因子在改变细胞转录的效果来确定生物活性。本发明的组合物可提供一种或多种生物上有活性的重编程因子。该组合物可包含至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约150μg/ml、至少约200μg/ml、至少约250μg/ml、至少约300μg/ml、或至少约500μg/ml的可溶重编程因子。
Klf4多肽是包含与人Klf4(即Kruppel-样因子4)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_004226(SEQ ID NO:1)和NM_004235(SEQID NO:2)。Klf4多肽，例如，与GenBank登录号NM_004235中提供的序列(SEQ ID NO:2)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
c-Myc多肽是包含与人c-Myc(即骨髓细胞瘤病毒癌基因同源物)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_002458(SEQ ID NO:3)和NM_002467(SEQ ID NO:4)。c-Myc多肽，例如，与GenBank登录号NM_002467中提供的序列(SEQ ID NO:4)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
Nanog多肽是包含与人Nanog(即Nanog同源框)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_079141(SEQ ID NO:5)和NM_024865(SEQID NO:6)。Nanog多肽，例如与GenBank登录号NM_024865中提供的序列(SEQ ID NO:6)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
Lin-28多肽是包含与人Lin-28(即秀丽新杆线虫(C.elegans)的Lin-28同源物)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_078950(SEQ ID NO:7)和NM_024674(SEQ ID NO:8)。Lin-28多肽，例如与GenBank登录号NM_024674中提供的序列(SEQ ID NO:8)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
Oct3/4多肽是包含与人Oct3/4(也称为智人POU 5类同源框1(POU5F1))的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_002692(SEQ IDNO:9)和NM_002701(SEQ ID NO:10)。Oct3/4多肽，例如与GenBank登录号NM_002701中提供的序列(SEQ ID NO:10)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
Sox2多肽是包含与人Sox2(即性别决定区Y-盒2蛋白)的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽，其序列可见于GenBank登录号NP_003097(SEQ ID NO:11)和NM_003106(SEQ ID NO:12)。Sox2多肽，例如与GenBank登录号NM_003106中提供的序列(SEQ IDNO:12)至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、95％、97％、99％、或100％相同的那些以及编码其的核酸可用作本发明中的重编程因子的用处。
本公开的方法还可以包括使哺乳动物体细胞与可以改变或调节转录的小分子或重编程增强剂接触。在一些示例中，小分子或重编程增强剂是组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂。已经描述小分子，包括但不限于siRNA、丙戊酸、BIX-01294和BayK8644可用于重编程细胞(参见Shi等，(2008)Cell Stem Cell 6；3(5):568-574和Huangfu等，(2008)NatureBiotechnology 26:795-797，各自通过引用具体纳入本文)。其他用于本公开方法的重编程增强剂包括含铝的盐(例如氢氧化铝)和TGF-β抑制剂(例如A83-01)。
合成转录因子
通常，术语“转录因子”是指具有与DNA结合(经由DNA结合结构域)的能力并能通过功能性(激活或阻抑物)结构域调节基因表达的复合物。结合本公开内容，DNA结合结构域可以被与(DNA结合)引导RNA(gRNA)组合使用的RNA结合结构域(例如，dCAS9)置换。本公开内容的示例性合成转录因子包括gRNA和dCas9-VP64，其中dCas9是示例性的R'NA结合结构域，并且VP64是示例性的反式激活结构域。本公开的另一示例性合成转录因子包括gRNA(包括至少一个MS2结合环)；dCas9和MS2-VP64，其中MS2是示例性的RNA结合结构域，并且VP64是示例性的反式激活结构域。
因此，本公开的合成转录因子包括(a)包含DNA结合区段和多肽结合区段的至少一种引导RNA(gRNA)，和(b)至少一种转录调节剂、多肽，其包括RNA结合结构域(能够结合gRNA的多肽结合区段)和至少一个功能结构域(例如转录激活结构域)。基于gRNA和转录调节剂之间的相互作用，转录调节剂被靶向细胞基因组内的特定DNA位置(例如，内源多潜能因子基因的启动子区域)。随后，转录调节剂的募集调节内源基因的表达，例如驱动多潜能因子基因的表达，从而有助于细胞的重编程。
为了调节细胞基因组内多个基因座的基因表达，可使细胞与合成的转录因子的混合物接触。例如，该混合物可以包括多个引导RNA，每个引导RNA具有不同的DNA结合区段，但是每个具有相同的多肽结合区段。在这种情况下，可以使用相同的转录调节剂来调节多个基因。在其他示例中，合成的转录因子的混合物可以包括具有不同多肽结合区段的至少两个引导RNA，在这种情况下，使用具有不同RNA结合结构域的至少两种不同的转录调节剂。
引导RNA
与转录调节剂结合并将转录调节剂靶向靶DNA内的特定位置(即内源多潜能因子基因的启动子区域)的RNA分子在本文中称为“引导RNA”或“gRNA”并且在本文中也可以被称为“靶向DNA的RNA”。引导RNA包含至少两个核苷酸区段：至少一个“DNA结合区段”和至少一个“多肽结合区段”。“区段”是指分子的部分、分段或区域，例如RNA分子的连续核苷酸片段。除非另外具体定义，“区段”的定义不限于总碱基对的特定数目。
引导RNA可以包括至少两个多肽结合区段。在一些实施方式中，将引导RNA的第一多肽结合区段设计为单独结合第一转录调节剂(例如，dCas9-VP64)或dCas9，并且第二多肽结合区段设计成募集第二转录调节剂。
例如，引导RNA的第一个多肽结合区段结合合成的基于dCas9的转录调控子(例如dCas9-VP64)，而引导RNA的一个或多个募集MS2的多肽结合区段(例如融合到四环和/或茎环2结构域)结合一个或多个基于MS2的转录调节剂(例如MS2-VP64)。
参见例如Konermann等Nature 2015,517：583-588(和支持材料)，其公开内容整体并入本文。在一些示例中，体细胞与dCas9(基于MS2的转录调节因子)和结合dCas9和MS2的引导RNA接触。
gRNA的多肽结合区段可以包含多于一个核酸分子的区域。在一些情况中，引导RNA的多肽结合区段包含沿着互补区域杂交的两个分开的分子。例如，包含两个分开分子的引导RNA的多肽结合区段可以包含(i)长度为100个碱基对的第一RNA分子的30个碱基对和长度为50个碱基对的第二RNA的15个碱基对。
可以将引导RNA作为分离的RNA分子引入到靶细胞中，或者使用含有编码引导RNA的DNA的表达载体将引导RNA引入到细胞中。
引导RNA的DNA结合区段
引导RNA的“DNA结合区段”(或“DNA-靶向序列”)包含与靶DNA内的特定序列互补的核苷酸序列。在本公开的一些实施方式中，靶DNA是内源重编程因子基因或其他多潜能因子基因的启动子区域。例如，引导RNA的DNA结合区段与内源性oct3/4基因、内源sox-2基因、内源klf4基因或内源c-myc基因的启动子区域内的序列互补。在其他示例中，DNA结合区段来自核苷酸序列文库，并且可以结合候选多潜能因子基因的启动子区域。
引导RNA的多肽结合区段
本公开的引导RNA包括一个或多个多肽结合序列/区段。引导RNA的多肽结合区段(或“蛋白质结合序列”)与本公开的转录调节剂(例如，修饰的Cas9多肽结构域或MS2多肽结构域)的RNA结合结构域相互作用。此类多肽结合区段或序列是本领域技术人员已知的，例如美国专利申请公开2014/0068797、2014/0273037、2014/0273226、2014/0295556、2014/0295557、2014/0349405、2015/0045546、2015/0071898、2015/0071899和2015/0071906，其公开内容在此整体引入。
在一些示例中，引导RNA包含至少一个dCas9结合区段。使用传统的CRISPR***，需要dCas9与导向RNA形成DNA结合复合物，然后所得复合物有效地结合DNA。因此，在一些示例中，合成的转录因子包括至少一种基于dCas9的转录调节剂(例如与反式激活或阻抑物结构域融合的dCas9)。然而，可以设计不依赖于Cas9结合的引导RNA。
在其它示例中，引导RNA包括至少两个多肽结合区段：第一多肽结合区段dCas9结合区段，和结合除dCas9之外的多肽的第二多肽结合区段(例如MS2)。在这种情况下，可以将dCas9本身(不与转录激活或阻抑物结构域融合)提供给细胞。
在一些示例中，引导RNA的多肽结合区段是MS2结合区段，其可例如融合至引导RNA的四环和/或茎环2结构域。这种结合结构域是本领域技术人员已知的。参见例如Konermann等Nature 2015,517：583-588(和支持材料)，其公开内容整体并入本文。
转录调节剂
本公开内容的转录调节剂包括至少一个RNA结合结构域(能够结合引导RNA的多肽结合区段)和至少一个功能结构域(例如转录激活结构域或阻抑物结构域)。基于转录调节剂的RNA结合结构域与引导RNA之间的相互作用，转录调控剂被靶向特定目的基因，细胞基因组内的DNA位置(例如内源性重编程因子基因的启动子区域)。转录调节剂向内源目的基因的募集调节靶基因的表达，从而有助于细胞重编程。这种调节可以取代外源重编程因子基因的表达。例如，不是将外源Oct3/4引入细胞中(例如通过编码多肽的表达载体)，而是使内源Oct3/4基因直接在细胞中被激活。
转录调节剂的RNA结合结构域(BP)
RNA结合结构域或RNA结合多肽是本领域技术人员已知的，例如美国专利申请公开2014/0068797、2014/0273037、2014/0273226、2014/0295556、2014/0295557、2014/0349405、2015/0045546、2015/0071898、2015/0071899和2015/0071906，其公开内容在此整体引入。在本公开内容的一些实施方式中，RNA结合结构域包括酶促灭活的Cas9多肽(dCas9)。在其中转录调节剂的RNA结合结构域不是dCas9(例如，MS2)的一些示例中，所述细胞另外提供dCas9，这是因为例如需要dCas9与引导RNA形成DNA-结合复合物。或者，细胞与至少两种转录调节剂接触，其中至少一种是基于dCas9的。在一些示例中，转录调节剂的RNA结合结构域包含MS2多肽。
通常将转录调节剂的RNA结合结构域融合至至少一个功能结构域，例如反式激活结构域如VP64、p65或HSF1。在一些示例中，RNA结合结构域(例如dCas9或MS2)与一个功能结构域准确地融合。例如，本公开的转录调节剂可具有通用结构：dCas9-VP64或MS2-p65与dCas9的组合。在其他示例中，单个RNA-结合结构域，如dCas9或MS2与多个功能域融合，其中每个功能域是独立选择的。如果转录调节剂包含至少两个功能性结构域，则功能性结构域可以以线性方式连接到RNA结合结构域。例如，本公开的转录调节剂可以具有通用结构：MS2-p65-HSF1。
转录调节剂的功能结构域(FD)
本公开的转录调节剂包含至少一个功能结构域。功能结构域可以是可以控制从DNA到信使RNA的遗传信息转录速率的任何结构域。功能结构域可通过促进(作为活化剂)或阻断(作为阻抑物)募集RNA聚合酶(将DNA遗传信息转录为RNA的酶)而单独或与复合物中的其他蛋白质一起执行该功能。通常为DNA结合转录因子的一部分的这种转录激活结构域是本领域普通技术人员已知的。在本公开的一些实施方式中，功能结构域选自VP64，p65，和HSF-1(人热休克因子1)(基因表达的激活剂)或KRAB(基因表达的抑制剂)的激活结构域。
在一些实施方式中，功能结构域(例如转录激活结构域或阻抑物结构域)与RNA结合结构域的氨基或羧基末端融合。在一些示例中，RNA结合结构域是dCas9，并且功能结构域(例如转录激活结构域)与dCas9多肽的C或N末端融合。在其他示例中，功能结构域(例如转录激活结构域)与RNA结合结构域的内部氨基酸残基融合。在其他示例中，RNA结合结构域与功能结构域的内部氨基酸残基融合。
在一些示例中，本公开的方法利用至少两种转录调节剂来调节单个基因的表达。这种组合的示例涉及dCas9-VP64和MS2-p65-HSFlin与可结合dCas9和MS2的gRNA的组合。参见例如Konermann等，同上。
示例性的转录调节剂组合包括：
1.dCas9-[(FD1)m-FD]n；
2.BD1-[(FD1)m-(FD)]n与dCas9组合；和
3.BD1-[(FD1)m-(FD)]n与dCas9-[(FD1)m-FD]n组合，
其中BD 1是除dCas9以外的RNA结合结构域；FD1和FD是独立选择的功能结构域，其可以相同或不同；m是独立地选自0和1的整数；并且n是独立地选自1至10的整数。在上述实施例的一个示例中，整数n独立地选自1至5(例如1或2)。在另一个示例中，n在每次出现时是1。在上述实施例的另一个示例中，m是0。
重编程
用于将合成转录因子(包括引导RNA和转录调节剂)引入体细胞的方法包括使细胞具有纯化的RNA或多肽，或使细胞具有编码该多肽的核酸。
有许多可用于将外源基因转入靶哺乳动物细胞的载体。这些载体可以附加方式保持，例如作为质粒，或病毒衍生的载体如巨细胞病毒、腺病毒等。合成转录因子的表达载体通常包含用于驱动所需基因表达，即转录激活，的合适启动子。这可包括广泛作用的启动子，例如，CMV-β-肌动蛋白启动器，或诱导型启动子，如在具体细胞群中有活性或者响应药物如四环素存在的启动子。通过转录活化，预期靶细胞中的转录将在基线水平上增加至少或约2、3、4、5、6、7、8、9、10、100或1000倍。
例如，为了制备人iPSC，培养初始体细胞(例如人PBMNC)，并通过预定载体组合的核转染进行转染以诱导重编程。在一些示例中，载体是附加型质粒。
例如，可以通过离心收集冷冻保存的起始细胞并将其接种到组织培养板(例如，6孔板；2-4×106个细胞/ml)上，并且在合适的条件下生长，例如在加湿的37℃的常氧条件下的培养箱中(例如，20.9％O2；5％CO2)。
经过一定的生长期(例如约3天)后，可通过离心收集细胞，悬浮于合适的生长培养基(例如含有所有补充物的PBMC培养基)中并计数。随后细胞可接种到组织培养板(例如，6孔板，0.5-1×106个细胞/ml)上，并且在合适的条件下生长，例如在加湿的37℃的常氧条件下的培养箱中(20.9％O2；5％CO2)。
在合适的生长期(例如约6天)之后，细胞可以在合适的条件下(例如使用LONZA 4DNucleofectorTM)在含有重编程质粒的合适的培养基(例如100μL Lonza P3NucleofectorTM溶液)中进行核转染。
在核转染之后，体细胞可保持在包含饲细胞层的常规培养基中，或者可在没有饲细胞层的情况下培养，即除了诱导为多潜能的那些以外没有体细胞。无饲细胞层培养可采用蛋白质涂覆的表面，例如，基质胶等。体细胞也可保持悬浮或附连至微运载体。
例如，核转染后，可以使用合适的培养基(例如含有所有补充物的PBMC培养基)稀释细胞，并将细胞转移至合适组织培养板的支持重编程的合适培养基中(例如6孔板，LonzaL7hPSC MatrixTM，PBMC培养基，包含所有补充物，任选地含有重编程增强剂如Lonza附加型Enhancer ATM)。随后可以在合适的条件下，例如在37℃(3％O2：5％CO2)的低氧湿润培养箱中培养细胞适当的时间(例如约2天)，由此允许细胞重编程。
在适当的生长期(例如核转染后约两天)后，将支持iPSC生长和集落形成的适当培养基(例如含有补充物的Lonza L7hPSC Culture MediumTM)加入核转染的细胞中。此后(例如核转染后约四天)，将培养基替换为支持iPSC生长和集落形成的合适培养基(例如LonzaL7hPSC Culture MediumTM，含有补充物)。随后可以在合适的条件下，例如在37℃(3％O2；5％CO2)的低氧湿润培养箱中，使细胞生长适当的时间(例如约14天)。
培养基可以根据需要替换，直到iPSC集落大到可以继代培养。使用合适的培养基(例如L7hPSC Culture MediumTM，含有补充物)将初始的iPSC集落手动传代到单独的孔中(例如L7hPSC MatrixTM)，并在合适的条件下孵育，例如在37℃潮湿的常氧条件培养箱(20.9％O2,5％CO2)中。对于随后的iPSC传代(例如P3和随后的传代)，可以使用适当的传代溶液(例如，Lonza LI 3hPSC Passaging SolutionTM)。
在一些实施方式中，体细胞的群进一步与外源重编程因子接触。如上所述，使体细胞的起始群与重编程因子接触，所述重编程因子以组合形式提供，并且其量足以使所述细胞重编程为多能性细胞。可向体细胞提供单独的或单一组合物(即重编程因子的预混组合物)形式的重编程因子。重编程因子可以在不同的时间同时或顺序地添加到目标细胞。重编程因子的剂量将随着细胞性质、因子、培养条件等变化。在一些实施方式中，剂量将是各因子约1nM至约1ìM，更通常约10nM至约500nM，或约100至200nM。
在一些实施方式中，重编程因子将包括与多肽穿透结构域融合的重编程因子的多肽序列。许多渗透结构域，例如多肽、肽模拟物和非肽载体是本领域已知的并且可以用于本发明中。例如，渗透多肽可以源自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)转录因子触角足基因(Antennapaedia)的第三个α螺旋，称为穿刺素(penetratin)。
重编程效率可以通过集落计数(例如通过形态学或碱性磷酸酶染色)来确定。
iPSC可能具有类似hESC的形态，生长成扁平集落，具有大的核质比，确定的边界和显著的核。另外，iPSC能够表达本领域普通技术人员已知的一种或多种关键的多能性标志物，包括但不限于碱性磷酸酶、SSEA3、SSEA4、Sox2、Oct3/4、Nanog、TRA160、TRA181、TDGF 1、Dnmt3b、FoxD3、GDF3、Cyp26a1、TERT和zfp42。另外，iPSC能够形成畸胎瘤。另外，它们能够形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织，或对于形成活生物体中的外胚层、中胚层或内胚层组织起作用。
可以为了多种目的向体细胞或体细胞衍生的iPSC中导入基因，例如为了取代具有功能缺失突变的基因、提供标志物基因等。或者，可引入表达反义mRNA或核酶的载体，从而阻断不需要的基因表达。基因治疗的其他方法是引入药物抗性基因以使正常祖细胞具有优势并经受选择压力，所述药物抗性基因例如多重耐药基因(MDR)或抗凋亡基因如bcl-2。本领域已知的各种技术可用于将核酸引入靶细胞，所述技术例如上述的电穿孔、钙沉淀DNA、融合、转染、脂质体转染、感染等。DNA引入的具体方法对实施本发明不重要。
在一些方面，本公开提供了根据本文公开的方法制备的iPS细胞。
使用方法
通过上述方法产生的iPSC可用于重建或补充接受者中正在分化或经分化的细胞。经诱导的细胞可分化成各种谱系的细胞类型。经分化的细胞的示例包括任何来自外胚层(例如，神经元和成纤维细胞)、中胚层(例如，心肌细胞)或内胚层(例如，胰腺细胞)谱系的经分化的细胞。经分化的细胞可以是以下的一种或多种：胰腺细胞、神经干细胞、神经元(例如，多巴胺能神经元)、少突胶质细胞、少突胶质细胞祖细胞、肝实质细胞、肝干细胞、星形细胞、肌细胞、造血细胞或心肌细胞。
存在多种将经诱导的细胞分化成更具体的细胞类型的方法。分化经诱导的细胞的方法可与用于分化干细胞，尤其是ES细胞、MSC、MAPC、MIAMI、造血干细胞(HSC)的那些方法类似。在一些情况中，分化离体发生；在一些情况中，分化体内发生。
所述经诱导的细胞，或从经诱导的细胞分化的细胞可用作治疗疾病(如遗传缺陷)的疗法。在一些方面，本公开内容提供了治疗患者中适用干细胞疗法的疾病的方法。示例性方法包括向有需要的患者施用治疗有效量的包含本公开的IPS细胞和药学上可接受的运载体的药物组合物。
所述疗法可针对治疗所述疾病的原因；或者，所述疗法可治疗所述疾病或症状的影响。经诱导的细胞可转至或接近对象的损伤位置；或所述细胞可以细胞迁移或驻留在损伤位置的方式引入所述对象。经转移的细胞宜替代受损或受伤细胞并使对象的总体病症改善。在一些情况中，经转移的细胞可刺激组织再生或修复。
经转移的细胞可以是从经诱导的细胞分化的细胞。经转移的细胞也可以是从经诱导的细胞分化的多能干细胞。在一些情况中，经转移的细胞可以是未经分化的经诱导的细胞。
向对象给予治疗的次数可变化。将经诱导的和/或经分化的细胞引入所述对象可为一次事件；但在某些情况中，所述治疗可在有限的时间引起改善并需要持续的一系列重复治疗。在其它情况中，在观察到效果之前可能需要多次给予细胞。确切的方案取决于疾病或病症、疾病的阶段和正接受治疗的个体对象的参数。
可通过任意以下途径向对象引入细胞：胃肠外、静脉内、动脉内、肌内、皮下、透皮、气管内、腹膜内、或进入脊液。
可以任意生理上可接受的培养基给予iPSC。它们可单独或与合适的物质或基质一起提供，例如，以支持它们在其植入的组织中的生长和/或组织。通常，将给予至少1x105个细胞，优选1x106或更多。可通过注射、导管等引入细胞。细胞在液氮温度下冷冻并且长期储存，能够在解冻后使用。若冷冻，所述细胞通常储存于10％DMSO、50％FCS、40％RPMI 1640培养基中。一旦解冻，所述细胞可用有关祖细胞增殖和分化的细胞因子和/或基质细胞扩增。
实施例1
通过内源激活人POU5F1/OCT4基因转录拯救重编程(基于CRISPR的重编程)
载体序列
如Mali，P.等，“用于靶特异性筛选的CAS9转录激活剂和用于合作基因组工程的成对切口酶(CAS9transcriptional activators for target specificity screening andpaired nickases for cooperative genome engineering)”NatBioiechnol 2013,31(9):833-8，其公开内容整体并入本文)所述制备dCas9、dCas9-VP64和引导RNA构建体的DNA序列。含有MS2结合环和MS2-转录调节剂融合蛋白(例如，MS2-VP64)的其他序列如Konermann等，Nature2015,517：583-588(和支持材料)所述制备，其公开内容整体并入本文。通过GeneART合成序列并将其克隆到附加型克隆载体中。这些载体直接用于以下实验。
用于人POU5F1/OCT4转录激活的gRNA的选择
将人外周血单核细胞(hPBMC)培养6天，然后用dCas9和gRNA编码载体的各种组合(参见下表1)转染。使用Lonza 4D NucleofectorTM(项目EO-115)和Lonza P3Primary Cell4D-NucleofectorTM试剂盒，用各质粒组合对106个细胞完成核转染。将细胞铺在完全的HPGM中并再培养48小时。收集细胞沉淀，纯化总RNA并进行qt-PCR以检测人POU5F1/OCT4mRNA的内源水平。
表1
载体组合
人PBMC的不依赖饲养层的重编程
使用下述方案和以下载体组合，将hPBMNC核转染以诱导重编程：(a)编码下述的五个载体：1，Oct4；2，Sox-2和Klf4；3，Lin28和c-Myc；4，P53DD；5，EBNA-1阳性对照(“冲田(Okita)组”)；(b)没有编码Oct4的载体的冲田组；和(c)没有编码Oct4的载体的冲田组，以及编码Cas-9-VP64和gRNA(发现其诱导Oct4转录)的上述载体。
通过集落计数(通过形态学或碱性磷酸酶染色)和集落质量(通过形态学)确定重编程效率。
使用以下程序和上述附加型质粒，通过重编程人PBMC产生人诱导型多潜能干细胞(iPSC)。材料：hPBMC(Lonza Cat.CC-2702,(50x106细胞/瓶)；Lonza L7hPSC CultureMediumTM和补充试剂盒；Lonza L13hPSC Passaging SolutionTM,Lonza L7hPSC MatrixTM,Lonza 41)NucleofectorTM；Lonza P3Primary Cell 4D-NucleofectorTM试剂盒；LonzaEpisomal Reprogramming KitTM(Episomal Reprogramming Plasmid MixTM；EpisomalEnhancer ATM)；6-和12-孔组织培养板,PBMC基础培养基；HPGMTM；PoieticsTM造血祖细胞生长培养基，不含抗生素；PBMC培养基补充物(参见表2).
表2
PBMC培养基补充物
将hPBMC在基础PBMC培养基(200×g，15分钟)中离心。除去培养基，并将细胞沉淀分散在含有所有补充物的10ml PBMC培养基中。计数细胞并以2-4×106个细胞/ml接种到6孔组织培养物处理的平板上。将板置于加湿的37℃培养箱中并保持常氧条件(20.9％O2；5％CO2)。
在第3天，使用基础PBMC培养基将细胞转移到15ml离心管中，并以200xg离心5分钟。除去培养基，并将细胞沉淀分散在含有所有补充物的10ml PBMC培养基中。计数细胞并以0.5-1×106细胞/ml接种到6孔板上。将板置于加湿的37℃培养箱中,常氧条件(20.9％O2；5％CO2)。
在第6天，将含所有补充物的2ml PBMC培养基加入到6孔板的各孔中(用L7hPSCMatrixTM预处理)。将6μl Episomal Enhancer ATM加入到每个孔中。将板在37℃(3％O2，5％CO2)的低氧湿润培养箱中预平衡1小时。将基础PBMC中的1×106个细胞转移到15mL管中，并以200×g离心5分钟。去除上清液，将细胞悬浮在核转染试剂中(100μL P3NucleofectorTM溶液，移液入含有3μg Episomal Reprogramming Plasmid MixTM的管中)。
将细胞转移至NucleocuvetteTM并经核转染(4D NucleofectorTM)。将约500μl的PBMC培养基(含有全部补充物)加入到比色杯中，并将细胞直接转移到平衡的6孔板上。将板置于37℃(3％O2，5％CO2)的低氧湿润培养箱中两天。
在第8天，将2ml的L7hPSC Culture MediumTM(含有补充物)加入到具有核转染细胞的每个孔中。在低氧条件下将细胞在L7hPSC Culture MediumTM中培养，直到培养出足够大以进行传代培养的集落。
传代培养iPSC集落
将12孔板用L7hPSC MatrixTM预处理，并使用含有补充物的L7hPSC CultureMediumTM将初始集落接种到单独的孔中。将板在加湿的37℃培养箱中，常氧条件(20.9％O2；5％CO2)下孵育。对于P3和以后的传代，使用L13hPSC Passaging SolutionTM。
实施例2
通过内源激活人OCT4基因转录拯救重编程(基于CRISPR的重编程)
载体序列
如Mali，P.等(“用于靶特异性筛选的CAS9转录激活剂和用于合作基因组工程的成对切口酶(CAS9transcriptional activators for target specificity screening andpaired nickases for cooperative genome engineering)”NatBioiechnol 2013，31(9)：833-8，其公开内容整体并入本文)和Chavez，A.等(“高效Cas9介导的转录重编程(Highlyefficient Cas9-mediated transcriptional programming)”Nat Methods.2015年四月；12(4)：326-8)所述，制备由与dCas9蛋白C-末端融合的VP64-p65-Rta激活结构域和引导RNA构建体组成的dCas9-VPR的DNA序列。通过GeneART合成序列并将其克隆到标准克隆载体中。这些载体直接用于以下实验。
确定人类OCT4转录激活的gRNA组合
用瞬时Cas9-VPR和gRNA编码载体的各种组合(参见表1)转染HEK293T细胞。使用Lipofectamine试剂将质粒共转染到HEK293T细胞中。转染后48小时收获细胞团。纯化总RNA并进行qRT-PCR以检测hOCT4mRNA的内源水平。
表1：用于确定用于HEK293T细胞中hOCT4转录激活的最佳gRNA组合的转染
| 条件编号 | 描述 | 质粒比例(μg) |
| 1-3 | dCas9-VPR，无gRNA | 1∶0 |
| 4-6 | dCas9-VPR 18+20gRNA | 1∶1(0.5的各gRNA) |
| 7-9 | dCas9-VP64 15-21gRNA | 1∶1(0.11的各gRNA) |
通过用两种gRNA(18+20)或七种gRNA(15-21)共转染的dCas9-VPR产生高水平的hOCT4mRNA(分别约360倍和约1380倍，参见图1)。对照iPSC细胞中人POU5F1/OCT4mRNA的内源水平比基线高约5900倍。尽管使用7种gRNA(15-21)检测到更高水平的hOCT4mRNA，但是大尺寸的质粒可能影响未来重编程实验中的转染效率。因此决定使用两种gRNA(18+20)的组合来产生用于重编程实验的附加型CRISPR载体。
生成用于激活内源人POU5F1/OCT4基因转录的附加型CRISPR载体
通过将由GeneArt合成的dCas9-VPR和gRNA 18+20克隆到pCE附加型载体(pCE-dCas9-VPR-OCT4)中，产生用于hOCT4转录活化的附加型CRISPR载体。另外，产生表达dCas9-eGFP融合蛋白的载体作为转染对照(pCE-dCas9-eGFP)。使用免疫荧光分析和qRT-PCR在HEK293T细胞中验证附加型载体pCE-dCas9-VPR-OCT4的功能。在具有瞬时dCas9-eGFP和附加型pCE-dCas9-eGFP载体的HEK293T细胞中实现了类似的转染效率(图2A)。用附加型和瞬时CRISPR-hOCT4载体实现HEK293T细胞中hOCT4的类似活化(图2B)。在以下实验中直接使用了附加型dCas9-eGFP和pCE-dCas9-eGFP载体。
通过CRISPR介导的内源人OCT4基因转录的激活来拯救重编程
为了证明CRISPR技术可用于替代人细胞重编程中的外源性OCT4，使用编码dCas9-VPR和用于hOCT4激活的gRNA的附加型载体(pCE-dCas9-VPR-OCT4)以及编码SOX2，KLF4，LIN28和L-MYC的附加型OKITA载体(包括oriP/EBNA-1的载体；Okita等，Stem Cells 31：458-466(2013)；Okita等，Nature Methods 5：409-412(2011))(无pCE-hOCT3/4的OKITA组)重编程两种类型的人体细胞，人***成纤维细胞(HFF)和外周血单核细胞(PBMNC)。作为CRISPR介导的重编程的阳性对照，体细胞用编码OCT4，SOX2，KLF4，LIN28和L-MYC的附加型OKITA载体转染(完全OKITA组)。通过使用Lonza 4D NucleofectorTM(项目EO-115)和LonzaP3Primary Cell 4D-NucleofectorTM试剂盒，用各质粒组合核转染体细胞，完成核转染。
表2：通过CRISPR介导的内源hOCT4基因转录激活来拯救重编程
使用上述转染程序，通过重编程HFF和PBMNC产生人诱导型多潜能干细胞(iPSC)。重编程效率由集落计数确定(参见图3A)。一般而言，与HFF相比，PBMNC获得更高的重编程效率。与使用完全Okita组进行重编程相比，使用pCE-dCas9-VPR-OCT4(CRISPR-OCT4)载体的重编程在HFF和PBMNC中都较低(分别为约4倍和约2.5倍，参见图3B)。这些结果表明，在缺乏外源OCT4的情况下，通过CRISPR的内源OCT4激活可以“拯救”重编程。
手动挑选使用CRISPR技术重编程HFF和PBMNC产生的iPSC集落并繁殖5-6代。随后根据细胞形态学，多潜能标志物表达和多谱系分化潜力来表征这些iPSC克隆。HFF和PBMNC衍生的iPSC克隆(分别为HFF-iPSC和PBMNC-iPSC)显示出类似hESC的形态，生长为扁平集落，具有大的核质比，确定的边界和显著的核(参见图4A)。HFF-iPSC和PBMNC-iPSC表达关键多潜能标志物，如OCT4，SSEA4，NANOG和TRA-1-81(参见图4A)。如HFF-iPSC的示例所示，由CRISPR介导的重编程产生的iPSC可以针对胚胎体(EB)并分化成三个胚层(外胚层，中胚层和内胚层)的细胞，如Pax-6，SMA和Sox 17的表达所示(参见图4B)。
除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明领域普通技术人员通常所理解的同样含义。尽管可以任何组合物、方法、试剂盒和手段来传播与本文所述的类似或等价的信息，来实施本发明，本发明描述了优选的组合物、方法、试剂盒和传播信息的手段。
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Claims (46)
1.一种核重编程哺乳动物体细胞的方法，所述方法包括：使哺乳动物体细胞的群与激活多潜能因子基因表达的合成转录因子在足以将所述哺乳动物体细胞重编程为诱导型多潜能干细胞(iPSC)的条件和时间段下接触。
2.一种核重编程哺乳动物体细胞的方法，所述方法包括：使哺乳动物体细胞的群与激活多潜能因子基因表达的合成转录因子在足以将所述哺乳动物体细胞转分化为与所述哺乳动物体细胞的细胞类型不同的靶细胞的条件和时间段下接触。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞是人细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞是成纤维细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述哺乳动物体细胞是原代血细胞。
6.如权利要求5所述的方法，其中所述血细胞是外周血单核细胞(PBMC)或脐带血单核细胞。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述合成转录因子包含：
(a)包含DNA结合区段和多肽结合区段的至少一种引导RNA，其中所述DNA结合区段结合多潜能因子基因的启动子区域；和
(b)至少一种转录调节剂，其结合所述引导RNA的所述多肽结合区段。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述多潜能因子基因选自oct3/4、sox2、klif、c-myc、lin28、nanog、glis-1、bcl2和bclx。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述多潜能因子基因选自oct3/4、sox2、klif、c-myc、lin28和nanog。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述多潜能因子基因是oct3/4。
11.如权利要求7至10中任一项所述的方法，其中所述转录调节剂包含酶促失活的Cas9多肽(dCas9)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述dCas9与转录激活结构域融合。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述转录激活结构域是VP64或p65。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括使所述哺乳动物体细胞的群与阻抑第二多潜能因子基因表达的第二合成转录因子接触。
15.如权利要求14所述的方法，其中被抑制的第二多潜能因子基因选自p19Arf、p16Ink4a、ROCK、PKA/PKG/PKC家族激酶基因，以及当被阻抑时抑制mTOR途径的基因。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述第二合成转录因子包含第二转录调节剂，所述第二转录调节剂包含与转录抑制子结构域融合的dCas9。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述转录抑制子结构域是KRAB。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与编码所述合成转录因子的至少一个表达载体接触。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述表达载体是非病毒的附加型载体。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与编码所述引导RNA和所述转录调节剂二者的表达载体接触。
21.如权利要求18或19所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与编码所述引导RNA的第一表达载体和编码所述转录调节剂的第二表达载体接触。
22.如权利要求7至17中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与转录调节剂多肽接触。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与转录调节剂多肽接触，并进一步与分离的gRNA核酸接触。
24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与至少三种合成转录因子接触，每种靶向不同的基因。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与下述接触：
(i)与转录激活结构域融合的dCas9；
(ii)包含与哺乳动物oct3/4基因的启动子区域的至少一部分互补的DNA结合区段的gRNA，
(iii)包含与哺乳动物sox2基因的启动子区域的至少一部分互补的DNA结合区段的gRNA，和
(iv)包含与哺乳动物klf4基因的启动子区域的至少一部分互补的DNA结合区段的gRNA。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与激活四种不同多潜能因子基因表达的至少四种合成转录因子接触。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：培养所述iPSC或所述靶细胞。
28.一种核重编程哺乳动物原代体细胞的方法，该方法包括：使哺乳动物原代体细胞的群与以下接触：
(a)至少一个引导RNA，其包含(i)与多潜能因子基因的启动子区域的一部分互补的DNA结合区段，和(ii)多肽结合区段；和
(b)至少一种转录调节剂，其包含：
(i)能够与所述引导RNA的所述多肽结合区段结合的dCas9；和
(ii)选自转录激活结构域和阻抑物结构域的功能结构域，
所述接触在足以将哺乳动物体细胞原代细胞重编程为诱导型多潜能干细胞(iPSC)的条件和时间段下进行。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述转录激活结构域是VP64或p65。
30.如权利要求28所述的方法，其中所述多潜能因子基因选自oct3/4、sox2、c-myc、klf4、nanog和lin28。
31.如权利要求28所述的方法，其中所述哺乳动物原代体细胞是人原代细胞。
32.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括：使所述哺乳动物体细胞的群与至少一种外源重编程因子接触。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述外源重编程因子选自Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Lin28、Nanog和SV40大T抗原及其组合。
34.如权利要求32或33所述的方法，包括：使所述哺乳动物体细胞的群与编码所述外源重编程因子的表达载体接触，或使所述哺乳动物体细胞的群与细胞渗透性外源重编程因子多肽接触。
35.如权利要求1-34中任一项所述的方法产生的iPSC群体。
36.如权利要求35所述的iPSC群体，其基本上不含表达载体成分。
37.一种药物组合物，其包含权利要求35所述的iPSC和药学上可接受的运载体。
38.一种治疗患者中适用干细胞疗法的疾病的方法，该方法包括给有此需要的患者施用治疗有效量的权利要求37所述的药物组合物。
39.一种组合物，其包含哺乳动物原代体细胞的群、至少一种引导RNA和结合所述引导RNA的至少一种转录调节剂。
40.一种用于实施前述权利要求中任一项所述的方法的试剂盒。
41.鉴定候选多潜能因子基因的筛选方法，所述方法包括：
(a)使哺乳动物体细胞的群与以下接触：
(i)至少一个候选引导RNA，其包含与候选多潜能因子基因的部分启动子区域互补的DNA结合区段；和多肽结合区段；和
(ii)至少一种转录调节剂，其结合所述候选RNA的所述多肽结合区段，
所述接触在足以将所述哺乳动物体细胞重编程为诱导型多潜能干细胞(iPSC)的条件和时间段下进行，从而形成测试细胞的群，和
(b)培养所述测试细胞，
其中所述候选多潜能因子基因不选自oct3/4、sox2、klf4、c-myc、lin28和nanog。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述测试细胞在培养时形成iPSC的一个或多个集落。
43.如权利要求41所述的方法，其特征在于，还包括：测量重编程效率。
44.如权利要求41所述的方法，其中所述哺乳动物体细胞的群与候选gRNA的文库接触，其中所述文库内的基本上各候选gRNA包含不同的DNA结合区段。
45.如权利要求41-44所述的方法，包括：使所述哺乳动物体细胞的群与编码所述合成转录因子的至少一种表达载体接触。
46.如权利要求41-45中任一项所述的方法，还包括：使所述哺乳动物体细胞的群与至少一种外源性重编程因子接触。
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