CN110760465B - 一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌ZD‑708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT‑10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD‑708菌株，在ZD‑708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰***对pKS1质粒的剪切修饰已失效。该菌株发酵培养获得的中性蛋白酶酶活为20200‑21930U/ml，上清中的蛋白含量为95‑100mg/mL，所表达的蛋白酶活水平高，大大降低了生产成本，拓宽了酶的应用领域。

Description

一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株可整合且高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术：

随着生物技术的发展，为了降低生产成本、拓展作用条件及范围，满足市场多样化产品的需求，需要开发或者优化出多株针对不同产品的，产酶活力高、生产稳定性好、适应强的生产菌株。由于多个新菌株的开发耗时较长，且往往是多个品种的酶产品由同一类的菌株来生产，因此，利用同一类表达***的菌株，生产多个不同的酶产品，会使生产研发的速度加快，紧跟市场瞬息万变的行业动态，最大限度度的满足市场的各种需求。例如毕赤酵母的表达***，枯草芽孢杆菌的表达***，地衣芽孢杆菌的表达***等等。

解淀粉芽孢杆菌为芽孢杆菌属，是美国食品和药品管理局公认的安全微生物。从上世纪60年代开始就有报道，2007年公布的解淀粉芽孢杆菌FZB42的全基因组序列，使人们更深入的认识了解解淀粉芽孢杆菌。该菌不污染环境，在自然界分布广泛，易分离培养，且生长快，稳定性好，目前已广泛用于酶制剂生产。

DNA同源重组的方法敲除目的基因，即设计目的基因两边相邻的基因片段并连接在一起，通过转化宿主细胞，在宿主内通过此相邻片段与目的基因两边相同片段的交换重组，完成对目的基因的敲除。在此敲除过程中，载体、转化方法和筛选标记的选择对建立一个高效稳定的操作体系产生重要影响。

温敏型质粒是一类可以在特定温度下可以自主复制，而高于特定温度时无法自主复制的质粒。同时温敏型质粒将质粒转化入宿主细胞和在宿主细胞中发生同源重组的两个过程分开进行，极大的提高了敲除的成功率，特别是对于解淀粉芽孢杆菌这种难转化的细菌类型。温敏型质粒例如pE194和pKS1等，其中pE194使用的时间最早，最广泛，但质粒本身较大，转化难度相对较大，且在使用过程中，在一些菌株中会出现对温度不敏感的情况，当温度升高至40度时，仍有部分细胞中的质粒会保持游离状态。pKS1在30度时自主复制，37度时停止复制，对温度的变化更为敏感。2010年Zakataeva等首次将pKS1质粒运用到解淀粉芽孢杆菌中，同时建立了解淀粉芽孢杆菌的敲除方法。

野生型解淀粉芽孢杆菌的转化率较低，且由于菌体内修饰***的限制，目前，针对解淀粉芽孢杆菌的筛选及针对其表达***改造的专利，未见报道。

发明内容：

本发明首先提供一株可高效分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciens)ZD-708(ΔGAΔEGL)，是在一株可高效产中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌LKT-10261的基础上，经过ARTP诱变后获得ZD-708菌株，在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得，并且其限制修饰***对pKS1质粒的剪切修饰已失效；

所述糖化酶基因GA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

所述纤维素酶基因EGL的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示；

解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciens)ZD-708菌株已于2019年10月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101，保藏号为CGMCC NO.18644。

本发明还提供菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)在生产中性蛋白酶中的应用。

进一步地，采用菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)发酵生产中性蛋白酶的方法如下：

将菌种按接种量5％-8％接种至发酵培养基中，置于200rpm-220rpm，35-37℃摇床中，培养80-90h。取发酵液经8000rpm，离心5min，测定上清的中性蛋白酶酶活为20200-21930U/ml，经测定上清中的蛋白含量为95-100mg/mL。

发酵培养基组成为：麦芽糊精32g/L，玉米粉14g/L，豆饼粉12g/L，酵母粉2.3g/L，Na₂HPO₄4.4g/L，KH₂PO₄5.1g/L，碳酸钙1％，pH7.0。

菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)可在25-65℃，pH4.5-8.5的条件下生长；其最适的生长温度为30-48℃，最适生长pH5.0-8.0。运用该菌种较宽的温度和pH适应性，可高效表达各种酸性、碱性、高温和低温不同特性的酶制剂，且利用该菌株表达普鲁兰酶时，蛋白表达水平可达到95-118mg/mL，能大幅度的降低生产成本，促进所表达的酶制剂在更多行业中的应用。

本发明还提供菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)在作为高效分泌表达外源蛋白表达***中的应用；

进一步地，可通过替换菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)中的中性蛋白酶基因APR，来实现目标产物的表达；

所述中性蛋白酶基因APR的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

有益效果：

利用本发明所构建的解淀粉芽孢杆菌ZD-708(ΔGAΔEGL)经过突变后其限制修饰***对pKS1质粒的剪切修饰已失效，作为中性蛋白酶的生产菌株可高效分泌表达中性蛋白酶，发酵培养中获得的中性蛋白酶酶活为20200-21930U/ml，经测定上清中的蛋白含量为95-100mg/mL，所表达的蛋白酶活水平高，大大降低了生产成本，拓宽了酶的应用领域，加速了相关行业新旧动能的转换，促进了相关行业经济的高质量发展。

附图说明：

图1 16SrRNA的PCR产物的电泳检测

其中，M为Marker，1为样品；

图2质粒pKS1的部分图谱；

图3糖化酶基因敲除的电泳检测

其中，M为Marker，1为样品；

图4纤维素酶基因敲除的电泳检测

其中，M为Marker，1为样品；

具体实施方式：

以下通过具体实施案例对本发明做详细说明，具体实施案例仅为举例说明，不作为对本发明实施范围的限定。

实施例1中性蛋白酶高产菌株的筛选及鉴定

1、菌株初筛

采集沂水县食品工业园区土样，并将采集到的土样用研钵研细；取5g研细的土样放入装有95ml无菌水的大三角瓶中充分震荡，得到土壤悬浮液；将所述土壤悬浮液梯度稀释，得到不同浓度的土壤悬浮液；选择浓度为10^-6、10^-7和10^-8的土壤悬浮液，取100μl加入SX培养基平板上，并涂布均匀，37℃的培养箱中培养1-3天；挑选有透明圈且大的单菌落再次划线于SX培养基平板上，进行二次确认和分离纯化，37℃，培养1-3天，得到分离纯化后的单菌落，取单菌落接种于装有5mLSX液体培养基的试管中，置于摇床中37℃，200rpm，培养1-2天，取菌悬液1mL和灭菌后的40％甘油1mL于5mL离心管中，置于-20℃的冰箱中保存备用。

平板筛选的SX培养基组成为：胰蛋白胨15g/L，酵母浸粉5g/L，氯化钠0.5g/L，氯化钾0.12g/L，氯化钙0.15g/L，硫酸镁2.2g/L，葡萄糖3.6g/L，脱脂奶粉1.7g/L，磷酸二氢钾1.2g/L，磷酸氢二钠0.96g/L，琼脂粉10g/L，pH7.0。

液体SX培养基为上述培养基中不加琼脂粉。

2、菌株的复筛

取冻存菌株，划线于SX培养基平板上，37℃，培养1-3天，用接种针取平板上透明圈较大的单菌落接种于装有10mLSX液体培养基的试管中，置于摇床中37℃，200rpm，培养1-2天，接种于24孔深孔板中进行高通量的复筛，其装液量为每孔3mL，接种量10％，置于摇床中37℃，200rpm，培养1-2天。

深孔板复筛采用的培养基组成为：麦芽糊精20g/L，蛋白胨14g/L，酵母粉3g/L，Na₂HPO₄3g/L，KH₂PO₄4.2g/L，pH7.0。

从15326株的菌株中，经复筛筛选到一株酶活最高的菌株编号LKT-10261，产中性蛋白酶酶活达到8000U/mL。

3、酶活的测定

用福林(Folin)法测定(参照《中华人民共和国专业标准》GB/T28715-2012蛋白酶活力测定方法)，其原理是蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸(如：酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生产钼蓝与钨蓝，用分光光度计于波长680nm下测定溶液的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算产品的酶活力。

酶活定义：在一定温度(40℃±0.2℃)和相应的pH条件下(酸性蛋白酶pH3.0，中性蛋白酶pH7.2)，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量，为1个酶活单位，以U表示。

4、菌株的鉴定

采用常规生理生化反应与16SrRNA技术对上述筛选得到的酶活最高菌株LKT-10261进行鉴定。本发明实施例采用上海生工生物所产基因组提取试剂盒提取本菌株中的基因组。附图1示出了对菌株LKT-10261进行16SrRNA的PCR鉴定时，PCR产物的电泳图。PCR产物由上海生工公司进行测序，并进一步用法国生物梅里埃细菌鉴定仪(参照《常见细菌鉴定手册》)，理化特征如表1所示，最终确定菌株LKT-10261为解淀粉芽孢杆菌，本菌株菌落呈白色，透明，椭圆形，边缘整齐，表面呈凸起球状。

表1.LKT-10261的主要生物学特征

实施例2菌株的诱变及不产芽孢且酶活水平提高菌株的筛选

1.菌悬液的制备

取冻存菌株LKT-10261，划线于SX培养基固体平板上，37℃，培养1-3天，用接种针取平板上透明圈相对较大的单菌落接种于装有100mLSX液体培养基的三角瓶中，置于摇床中37℃，200rpm，培养1.5天，吸取上述种子液40mL于离心管，8000rpm离心5min，弃上清，菌体以30mL生理盐水清洗。相同条件离心2次，沉淀的菌体以10mL无菌水重悬即为菌悬液，菌悬液浓度在10⁷个/mL左右。

2.常温常压等离子体诱变(ARTP诱变)

吸取10μL菌悬液于载片上，用镊子将载片放于ARTP诱变***操作室旋转台上，缓慢调节升降台旋钮(参考升降台标尺)将载片与发生器间距调至约为1.6mm，诱变照射时间选择8s、12s、15s、17s。诱变完成后，将载片移至分装有1mL生理盐水的EP管中，用漩涡振荡器摇匀后进行适当稀释。取100μL涂布于SX培养基平板上，37℃的培养箱中培养1-3天；选透明圈大的单菌落，进一步摇瓶筛选。

3.摇瓶筛选不产芽孢且酶活水平高的诱变菌株

用接种针取平板上透明圈相对较大的单菌落接种于装有100mLSX液体培养基的三角瓶中，置于摇床中37℃，200rpm，培养1.5天。取5ml接种于摇瓶筛选培养基，置于摇床中37℃，200rpm，培养3天，测定酶活前图片镜检，若不产芽孢则测定酶活水平。筛选得到产酶水平明显提高且不产芽孢的3株诱变菌株的摇瓶酶活水平如下：

诱变菌株	三次平均酶活水平
		ZD-10916	17427
ZD-708	16960
		ZD-6628	13718

摇瓶筛选培养基组成为：麦芽糊精40g/L，玉米粉15g/L，豆饼粉14g/L，酵母粉2g/L，Na₂HPO₄4g/L，KH₂PO₄5g/L，碳酸钙2％，pH7.0。

所筛选到的不产芽孢诱变菌株，对后续的发酵过程有利。

实施例3 3株诱变菌株是否能进行分子遗传操作的验证

有学者(Connaughton J F,et al.Gene Analysis Techniques,1988,5(6):116-124.)提出解淀粉芽孢杆菌的限制修饰***主要是R.BamHⅠ/M.BamHⅠ***，凡是带有未甲基化修饰的GGATCC片段的DNA几乎无法转化解淀粉芽孢杆菌。而质粒pKS1上有BamHⅠ位点，见附图2，因此，若菌株的限制修饰***未受到诱变破坏，则质粒pKS1转化进入解淀粉芽孢杆菌后会被内源的BamHⅠ限制性内切酶降解，反之则转化子会在抗性平板上生长并表现出质粒上卡那和红霉素的抗性。因此，取所筛选到的上述3株诱变菌株ZD-10916、ZD-708和ZD-6628的进行质粒pKS1的转化，以验证菌株的限制修饰***对该质粒的剪切修饰是否已经失效，便于后续在该菌株的基础上进行分子操作。

3.1制备电转化感受态细胞

取上述3株诱变菌株的冻存管，分别划线于LB平板，置于37℃培养箱中，培养1-2天，挑取单菌落接种至200mLLB培养基中，于37℃摇床中，200rpm培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，将菌液在冰水浴中放置15min，在4℃环境下，用2个50mL离心管，9000rpm离心15min后去上清，全部离心完后，用冰浴中预冷的电转化缓冲液(0.7mol/L山梨醇、0.8mol/L甘露醇和12％甘油，去离子水配置)重复悬浮沉淀菌体，再次在4℃环境下，9000rpm离心15min后去上清，反复洗涤沉淀菌体5次，最后加入4ml预冷的电转化缓冲液，重复悬浮菌体后，100μL/管分装并迅速置于-70℃冰箱保藏备用。

3.2质粒pKS1的电转化验证

取制备好的上述3株菌的电转化感受态，加入1.5μL浓度为80ng/μL的质粒pKS1，重复混匀后，加入预冷的2mm电转杯中，1800V电击5ms后，立即加入1.5ml含0.6mol/L山梨醇和0.4mol/L甘露醇的SX培养基，并置于30℃，130rpm的摇床中培养3h，摇匀后取50μl菌液，涂布于含Kan(30μg/ml)的LB固体平板上，并置于30℃的培养箱中培养2天，若所涂布的LB平板上有菌落长出，则可以进行下一步的分子遗传操作。实验结果显示上述三株诱变菌株中，只有ZD-708有大量菌落长出，说明经过诱变后诱变菌株ZD-708的可进行分子遗传操作。

实施例4诱变菌株ZD-708表达***的精简优化

为进一步精简诱变菌株ZD-708的表达***，减少其他杂蛋白的分泌表达，使更多的能量流和物质流流向目的蛋白，以利于后续目的蛋白的提取，需要鉴定并删除一些非必需杂蛋白的基因。

4.1杂蛋白基因的鉴定

选取诱变菌株ZD-708的摇瓶发酵液，8000rpm，离心5min得到上清液，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，并回收3个主要条带的酶蛋白。

解淀粉芽孢杆菌所能产生的主要酶种类有：糖化酶、纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶和α-淀粉酶。

利用国标法，对上述回收的3种主要条带中的蛋白进行逐一验证，其中各个酶的国标验证如下：糖化酶参见国标GB8276-2006，纤维素酶参见国标NY/T912-2004，果胶酶参见国标NY/T912-2004，蛋白酶参见国标GB/T23527-2009，植酸酶参见国标GB/T18634-2009，α-淀粉酶参见国标GB/T24401-2009。

经过验证得出三个主要条带的酶种类分别为：中性蛋白酶，纤维素酶，糖化酶。

用上海生工的细菌基因组DNA快速抽提试剂盒，提取菌株ZD-708的基因组，并送上海生工生物进行全基因组测序。通过与其它已知解淀粉芽孢杆菌的基因组序列中的纤维素酶和糖化酶保守序列进行比对，找到本诱变菌株ZD-708基因组序列中的纤维素酶和糖化酶基因序列。

4.2杂蛋白基因的无痕删除

4.2.1同源臂引物的设计

根据诱变菌株ZD-708基因组序列中，纤维素酶和糖化酶基因序列的上下游700bp-100bp范围的序列，设计扩增这两个基因的上、下游同源臂引物。同时在引物上添加KpnⅠ和NotⅠ酶切位点以及保护碱基，设计的引物如下：

扩增糖化酶基因(GA基因)上、下游同源臂片段的两对引物GA-S1/GA-X1和GA-S2/GA-X2；此对引物扩增出的上、下游同源臂片段名称分别为GA-S(上游同源臂)和GA-X(下游同源臂)；将上述两个同源臂片段融合在一起的引物为GA-S1和GA-X2，融合片段的名称为GA-S-X；引物YZ-1和YZ-2为验证GA基因是否敲除的引物，若能扩增出GA基因片段则未敲除，若不能扩增出GA基因片段，则敲除成功。

扩增纤维素酶基因(EGL基因)上、下游同源臂片段的两对引物EGL-S1/EGL-X1和EGL-S2/EGL-X2；此对引物扩增出的上、下游同源臂片段名称分别为EGL-S(上游同源臂)和EGL-X(下游同源臂)；将上述两个同源臂片段融合在一起的引物为EGL-S1和EGL-X2，融合片段的名称为EGL-S-X；引物YZ-3和YZ-4为验证EGL基因是否敲除的引物，若能扩增出EGL基因片段则未敲除，若不能扩增出EGL基因片段，则敲除成功。

具体的引物序列如下表所示：

4.2.2同源臂的扩增

分别用上述4对引物，以试剂盒提取出的诱变菌株ZD-708基因组为模板，进行不同同源臂的扩增。具体的反应体系如下：

所用PCR反应体系为50μL，如下所示。

成分	体积
		ddH2O	32.0μL
10×PCR Buffer	5.0μL
		dNTP(2.5mmol/L)	5.0μL
上游引物(10mmol/L)	2.0μL
		下游引物(10mmol/L)	2.0μL
菌株ZD-708基因组	2.0μL
		Taq DNA聚合酶(5U/μL)	2.0μL

采用的退火温度为55-65℃。以56℃为例，其反应程序如下。

将扩增得到的同源臂片段经核酸电泳验证后，用切胶回收试剂盒(购自上海生工生物)回收得到4条同源臂片段分别为GA-S/GA-X/EGL-S/EGL-X。再分别以GA-S和GA-X互为模板，以GA-S1和GA-X2为引物，进行融合PCR，具体反应体系如下：退火温度为67℃。

成分	体积
		ddH2O	32.0μL
10×PCR Buffer	5.0μL
		dNTP(2.5mmol/L)	5.0μL
GA-S1(10mmol/L)	2.0μL
		GA-X2(10mmol/L)	2.0μL
GA-S同源臂片段	1.0μL
		GA-X同源臂片段	1.0μL
Taq DNA聚合酶(5U/μL)	2.0μL

同理，以EGL-S和EGL-X互为模板，以GA-S1和GA-X2为引物，进行融合PCR。

4.2.3融合片段与T载体的连接

将上述得到PCR产物跑核酸电泳，经切胶回收试剂盒(购自上海生工生物)得到2条同源臂融合片段，将纯化回收的2条同源臂融合片段、pMD19-T simple vector(购自上海生工生物)和Solution I(购自上海生工生物)按照4.5:0.5:5的体积比添加到连接体系中，于16℃下反应1h-6h。化转入E.coliTop10的感受态细胞(购自上海生工生物)中，经过蓝白斑筛选后，进一步经测序验证，得到分别含有两个基因同源臂融合片段的克隆质粒，分别命名为T-GA-S-X和T-EGL-S-X。

4.2.4敲除质粒的构建

4.2.4.1融合同源臂GA-S-X与pKS1质粒的连接

用KpnⅠ和NotⅠ分别双酶切上述得到的克隆质粒T-GA-S-X和温敏型质粒pKS1(购自上海生工)，所用双酶切反应体系如下：

成分	体积
		克隆质粒或者温敏质粒	5.0μL
KpnⅠ	1.0μL
		NotⅠ	1.0μL
10*FastDigest	2.0μL
		ddH<sub>2</sub>O	11.0μL
Total	20.0μL

将上述得到双酶切产物跑核酸电泳，经切胶回收试剂盒(购自上海生工生物)得到都带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点粘性末端的融合同源臂片段GA-S-X和温敏型质粒pKS1的线性片段。然后将两者连接在一起，反应体系如下：

成分	体积
		线性质粒pKS1	3.0μL
融合同源臂片段GA-S-X	1.0μL
		SolutionⅠ	5.0μL
ddH<sub>2</sub>O	1.0μL
		Total	10.0μL

将所得到的连接产物化转入E.coliTop10的感受态细胞(购自上海生工生物)中，涂布含有红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于30℃培养箱中，培养15h。随机挑选抗性平板上的单菌落，接入50mL含有红霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，置于30℃摇床中，200rpm培养12h。然后用质粒提取试剂盒(购自上海生工)，提取重组质粒，此重组质粒命名为pKS1-GA，并进一步测序验证。

4.2.4.2融合同源臂EGL-S-X与pKS1质粒的连接

用KpnⅠ和NotⅠ分别双酶切上述得到的克隆质粒T-EGL-S-X和温敏型质粒pKS1(本公司保藏)，所用双酶切反应体系如下：

成分	体积
		克隆质粒或者温敏质粒	5.0μL
KpnⅠ	1.0μL
		NotⅠ	1.0μL
10*FastDigest	2.0μL
		ddH<sub>2</sub>O	11.0μL
Total	20.0μL

将上述得到双酶切产物跑核酸电泳，经切胶回收试剂盒(购自上海生工生物)得到都带有KpnⅠ和NotⅠ酶切位点粘性末端的融合同源臂片段EGL-S-X和温敏型质粒pKS1的线性片段。然后将两者连接在一起，反应体系如下：

将所得到的连接产物化转入E.coliTop10的感受态细胞(购自上海生工生物)中，涂布含有红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于30℃培养箱中，培养15h。随机挑选抗性平板上的单菌落，接入50mL含有红霉素(100μg/mL)的LB液体培养基中，置于30℃摇床中，200rpm培养12h。然后用质粒提取试剂盒(购自上海生工)，提取重组质粒，命名为pKS1-EGL，并进一步测序验证。

4.2.5糖化酶基因GA的敲除

4.2.5.1诱变菌株ZD-708电转化感受态的制备

同实例3.1中感受态的制备流程。

4.2.5.2重组质粒pKS1-GA的电转化

取100μL诱变菌株ZD-708电转化感受态，加入1.5μL浓度为80ng/μL的重组质粒pKS1-GA，重复混匀后，加入预冷的2mm电转杯中，1800V电击5ms后，立即加入1.5ml含0.6mol/L山梨醇和0.4mol/L甘露醇的SX液体培养基，置于于30℃摇床中，200rpm培养6h，然后取100μL涂布于红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于30℃培养箱中，培养15h。挑取在抗性平板上长出的单菌落，接种到50mL无抗性的LB液体培养基中，置于37℃，200rpm的摇床中培养15h，取100μL涂布于红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，置于37℃培养箱中，培养15h，长出的单菌落即为发生同源重组单交换的转化子。再转接单交换的转化子到无抗性的LB培养基中，置于30℃，200rpm的摇床中培养38h，取100μL涂布于无抗性的LB平板上，置于37℃培养箱中，培养15h，随机挑选约100个单菌落转接至红霉素(100μg/mL)抗性的LB平板上，挑选在抗性平板上不长的单菌落进行菌落PCR鉴定，用引物YZ-1和引物YZ-2进行PCR扩增后，若GA基因未成功敲除则PCR产物长度在3563bp，若GA基因成功敲除则PCR产物长度在530bp。成功敲除糖化酶GA基因的菌株命名为ZD-708(ΔGA)，电泳检测糖化酶是否敲除的结果见附图3。

4.2.6纤维素酶基因EGL的敲除

将上述得到的菌株ZD-708(ΔGA)制备成电转感受态细胞，具体方法同3.1。

取100μLZD-708(ΔGA)电转化感受态，加入1.5μL浓度为80ng/μL的重组质粒pKS1-EGL，之后的操作流程同糖化酶GA基因的敲除，最后验证时菌落PCR的引物分别为YZ-3和引物YZ-4，用引物YZ-3和引物YZ-4进行PCR扩增后，若EGL基因未成功敲除则PCR产物长度在2726bp，若EGL基因成功敲除则PCR产物长度在451bp。成功敲除EGL基因的菌株命名为ZD-708(ΔGAΔEGL)，电泳检测纤维素酶是否敲除的结果见附图4。

菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)可在25-65℃，pH4.5-8.5的条件下生长；其最适的生长温度为30-48℃，最适生长pH5.0-8.0。运用该菌种较宽的温度和pH适应性，可高效表达各种酸性、碱性、高温和低温不同特性的酶制剂，能大幅度的降低生产成本，促进所表达的酶制剂在更多行业中的应用。

实施例5基因组精简后的菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)发酵生产中性蛋白酶的方法

(1)平板培养：37℃培养箱中，培养28h；

平板培养基组成为：蛋白胨8g/L，酵母粉3g/L，氯化钠2g/L，酪蛋白3g/L，硫酸镁1g/L，葡萄糖10g/L，琼脂13g/L；

(2)种子培养：置于220rpm，37℃摇床中，培养13h；

种子培养基组成为：蛋白胨4g/L，酵母粉5g/L，氯化钠4g/L，硫酸镁2g/L，葡萄糖18g/L；

(3)摇瓶发酵培养：接种量为8％，接种后置于220rpm，37℃摇床中，培养90h；

摇瓶发酵培养基组成为：麦芽糊精32g/L，玉米粉14g/L，豆饼粉12g/L，酵母粉2.3g/L，Na₂HPO₄4.4g/L，KH₂PO₄5.1g/L，碳酸钙1％，pH7.0；

摇瓶发酵完成后取发酵液经8000rpm，离心5min，测定上清中中性蛋白酶的酶活为21930U/ml，经测定上清中的蛋白含量为95mg/mL；

蛋白含量按照文献方法进行(Bradford.Anal Chem，1976)。

实施例6基因组精简后的菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)发酵生产中性蛋白酶的方法

(1)平板培养：37℃培养箱中，培养28h；

平板培养基组成为：蛋白胨8g/L，酵母粉3g/L，氯化钠2g/L，酪蛋白3g/L，硫酸镁1g/L，葡萄糖10g/L，琼脂13g/L；

(2)种子培养：置于220rpm，37℃摇床中，培养13h；

种子培养基组成为：蛋白胨4g/L，酵母粉5g/L，氯化钠4g/L，硫酸镁2g/L，葡萄糖18g/L；

(3)摇瓶发酵培养：接种量为5％，接种后置于200rpm，35℃摇床中，培养80h；

摇瓶发酵培养基组成为：麦芽糊精32g/L，玉米粉14g/L，豆饼粉12g/L，酵母粉2.3g/L，Na₂HPO₄4.4g/L，KH₂PO₄5.1g/L，碳酸钙1％，pH7.0；

摇瓶发酵完成后取发酵液经8000rpm，离心5min，测定上清中中性蛋白酶的酶活为20200/ml。

序列表

<110> 山东隆科特酶制剂有限公司

<120> 一株高效分泌表达外源蛋白的解淀粉芽孢杆菌及其应用

<130> 1

<141> 2019-11-15

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1517

<212> DNA

<213> 菌株ZD-708(ΔGAΔEGL)

<400> 1

gtgggtttaggtaagaaattgtcagtctgccgggtgttcaggcctctagtgctgtagccg 60

cttcctttatgagtttaaccagctggtgcaagaatcctcagcttaaagaaaacctgacga 120

attttgtaccgaagcagtgggtccgctgtagcggcgaattgccttctgtcagtgacaaag 180

ctatcaatgacgatacttgaaacaaaacaccaaggcaaagtccttaaaggcaatccttct 240

gaaagtgcct attgaagctg ataccgatga tctcggctac aagcacttcc gttatgtgcc 300

tgtcgtaaac ggtattaacg gtgaattaaa caacgatgtt tccgccaaaa cggcaaacag 360

caaaagtctt ctaacggaac cgttgcaaac aaaaacaaag ccgagctgaa agcagcagcc 420

acaaaaatta tgcgcaaatc aggcgctgga tcatgcttat aaagcgatcg gcaaatcacc 480

tgaagcagac ggcaaatacc gcctcgccta tgatgtaacc atccgctaca tcgaaccgga 540

acccgttatc tgggtgaaag actctcaagt cattattcac gtcgataaat ccaacaactg 600

caaactggga agtaaccgtt gatgcggaaa caggaaaaat ccttgaaaaa gcaaaacaac 660

attaaatatt tcttctgaaa gcggcaaata tgtgctgcgc gatctttcta aacctaccga 720

gtgggcatgc cgccacaacc ggaacaggta cgactcttaa aggaaaaacg gtctgctcgt 780

atccagcacc acaaaccagt ttacaacttc ttctcagcgc gctgcacacc gttgataaca 840

caaaataata cgtacgatct gcaaaaccgc gagtggagct ataacctgcc ctccgtgggg 900

cgcataacaa cctcggcaaa gtgtatgaat atttctatca gaagtataat cgcaacagct 960

acgacaataa aggcgtacaa taacgcagcc aagatcgtat ctcaatacgg cagcagatcg 1020

gcgaccaaat gatttacggt gacggcgacg gttgaattcc atgaagattc ttctcaccta 1080

tgacacatgc tttccggttc aatggacgta accgctcgtt acacaggtct gatgaaacag 1140

ccaacctgaa ctacgaaaat cgggcgcttt aagcttacgc aacattctat tcgggtactt 1200

caacgatact gaggactggg atatcggtga agatagtcag ggacagccag ccggctctcc 1260

gcagcttatc caatccggcg tatgacaggg catacaaaca ttacaaaaat cgcggaatcc 1320

cgaacaaagc cgcttacaat atcaacgagg cgtgaacaaa gcggagcaga tttactatcg 1380

tgctctgacg gtatacctct gtcactccgt cacttcggga ccttttaaag atgcaaaagc 1440

cgctttgatt cacaactcac gtcgacgcga ccgggctctc aagatgctag aagctgcctg 1500

gaatggtcgg attgtaa 1517

<210> 2

<211> 1222

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciensZD-708)

<400> 2

atgatccttc ttttgaagac ttatataaag ttgacagaac tgacttggaa accttcttgg 60

acaaacaaaa gaaattcaaa cgatgtatct ttatactatc ttttacaaaa cattgcttat 120

ccaggccaat ttaacacaga tggttctgca tacaccggag cttgggggag aaccagccta 180

atttaatgac ggtgttcccg gtactgttat tgcttctcca tcattttcga acagttcttt 240

ctgaactaga agataataac ttcaatacca ctttggctaa acctcaatcc ggactactat 300

taccaatgga ccagagattc cgcaattaca taaggcagtt gagtactaca ttaataccag 360

ttacaacctt caaagaacac ctaaccacaa gtggcagctt tgatgatgaa aatcataaag 420

gcttgggagg cagacacttt tttacaagct tggttcaaca gaaagccctt gcttaaaatg 480

ctgctgcttc taccctcgaa agttatttga gtggcagtga tggtgacaaa actcctagac 540

aaggtctaga ttcagccact tatattggcc cacttttgga tttgttaata ctgatgttaa 600

ccacattgtt gaaaacccag atttgcttgt taacagtgct tattctgctg gtgcagctat 660

tggcagatac ccagaagaca gtatgttttg caatcatatt acttgttatt ggaggataat 720

aaagacagat actgacgcaa aatgatggtc ctgctttgag agcttatgca tcaaaccaga 780

cttcaaggaa tatgttatag ggtactggga ttctactggg tttgatcttt gggaggaacc 840

caaactcatg atattggcga aagcagctca actccatttg atgttgacaa tgtaatgaca 900

ttaccattaa caagattaac tacgattttt ttaacaagta tatggctcat tgtgtttaca 960

atggtgatgg ttcatctgaa ggcaatccat ggtttttagc taccctatgc tgcccaagtt 1020

ccatacaaac ttgtttatga tgcaaagtct gcctcatgat gattcttttt gcaagtcatt 1080

ttggatcata ttaatgatgc gaatgaacaa cttaacagaa ataccggtta ttccaccagt 1140

gcctactctt ttatgacaac tggagcagtg gtgctcttct tgaagctatt agacttagaa 1200

ataaggtcaa ggctttggct aa 1222

<210> 3

<211> 1203

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacilluse amyloliquefaciensZD-708)

<400> 3

atgaaacggt caatccttgc tactattttt attacgtgtt tattgattgc ggtattgaca 60

atgggcggca agatgccttc gccggcatca gcagcaggga caaaaacgcc agtagcaaag 120

cggatacaac tgaaagggat cagttcacat ggattgcaat ggtatggcga atgggtcagc 180

ttagcataaa aggtacacaa cttgtaaacc aagacggcat ttcgtcaata aagacagctt 240

aaaatggctg agagacgatt ggggcatcac cgttttccgc gcggcaactg tatacggcag 300

acggcggtta tattgacaac ctcatttatg aaattgcaaa tgaaccaaac ggtgacgtga 360

actggaagcg tgatattaca accgtatgcg gaagaagtga tttccgttat ccgcaaaaat 420

gaccccgaca atcccatcat tgtcggaacc ggtacatgga gccaggatgt gaatgatgct 480

gccgatgacc agctaaaaga tgcaaacgtc atgtacgcgc ttcattttta tgccggcaca 540

cacggccaat ctttacggga taaagcaaac tatgcactca gtaacaggag cgcctatttt 600

cgtgacggaa tggggaacaa gcgggtgaac tggaatcttt ctgataagca ggaatcatcc 660

tcagcgttaa agcctggagc atctagaaaa cattcgcagc aacaaagatt caacgaagga 720

cgcccctgaa acgccaaaac aggcggctgg ccgctgtcag atttaactgc ttcaggaacc 780

ttcgtaagag cacaagataa tcccacacag gaaaaaggcg tttctgtaca atacaaatgc 840

aggggatggg agtgtgaaca gcaaccaaat ccgcccgcag cttcacataa gatacctatc 900

tggaactggg gtttaaaaaa ggaacactgt caccgggagc aagcaaaaat aacgggaata 960

cgacggttga tttaaaagaa tgtcactgcc cgttactggt ataacgcgaa aaacaaaggc 1020

caaaactttg actgtgacta cgcgccacag ggaatattca gcttcgtctt cacaacgatg 1080

actggagcaa ttatgcacat taaaacaacg aaaaagcggc gattattcca ttttgggttt 1140

tccaatcaaa tacgtaaaat cacattatat catcaaggaa aactgagaac agaacccaat 1200

taa 1203

Claims (5)

1.一株分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，该菌株具体为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZD-708∆GA∆EGL，是在ZD-708菌株基础上敲除糖化酶基因GA和纤维素酶基因EGL所得；

所述ZD-708菌株，保藏号为CGMCC NO.18644；

所述纤维素酶基因EGL的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.如权利要求1所述的分泌表达中性蛋白酶的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于，所述糖化酶基因GA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

3.权利要求1所述菌株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ZD-708∆GA∆EGL在生产中性蛋白酶中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，发酵生产中性蛋白酶的方法如下：将菌种按接种量5%-8%接种至发酵培养基中，置于200rpm-220rpm，35-37℃中，培养80-90h；发酵液上清的中性蛋白酶酶活达到20200-21930U/ml。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，发酵培养基组成为：麦芽糊精32g/L，玉米粉14g/L，豆饼粉12g/L，酵母粉2.3g/L，Na₂HPO₄4.4g/L，KH₂PO₄5.1g/L，碳酸钙1%，pH7.0。

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