JPH06501705A - 抗−腫瘍抗体及び生物学的活性剤の組合せによる相乗治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗−腫瘍抗体及び生物学的活性剤の組合せによる相乗治療発明の分野 本発明は、疾病の処理、たとえば化学療法への抗体療法及び生物学的活性剤の組 合せの使用に関する。腫瘍担持哺乳類が、抗−腫瘍抗体及び化学療法による処理 から成る組合された手段により処理される場合、有意に高い緩解を達成する驚く べき発見に一部基づかれている。本発明の方法は、腫瘍細胞を効果的に根絶する ために外因性化合物と接触して作用する免疫システムを配置するためのユニーク な手段を提供する。

発明の背景 層重１１七１すＣ８紐」１１血生 腫瘍細胞は、それらの正常な細胞性相当部分上に不在するか又は少量で存在する ある抗原を発現する。それらのほとんどは、腫瘍及びある胚細胞により共有され る分化抗原である。！！瘍において十分な選択性を伴なって出現するい（つかの 抗原は、治療剤のための可能な標的として作用することができる。これは、この 報告（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍａｎｄ　［ｌｅｌｌｓｔｒｏｍ、Ａｃｃｏｓ　１ｉｓ ｈ　５ｃｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ−１９８４Ｐｒ１ｚ ｅＹｅａｒ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｏｔｏｒｓ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ 　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ＋Ｊ、Ｇ、Ｆｏｒｔｎｅｒ　＆Ｊ、Ｅ、Ｒｈｏａｄｓ、 ｅｄｓ、＋Ｊ、Ｂ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ　Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐｈ１ｌａｄｅｌ ｐｈｆａ　１９８５＋２１６〜２４０ページ）においてほとんど研究されたヒト 腫瘍の１つである悪性黒色腫、及び他の腫瘍（Ｂｕｒｃｈｅｌｌ　ａｎｄ　Ｔａ ｙｌｏｒ−Ｐａｐａｄｉｓｉｔｒｉｏｕ＋ＲＪ、Ｂａｌｄｗｉｎ　ａｎｄ　Ｖ、 Ｓ、Ｂｙｅｒｓ、ｅｄｓ、、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｆｅｓ　 ｆｏｒＴｕｍｏｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｒｕ　Ｔａｒ　ｅｔｉｎ　 ＋Ａｃａｄｅｓｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、１９８５．１〜１５ベージｉ　Ｋｅｍｓｈｅ ａｄ、　Ｍ、２８１〜３０２ページ）のために最近、再調査された。

多くの抗体が、正常な組織によりもヒト腫瘍により、より多量に発現される細胞 表面抗原に対して製造された。細胞表面抗原に対する抗体は、補体の存在下で腫 瘍細胞に対して細胞毒性であり得（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍなど、、１９６２．Ｐｒ ｏｇ、Ａｌｌｅｒｇｙ　９：１５８〜２４５）、そしていくつかの抗体は抗体依 存性細胞性細胞毒性を仲介できる（Ｐｅｒｌｍａｎｎなど、。

１９６９、Ａｄｖ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、土）　：１１７〜１９３；　ＭａｃＬｅｎ ｎａｎなど、＋　１９６９＋Ｉｍ＋＊ｕｎｏｌ。

１７：８９７〜９１０；　５ｋｕｒｚａｋなど、、　１９７２．Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、　臣：９９７〜１００２；Ｐｏ１ｌａｃｋなど、、　１９７２．　Ｉｎｔ 、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ、　９　：３１６〜３２３）ことがまた、十分に確立されて いる。最初の場合においては、適切な補体ＲＣ一般的にウサギ又はテンジクネズ ミ）、及び後者の場合においては、エフェクター細胞源（一般的にはマウス起源 の）が必要とされる。

腫瘍関連抗原に対する抗体がヒトエフェクター細胞の存在下でヒト腫瘍細胞を殺 害できることが見出され（Ｈｅ１１ｉｔｒｏ−など、、１９８１．Ｉｎｔ。

Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　２７：２Ｂ１〜２８５）、そしてそのような抗原に対する抗 体が補体源としてヒト血清の存在下で腫瘍細胞を殺害できることが見出された（ Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍなど、、１９８５．Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、８２：　１４９９〜１５０２；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍなど、＋１９８５＋Ｍｏｎ ｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐ ｙ＋ＵＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉａ　ｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ ｌｕｌａｒ　Ｂｔｏ１ｏｇｙ＋第２７ｔＬ、　１４９〜１６４ページ、Ａｌａｎ 　Ｒ０Ｌｉｓｓ＋Ｉｎｃ、＋ＮＹ）。

抗癌剤を調製するための興味あるアプローチは、放射性同位体による抗体のラベ リング（Ｌａｒｓｏｎなど、＋１９８３．Ｊ、Ｃ１１ｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、　７２ ：２１０１〜２１１４；０ｒｄｅｒ、１９８４．Ｃｏｍｐｒ、Ｔｂｅｒａｐｙ　 １０：９〜１８；　Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏなど。

１９８４、Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　Ｒｅｐｏｒｔｓ　６８：３１７ 〜３２８；ｄｅ　Ｎａｒｄｏなど、　、　１９８５゜Ｉｎｔ、Ｊ、Ｒａｄｉａｔ ｉｏｎ　Ｏｎｃｏｌｏｇｙ　Ｂｉｏｌ、Ｐｈｙｓ、　１１：３３５〜３４Ｂ）、 又はトキシン（Ｊａｎｇｅｎなど、＋１９８２．１ｇ＋ｎｕｎ＋：＋１．Ｒｅｖ 、　６２：１８５〜２１６；Ｖｉｔｅｔｔａ　ａｎｄ　Ｕｈｒ。

１９８４、　Ｔｊａｎｓｐｌａｎｔ、３７：５３５〜５３Ｂ）又は抗癌薬（Ｇｈ ｏｓｅなど、、１９７２．Ｂｒ１ｔ。

Ｍｌｌｄ、Ｊ、ｉ：４９５〜４４９；　Ｈｕｒｗｉｔｚなど、、１９７５．Ｃａ ｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、３５：　１１７５〜１１８１；Ｒｏｗｌａｎｄなど、＋１９ ８５＋Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ、　１９：１〜７ ）への抗体の接合を包含する。前記抗体は特異性を付与し、そして前記同位体又 は薬物は腫瘍を破壊する能力を提供する。しかしながら、このアプローチの欠点 は、抗癌薬及び放射性同位体の両者が正常な組織に対して高レベルの毒性を有す る事実である。従って、種々の器官、たとえば腎臓、肝臓又は骨髄における非特 異的摂取が実質的な副作用を導びくであろう。

発明の要約 本発明は、腫瘍細胞の増殖を阻害するための化学療法への、たとえば腫瘍増殖を 処理し、そして阻害することによる疾病の処理への、生物学的活性剤の投与と抗 体療法の組合せの使用に関する。それは組合しての治療の驚くべき有効性の観察 に一部基づかれており；抗腫瘍抗体８１１９６を受けたいくつかの腫瘍担持哺乳 類は化学療法に応答して腫瘍増殖の有意に高い阻害性を達成した。ＩＩ似する腫 瘍担持哺乳類は、化学療法のみに対して有意に低レベルの応答を示し、そして抗 体のみに対してはまったく応答しなかった。

特に好ましい本発明の態様においては、抗腫瘍抗体、たとえば、好ましくはＢＲ ９６モノクローナル抗体が、哺乳類に投与され、これは続いて又は同時に、標準 の化学療法により処理される０本発明の好ましい態様においては、化学療法は抗 体処理と同時に操作される。

組合しての治療の有効性は、悪性細胞を化学療法剤の毒性効果に対してより敏感 にし、又は化学療法薬物により、相乗作用する哺乳類における免疫応答を誘発す る腫瘍部位での抗体に寄与できることが示唆される。

図面の説明 図１は、ＢＲ９６抗体又はドキソルビシン（Ａｄｒ）　、及びＢＲ９６及びＡｄ ｒの組合せによるヌードマウス（Ｂａ１ｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ雌）の処理による腫 瘍体積に対する効果を示す、ヒト肺腺癌（Ｈ２７０？）腫瘍移植物を、個々のマ ウスの右の後部側腹部中に挿入し、そしてそれらのマウスを処理グループに分け た（８匹のマウス／グループ）、対照のマウス（白丸）はＰＢＳ注射を受け；残 るマウスはＡｄｒのみ（７ｔｇ／ｋｇ／注射、黒の四角）　、ＢＲ９６のみ（黒 丸）；ＢＲ９６及び５　ｗｇ／ｋｇ／注射のＡｄｒ　（白の三角）及びＢＲ９６ 及び７　ｗｇ／ｋｇ／注射のＡｄｒ　（黒の三角）により処理された。

図２は、ＢＲ９６抗体及びミイトマイシンＣ（ＭＭＣ）により処理されたヌード マウスにおける腫瘍体積の阻害を示す、ヒト肺腺癌Ｈ２７０７腫瘍移植物をＢａ １ｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ雌マウスの右の後部側腹部中に挿入し、そしてマウスを処 理グループに分けた。対照マウス（白丸）はＰＢＳ注射を受け；残るマウスはＭ ＭＣのみ（３■／ｋｇ／注射、黒の四角）、ＢＲ９６のみ（黒丸）ＨＢＲ９６及 び２■／ｋｇ／注射のＭＭＣ（白の三角）及びＢＲ９６及び３■／ｋｇ／注射の ＭＭＣ（黒の三角）を受けた。

発明の詳細な記載 本発明は、抗腫瘍抗体及び標準の化学療法による処理を含んで成る治療手段に関 する０本発明の好ましい態様においては、抗腫瘍抗体が腫瘍細胞の表面上で抗原 と反応する。最っとも好ましい態様においては、抗腫瘍抗体はモノクローナル抗 体ＢＩ？９６である。

腫瘍細胞殺害における抗体／化学療法手段の効率を説明する義務は存在しないが 、ＢＲ９６のように内在化する、腫瘍細胞の表面に結合する抗体が、たぶん薬物 摂取を高めることによって細胞を化学療法殺害に対してより敏感にすることが推 測される。ヌードマウス以外の免疫競争個人に付与される場合、抗腫瘍抗体によ る処理は、細胞を薬物に対してより感受性にし、又は細胞を動物又は患者の免疫 応答に対してより感受性にすることによって、化学療法薬物、たとえばドキソル ビシン（アドリアマイシン）及びマイトマイシンＣを相乗する免疫応答を誘発す ることによって追加の利点を提供できる。

開示の明確さのために、本発明の詳細な記載が次のサブセクションに分けられる であろうが、但し、それは本発明を制限するものではない： （ｉ）本発明の抗体分子の特徴； （ｉｉ）モノクローナル抗体の調製；及び（ｉｉｉ）抗腫瘍抗体及び生物学的活 性剤の組合せによる腫瘍治療。

の　の 実質的にいづれかの起源の抗体が本発明に従って使用され得るが、しかし好まし い態様においては、その抗体は腫瘍関連抗原を定義する。モノクローナル抗体は 、連続したアンプル供給の利点を付与する。実際、腫瘍関連抗原によりマウスを 免疫化し、そしてそのような抗原に対しての抗体を製造するハイブリドーマを確 立することによって、多くの種類の腫瘍と反応でき、そしてそれらの腫瘍を処理 できる抗体のパネルの急速な確立を可能にできる。

ＢＲ９６抗体は、１ｇＧ３サブクラスの抗体である。その抗体は、種々の器官タ イプの癌細胞、たとえば***、肺、結腸及び卵巣の腫瘍、並びに種々の乳、肺及 び結腸癌から確立された培養細胞系に対して高い特異性を示す、さらに、ＢＲ９ ６抗体は他のタイプの腫瘍細胞、たとえばＴ−細胞リンパ腫細胞系、ＣＥＭ及び ＭＯＬＴ−４、Ｂ細胞リンパ腫細胞系Ｐ３ＨＲ−１又は黒色腫細胞系に対しての 結合性を示さない、　Ｂ［１９６抗体は、たとえば電子顕微鏡により示されるよ うに、抗原陽性腫瘍細胞にインターナリゼーションでき、それは抗原陽性腫瘍細 胞に対して毒性であり、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性を仲介し、そして驚くべきこと には、それは、十分に高い用量で適用される場合、非変性形で単独で細胞毒性で ある。ＢＲ９６抗体は、フコシル化されたＬｅ’抗原、又はそのような実物体に 密接に関連する抗原を認識するように思われる。

本明細書に使用される場合、用語“ＢＲ９６抗ぽは、完全な損なわれテイナいポ リクローナル及びモノクローナル抗体分子、たとえばハイブリドーマＡＴＣＣＮ ｃｔ　ＨＢ１００３６により生成されるネズミＢＲ９６モノクローナル抗体、及 びキメラ抗体分子、たとえばハイブリドーマＡＴＣＣＮ１１１ＩＢ１０４６０に より生成されるキメラＢＲ９６抗体を包含する。上記Ｂ［１９６抗体は、当業界 において十分に確立された技法を用いれば、抗体の活性抗原結合領域を含むその いづれかのフラグメント、たとえばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’　）ｚ　及びＦｖフラグ メントを含む〔たとえば、Ｒｏｕｓｅａｕｚなど、＋”Ｏｐｔｉｍａｌ　Ｃｏｎ ｄｉｔｉｏｎｓ　Ｆｏｒ　Ｔｈｅ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅ ａｌｙｔｉｃＦｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｆｒｏｍ　１ｌｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＩｇＧ 　ｏｆ　Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　Ｒａｔ　ＩｇＧ　５ｕｂｃｌａｓｓｅｓ″B Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　、、匪：６６３〜６６９（Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｒｅｓｓ　１９８６）　）　ｍ本発明のＢＲ９６抗体はまた、融合タンパク 質を含む。

さらに、ＢＲ９６抗体は、主要器官、たとえば腎臓、肺臓、肝臓、皮膚、肺、乳 房、結腸、脳、甲状腺、心臓、リンパ節又は卵巣からの正常なヒト組織に対して いづれかの免疫組織学的に検出可能な結合性を示さない、その抗体は末梢血液リ ンパ球と反応しない、　ＢＲ９６抗体は、扁桃腺及びコラ丸におけるいくらかの 細胞に対して制限された結合性を示し、そして膵臓における豚房細胞、及び胃及 び食道における上皮細胞に結合する。従って、ＢＲ９６抗体は、正常な細胞に比 較して、腫瘍細胞に対して高い程度の特異性において、最っとも知られた抗腫瘍 抗体よりもすくれている（たとえば、Ｈｅ１ｌｓｔｒｏ−など、。

”Ｉｓ−ｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ　Ｔｏ　Ｔｕｌ＋ｏｒ　 Ｔｈｅｒａｐｙ：ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｔｕｍｏｒ　Ｖ ａｃｃｉｎｅｓ、ａｎｄ　Ａｎｔｉ−１ｄｉｏｔｙｐｅｓ’＋７門ｏｄｉｆｉｅ ｄ　Ａｎｔｉ　ｅｎｓ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｉｎ　Ｄｉａ　ｎｏｓ ｉｓ　ａｎｄ　ＴｈｅｒａＱｕａｓｈ／Ｒｏｄｗｅｌｌ　（出版者）、１〜３９ ページ（Ｍａｒｃｅｌｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、Ｉｎｃ、、１９８９）及びＢａｇｓｈ ａｗｅ、”７ｗ＋１ｏｕｒ　Ｍａｒｋｅｒｓ−Ｗｈｅｒｅ　Ｄｏ　Ｈｅ　Ｇｏ　 Ｆｒｏｍ　Ｈｅｒｅ’、Ｂｒ、Ｊ。

Ｃｎｃｅｒ、４８：１６７〜１７５（１９８３）を参照のこと）。

モノクローナル　のｉｌｌ 本発明によれば、モノクローナル抗体は、当業界において知られているいづれか の方法、たとえばＸｏｈｌｅｒ　ａｎｄ　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５，Ｎａｔ ｕｒｅ２５６　：４９５〜４９７）により本来開発されたハイブリドーマ技法及 びトリオーマ技法、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒｎなど、　 、　１９８３゜Ｉｍｓｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄａｙ　↓ニア２）、ＥＢＶ−ハイ ブリドーマ技法（Ｃｏｌｅなど、＋１９８５、　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔ ｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａ　、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ ｓ＋Ｉｎｃ、７７〜９６ページ及びＨｕｓｅなと、、１９８９，５ｃｉｅｎｃｅ 　２４６　：　１２７５〜１２８１）。

並びに前記で論しられたキメラ抗体技法を用いて生成され得るが、そのような技 法はそれだけには限定されない。

本発明はマウスモノクローナル抗体を用いて示されるが、本発明はそれだけには 限定されず；事実、ヒト抗体が使用され得、そして好ましいことがわかっている 。そのような抗体は、ヒトハイブリドーマを用いて（Ｃｏｔｅなと、＋１９８３ ＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋　８０：　２０２６〜２０３０） 又はＥＢＶウィルスによりヒトＢ細胞をインビトロで形質転換することによって （Ｃｏｌｅなど、＋１９８５＋　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ 　ａｎｄＣａｎｃｅｒユ匝ユ■、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ＋　７７〜９６ページ ）、得られる。実際、本発明によれば、°゛キメラ抗体の生成のための技法（Ｍ ｏｒｒｉｓｏｎなど、＋１９８４＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋ 　８１：　６８５１〜６８５５；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど、。

１９８４、Ｎａｔｕｒｅ　３１２　：６０４〜６０８；Ｔａｋｅｄａなど、、１ ９８５．Ｎａｔｕｒｅ　３１４　：４５２〜４５４）が、適切な生物学的活性の ヒト抗体分子からの遺伝子と共に適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝 子をスプライシングすることによって開発された。

下記サブセクションは、次の例に使用される抗体がいかにして調製されるかを記 載する。

ＢＲ９６として命名された本発明のモノクローナル抗体は、免疫原として乳癌細 胞系Ｈ３３９６を用いて下記ハイブリドーマ技法により生成された。下記に記載 されるようにして調製され、そしてＢＲ９６抗体を生成するＢＲ９６ハイブリド ーマは、１９８９年２月２２日、ＡＴＣＣに寄託され、そして次のように同定さ れた：　Ｂ１１６６　ＡＴＣＣ受託番号Ｉ　ＨＢ　１００３６゜もう１つの態様 によれば、ＢＲ９６Ｒ９６モノクローナル抗（ａｂ’　）ｚフラグメントが、下 記のようにして、精製されたＢＲ９６（Ｎｉｓｏｎｏｆｆなど、。

”Ｔｈｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅ”、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅ ｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９７５）　）のペプシン消化により生成された。腫 瘍（）１３３９６）及びｌ’１ｃＦ７細胞へのＦ（ａｂ’　）ｚフラグメントの 結合は、完全なりＲ９６モノクローナル抗体の結合に相当できることが示された 。

さらに、キメラ（ネズミ／ヒト）抗体が、Ｆｅ１ｌなど−ｒ　Ｐｒｏｃ、Ｎａ　 ｋｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８６：８５０７〜８５１１（１９８９）、及び１９ ８８年９月１４日に出願されたＵ、Ｓ同時係属出願番号第２４３，８７３号及び １９９０年６月２２日に出願されたＵ、Ｓ出願番号第４６８　、０３５号（本出 願と同じ譲受人に譲渡されている）に記載されているような２段階相同組換え方 法を用いて生成された；前記すべての書類の開示は、引用により本明細書に組込 まれる。この２段階方法は、ヒトＩｇ−Ｇｇａｍｍａｌ　ｆ＋鎖を含むＢＲ９６ キメラ抗体を発現するハイブリドーマを生成するために、ネズミＢＲ９６モノク ローナル抗体を発現するマウスハイブリドーマ細胞系（ハイブリドーマＡＴＣＣ Ｎｃｔ　）１８１００３６）をトランスフェクトするためへのヒトＩ。

Ｇｇａｍｍａｌ　Ｈ鎖コードする標的ベクターの使用を包含する０次に、このハ イブリドーマは、ヒトＫＬ鎖を含むＢＲ９６キメラ抗体を発現するネズミハイブ リドーマを生成するために、ヒトカッパ（Ｋ）Ｌ鎖をコードするＤＮＡを含む標 的ベクターによりトランスフェクトされる。ハイブリドーマをトランスフェクト するために使用される標的ベクターは、Ｘｂａｌ酵素により消化されたｐＨｇａ ｍｍａｌ　ＨＣ−ＤＤａベクター（Ｏｎｃｏｇｅｎ。

５ｅａｔｔｌｅ、−＾）及びＨＩｎｄＩ［［消化ｐｓＶｚｇｐｔ／Ｃｋベクター （Ｏｎｃｏｇｅｎ＋５ｅａｔｔｌｅ。

ＷＡ）である。

下記のようにして調製され、そしてキメラヒト／ネズミＢＲ９６抗体を生成する 、ＣｈｉＢＲ９６として本明細書において同定されるキメラＢＲ９６ハイブリド ーマは、１９９０年５月２３日、ＡＴＣＣに寄託され、そして次のように同定さ れる：　ＣｈｉＢＲ９６ＡＴＣＣ受託番号：　ＨＢ　１０４６０゜キメラ抗体を 発現するハイブリドーマが同定された後すぐに、そのハイブリドーマは培養され 、そして所望するキメラ分子が、モノクローナル抗体を単離するために、当業界 において良く知られている技法を用いて細胞培養上清液から単離される。

さらに、本発明は、ＢＲ９６抗体と同じ抗原決定基を結合でき、そしてその部位 で結合のために抗体と競争できる抗体を包合する。それらは、ＢＲ９６抗体と同 じ抗原特異性を有するが、しかし種起源、同位体、結合親和性又は生物学的機能 （たとえば細胞毒性）において異なる抗体を包含する。たとえば、Ｂ１１９６抗 体の抗原結合領域を有する本発明の抗体のクラス、同位体及び他の変異体が当業 界において知られているクラススイッチ組換え及び融合技法を用いて構築され得 る（たとえば、Ｔｈａｉ＋５ａｎａなど、、”Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂａｌｉｎ　 Ｈｅａｖｙ　Ｃｈａｉｎ　ＣｌａｓｓＳｗｉｔｃｈ　Ｆｒｏｍ　ＩｇＭ　ｔｏ　 ＩｇＧ　Ｉｎ　Ａ　［１ｙｂｒｉｄｏｓａ’、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｉｇ＋ｍｕｎｏ１． ＋１３：６１４（１９８３）　；５ｐｉｒａなど、、’Ｔｈｅ　Ｉｄｅｎｔｉｆ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　ＣｌａｓｓＳｗｉｔｃｈ　Ｖａ ｒｉａｎｔｓ　Ｂｙ　５ｕｂｓｓｌｅｃｔｉｏｎ　Ａｎｄ　ＥＬＩＳＡ　Ａｓ５ ａｙ”、Ｊ、１ｍ＋ｍｕｎｏｌ。

じ結合特異性を有する他のキメラ抗体又は他の組換え抗体（たとえば、抗体が第 ２タンパク質、たとえばリンホカイン又は腫瘍阻害増殖因子と共に組合される融 合タンパク質）は、本発明の範囲内にある。

び　・ゞ　の　ムせによる　ンム５ 本発明は、抗腫瘍抗体による処理、及び標準の化学療法における生物活性剤によ る処理を含んで成る組合しての治療を提供する。本発明の好ましい態様において は、化学療法が抗体治療と同時に施こされる。

本発明において使用される抗体は、抗腫瘍抗体、好ましくはモノクローナル抗体 ＢＲ９６である０本発明の特定の態様においては、完全な抗体分子を使用するこ とが所望されるが、しかし他の態様においては、Ｆｖ、　Ｆ（ａｂ）及びＦ　（ ａｂ　’　）　ｚフラグメントを含む抗体分子のフラグメントを使用することが 所望される（但し、前記フラグメントだけには限定されない）、そのようなフラ グメントは、腫瘍細胞に結合し、そして化学療法剤に対して前記細胞をより敏感 性にし、そして抗体分子のＦｃ領域に関連する免疫機能を最小にし、そして非相 同Ｆｃ５Ｉ域で向けられる免疫応答の生成を最小にする。他方、Ｆｃ＠ｌ域に関 連する免疫機能を最大にするためにヒトｐｃｅｉ域を含むようにモノクローナル 抗体を構築することが所望される。従って、本発明は、特定の情況への抗体治療 手段をより良好に適合せしめる。

本発明で使用される化学療法手段は、腫瘍又は悪性の処理のために適切であると 思われるいづれかの手段を包含する。異なった悪性は、特定の抗腫瘍抗体及び特 定の化学療法手段の使用を必要そして、前記使用は場合次第で決定されるであろ う０本発明は、いづれかの悪性状態、たとえば腺癌、たとえば乳癌及び結腸癌、 非小細胞肺癌、白血病、リンパ腫及び神経外胚葉山来の腫瘍、たとえば黒色腫、 異状細胞腫及び多形性グリア芽腫に間するが、但しこれだけには限定されない。

抗腫瘍抗体治療及び化学療法の組合せ処理の使用が次の例に示される０本発明に よれば、抗腫瘍抗体はその腫瘍細胞標的と接触できることを確保することが所望 される。従って、外因的に投与された抗体に比較的に到達しにくい腫瘍、たとえ ば脳腫瘍を担持する哺乳類においては、腫瘍中に局部的に抗体を投与するか、又 は脳腫瘍の場合、たとえば浸透調整剤により、血液脳バリヤーをより透過性にし 、又は脳骨髄液中に又は頚動脈を通して抗体又は抗体フラグメントを投与するこ とが所望される。

本発明を一般的に記載して来たが、次に例示される例は本発明をより一層理解す るためであって、限定するものではない。

例１ ヌードマウスに゛しる　−の ヌードマウス（Ｂａｌｂ／ｃ　ｎｕ／ｎｕ雌）を、８匹の特定処理グループ（８ 匹のマウス／グループ）に分けた０個々のグループは、８２７０７腫瘍（Ｏｎｃ ｏｇｅｎでの培養において確立されたヒト肺膝癌の転移から確立された）の約３ ■×３ＩＩｌｌの断片の移植片を受け；その腫瘍片が右の後部横腹中に挿入され た。腫瘍はすべてのマウスで増殖した。

腫瘍移植後１３．１７及び２１日目、マウスは、それらのグループに基づく特定 の処理手段を受けた。

対照のマウスグループは、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、０．２ｍ）の注射を受けた 。残るグループのマウスは、ＢＲ９６（ＰＢＳ　Ｏ，２ｄ中、０．５■／注射） 又は化学療法薬物又は両者の組合せの注射を受けた。化学療法薬物は、約０．２ ｄの体積で投与され；ドキソルビシン（アドリアマイシン）は５■／ｋｇ／注射 又は７■／ｋｇ／注射のいづれかの用量で使用され、そしてマイトマイシンＣは ２ｇ／ｋｇ／注射及び３■／ｋｇ／注射で投与された。すべての処理は、腫瘍移 植後、１３．１７及び２１日目で行なわれた。腫瘍体積は、移植後１３゜２０． ２６．３６．４３及び５０日目で決定された。この研究の結果は図１及び２に示 される。

７■／ｋｇ／注射の用量で、アドリアマイシンは、マウスに対して毒性であり、 ５０日までにグループ中のすべての８匹のマウスをＲＷする。　ＢＲ９６が７■ ／ｋｇ／注射の用量のアドリアマイシンと共に投与される場合、そのグループの すべてのマウスが４２日目までに死亡した。

５■／→／注射へのアドリアマイシンの用量の低下は、ＢＲ９６ト（り組合せに おいていくらかの毒性を生成し続け、４２日目までにグループ中の８匹のうち２ 匹のマウスの死をもたらした。

、マイトマイシンＣ（３■／ｋｇ／注射）の投与は、８１１９６投与と共に与え られる場合、腫瘍体積の有意な低下をもたらした。マイトマイシンＣ（３ｇ／ｋ ｇ／注射）の単独での投与は腫瘍増殖を阻害するが、しかし組合してのＢ［１９ ６／マイトシンＣ処理のために見出されるのと同じ程度はどではなかった。

マイトマイシンＣの用量が２■／ｋｇ／注射に減じられ、そしてＢＲ９６と共に 投与される場合、抗腫瘍活性の少々の上昇がＢＲ９６のみの投与のために見出さ れる活性以上に見出された。マイトマイシンＣによる毒性効果は、使用される用 量でいづれの動物に見出されなかった。

ＢＲ９６はそれ自体、抗腫瘍活性を有するが、前記で示されたように、モノクロ ーナル抗体の抗腫瘍活性は、本発明の研究に使用される用量及び時点でマウスに 与えられる場合、検出されなかった。

例２ の　に・　るドキソルビシン　びＢＲ９６の　ムせの六Ｏｒ＋ｃｏｇｅｎでの組 織培養において確立されたヒト乳癌細胞（８３３９６及びＨ３６３０）を、１０ ％ウシ胎児血清を含むＩＭＤｌ’ｌ　１００μｉ中、１０４細胞／ウエルの密度 で９６−ウェルのフラット底プレートのウェル中にプレートシた。プレートを、 ウェルへの細胞の付着を可能にするために３７°Ｃで１２〜１６時間、維持した ０次に、培地を個々のウェルから除き、そして新しい培地１００ｕｆ又はＢＲ９ ６及び／又はドキソルビシン（アドリアマイシン）を含む培地１００μｌにより 交換した。種々の濃度のＢＲ９６及び／又はドキソルビシンを研究した０次に、 細胞を３７°Ｃで１８時間、維持し、その時点で、１μＣｉの〔３Ｈ］−チミジ ン（”Ｈ−ＴｄＲ）を個々のウェルに添加し、そして細胞を３７°Ｃでさらに６ 時間、維持した。次に、プレートを一２０゛Ｃで６時間、凍結せしめ、融解し、 そして個々のウェルをガラス繊維フィルター上に収穫し、洗浄し、そしてＤＮＡ 合成に対応する放射能をシンチレーシジンカウンターにより決定した０表１に示 される結果は、試験された個々の乳癌細胞系のために低濃度でのＢＲ９６及びド キソルビシン（Ａｄｒ）の相乗効果を示す、　ＢＲ９６の不在下で、より高い（ より毒性の）濃度のＡｄｒが細胞増殖を阻害するために必要である。　Ａｄｒの 不在下で、ＢＲ９６の高い濃度が、細胞増殖のを意な阻害のために必要とされる 。

表　１ 濃度　Ｏｕｇ／　１ｕｇ／　ｌＯｕｇ／　１１００ｕ／　１０００μｇ／−（、 ｌ−ｉラ一　ｍｌ　ｇ＋１　■１　ｍｌ　閣ｌｏ、ｏｏｏｏ　ｏ％　〜３３％　 ０％　２４％　４８％０．００２５−１７％　−１４％　２１％　３９％　５６ ％０．０１００　−３％　−１３％　２３％　３８％　５８％０．０４００　１ ５％　−８％　２９％　４０％　５４％濃度　Ｏｔｔｇ／　Ｉμｇ／　ＬＯｕｇ ／　１ｏｏｔ！ｇ／　１０００１１ｇ／４　−１　ｔａ　ｌ　ｍ　ｌ　ｍ　１　 ｍ　ｌｏ、ｏｏｏｏ　ｏ％　−２７％　−７％　１５％　４４％０．００２５　 −８％　−１％　１５％　２４％　４９％０．０１００　３％　０％　１４％　 ２６％　５２％０．０４００　１５°　７°　７°　２９’　５８’ＢＲ９６及 びＡｄｒの組合せは、ＢＲ９６及びＡｄｒの低濃度で有意な細胞増殖阻害を生成 し；その組合された処理のための抗腫瘍効果は、それらの低濃度でＢＲ９６及び Ａｄｒの付加効果よりも有意に高い。

前記の記載及び例は、本発明を例示するものであって、本発明を限定するもので はない。種々の変更及び修飾が本発明の範囲内で行なわれ得る。

口ｇｕｒａ　１ Ｆｉｇｕｒｅ　２ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｋ　３９／３９５ 　Ｔ　９２８４−４Ｃ（７２）発明者　シュレイバー、ジョージアメリカ合衆国 、ワシントン　９８０５２．　レッドモンド、ワンハンドレッドセブンティーン セカンド　アベニュ　ノースイーストＩ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．腫瘍細胞の増殖を阻害するための方法であって、前記細胞に結合する抗体及 び前記細胞の増殖を変性できる生物学的活性剤と前記細胞とを接触せしめること を含んで成る方法。
2. ２．前記生物学的活性剤が化学療法薬物である請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記化学療法薬物がドキソルビシン及びマイトマイシンＣから成る群から選 択される請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．前記抗体が受託番号ＨＢ１００３６としてＡＴＣＣにに寄託されているよう なＢＲ９６に実質的に類似する結合特異性を有するモノクローナル抗体である請 求の範囲第１項記載の方法。
5. ５．前記腫瘍細胞がヒト腫瘍細胞である請求の範囲第１項記載の方法。
6. ６．前記腫瘍細胞が前記抗体及び前記生物学的活性剤と哺乳類においてインビボ で接触される請求の範囲第１項記載の方法。
7. ７．哺乳類における腫瘍増殖を処理するための方法であって、前記腫瘍の細胞に 結合する抗体、及び前記腫瘍細胞の増殖を変性することができる生物学的活性剤 を前記哺乳類に投与することを含んで成る方法。
8. ８．前記生物学的活性剤が化学療法薬物である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．前記化学療法薬物がドキソルビシン及びマイトマイシンＣから成る群から選 択される請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．前記抗体が受託番号ＨＢ１００３６としてＡＴＣＣに寄託されているよう なＢＲ９６に実質的に類似する結合特異性を有するモノクローナル抗体である請 求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．前記腫瘍細胞が肺腺癌細胞である請求の範囲第７項記載の方法。
12. １２．前記腫瘍細胞が乳癌細胞である請求の範囲第７項記載の方法。