CN110747245A - 一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法，属于麦芽低聚糖生产技术领域。本发明以淀粉或糊精为底物，通过添加环糊***解酶和环糊精葡萄糖基转移酶对底物进行协同作用，利用环糊***解酶充分水解环糊精葡萄糖基转移酶产生的环糊精，一方面，环糊精的水解可以制备麦芽低聚糖；另一方面，环糊精的水解降低了环糊精对环糊精葡萄糖基转移酶的抑制作用，在促进该酶制备麦芽低聚糖的同时提升了环糊精葡萄糖基转移酶对淀粉的利用率，最终可以制备含量达60％以上的麦芽糖至麦芽八糖的复合麦芽低聚糖浆，其中聚合度在四及四以上的麦芽低聚糖的纯度能达到65％以上。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法，属于麦芽低聚糖生产技术领域。
背景技术
麦芽低聚糖主要是由2-10个葡萄糖以α-1,4键连接而成的直链麦芽低聚糖。麦芽低聚糖是一种新型的功能性淀粉糖，具有很多优良的性质。一方面，麦芽低聚糖具有溶解度高、粘度高、甜度低、保湿性能好而吸湿性小等特点，因而具有良好的食品加工适应性，在改善食品品质方面具有巨大的应用潜力。另一方面，在食用麦芽低聚糖后不会引起餐后血糖的迅速升高，具有特殊的生理功效，可以应用在特殊疾病患者的膳食以及功能性运动饮料中。麦芽低聚糖的制备通常使用麦芽低聚糖酶，如利用麦芽三糖酶和麦芽四糖酶制备麦芽三糖和麦芽四糖等，因此，麦芽低聚糖酶也受了到广泛关注。然而由于目前发掘的麦芽低聚糖酶仍存在种类少，稳定性低以及产率不高等问题，其他酶在麦芽低聚糖制备中的应用也在逐渐被发掘。此外，目前制备聚合度较低的麦芽低聚糖的方法已较为成熟，而聚合度相对高的麦芽低聚糖在提升食品品质及人体健康中更具有优势，因此，对聚合度相对高的麦芽低聚糖制备的研究也引起了广泛的兴趣。
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是一种作用于多糖链中α-1,4糖苷键的酶，具有水解、歧化、环化和和偶合四种反应能力，并且通过其环化能力利用淀粉或淀粉衍生物生产环糊精。除环糊精的生产外，由于CGTase具有与麦芽低聚糖酶类似的对淀粉侧链的修饰作用，也有很多研究致力于将CGTase用于麦芽低聚糖的制备。据研究报道，利用CGTase制备麦芽低聚糖通常采用抑制CGTase的环化活力，提升其水解活力的方法，如突变关键氨基酸改造蛋白结构或添加外源物质抑制环糊精的生成等。然而，蛋白改造通常技术上较为复杂，且容易造成酶活的损失，而添加外源物质具有后期难以除去等问题。环糊***解酶(CDase)属于α-淀粉酶家族，因其对环糊精的高度水解特异性而受到了广泛关注。前期曾有学者使用环糊精作为底物制备高纯度的麦芽低聚糖，而环糊精作为底物的成本十分昂贵。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过利用环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶复合酶制剂制备麦芽低聚糖的方法，利用CDase的环糊***解作用，一方面可以水解环糊精制备麦芽低聚糖，另一方面，CDase可通过水解环糊精，减轻环糊精对CGTase的抑制，提升CGTase对淀粉及其衍生物的利用效率，增加麦芽低聚糖的含量。利用本发明制得的麦芽低聚糖的转化率可达60％以上，由上述方法制备所得麦芽低聚糖的主要成分为麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦芽八糖，聚合度在四及四以上的比例达65％以上。
本发明的第一个目的是提供一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法，所述方法是以淀粉或糊精为底物，将淀粉或糊精溶于缓冲体系中，再添加环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶进行酶解，得到麦芽低聚糖浆；所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为7.5-35U/g干基淀粉或糊精；所述麦芽低聚糖的主要成分为麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦芽八糖。
在本发明的一种实施方式中，所述添加环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶可以是同时添加，也可以是先加环糊精葡萄糖基转移酶再加环糊***解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶包括α-环糊精葡萄糖基转移酶，β-环糊精葡萄糖基转移酶和γ-环糊精葡萄糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊***解酶在NCBI中的编号为WP_048164969.1.
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉或糊精底物具体为玉米淀粉，高直链玉米淀粉，蜡质玉米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉，红薯淀粉，豌豆淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，绿豆淀粉，红豆淀粉，莲子淀粉，栗子淀粉，麦芽糊精或干糊精，所述用底物浓度为5％-30％。
在本发明的一种实施方式中，所述使用的缓冲体系浓度为10-500mM、pH为5-10。
在本发明的一种实施方式中，所述控制反应温度为50-100℃，控制反应时间为4-48h。
在本发明的一种实施方式中，所述使用环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为7.5-35U/g干基淀粉或糊精，所用的环糊***解酶的添加量为10-100U/g干基淀粉或糊精。
本发明的第二个目的是提供一种采用上述方法制备得到的麦芽低聚糖浆。
本发明的第三个目的是提供一种上述麦芽低聚糖浆在食品、保健品、饮料、医药、饲料添加剂领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)本发明的方法以淀粉或糊精为底物，同时添加环糊***解酶和环糊精葡萄糖基转移酶进行协同作用，在复合酶制剂作用底物过程中，利用环糊***解酶充分水解环糊精葡萄糖基转移酶产生的环糊精，一方面，环糊精的水解可以制备麦芽低聚糖，另一方面，环糊精的水解降低了环糊精对环糊精葡萄糖基转移酶的抑制作用，在促进该酶制备麦芽低聚糖的同时提升了环糊精葡萄糖基转移酶对淀粉的利用率，可以制备含量达60％以上的麦芽糖至麦芽八糖的复合麦芽低聚糖浆，其中聚合度在四及以上的麦芽低聚糖占主要比例，具有良好的应用前景；
(2)本发明所提供的生产麦芽低聚糖的方法，具有底物转化率高，所得高聚合度的麦芽低聚糖含量高，且工艺简单，成本低廉等优势。此外，在该方法中引入的环糊***解酶不增加体系中葡萄糖的含量，避免了葡萄糖对麦芽低聚糖浆生产加工的影响。该方法利用复合酶制剂替代以往单一的麦芽低聚糖制备方法，为麦芽低聚糖生产提供了新的思路。
附图说明
图1为实施例1中所得麦芽低聚糖浆在不同时间的底物转化率。
图2为实施例1中在24h反应所得麦芽低聚糖浆不同组分的相对含量，G2～G8分别代表麦芽糖至麦芽八糖。
图3为实施例3中环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶作用淀粉过程中的还原糖生成量。
图4为实施例4中环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶作用淀粉过程中的葡萄糖释放量。
图5为实施例5中在24h反应所得麦芽低聚糖浆不同组分的相对含量，G2～G8分别代表麦芽糖至麦芽八糖。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解实施例是为了更好地解释本发明，不用于限制本发明。
实施例1：同时添加环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶
将玉米淀粉溶于pH 6的缓冲体系中配置成5％的淀粉乳，糊化后加入7.8U/g干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶和21.6U/g干基淀粉的环糊***解酶，于70℃下反应24h,分别在1h，6h，12h，24h取出部分反应样品，沸水浴终止反应，得到麦芽低聚糖浆。利用高效液相测定其中的麦芽低聚糖含量，测定结果如图1与图2所示。在复合酶反应过程中，底物转化率可达61.0％，麦芽糖至麦芽八糖的比例为，麦芽糖：16.4％；麦芽三糖：16.9％；麦芽四糖：31.6％；麦芽五糖：12.7％；麦芽六糖：6.5％；麦芽七糖：6.9％；麦芽八糖：9.0％，表现出了较好的麦芽低聚糖制备效果，其中糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占66.7％。
实施例2：同时添加环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶
将玉米淀粉溶于pH 6的缓冲体系中配置成5％的淀粉乳，糊化后加入7.8U/g干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶和21.6U/g干基淀粉的环糊***解酶，于70℃下反应24h，沸水浴终止反应，分别以DNS法和葡萄糖测定试剂盒测定得到的麦芽低聚糖浆中的还原糖和葡萄糖含量，结果如图3和图4。由图3和图4可以看出在复合酶的作用过程中底物的利用率提升，复合酶提升底物利用率及促进反应效率的效果明显，而由图4可以看出，复合酶对葡萄糖的含量无提升，避免了复合酶产生大量的葡萄糖对麦芽低聚糖浆生产加工的影响。
实施例3：
将木薯淀粉溶于pH 5.5的缓冲体系中配置成10％的淀粉乳，糊化后加入10.6U/g干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶和42.6U/g干基淀粉的环糊***解酶，于70℃下反应24h，沸水浴终止反应，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占71.3％，底物转化率达65.8％。
实施例4：
将麦芽糊精溶于pH 7的缓冲体系中配置成5％的淀粉乳，糊化后加入7.8U/g干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶和42.6U/g干基淀粉的环糊***解酶，于60℃下分别反应12h，沸水浴终止反应，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占68.2％，底物转化率达61.2％。
实施例5：先加环糊精葡萄糖基转移酶再加环糊***解酶
将玉米淀粉溶于pH 6的缓冲体系中配置成5％的淀粉乳，糊化后加入7.8U/g干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶，于70℃下先反应24h；灭酶；再加入11.56U/g干基淀粉的环糊***解酶，于70℃下反应24h，得到麦芽低聚糖浆，利用高效液相测定其中的麦芽低聚糖含量，测定结果如图5所示。在复合酶反应过程中，底物转化率可达50.2％，麦芽糖至麦芽八糖的比例为，麦芽糖：16.4％；麦芽三糖：18.9％；麦芽四糖：11.6％；麦芽五糖：10.7％；麦芽六糖：19.5％；麦芽七糖：16.0％；麦芽八糖：6.9％，表现出了具有较好的麦芽低聚糖制备效果，糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占64.7％。可以看出先后添加两种酶，也可以取得较好的麦芽低聚糖制备效果，且制备所得聚合度在四及四以上的麦芽低聚糖具也有较高比例，而淀粉转化率相对低于同时添加两种酶时的淀粉转化率。
对比例1：环糊精葡萄糖基转移酶单独处理
将玉米淀粉溶于pH 6的缓冲体系中配置成5％的淀粉乳，糊化后加入7.8U/干基淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶，于60℃下反应24h，沸水浴终止反应，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中的主产物主要为聚合度在四以下的麦芽低聚糖占58％，底物转化率达5.6％。与实施例1相比，同时添加环糊***解酶和环糊精葡萄糖基转移酶进行协同作用，在复合酶制剂作用底物过程中，利用环糊***解酶充分水解环糊精葡萄糖基转移酶产生的环糊精，一方面，环糊精的水解可以制备麦芽低聚糖，另一方面，环糊精的水解降低了环糊精对环糊精葡萄糖基转移酶的抑制作用，在促进该酶制备麦芽低聚糖的同时提升了环糊精葡萄糖基转移酶对淀粉的利用率。
对比例2：环糊***解酶单独处理
省略实施例1中的环糊精葡萄糖基转移酶，其他条件或者参数与实施例1一致，所得产物中无可检测出的麦芽低聚糖。
对比例3：
将实施例1中的反应温度70℃调整为45℃，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占41.3％，底物转化率达15.2％。可以看出，温度过低会降低复合酶制备麦芽低聚糖的底物转化率和高聚合度低聚糖的比例，达不到制备麦芽低聚糖的目的。
对比例4：
将实施例1中的底物浓度5％调整为1％，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占21.3％，底物转化率达65.2％。可以看出，底物浓度过低会降低复合酶会迅速利用底物，而产生的环糊精也会被过度降解，得到的低聚糖主要以麦芽糖为主，高聚合度低聚糖的比例降低。
对比例5：
将实施例1中的底物浓度5％调整为35％，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中的聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占63.5％，底物转化率达48.2％。可以看出，底物浓度过高并不会显著提升产物中的聚合度在四及四以上的麦芽低聚糖的比例，相反，过高的底物浓度会显著降低反应的底物转化率。
对比例6：
将实施例1中的环糊***解酶添加量21.6U/g干基淀粉调整为3.6U/g干基淀粉，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，底物转化率达35.2％。可以看出，当环糊***解酶添加量过低，环糊***解不充分，底物转化率降低，达不到制备麦芽低聚糖的目的。
对比例7：
将实施例1中的，环糊***解酶添加量21.6U/g干基淀粉调整为154.2U/g干基淀粉，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占32.5％，底物转化率达64.2％。可以看出，当环糊***解酶添加量过高，尽管底物转化率提升，但体系中产生的环糊精被过度水解，会导致糖浆中聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例降低。
对比例8：
将实施例1中的，环糊精葡萄糖基转移酶添加量7.8U/g干基淀粉调整为3.2U/g干基淀粉，反应24h，其他条件或者参数与实施例1一致，得到麦芽低聚糖浆，糖浆中聚合度在四及以上的麦芽低聚糖比例占52.5％，底物转化率达34.2％。可以看出，酶量添加过低，底物转化率过低，达不到制备麦芽低聚糖的目的。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法，其特征在于，所述方法是以淀粉或糊精为底物，将淀粉或糊精溶于缓冲体系中，再添加环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶进行酶解，得到麦芽低聚糖浆；所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为7.5-35U/g干基淀粉或糊精；所述麦芽低聚糖的主要成分为麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和麦芽八糖。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶和环糊***解酶是同时添加，或是先加环糊精葡萄糖基转移酶再加环糊***解酶。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶包括α-环糊精葡萄糖基转移酶，β-环糊精葡萄糖基转移酶和γ-环糊精葡萄糖基转移酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉或糊精底物具体为玉米淀粉，高直链玉米淀粉，蜡质玉米淀粉，马铃薯淀粉，木薯淀粉，红薯淀粉，豌豆淀粉，小麦淀粉，大米淀粉，绿豆淀粉，红豆淀粉，莲子淀粉，栗子淀粉，麦芽糊精或干糊精。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物浓度为5％-30％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用缓冲体系溶解底物，所述缓冲液体系浓度为10-500mM、pH为5-10。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述酶解反应温度为50-100℃，反应时间为4-48h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，环糊***解酶的添加量为10-100U/g干基淀粉或糊精。
9.应用权利要求1-8任一所述的方法制备得到的麦芽低聚糖浆。
10.一种权利要求9所述的麦芽低聚糖浆在食品、保健品、饮料、医药和饲料添加剂方面的应用。
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