CN110743034B - 一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用 - Google Patents

一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。本发明提供了一种可实现局部高效、持续抗氧化和降血糖联合治疗的多功能水凝胶敷料，包括具有电正性和抗氧化性的氨基酸基聚酯酰胺、蛋白类降糖药物、负电性水凝胶基质和光引发剂；其中，氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为1～2000：1。该多功能水凝胶的内部三维多孔结构均匀、稳定，不仅能够有效促进糖尿病慢性创面的愈合，而且还具有局部高效、持续抗氧化和降血糖的内外联合治疗功效及协同治疗效果，还能够促进细胞的生长和迁移；另外，该多功能水凝胶的制备方法简单，易于实现，在制备糖尿病皮肤溃疡创面修复材料中具有良好的应用前景。

Description

一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备 方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。
背景技术
糖尿病是威胁类健康的三大杀手之一，其对患者的最大威胁源于其严重的并发症，其中，糖尿病慢性创面难愈合，临床上称之为糖尿病足，是最典型的代表。糖尿病慢性创面病程反复、易感染，难愈合、易导致局部组织缺血坏死，严重者甚至导致截肢或死亡，给患者及家人带来沉重的心理和经济负担。目前，糖尿病慢性创面难以愈合且缺乏有效治疗手段，已成为一个棘手而又亟待解决的临床和科学问题。
糖尿病大面积全层慢性伤口难以自愈合或无法完全愈合，高血糖和氧化应激是其两大诱因。创面愈合是机体通过自身的再生能力，为恢复其表面的连续性和完整性，维持内环境稳定所进行的一系列修复活动。创面愈合的两大重要参数是上皮化和血管化。高血糖状态下，创面愈合过程中胶原沉积减少、创面弹性减弱，各项功能受损易导致炎症损害和创面感染。因此，长期高血糖下创面愈合更加困难。有研究表明，胰岛素的局部给药能有效加速局部血管化、促进成纤维细胞的生长和胶原合成，进而促进肉芽组织生长，加速创面愈合。由此可知，在全层慢性伤口愈合治疗中引入胰岛素局部给药，实现有效局部持续降血糖，是从内部调节角度改善慢性伤口难以愈合的有效策略。但是，目前可实现高效负载和局部长效递送胰岛素的体系仍未见重大突破，且在联合改善伤口愈合和氧化应激方面未有报道。
伤口的愈合过程常分为血球凝聚期、炎症期、细胞增生期和修复塑型期。在伤口愈合过程中，不同的阶段有不同的细胞和因子参与。由于感染或细胞渗出液的刺激，炎性细胞释放促炎因子，介导炎症反应，产生大量细胞组织碎片，激活免疫***促进嗜中性粒细胞产生大量ROS。ROS的过度产生会打破细胞的氧化/抗氧化平衡，此时内源性的抗氧化物质如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽等难以抵抗恶劣环境，最终导致过量ROS对细胞造成损伤，对伤口造成二次伤害，进而加重感染，延缓组织修复和创面愈合。许多研究表明，提高创面抗氧化能力有助于创面修复，尤其是慢性创面。但是，目前尚未有任何有关具有高效和持续抗氧化的递药体系的报道。
因此，建立一种能够联合内部调节血糖、外部改善氧化应激来解决糖尿病慢性创面难以愈合问题的策略，具有重要的应用价值。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有促进糖尿病慢性创面愈合的技术空白，提供一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。本发明提供的多功能水凝胶的制备方法简单，制备得到的多功能水凝胶具有良好的生物相容性，可实现局部血糖调节和创面氧化应激改善，能够有效加速糖尿病慢性创面的修复，有效解决糖尿病慢性创面敷料的生物利用度差、创面愈合效果差和生物安全性差的问题。
本发明的目的是提供一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料。
本发明另一目的是提供所述多功能水凝胶的制备方法。
本发明再一目的是提供所述多功能水凝胶在作为或制备创面修复材料中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明首先提供了一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，由具有电正性和抗氧化性的氨基酸基聚酯酰胺、蛋白类降糖药物、负电性水凝胶基质和光引发剂制备而成；其中，氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为1～2000：1。
本发明的多功能水凝胶敷料的内部三维多孔结构均匀、稳定，具有良好的生物安全性，能够满足细胞生长的需求；该多功能水凝胶敷料不仅能够有效促进糖尿病慢性创面的愈合，而且还具有局部高效、持续抗氧化和降血糖的内外联合治疗功效及协同治疗效果，能够有效提高药物利用度及药效，减少对机体的毒副作用；同时，该多功能水凝胶敷料的水汽透过率与健康皮肤一致，并可显著促进细胞的增殖和迁移；另外，该多功能水凝胶敷料的制备方法简单，反应周期短，易于实现，在促进糖尿病慢性创面的愈合方面具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
若氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比过大(＞2000：1)，则会引起细胞毒性；若氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比过小(＜1：1)，则持续降血糖效果较差。
在本发明较佳的实施例中，氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为1～1000：1；优选为10～150：1，更优选为25～100：1，更进一步优选为50：1或100：1。
所述氨基酸基聚酯酰胺是指含有氨基酸残基的可降解聚酯酰胺。
优选地，所述氨基酸基聚酯酰胺(Arg-PEA)的制备方法可参考现有技术制备得到；具体地，可参考Jun Wu等在2013年公开的文章(Jun Wua and Chih-Chang Chu,Waterinsoluble cationic poly(ester amide)s:synthesis,characteriza tion andapplicationst，J.Mater.Chem.B,2013,1,353)。
具体的制备方法为：在催化剂和溶剂存在的条件下，将氨基酸与二元醇发生酯化反应，得到改性聚酯酰胺单体，然后，在缚酸剂和溶剂存在的条件下，使改性聚酯酰胺单体与羧酸二对硝基苯基酯发生缩聚反应，即可得到所述氨基酸基聚酯酰胺。
更优选地，所述氨基酸基聚酯酰胺的制备方法为：以对甲苯磺酸为催化剂、甲苯/苯为溶剂，在120℃～140℃条件下，氨基酸与二元醇发生酯化反应，得到改性聚酯酰胺单体，然后，以三乙胺为缚酸剂，以DMSO为溶剂，在60℃～80℃条件下，改性聚酯酰胺单体与羧酸二对硝基苯基酯进行缩聚反应，即可得到所述氨基酸基聚酯酰胺。
进一步优选地，所述氨基酸与二元醇的摩尔比为1～3：1。
更进一步优选地，所述氨基酸与二元醇的摩尔比为2：1。
进一步优选地，所述改性聚酯酰胺单体与羧酸二对硝基苯基酯的摩尔比为1：1。
进一步优选地，所述氨基酸为精氨酸或赖氨酸。
进一步优选地，所述酯化反应的温度为130℃。
进一步优选地，所述缩聚反应的温度为70℃。
本领域常用的能够实现降血糖效果的蛋白类药物均可应用于本发明中。
优选地，所述蛋白类降糖药物为胰岛素或GLP-1受体激动剂，其中，所述GLP-1受体激动剂可选自艾塞那肽或利拉鲁肽等任意一种GLP-1受体激动剂，只要能够实现降血糖效果即可。
更优选地，所述蛋白类降糖药物为胰岛素。
优选地，所述负电性水凝胶基质为用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸或用甲基丙烯酸酐改性的明胶。
更优选地，所述负电性水凝胶基质为用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸。
优选地，所述负电性水凝胶基质的改性方法为：将水凝胶基质溶解于去离子水中得到水凝胶基质溶液，冰浴下缓慢滴加过量的甲基丙烯酸酐，避光反应22～26h，得到用甲基丙烯酸酐改性的水凝胶基质初产物，透析3～10d，冷冻干燥，即可得到所述负电性水凝胶基质。
透析可以去除未反应的过量的甲基丙烯酸酐，若透析时间过长(＞10d)，则透析效率降低；若透析时间过短(小于3d)，则甲基丙烯酸酐残留，具有一定的细胞毒性。
优选地，所述透析的时间为5d。
优选地，所述避光反应的时间为24h。
在本发明较佳的实施例中，所述氨基酸基聚酯酰胺的浓度为5～10000mg/mL，优选为100～1000mg/mL，更优选为500mg/mL。
若氨基酸基聚酯酰胺的浓度过高(＞10000mg/mL)，则会引起细胞毒性；若氨基酸基聚酯酰胺的浓度过低(＜5mg/mL)，则导致递送蛋白类药物的效果和抗氧化性能不佳。
在本发明较佳的实施例中，所述蛋白类降糖药物的浓度为0.1～100mg/mL，优选为1～20mg/mL，更优选为5mg/mL。
若蛋白类降糖药物的浓度过高(＞100mg/mL)，则易导致低血糖；若蛋白类降糖药物的浓度过低(＜0.1mg/mL)，则降血糖效果较差。
优选地，所述负电性水凝胶基质的浓度为1～100mg/mL。
若负电性水凝胶基质的浓度过高(＞100mg/mL)，则容易发生固化结块现象；若负电性水凝胶基质的浓度过低(＜1mg/mL)，则无法成胶。
更优选地，所述负电性水凝胶基质的浓度为10～30mg/mL。
更进一步优选地，所述负电性水凝胶基质的浓度为20mg/mL。
在本发明较佳的实施例中，所述光引发剂的质量体积浓度为0.1％～10％，优选为0.5％～1.5％，更优选为1％。
光引发剂的加入可以实现光交联，若光引发剂的质量体积浓度过大(＞10％)，则引入的杂质成分增加，降低了有效成分的比例；若光引发剂的质量体积浓度过小(＜0.1％)，则成胶性能不佳。
优选地，所述光引发剂为光引发剂2959。
优选地，所述光引发剂的溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、氯仿或乙醇中的任意一种。
更优选地，所述光引发剂的溶剂为乙醇。
另外，本发明还提供了所述多功能水凝胶敷料的制备方法，包括以下步骤：
S1.按照所述质量比将氨基酸基聚酯酰胺与蛋白类降糖药物混合，得到载药纳米复合物；
S2.将步骤S1得到的载药纳米复合物与负电性水凝胶基质混合，加入光引发剂，紫外照射，即可得所述多功能水凝胶敷料；步骤S2所述载药纳米复合物与负电性水凝胶基质的质量比为1～150：1。
更优选地，步骤S2所述载药纳米复合物与负电性水凝胶基质的质量比为6.5～25.25：1。
更进一步优选地，步骤S2所述载药纳米复合物与负电性水凝胶基质的质量比为25.25：1。
优选地，所述紫外光照射的时间为10～600s。
若紫外光照射的时间过长(＞600s)，则易破坏所负载的胰岛素分子的活性；若紫外光照射的时间过短(＜10s)，则不利于成胶。
更优选地，所述紫外光照射的时间为30s。
本发明以L-精氨酸为原料，合成了一种精氨酸基聚酯酰胺，其具有较好的电正性和抗氧化性。本发明先将蛋白类降糖药物(胰岛素)通过静电相互作用与精氨酸基聚酯酰胺形成载药纳米复合物，再将该载药纳米复合物固载于负电性水凝胶基质(用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸)中，得到多功能水凝胶敷料。本发明基于氨基酸基聚酯酰胺(如精氨酸基聚酯酰胺)的特殊结构和性质，制备得到的多功能水凝胶敷料可高效递送蛋白类降糖药物(胰岛素)和持续抗氧化，改善药物的生物利用度；然后，通过内外结合的联合治疗法实现协同作用，再加上负电性水凝胶基质(用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸)本身的促进细胞生长和迁移的效果，以达到更加高效的促进糖尿病慢性创面愈合的目的。
另外，所述多功能水凝胶敷料在作为或制备糖尿病创面修复材料中的应用，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，所述创面为糖尿病皮肤溃疡创面。
更优选地，所述创面为糖尿病慢性皮肤溃疡创面。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料及其制备方法和应用。构建了一种可实现内部调节血糖和外部改善氧化应激的联合治疗糖尿病溃疡的策略，以氨基酸基聚酯酰胺为主要材料，成功开发制备得到了一种可实现内部调节血糖和外部改善氧化应激的多功能水凝胶敷料，该多功能水凝胶敷料的内部三维多孔结构均匀、稳定，具有良好的生物安全性，且其水汽透过率与健康皮肤一致，能够满足细胞生长的需求；可以包裹不同种类的促进伤口愈合的蛋白类降糖药物，在高血糖环境下，可迅速释放包裹的蛋白类降糖药物，实现局部高效、持续降血糖的功效，从而可显著提高药物的生物利用度，减少不良反应和毒副作用；
(2)本发明制备得到的多功能水凝胶敷料可成功发挥氨基酸基聚酯酰胺的抗氧化作用，具有良好的清除DPPH自由基和羟基自由基能力，能够显著改善糖尿病慢性创面的氧化应激反应，具有长时间持续、高效抗氧化的效果，并可显著促进细胞的增殖和迁移，实现内部调节血糖和外部改善氧化应激的联合治疗效果，对促进糖尿病皮肤溃疡创面的愈合具有重要意义；
(3)本发明多功能水凝胶敷料的制备方法简单，具有反应步骤少、反应周期短、重复性好、易于实现和绿色安全等优势，可大规模推广应用，在制备糖尿病皮肤溃疡创面修复材料中具有良好的应用前景和广阔的发展空间。
附图说明
图1是本发明制备多功能水凝胶敷料的流程示意图；其中，2-Arg-2-S代表精氨酸基聚酯酰胺；Insulin代表胰岛素；NP complex代表载药纳米复合物；HA-MA代表用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸。
图2是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的生物相容性评价结果图；其中，a)图是细胞活死染色结果图，b)图是细胞骨架染色结果图。
图3是MTT法检测本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的细胞毒性结果图；其中，a)图是24h的细胞毒性结果图；b)图是48h的细胞毒性结果图。
图4是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的实体图和SEM图。
图5是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的水蒸气透过率测试结果图。
图6是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的药物释放曲线图。
图7是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的体内降血糖效果测试结果图。
图8是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料清除DPPH自由基能力的测试结果图。
图9是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料清除羟基自由基能力的测试结果图。
图10是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对NIH 3T3细胞迁移的影响结果和迁移率结果图；其中，a)图是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对NIH 3T3细胞划痕实验的影响结果图；b)图是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对NIH 3T3细胞迁移率的影响结果图。
图11是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对大鼠伤口愈合程度影响的伤口拍照结果图。
图12是本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对大鼠伤口愈合程度和体重变化影响结果图；其中，a)图是大鼠的体重变化统计图；b)图是大鼠的伤口愈合程度统计结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例1～6制备多功能水凝胶敷料的流程示意图如图1所示。
实施例1内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解胰岛素，按照质量比为100：1将浓度为500mg/mL的精氨酸基聚酯酰胺加入胰岛素中，混合，得到载药纳米复合物(2-Arg-2-S/Insulin纳米复合物)；
S2.按照质量比为25.25：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为20mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为1％的光引发剂2959(用乙醇溶解)，使得最终胰岛素的浓度为5mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，精氨酸基聚酯酰胺的制备方法为：以对甲苯磺酸为催化剂、甲苯/苯为溶剂，在130℃条件下，将摩尔比为2：1的精氨酸与二元醇发生酯化反应，得到改性聚酯酰胺单体，然后，以三乙胺为缚酸剂，以DMSO为溶剂，在70℃条件下，将摩尔比为1：1的改性聚酯酰胺单体与羧酸二对硝基苯基酯进行缩聚反应，即可得到所述氨基酸基聚酯酰胺。
用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸的制备方法为：将透明质酸盐溶解于去离子水中得到透明质酸盐溶液，冰浴下缓慢滴加过量的甲基丙烯酸酐，避光反应24h，得到用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸初产物，透析5d，冷冻干燥，即可得到所述用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸。
实施例2内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解胰岛素，按照质量比为25：1将浓度为5mg/mL的精氨酸基聚酯酰胺加入胰岛素中，混合，得到载药纳米复合物；
S2.按照质量比为65：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为10mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为0.1％的光引发剂2959(用氯仿溶解)，使得最终胰岛素的浓度为1mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，除了精氨酸与二元醇的摩尔比为1：1，酯化反应的温度为120℃，缩聚反应的温度为60℃外，精氨酸基聚酯酰胺的制备方法与实施例1相同；
除了避光反应的时间为22h，透析的时间为3d，用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸的制备方法与实施例1相同。
实施例3内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解胰岛素，按照质量比为150：1将浓度为10000mg/mL的精氨酸基聚酯酰胺加入胰岛素中，混合，得到载药纳米复合物；
S2.按照质量比为150：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为30mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为10％的光引发剂2959(用DMSO溶解)，使得最终胰岛素的浓度为20mg/mL，紫外光照射600s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，除了精氨酸与二元醇的摩尔比为3：1，酯化反应的温度为140℃，缩聚反应的温度为80℃外，精氨酸基聚酯酰胺的制备方法与实施例1相同；
除了避光反应的时间为26h，透析的时间为10d，用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸的制备方法与实施例1相同。
实施例4内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解利拉鲁肽，按照质量比为1000：1将浓度为500mg/mL的改性赖氨酸高分子聚合物加入利拉鲁肽中，混合，得到载药纳米复合物；
S2.按照质量比为1：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为20mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的明胶混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为1％的光引发剂2959(用乙醇溶解)，使得最终利拉鲁肽的浓度为100mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，改性赖氨酸高分子聚合物的制备方法为：以对甲苯磺酸为催化剂、甲苯/苯为溶剂，在130℃条件下，将摩尔比为2：1的赖氨酸与二元醇发生酯化反应，得到改性聚酯酰胺单体，然后，以三乙胺为缚酸剂，以DMSO为溶剂，在70℃条件下，将摩尔比为1：1的改性聚酯酰胺单体与羧酸二对硝基苯基酯进行缩聚反应，即可得到所述氨基酸基聚酯酰胺。
用甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备方法为：将明胶溶解于去离子水中得到明胶溶液，冰浴下缓慢滴加过量的甲基丙烯酸酐，避光反应24h，得到用甲基丙烯酸酐改性的明胶初产物，透析5d，冷冻干燥，即可得到所述用甲基丙烯酸酐改性的明胶。
实施例5内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解利拉鲁肽，按照质量比为2000：1将浓度为1000mg/mL的改性赖氨酸高分子聚合物加入利拉鲁肽中，混合，得到载药纳米复合物；
S2.按照质量比为25.25：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为1mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的明胶混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为0.5％的光引发剂2959(用氯仿溶解)，使得最终利拉鲁肽的浓度为0.1mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，除了精氨酸与二元醇的摩尔比为1：1，酯化反应的温度为120℃，缩聚反应的温度为60℃外，改性赖氨酸高分子聚合物的制备方法与实施例4相同；
除了避光反应的时间为22h，透析的时间为3d，用甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备方法与实施例4相同。
实施例6内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的制备
一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其制备方法包括以下步骤：
S1.溶解艾塞那肽，按照质量比为1：1将浓度为100mg/mL的改性赖氨酸高分子聚合物加入利拉鲁肽中，混合，得到载药纳米复合物；
S2.按照质量比为25.25：1将步骤S1得到的载药纳米复合物与浓度为100mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的明胶混合，得到水凝胶前驱液，加入质量体积浓度为1.5％的光引发剂2959(用DMSO溶解)，使得最终艾塞那肽的浓度为5mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述多功能水凝胶敷料。
其中，除了精氨酸与二元醇的摩尔比为3：1，酯化反应的温度为140℃，缩聚反应的温度为80℃外，改性赖氨酸高分子聚合物的制备方法与实施例4相同；
除了避光反应的时间为26h，透析的时间为10d，用甲基丙烯酸酐改性的明胶的制备方法与实施例4相同。
对比例1仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸(HA-MA)组
一种水凝胶敷料，除了不加入精氨酸基聚酯酰胺、胰岛素之外，其余的制备方法与实施例1相同；
具体的制备方法为：在浓度为20mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸中加入质量体积浓度为5％的光引发剂2959(用乙醇溶解)，紫外照射30s，即可得到所述水凝胶敷料。
对比例2仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组
一种水凝胶敷料，除了不加入精氨酸基聚酯酰胺之外，其余的制备方法与实施例1相同；
具体的制备方法为：溶解胰岛素，与浓度为20mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸混合，加入质量体积浓度为5％的光引发剂2959(用乙醇溶解)，使得最终胰岛素的浓度为5mg/mL，紫外光照射30s，即可得到所述水凝胶敷料。
对比例3仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和精氨酸基聚酯酰胺(HA-M2-Arg-2-S)组
一种水凝胶敷料，除了不加入胰岛素之外，其余的制备方法与实施例1相同；
具体的制备方法为：将浓度为7.5mg/mL的改性精氨酸高分子聚合与浓度为20mg/mL的用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸混合，加入质量体积浓度为5％的光引发剂2959(用乙醇溶解)，紫外光照射30s，即可得到所述水凝胶敷料。应用例1内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶的生物相容性和细胞毒性评价
1、实验方法
应用本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料处理NIH 3T3细胞后，采用钙黄绿素/PI活死染色法评价NIH 3T3细胞的细胞活性，钙黄绿素可以将活细胞染成绿色，PI则将死细胞染成红色；采用FITC-鬼笔环肽和Hoechest进行了细胞骨架染色。另外，采用MTT法检测了本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料对NIH 3T3细胞的毒性。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的生物相容性评价结果图如图2所示，从a)图中可以看出，同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组未出现红色，表明本发明制备得到的多功能水凝胶敷料具有良好的生物相容性；从b)图中可以看出，NIH3T3细胞的形态为清晰的丝状肌动蛋白和圆形细胞核，这种形态在多功能水凝胶敷料具表面生长时未受干扰；观察到NIH 3T3细胞在肌动蛋白细胞骨架上扩散，表明本发明制备得到的多功能水凝胶敷料表面支持细胞的粘附和生长。
MTT法检测本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的细胞毒性结果图如图3所示，可以看出，本发明制备得到的多功能水凝胶敷料具有较好的细胞毒性，不会引起细胞死亡。
应用例2内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶的表征
1、实验方法
将本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料分别在扫描电子显微镜下进行观察，拍照。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的实体图和SEM图如图4所示，可以看出，仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸(HA-MA)组，胶液呈白色透明状，水凝胶呈白色透明；仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组，胶液呈白色透明状，水凝胶呈乳白色状，是由胰岛素分子固载于用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸所致；而同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组，随着精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素质量比的增加，其胶液和水凝胶颜色逐渐加深，是由于精氨酸高分子聚合物本身颜色所致；其中，当精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素的质量比为100：1时，得到的多功能水凝胶具有均匀、稳定的三维多孔结构，表明精氨酸高分子的引入不会破坏水凝胶的三维网络结构。
应用例3内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的水蒸气透过率测试
1、实验方法
取1cm口径的试剂瓶，装入10mL蒸馏水，称重记录质量；然后将直径与瓶口匹配的本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料分别覆盖于瓶口，在37℃条件下孵育24h，再次称重，记录质量变化，计算其水蒸气透过率。
水蒸气透过率的计算公式如下：WVTR＝(W0-Wt)/S，其中，WVTR代表水蒸气透过率(g/m2h)，S代表瓶口面积(m2)，W0-Wt代表质量变化(g)。
2、实验结果
多孔结构显示良好的水蒸气透过率，有利于伤口愈合过程中细胞生长的水蒸气交换。在治疗慢性皮肤创伤时，应在创面保持适当的水蒸气透过率，为新生肉芽组织提供足够的氧气；若水蒸气透过率过高，则会增加创面氧化应激，延迟创面修复。本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的水蒸气透过率测试结果如图5所示，其中，仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸(HA-MA)组，水蒸气透过率最高；仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组，水蒸气透过率稍有降低；而同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组，在精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素的不同质量比(25：1、50：1、100：1)下，多功能水凝胶敷料的水蒸气透过率逐渐降低；其中，当精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素的质量比为100：1时，具有与健康皮肤类似的水蒸气透过率(240～1920g/m2)，可以为新生肉芽组织提供适量的氧气，既不影响伤口的水蒸气透过率，又能防止因过度暴露伤口而引起的氧化应激。
应用例4内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的药物缓释和降血糖效果测试
1、实验方法
药物缓释实验：将含有胰岛素的本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例2制备得到的水凝胶敷料分别置于pH＝7的PBS中，于37℃恒温摇床避光孵育，于设定时间取出1mL的PBS缓冲液测定释药量，同时补加1mL新鲜PBS；然后用488nm激发、515nm发射的荧光光谱仪测定释放介质的荧光强度，评价本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料的胰岛素释放行为和缓释效果。
降血糖实验：麻醉糖尿病慢性创面模型大鼠，将本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例2和3制备得到的水凝胶敷料分别敷于大鼠创面处，用血糖仪定时测量大鼠的血糖，将初始血糖浓度取定位为100％，主要考察大鼠12h内血糖的变化。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的药物释放曲线如图6所示，可以看出，与仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组相比，同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组药物的突释现象得到改善，可实现较好的药物缓释作用；且随着精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素质量比的增加，药物的缓释效果逐渐增加；其中，当精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素的质量比为100：1时，得到的多功能水凝胶敷料对药物的缓释效果最好。
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料的体内降血糖效果测试结果如图7所示，可以看出，与直接注射胰岛素(Injected Insulin)组、仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组、仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和精氨酸基聚酯酰胺(HA-M2-Arg-2-S)组相比，直接注射胰岛素(Injected Insulin)组可以在前3小时有效降低血糖，但在数小时内会恢复高血糖；仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和精氨酸基聚酯酰胺(HA-M2-Arg-2-S)不能有效降低血糖；而加入精氨酸基聚酯酰胺组(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组的持续降血糖效果优于直接注射胰岛素(Injected Insulin)组，表现出最好的持续降血糖作用，且在精氨酸基聚酯酰胺和胰岛素的质量比为100：1时，得到的多功能水凝胶敷料具有更持久的降血糖效果。值得一提的是，加入精氨酸基聚酯酰胺组(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组是由于2-Arg-2-S/Insulin纳米复合物和水凝胶的双重缓释作用，可以进一步延长降糖效果，持续改善降糖效果。综上所述，这种以精氨酸为基础的多功能水凝胶敷料具有良好的持续调节血糖和改善抗氧化能力的双重作用，在慢性糖尿病创面的治疗中具有广阔的应用前景。
应用例5内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的清除自由基能力测试
1、实验方法
DPPH自由基清除实验：将DPPH粉末溶解于无水乙醇成80ug/mL，将5mg/mL的本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料的浸提液、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料的浸提液分别与DPPH溶液等体积混合均匀，静置30min后，取200uL上清液于517nm测吸光度，计算DPPH清除率。
DPPH自由基清除率的计算公式为：DPPH清除率(％)＝(AC-AS)/AC*100，其中，AC代表乙醇OD值，AS代表样品OD值。
羟基自由基清除实验：在FeSO4·7H2O(4mM)和水杨酸(2mM)的混合溶液中加入等体积的本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料的浸提液(5mg/mL)、对比例1和对比例2制备得到的水凝胶敷料的浸提液，最后加入1体积双氧水，避光孵育30min，于510nm测吸光度，计算羟基清除率。
羟基自由基清除率的计算公式为：羟基清除率(％)＝(AC-AS)/AC*100，其中，AC代表乙醇OD值，AS代表样品OD值。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶的清除DPPH和羟基自由基能力的测试结果分别如图8和图9所示，可以看出，与仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸(HA-MA)组、仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组相比，同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组，得到的多功能水凝胶的DPPH和羟基自由基清除率显著增强，且随着精氨酸高分子聚合物和胰岛素的质量比增大，DPPH和羟基自由基清除率逐渐增强；另外，随着处理时间的延长，DPPH和羟基自由基清除率也逐渐增强。因此，本发明制备得到的多功能水凝胶可持续、高效的清除过量的DPPH和羟基自由基，对于创面愈合具有重要意义。
以上结果表明：本发明制备得到的多功能水凝胶对DPPH和羟基自由基清除效果显著，抗氧化性能极佳，可有效改善慢性创面的氧化应激状态。
应用例6内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料对NIH 3T3细胞迁移的影响
1、实验方法
(1)将NIH 3T3细胞(成纤维细胞)接种于六孔板，待细胞铺板整个六孔板，用移液器的枪头划痕，使形成一道无细胞区域；
(2)分别加入上述本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料的浸提液、对比例2和3制备得到的水凝胶敷料的浸提液进行共培养，不同时间进行观察，拍照取样；以PBS作为空白阴性对照。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对NIH 3T3细胞划痕实验和迁移率的影响结果如图10所示，可以看出，与空白阴性对照、仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和胰岛素(HA-MA/Insulin)组、仅加入用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸和精氨酸基聚酯酰胺(HA-M2-Arg-2-S)组相比，同时加入精氨酸基聚酯酰胺(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组可显著促进NIH 3T3细胞的增殖和迁移，有利于慢性创面愈合。
应用例7内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料的动物实验
1、实验方法
将糖尿病慢性创面大鼠麻醉后，用生理盐水清理创面，并于创面处贴服本发明实施例1制备得到的多功能水凝胶敷料、对比例2和3制备得到的水凝胶敷料，同时设置空白阴性对照组，期间检测血糖浓度，记录创面的面积变化等。
2、实验结果
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对大鼠伤口愈合程度影响的伤口拍照结果图如图11所示，可以看出，与空白阴性对照组相比，经过20天的治疗后，单独抗氧化(HA-M2-Arg-2-S)组和单独降血糖(HA-MA/Insulin)组伤口面积显著降低，愈合效果得到了改善，但伤口尚未痊愈，表明单独治疗的效果欠佳，有待提高；值得一提的是，实验(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组结合了降血糖和抗氧化联合治疗的双重功效，发挥了协同增效作用，取得了最大的治疗效果，其伤口基本愈合，糖尿病慢性创面的治疗得到了最优的效果。
本发明制备得到的多功能水凝胶敷料对大鼠伤口愈合程度和体重变化影响结果图如图12所示，从a)图和b)图中可以看出，实验(HA-MA/2-Arg-2-S/Insulin)组大鼠的伤口区域显著减小，大鼠体重明显增加。
以上结果表明：本发明制备得到的多功能水凝胶具有良好的生物相容性，结合了高血糖调节和抗氧化改善，最大限度地提高了治疗效果，能够实现内部调节血糖和外部改善氧化应激的联合效果，同时具有生物可降解性、高生物安全性等特点，可以包裹不同种类的促进伤口愈合的蛋白类降糖药物，从而可显著提高药物的生物利用度，减少不良反应和毒副作用，并在体内具有优异的促进慢性创面修复的作用，也证实了本发明多功能水凝胶敷料设计的有效性。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种内外协同治疗糖尿病溃疡的多功能水凝胶敷料，其特征在于，由具 有电正性和抗氧化性的氨基酸基聚酯酰胺、蛋白类降糖药物、负电性水凝胶基质和光引发剂制备而成；其中，氨基酸基聚酯酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为 1～2000：1；
所述蛋白类降糖药物为胰岛素或 GLP-1 受体激动剂；所述负电性水凝胶基 质为用甲基丙烯酸酐改性的透明质酸或用甲基丙烯酸酐改性的明胶；
所述负电性水凝胶基质的浓度为 1～100 mg/mL。
2.根据权利要求 1 所述的多功能水凝胶敷料，其特征在于，氨基酸基聚酯 酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为 10～150：1。
3.根据权利要求 2 所述的多功能水凝胶敷料，其特征在于，氨基酸基聚酯 酰胺和蛋白类降糖药物的质量比为 25～100：1。
4.根据权利要求 3 所述的多功能水凝胶敷料，其特征在于，所述氨基酸基 聚酯酰胺的浓度为 5～10000 mg/mL。
5.根据权利要求 1 所述的多功能水凝胶敷料，其特征在于，所述蛋白类降 糖药物的浓度为 0.1～100 mg/mL。
6.根据权利要求 1 所述的多功能水凝胶敷料，其特征在于，所述光引发剂 的质量体积浓度为 0.1%～10%。
7.权利要求 1～6任一所述多功能水凝胶敷料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1. 按照限定的质量比将氨基酸基聚酯酰胺与蛋白类降糖药物混合，得到载药纳米复合物；
S2. 将步骤 S1 得到的载药纳米复合物与负电性水凝胶基质混合，加入光引 发剂，紫外照射，即可得所述多功能水凝胶敷料；步骤 S2 所述载药纳米复合物 与负电性水凝胶基质的质量比为 1～150：1。
8.权利要求 1～6任一所述多功能水凝胶敷料或权利要求 7所述方法制备得到的多功能水凝胶敷料在制备糖尿病创面修复材料中的应用。
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