CN110741084A - 甘露聚糖酶变体和对其编码的多核苷酸 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及甘露聚糖酶变体。本发明还涉及编码这些变体的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及使用这些变体的方法。

Description

甘露聚糖酶变体和对其编码的多核苷酸
序列表的引用
本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。
发明背景
技术领域
本发明涉及表现出甘露聚糖酶活性的甘露聚糖酶变体、包含这些甘露聚糖酶变体的组合物、编码这些变体的多核苷酸、产生这些变体的方法以及使用这些变体的方法。
背景技术
内切-1,4-甘露聚糖酶(EC 3.2.1.78)参与(1→4)-β-D-甘露糖苷键在甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖中的随机水解(Ademark等人,(1998)J.Biotechnol.[生物技术杂志]63:199-210)。
含甘露聚糖的多糖通常是木头(软木和硬木)中半纤维素部分的主要组分。
在若干棵棕榈树的果实(例如棕榈仁和椰子)中发现了基本上未被取代的线性β-1,4-甘露聚糖。存在于例如象牙果中的未被取代的β-1,4-甘露聚糖在单个多糖链的构型中类似于纤维素，并且是水不溶性的。在豆科种子中，水溶性半乳甘露聚糖是主要的储存碳水化合物，其占总干重的高达20％。参见Moreira等人,(2008)Appl.Microbiol.Biotechnol.[应用微生物学与生物技术]79:165-178。半乳甘露聚糖具有被单个α-1,6-半乳糖取代的(任选地被乙酰基基团取代的)线性β-1,4-甘露聚糖主链。葡甘露聚糖是线性多糖，其具有β-1,4-连接的甘露糖和葡萄糖以或多或少规则的方式交替的主链，该主链任选地被半乳糖和/或乙酰基基团取代。甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖(即，具有支链半乳糖的葡甘露聚糖主链)占软木半纤维素的超过50％。此外，许多红藻的纤维素含有大量的甘露糖。
甘露聚糖酶已经在若干种芽孢杆菌属(Bacillus)生物体中被鉴定出来，但也可以从其他细菌、真菌、植物和动物中被鉴定出来。参见Araujo A.等人,(1990)/.App.Bacteriol.[应用细菌学]68:253-261；Dutta S.等人,(1997)Plant Physiol.[植物生理学]113:155-161；Puchar V.等人,(2004)Biochim.Biophys.Acta[生物化学与生物物理学报]1674:239-250。来自许多生物体的编码这些酶的基因也已经被克隆和测序，基于它们的序列，许多(如果不是全部的话)也已经被分类为糖基水解酶(GH)家族5或26的成员。参见例如，Bewley D.J.,(1997)Planta[植物学]203:454-459；Halstead J.R.等人,(2000)FEMS Microl.Lett.[FEMS微生物快报]192:197-203；Xu B.等人,(2002)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]269:1753-1760；Henrissat,B.(1991)Biochem.J.[生物化学杂志]280:309-316。
β-甘露聚糖酶已被用于如下工业的商业应用中，例如，造纸和纸浆工业、食品和饲料工业、制药工业和能源工业。Lee J.T.等人,(2003)Poult.Sci.[家禽科学]82:1925-1931；McCutchen M.C.等人,(1996)Biotechnol.Bioeng.[生物技术和生物工程]52:332-339；Suurnakki A.等人,(1997)Adv.Biochem.Eng.Biotechnol[生物化学工程/生物技术的进展],57:261-287。
在家庭护理工业中，已知在例如衣物洗涤剂中使用甘露聚糖酶。在WO1999/064619中，披露了一种碱性甘露聚糖酶，当应用于清洁组合物中时，该碱性甘露聚糖酶在碱性pH范围内也表现出甘露聚糖酶活性。
在WO 2016/054176中，披露了表现出β-甘露聚糖酶活性的其他甘露聚糖酶。
然而，在现有技术中尚未披露具有改善的稳定性的甘露聚糖酶，特别是当用于洗涤剂中时。从本文披露的数据可以看出，野生型甘露聚糖酶的稳定性可以通过蛋白质工程显著改善。从商业角度看，提供具有改善的稳定性的甘露聚糖酶将对洗涤剂生产工业产生巨大影响。
因此，本发明的目的是提供与其亲本相比具有改善的稳定性的甘露聚糖酶变体。
发明内容
本发明涉及一种分离的甘露聚糖酶变体，其中所述变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
本发明还涉及包含如本文披露的变体的组合物，这种组合物在家庭或工业清洁过程中的用途，编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体、和宿主细胞；以及产生这些变体的方法，连同使用本文披露的组合物在自动机器中进行餐具洗涤或衣物洗涤的方法。
定义
在进一步详细描述本发明之前，应理解的是，本发明的变体、组合物和方法不限于所描述的特定实施例，因为这些当然可以改变。还应理解的是，本文所使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，而不意图具有限制性，因为本发明的范围将仅由所附权利要求书限制。
因此，在进一步详细讨论本发明之前，首先定义如下术语。根据详细描述，以下缩写和定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“一种酶”时包括多种此类酶，且提及“该剂量”时包括提及本领域技术人员已知的一种或多种剂量及其等同物等。
某些范围在本文中以数值前面加术语“约”的方式呈现。如本文所使用的，术语“约”用于为其后面的准确数字以及接近或近似于该术语后面的数字的数字提供字面支持。在确定数字是否接近或近似于特定叙述的数字时，接近或近似的未叙述的数字可以是在呈现其的上下文中提供特定叙述的数字的基本上等同物的数字。例如，结合数值，术语“约”是指数值的-10％至+10％的范围，除非在上下文中另外具体定义该术语。在另一个实例中，短语“约9的pH值”是指从8.1至9.9的pH值，除非另外具体定义该pH值。
甘露聚糖酶：如本文所使用的，术语“甘露聚糖酶(mannanase)”或“半乳甘露聚糖酶”是指如下甘露聚糖酶(mannanase enzyme)，该甘露聚糖酶被定义为正式命名的甘露聚糖内切-1,4-β-甘露糖苷酶，并且具有可替代的名称β-甘露聚糖酶和内切-1,4-甘露聚糖酶。该甘露聚糖酶术语还意指酶的多肽或多肽结构域，该酶具有催化甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖的(1->4)β-D-甘露糖苷键的切割或水解的能力。因此，这意味着甘露聚糖酶具有甘露聚糖酶活性(EC 3.2.1.78)。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定甘露聚糖酶活性。在一个方面，本发明的变体具有SEQ ID NO:1的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的甘露聚糖酶活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
cDNA：术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。
编码序列：术语“编码序列”意指多核苷酸，该多核苷酸直接规定了变体的氨基酸序列。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的变体的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该变体的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区域连接的特异性限制位点的目的，控制序列可以提供有接头。
包含：如本文所使用的，术语“包含”是指包括但不限于术语“包含”之后的一个或多个组分或者一个或多个特征。术语“包含”之后的一个或多个组分或者一个或多个特征是必需的或强制性的，但是实施例可以进一步包括其他非强制性的或任选的一个或多个组分或者一个或多个特征。
由......组成：如本文所使用的，术语“由......组成”是指包括且限于在术语“由......组成”之后的一个或多个组分或者一个或多个特征。因此，术语“由......组成”之后的一个或多个组分或者一个或多个特征是必需的或强制性的，并且在实施例中不存在其他非强制性的或任选的一个或多个组分或者一个或多个特征。
表达：术语“表达”包括涉及变体产生的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：如本文所使用的，术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，该分子包含编码变体的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。此类控制序列可包括用于影响转录的启动子、用于控制转录的任选操纵子序列、编码mRNA上合适的核糖体结合位点的序列、以及控制转录和翻译的终止的序列。不同的细胞类型可以与不同的表达载体一起使用。
片段：术语“片段”意指具有在成熟多肽的氨基和/或羧基末端不存在的一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有甘露聚糖酶活性。在一个方面，片段含有至少250个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸250至300)、至少260个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸260至300)、至少270个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸270至300)、或至少285个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2的氨基酸285至300)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。可用于本发明的宿主细胞通常是原核或真核宿主，包括其中可实现表达的任何可转化微生物。使用重组DNA技术，用构建的载体转化或转染宿主细胞。此类转化的宿主细胞可能能够进行以下中的一者或两者：复制编码本发明变体的载体和表达所需的肽产物。
改善的特性：如本文所使用的，术语“改善的特性”是指与亲本相比有所改善的、与变体相关的特征。此类改善的特性包括但不限于：催化效率、催化速率、洗涤剂内稳定性(in-detergent stability)、化学稳定性、氧化稳定性、pH活性、pH稳定性、比活性、在贮存条件下的稳定性、底物结合、底物切割、底物特异性、底物稳定性、表面特性、热活性、以及热稳定性。
洗涤剂内稳定性:如本文所使用的，术语“洗涤剂内稳定性”是指甘露聚糖酶当在洗涤剂中孵育时的稳定性，无论是野生型、亲本或变体形式。出于本发明的目的，可以如实例3中所示确定洗涤剂内稳定性。
分离的：如本文所使用的，术语“分离的”是指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子的使用)。分离的物质可以存在于发酵液样品中。
成熟多肽：如本文所使用的，术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰(例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等)之后处于其最终形式的多肽。在一个方面，基于预测SEQ ID NO:1的氨基酸-28至-1是信号肽的SignalP 3.0预测(使用在***上训练的神经网络(NN)和隐马尔可夫模型(HMM))，该成熟多肽是SEQ ID NO:1的氨基酸1至298。在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。
成熟多肽编码序列：如本文所使用的，术语“成熟多肽编码序列”是指编码具有甘露聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。在一个方面，成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸218至1111。
突变体：如本文所使用的，术语“突变体”是指编码变体的多核苷酸。
核酸构建体：如本文所使用的，术语“核酸构建体”是指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成含有核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。
可操作地连接：如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指如下构型，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置处，从而使得该控制序列指导该编码序列的表达。因此，“可操作地连接”意指具有已知或所需活性的调节区或功能结构域(例如启动子、终止子、信号序列或增强子区)以如下方式附接至或连接至靶标(例如，基因或多肽)，这种方式允许调节区或功能结构域根据其已知或所需活性控制该靶标的表达、分泌或功能。
亲本或亲本甘露聚糖酶：如本文所使用的，术语“亲本”、“亲本甘露聚糖酶”或“亲本多肽”是指对其作出修饰以产生本发明的这些酶变体的具有甘露聚糖酶活性的任何多肽。在本发明中，应理解的是，亲本多肽既是指在一个或多个氨基酸位置处不包括人造取代、***或缺失的天然存在的多肽，又是指非天然存在的多肽(例如杂合子)或包含人造修饰的多肽。类似地，术语“亲本”相对于多核苷酸，是指不包括人造核苷变化的天然存在的多核苷酸和非天然存在的多核苷酸(例如杂合子)或包含人造修饰的多核苷酸。编码亲本多肽的多核苷酸不限于天然存在的多核苷酸，而是涵盖编码该亲本多肽的任何多核苷酸。亲本甘露聚糖酶可以是与SEQ ID NO:1或2具有至少58％、60％，例如至少62％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％序列同一性的任何甘露聚糖酶。在本发明的一个特定方面，亲本甘露聚糖酶是SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ IDNO:2具有至少58％序列同一性的多肽。
多肽或酶：术语“多肽”和“酶”可以互换地使用，以指包含由肽键连接的氨基酸残基的任何长度的聚合物。本文使用了常规的氨基酸残基的单字母或三字母密码。该聚合物可以是线性或支链聚合物，可以包含经修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸阻断。这些术语也涵盖已经被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分偶联。该定义还包括，例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。
序列同一性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列同一性”来描述。如本文所使用的，“序列同一性百分比(％)”相对于本文鉴定的氨基酸或核苷酸序列，被定义为在比对序列和(如果需要的话)引入空位(以便获得最大的序列同一性百分比)并且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，在候选序列中的氨基酸残基或核苷酸与在甘露聚糖酶序列(如SEQ ID NO:1的序列或SEQ ID NO:2的序列)中的氨基酸残基或核苷酸或者对于序列为SEQ ID NO:3的核苷酸相同的百分比。
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman-Wunsch algorithm)(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,TrendsGenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的尼德尔(Needle)程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,见上文)来确定两个脱氧核苷酸序列之间的序列同一性，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，Rice等人,2000,见上文)(优选版本5.0.0或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10，空位延伸罚分0.5，以及EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版本)取代矩阵。使用尼德尔标记的“最长同一性”的输出(使用非简化(-nobrief)选项获得)作为同一性百分比并且如下计算：
(同一的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
变体：如本文所使用的，术语“变体”是指具有甘露聚糖酶活性的、在一个位置处包含修饰(即，取代或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替换占用某一位置的氨基酸；并且缺失意指去除占用某一位置的氨基酸。本发明的变体具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的成熟多肽的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的甘露聚糖酶活性。
野生型甘露聚糖酶：如本文所使用的，术语“野生型甘露聚糖酶”是指由天然存在的微生物(例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌)表达的甘露聚糖酶。
本发明中引用的序列
SEQ ID NO:1是包括信号肽的亲本甘露聚糖酶。
SEQ ID NO:2是SEQ ID NO 1的成熟多肽。
SEQ ID NO:3是编码SEQ ID NO:1的多肽的核苷酸序列。
SEQ ID NO:4是成熟蛋白酶。
变体命名惯例
出于本发明的目的，将SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽用以确定另一种甘露聚糖酶中的相对应的氨基酸残基。另一种甘露聚糖酶的氨基酸序列与在SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽进行比对，并且基于该比对，使用尼德曼-翁施算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定对应于SEQ ID NO:2中披露的成熟多肽中的任何氨基酸残基的氨基酸位置编号，该算法如EMBOSS软件包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件(The European Molecular Biology Open Software Suite)，Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选版本5.0.0或更新版本)的尼德尔程序所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5、以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)取代矩阵。
可以通过使用若干计算机程序，使用其对应默认参数比对多个多肽序列来确定在另一种甘露聚糖酶中的对应氨基酸残基的鉴定，这些计算机程序包括但不限于MUSCLE(通过对数预期的多序列比较；版本3.5或更新版本；Edgar,2004,Nucleic Acids Research[核酸研究]32:1792-1797)，MAFFT(版本6.857或更新版本；Katoh和Kuma,2002,Nucleic AcidsResearch[核酸研究]30:3059-3066；Katoh等人,2005,Nucleic Acids Research[核酸研究]33:511-518；Katoh和Toh,2007,Bioinformatics[生物信息学]23:372-374；Katoh等人,2009,Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]537:39-64；Katoh和Toh,2010,Bioinformatics[生物信息学]26:1899-1900)，以及采用ClustalW(1.83或更新版本；Thompson等人,1994,Nucleic Acids Research[核酸研究]22:4673-4680)的EMBOSS EMMA。
当其他酶与SEQ ID NO:2的成熟多肽相背离，这样使得传统的基于序列的比较方法不能检测其相互关系时(Lindahl和Elofsson,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]295:613-615)，可使用其他成对序列比较算法。在基于序列的搜索中较高的敏感度可使用搜索程序来获得，这些搜索程序利用多肽家族的概率表现(谱)来搜索数据库。例如，PSI-BLAST程序通过迭代数据库搜索过程来产生多个谱，并且能够检测远距离同源物(Atschul等人,1997,Nucleic Acids Res.[核酸研究]25:3389-3402)。如果多肽的家族或超家族具有在蛋白结构数据库中的一个或多个代表，可以实现甚至更高的敏感度。程序例如GenTHREADER(Jones,1999,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]287:797-815；McGuffin和Jones,2003,Bioinformatics[生物信息学]19:874-881)利用来自多种来源(PSI-BLAST、二级结构预测、结构比对谱、以及溶剂化势)的信息作为预测查询序列的结构折叠的神经网络的输入。类似地，Gough等人,2000,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]313:903-919的方法可用于将未知结构的序列与存在于SCOP数据库中的超家族模型进行比对。这些比对进而可以用于产生多肽的同源性模型，并且使用出于该目的而开发的多种工具可以评估此类模型的准确度。
对于已知结构的蛋白质，若干工具和资源可用于检索并产生结构比对。例如，蛋白质的SCOP超家族已经在结构上进行比对，并且那些比对是可访问且可下载的。可以使用多种算法例如距离比对矩阵(Holm和Sander,1998,Proteins[蛋白质]33:88-96)或组合延伸(Shindyalov和Bourne,1998,Protein Engineering[蛋白质工程]11:739-747)比对两种或更多种蛋白质结构，并且这些算法的实施可以另外用于查询具有感兴趣结构的结构数据库，以便发现可能的结构同源物(例如，Holm和Park,2000,Bioinformatics[生物信息学]16:566-567)。
在描述本发明的变体中，为了便于参考，对以下所述的命名法进行了改编。采用了已接受的IUPAC单字母或三字母的氨基酸缩写。
取代.对于氨基酸取代，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、被取代的氨基酸。因此，将在位置226处的苏氨酸被丙氨酸取代表示为“Thr226Ala”或“T226A”。多个突变通过加号(“+”)分开，例如“Gly205Arg+Ser411Phe”或“G205R+S411F”代表在位置205和位置411处的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)分别被精氨酸(R)和苯丙氨酸(F)取代。
缺失.对于氨基酸缺失，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、*。因此，将在位置195处的甘氨酸的缺失表示为“Gly195*”或“G195*”。多个缺失由加号(“+”)分开，例如，“Gly195*+Ser411*”或“G195*+S411*”。
***.对于氨基酸***，使用以下命名法：原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***的氨基酸。因此，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸表示为“Gly195GlyLys”或“G195GK”。多个氨基酸的***被表示为[原始氨基酸、位置、原始氨基酸、***的氨基酸#1、***的氨基酸#2；等]。例如，将在位置195处的甘氨酸之后***赖氨酸和丙氨酸表示为“Gly195GlyLysAla”或“G195GKA”。
在此类情况下，通过将小写字母添加至在所***的一个或多个氨基酸残基之前的氨基酸残基的位置编号而对所***的一个或多个氨基酸残基进行编号。在以上实例中，该序列因此会是：
<u>亲本：</u> <u>变体：</u>
195 195 195a 195b
G G-K-A
多个修饰.包含多个修饰的变体由加号(“+”)分开，例如“Arg170Tyr+Gly195Glu”或“R170Y+G195E”代表在位置170和位置195处的精氨酸和甘氨酸分别被酪氨酸和谷氨酸取代。
不同修饰.在某个位置处可以引入不同修饰的情况下，这些不同的修饰由逗号分开，例如“Arg170Tyr,Glu”代表在位置170处的精氨酸被酪氨酸或谷氨酸取代。因此，“Tyr167Gly,Ala+Arg170Gly,Ala”表示以下变体：“Tyr167Gly+Arg170Gly”、“Tyr167Gly+Arg170Ala”、“Tyr167Ala+Arg170Gly”、和“Tyr167Ala+Arg170Ala”。
具体实施方式
本发明涉及分离的甘露聚糖酶变体，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
本发明的发明人已经发现，在上述(a)所列位置之一中的修饰提供了与亲本甘露聚糖酶相比(即，在所列位置中的任一处不包含修饰的甘露聚糖酶)具有改善的稳定性的甘露聚糖酶变体。因此，当变体具有(a)所列位置中的至少一个时，观察到甘露聚糖酶变体的改善。当将(a)所列位置与任何其他修饰组合时，已经观察到稳定性得到维持。因此，这些位置被认为对于甘露聚糖酶的稳定性是重要的。特别地，该稳定性可以被观察为洗涤剂组合物中的稳定性。此类洗涤剂稳定性可以如实例3中所述确定，即通过在洗涤剂中孵育变体(例如在40℃下持续24小时或在45℃下持续16小时)，然后测量残余活性。该残余活性与在4℃下孵育相同小时数的亲本甘露聚糖酶的残余活性相关/与其进行比较。甘露聚糖酶变体的改善以半衰期改善因子(HIF)给出。
因此，本发明提供了亲本甘露聚糖酶的变体，其中该变体在位置260、288、294和295中的一个或多个处包含至少一个取代，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，并且在氨基酸序列中任何其他位置的位置处包含至少一个第二(或另外的)取代。如本文所使用的，术语“第二取代”或“另外的取代”应理解为不在以下位置260、288、294和295中的任一处的取代。然而，根据本发明的变体可以在位置260、288、294和295中的任一处包含超过一个取代。此外，术语“第二取代”应理解为“至少一个第二取代”，即第二取代可以在一个或多个位置上。
洗涤剂组合物中的稳定性在本文中可以称为“洗涤剂内稳定性”，并且属于本文中别处描述的定义。这些术语可以互换地使用，但构成本发明的相同含义和目的。如实例中所述已确定了稳定性。
从实例可以看出，所有披露的变体都具有改善的稳定性，特别是在应力下测试时。通过改变(即升高pH)，孵育更长/延长的时间段，改变的(即升高的)温度和/或在蛋白酶的存在下，可以增加根据本发明的这种应力。
应理解的是，本发明的变体包含至少两个修饰(例如取代)，这意味着这些变体可在(a)中所列位置之一处包含取代，然后一个或多个第二/另外的取代在本文披露的任何其他位置上。然而，还应理解的是，本发明的变体可以是如下变体，这些变体在(a)中所列位置的超过一个处(即在两个、三个或全部四个位置处)包含取代。因此，本发明的实施例涵盖如下变体，这些变体在以下位置包含取代或由其组成：260+288、260+294、260+295、288+294、288+295、294+295、260+288+294、260+288+295、260+294+295、288+294+295、和260+288+294+295。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260和288的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260和294的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置288和294的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置288和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置294和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260、288和294的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260、288和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260、294和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置288、294和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，甘露聚糖酶变体在对应于SEQ ID NO:2的位置260、288、294和295的位置处包含修饰，并且第二修饰选自所述变体中的任何其他位置。
在一个实施例中，该改变是取代。在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置260的位置处的取代是F、Y、L或T，优选是F。在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置288的位置处的取代是I。在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置294的位置处的取代是P、K、I、R、V或H，优选是P。在一个实施例中，在对应于SEQ ID NO:2的位置295的位置处的取代是K、V、P、L、R、A、N、M或I，优选是P或V。
在一个实施例中，该改变是缺失。
在实施例中，该至少一个第二取代在选自以下位置中的至少一个或多个位置上：1、2、3、4、5、6、8、11、13、14、18、30、32、33、34、35、37、41、45、47、57、59、60、63、65、70、71、74、77、78、80、82、83、93、95、97、98、100、104、108、111、114、116、118、119、131、133、135、136、139、142、143、150、169、172、174、176、177、180、183、184、185、196、200、202、203、205、210、213、228、229、234、235、241、243、244、250、254、257、262、266、268、270、272、273、276、279、280、283、286、290、296、和298，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
当改善因子(IF)大于1.0时，这意味着与亲本甘露聚糖酶相比，测试的变体具有改善的特性，例如改善的稳定性。
可以在对应于以下位置的任一位置处进行取代：1、2、3、5、6、8、9、10、11、13、14、16、17、18、19、21、35、37、38、39、41、44、45、47、59、60、62、65、67、68、70、71、74、77、78、79、80、81、82、83、93、95、96、97、98、100、104、107、110、111、114、115、116、118、119、132、133、135、136、139、142、143、147、150、152、154、164、167、169、174、175、176、177、180、181、183、184、185、199、200、202、203、205、206、210、212、213、214、215、226、229、234、235、241、242、243、244、254、257、258、259、260、261、267、270、273、276、279、280、283、285、286、288、289、290、292、293、294、295、296、299、和301，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
除非本文明确披露，否则氨基酸残基或位置的编号根据SEQ ID NO:2进行。
在一个实施例中，该一个或多个位置选自SEQ ID NO:2的多肽的位置14、37、47、77、81、82、83、93、98、116、135、136、241、242、257、和258。
特别地，甘露聚糖酶变体在选自以下位置组的位置上包含两个修饰：14+260、14+288、14+294、14+295、37+260、37+288、37+294、37+295、47+260、47+288、47+294、47+295、77+260、77+288、77+294、77+295、81+260、81+288、81+294、81+295、82+260、82+288、82+294、82+295、83+260、83+288、83+294、83+295、93+260、93+288、93+294、93+295、98+260、98+288、98+294、98+295、116+260、116+288、116+294、116+295、135+260、135+288、135+294、135+295、136+260、136+288、136+294、136+295、241+260、241+288、241+294、241+295、242+260、242+288、242+294、242+295、257+260、257+288、257+294、257+295、258+260、258+288、258+294、258+295、和260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个实施例中，该至少两个取代选自以下位置的组：14+260、14+288、14+294、14+295、37+260、37+288、37+294、37+295、47+260、47+288、47+294、47+295、77+260、77+288、77+294、77+295、81+260、81+288、81+294、81+295、82+260、82+288、82+294、82+295、83+260、83+288、83+294、83+295、93+260、93+288、93+294、93+295、98+260、98+288、98+294、98+295、116+260、116+288、116+294、116+295、135+260、135+288、135+294、135+295、136+260、136+288、136+294、136+295、241+260、241+288、241+294、241+295、242+260、242+288、242+294、242+295、257+260、257+288、257+294、257+295、258+260、258+288、258+294、258+295、和260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个实施例中，该至少第二取代在SEQ ID NO:2的多肽的位置93和136中的一个或两个上。
具体地，本发明涉及在以下位置的组中包含取代的甘露聚糖酶变体：14+93+260、14+93+288、14+93+294、14+93+295、37+93+260、37+93+288、37+93+294、37+93+295、47+93+260、47+93+288、47+93+294、47+93+295、77+93+260、77+93+288、77+93+294、77+93+295、81+93+260、81+93+288、81+93+294、81+93+295、82+93+260、82+93+288、82+93+294、82+93+295、83+93+260、83+93+288、83+93+294、83+93+295、93+98+260、93+98+288、93+98+294、93+98+295、93+116+260、93+116+288、93+116+294、93+116+295、93+135+260、93+135+288、93+135+294、93+135+295、93+136+260、93+136+288、93+136+294、93+136+295、93+241+260、93+241+288、93+241+294、93+241+295、93+242+260、93+242+288、93+242+294、93+242+295、93+257+260、93+257+288、93+257+294、93+257+295、93+258+260、93+258+288、93+258+294、93+258+295、和93+260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在另一个实施例中，本发明涉及在以下位置的组中包含取代的甘露聚糖酶变体：14+136+260、14+136+288、14+136+294、14+136+295、37+136+260、37+136+288、37+136+294、37+136+295、47+136+260、47+136+288、47+136+294、47+136+295、77+136+260、77+136+288、77+136+294、77+136+295、81+136+260、81+136+288、81+136+294、81+136+295、82+136+260、82+136+288、82+136+294、82+136+295、83+136+260、83+136+288、83+136+294、83+136+295、93+136+260、93+136+288、93+136+294、93+136+295、98+136+260、98+136+288、98+136+294、98+136+295、116+136+260、116+136+288、116+136+294、116+136+295、135+136+260、135+136+288、135+136+294、135+136+295、136+241+260、136+241+288、136+241+294、136+241+295、136+242+260、136+242+288、136+242+294、136+242+295、136+257+260、136+257+288、136+257+294、136+257+295、136+258+260、136+258+288、136+258+294、136+258+295、和136+260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在另一个实施例中，本发明涉及在以下位置的组中包含取代的甘露聚糖酶变体：14+93+136+260、14+93+136+288、14+93+136+294、14+93+136+295、37+93+136+260、37+93+136+288、37+93+136+294、37+93+136+295、47+93+136+260、47+93+136+288、47+93+136+294、47+93+136+295、77+93+136+260、77+93+136+288、77+93+136+294、77+93+136+295、81+93+136+260、81+93+136+288、81+93+136+294、81+93+136+295、82+93+136+260、82+93+136+288、82+93+136+294、82+93+136+295、83+93+136+260、83+93+136+288、83+93+136+294、83+93+136+295、93+136+260、93+136+288、93+136+294、93+136+295、93+98+136+260、93+98+136+288、93+98+136+294、93+98+136+295、93+116+136+260、93+116+136+288、93+116+136+294、93+116+136+295、93+135+136+260、93+135+136+288、93+135+136+294、93+135+136+295、93+136+260、93+136+288、93+136+294、93+136+295、93+136+241+260、93+136+241+288、93+136+241+294、93+136+241+295、93+136+242+260、93+136+242+288、93+136+242+294、93+136+242+295、93+136+257+260、93+136+257+288、93+136+257+294、93+136+257+295、93+136+258+260、93+136+258+288、93+136+258+294、93+136+258+295、和93+136+260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
在一个实施例中，该至少两个取代选自A1G、A1V、N2E、S3P、G4D、F5H、Y6H、Y6M、Y6F、Y6W、Y6H、S8T、S8P、S8R、T11K、T11R、Y13F、D14S、D14K、N18V、N18R、A30T、Y32F、Y32W、K33Q、D34G、Q35L、T37P、E41V、E41N、N45G、G47S、G47A、D57N、G59Q、Q60R、K63R、K63Q、D65E、R70K、N71S、S74K、E77T、E77N、D78G、H80K、V82R、V82I、V82S、A83P、A83S、Y93Q、Y93A、S95D、A97R、S98P、S98D、N100Y、D104A、D104G、E108S、S111A、S111K、S111R、I114Q、I114M、I114W、K116R、D118K、T119R、S131T、E133R、E133Q、D135P、A136P、D139A、D139R、K142M、K142V、K142S、K142R、Q143R、N150T、N150R、N150S、Q169A、Q169R、Q169K、H172R、Y174R、Y174L、Y174W、Y174F、R176Q、E177S、E177Y、N180R、P183T、P183G、Q184E、Q184K、R185G、Y196W、Y196F、N200T、S202R、Q203T、R205K、R210L、R210G、R210M、N213V、N213D、T228S、N229D、E234F、E234Y、A235K、A235R、S241C、Q243K、Q243E、R244K、R244V、A250G、K254Y、G257W、G257E、G257A、G257G、W260F、W260Y、W260L、W260T、Y262F、S266A、D268N、A270D、N272M、N272T、N273E、N273D、A276E、A276W、A276D、N279D、N279E、T280L、N283W、N283H、Y286W、Y286F、L288I、E290A、L294P、L294K、L294I、L294R、L294V、L294H、S295K、S295V、S295P、S295L、S295R、S295A、S295N、S295M、S295I、T296S、和F298Y。
因此，该至少两个取代可以是本文所列的那些的任何组合。此类至少两个取代可以选自由以下组成的组：A1G+N2E、A1G+S3P、A1G+G4D、A1G+F5H、A1G+Y6H、A1G+Y6M、A1G+Y6F、A1G+Y6W、A1G+Y6H、A1G+S8T、A1G+S8P、A1G+S8R、A1G+T11K、A1G+T11R、A1G+Y13F、A1G+D14S、A1G+D14K、A1G+N18V、A1G+N18R、A1G+A30T、A1G+Y32F、A1G+Y32W、A1G+K33Q、A1G+D34G、A1G+Q35L、A1G+T37P、A1G+E41V、A1G+E41N、A1G+N45G、A1G+G47S、A1G+G47A、A1G+D57N、A1G+G59Q、A1G+Q60R、A1G+K63R、A1G+K63Q、A1G+D65E、A1G+R70K、A1G+N71S、A1G+S74K、A1G+E77T、A1G+E77N、A1G+D78G、A1G+H80K、A1G+V82R、A1G+V82I、A1G+V82S、A1G+A83P、A1G+A83S、A1G+Y93Q、A1G+Y93A、A1G+S95D、A1G+A97R、A1G+S98P、A1G+S98D、A1G+N100Y、A1G+D104A、A1G+D104G、A1G+E108S、A1G+S111A、A1G+S111K、A1G+S111R、A1G+I114Q、A1G+I114M、A1G+I114W、A1G+K116R、A1G+D118K、A1G+T119R、A1G+S131T、A1G+E133R、A1G+E133Q、A1G+D135P、A1G+A136P、A1G+D139A、A1G+D139R、A1G+K142M、A1G+K142V、A1G+K142S、A1G+K142R、A1G+Q143R、A1G+N150T、A1G+N150R、A1G+N150S、A1G+Q169A、A1G+Q169R、A1G+Q169K、A1G+H172R、A1G+Y174R、A1G+Y174L、A1G+Y174W、A1G+Y174F、A1G+R176Q、A1G+E177S、A1G+E177Y、A1G+N180R、A1G+P183T、A1G+P183G、A1G+Q184E、A1G+Q184K、A1G+R185G、A1G+Y196W、A1G+Y196F、A1G+N200T、A1G+S202R、A1G+Q203T、A1G+R205K、A1G+R210L、A1G+R210G、A1G+R210M、A1G+N213V、A1G+N213D、A1G+T228S、A1G+N229D、A1G+E234F、A1G+E234Y、A1G+A235K、A1G+A235R、A1G+S241C、A1G+Q243K、A1G+Q243E、A1G+R244K、A1G+R244V、A1G+A250G、A1G+K254Y、A1G+G257W、A1G+G257E、A1G+G257A、A1G+W260F、A1G+Y262F、A1G+S266A、A1G+D268N、A1G+A270D、A1G+N272M、A1G+N272T、A1G+N273E、A1G+N273D、A1G+A276E、A1G+A276W、A1G+A276D、A1G+N279D、A1G+N279E、A1G+T280L、A1G+N283W、A1G+N283H、A1G+Y286W、A1G+Y286F、A1G+L288I、A1G+E290A、A1G+L294P、A1G+L294K、A1G+L294I、A1G+L294R、A1G+L294V、A1G+L294H、A1G+S295K、A1G+S295V、A1G+S295P、A1G+S295L、A1G+S295R、A1G+S295A、A1G+S295N、A1G+S295M、A1G+S295I、A1G+T296S、A1G+F298Y、A1V+N2E、A1V+S3P、A1V+G4D、A1V+F5H、A1V+Y6H、A1V+Y6M、A1V+Y6F、A1V+Y6W、A1V+Y6H、A1V+S8T、A1V+S8P、A1V+S8R、A1V+T11K、A1V+T11R、A1V+Y13F、A1V+D14S、A1V+D14K、A1V+N18V、A1V+N18R、A1V+A30T、A1V+Y32F、A1V+Y32W、A1V+K33Q、A1V+D34G、A1V+Q35L、A1V+T37P、A1V+E41V、A1V+E41N、A1V+N45G、A1V+G47S、A1V+G47A、A1V+D57N、A1V+G59Q、A1V+Q60R、A1V+K63R、A1V+K63Q、A1V+D65E、A1V+R70K、A1V+N71S、A1V+S74K、A1V+E77T、A1V+E77N、A1V+D78G、A1V+H80K、A1V+V82R、A1V+V82I、A1V+V82S、A1V+A83P、A1V+A83S、A1V+Y93Q、A1V+Y93A、A1V+S95D、A1V+A97R、A1V+S98P、A1V+S98D、A1V+N100Y、A1V+D104A、A1V+D104G、A1V+E108S、A1V+S111A、A1V+S111K、A1V+S111R、A1V+I114Q、A1V+I114M、A1V+I114W、A1V+K116R、A1V+D118K、A1V+T119R、A1V+S131T、A1V+E133R、A1V+E133Q、A1V+D135P、A1V+A136P、A1V+D139A、A1V+D139R、A1V+K142M、A1V+K142V、A1V+K142S、A1V+K142R、A1V+Q143R、A1V+N150T、A1V+N150R、A1V+N150S、A1V+Q169A、A1V+Q169R、A1V+Q169K、A1V+H172R、A1V+Y174R、A1V+Y174L、A1V+Y174W、A1V+Y174F、A1V+R176Q、A1V+E177S、A1V+E177Y、A1V+N180R、A1V+P183T、A1V+P183G、A1V+Q184E、A1V+Q184K、A1V+R185G、A1V+Y196W、A1V+Y196F、A1V+N200T、A1V+S202R、A1V+Q203T、A1V+R205K、A1V+R210L、A1V+R210G、A1V+R210M、A1V+N213V、A1V+N213D、A1V+T228S、A1V+N229D、A1V+E234F、A1V+E234Y、A1V+A235K、A1V+A235R、A1V+S241C、A1V+Q243K、A1V+Q243E、A1V+R244K、A1V+R244V、A1V+A250G、A1V+K254Y、A1V+G257W、A1V+G257E、A1V+G257A、A1V+W260F、A1V+W260Y、A1V+W260L、A1V+W260T、A1V+Y262F、A1V+S266A、A1V+D268N、A1V+A270D、A1V+N272M、A1V+N272T、A1V+N273E、A1V+N273D、A1V+A276E、A1V+A276W、A1V+A276D、A1V+N279D、A1V+N279E、A1V+T280L、A1V+N283W、A1V+N283H、A1V+Y286W、A1V+Y286F、A1V+L288I、A1V+E290A、A1V+L294P、A1V+L294K、A1V+L294I、A1V+L294R、A1V+L294V、A1V+L294H、A1V+S295K、A1V+S295V、A1V+S295P、A1V+S295L、A1V+S295R、A1V+S295A、A1V+S295N、A1V+S295M、A1V+S295I、A1V+T296S、A1V+F298Y、N2E+S3P、N2E+G4D、N2E+F5H、N2E+Y6H、N2E+Y6M、N2E+Y6F、N2E+Y6W、N2E+Y6H、N2E+S8T、N2E+S8P、N2E+S8R、N2E+T11K、N2E+T11R、N2E+Y13F、N2E+D14S、N2E+D14K、N2E+N18V、N2E+N18R、N2E+A30T、N2E+Y32F、N2E+Y32W、N2E+K33Q、N2E+D34G、N2E+Q35L、N2E+T37P、N2E+E41V、N2E+E41N、N2E+N45G、N2E+G47S、N2E+G47A、N2E+D57N、N2E+G59Q、N2E+Q60R、N2E+K63R、N2E+K63Q、N2E+D65E、N2E+R70K、N2E+N71S、N2E+S74K、N2E+E77T、N2E+E77N、N2E+D78G、N2E+H80K、N2E+V82R、N2E+V82I、N2E+V82S、N2E+A83P、N2E+A83S、N2E+Y93Q、N2E+Y93A、N2E+S95D、N2E+A97R、N2E+S98P、N2E+S98D、N2E+N100Y、N2E+D104A、N2E+D104G、N2E+E108S、N2E+S111A、N2E+S111K、N2E+S111R、N2E+I114Q、N2E+I114M、N2E+I114W、N2E+K116R、N2E+D118K、N2E+T119R、N2E+S131T、N2E+E133R、N2E+E133Q、N2E+D135P、N2E+A136P、N2E+D139A、N2E+D139R、N2E+K142M、N2E+K142V、N2E+K142S、N2E+K142R、N2E+Q143R、N2E+N150T、N2E+N150R、N2E+N150S、N2E+Q169A、N2E+Q169R、N2E+Q169K、N2E+H172R、N2E+Y174R、N2E+Y174L、N2E+Y174W、N2E+Y174F、N2E+R176Q、N2E+E177S、N2E+E177Y、N2E+N180R、N2E+P183T、N2E+P183G、N2E+Q184E、N2E+Q184K、N2E+R185G、N2E+Y196W、N2E+Y196F、N2E+N200T、N2E+S202R、N2E+Q203T、N2E+R205K、N2E+R210L、N2E+R210G、N2E+R210M、N2E+N213V、N2E+N213D、N2E+T228S、N2E+N229D、N2E+E234F、N2E+E234Y、N2E+A235K、N2E+A235R、N2E+S241C、N2E+Q243K、N2E+Q243E、N2E+R244K、N2E+R244V、N2E+A250G、N2E+K254Y、N2E+G257W、N2E+G257E、N2E+G257A、N2E+W260F、N2E+W260Y、N2E+W260L、N2E+W260T、N2E+Y262F、N2E+S266A、N2E+D268N、N2E+A270D、N2E+N272M、N2E+N272T、N2E+N273E、N2E+N273D、N2E+A276E、N2E+A276W、N2E+A276D、N2E+N279D、N2E+N279E、N2E+T280L、N2E+N283W、N2E+N283H、N2E+Y286W、N2E+Y286F、N2E+L288I、N2E+E290A、N2E+L294P、N2E+L294K、N2E+L294I、N2E+L294R、N2E+L294V、N2E+L294H、N2E+S295K、N2E+S295V、N2E+S295P、N2E+S295L、N2E+S295R、N2E+S295A、N2E+S295N、N2E+S295M、N2E+S295I、N2E+T296S、N2E+F298Y、S3P+G4D、S3P+F5H、S3P+Y6H、S3P+Y6M、S3P+Y6F、S3P+Y6W、S3P+Y6H、S3P+S8T、S3P+S8P、S3P+S8R、S3P+T11K、S3P+T11R、S3P+Y13F、S3P+D14S、S3P+D14K、S3P+N18V、S3P+N18R、S3P+A30T、S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S、N279D+F298Y、W260Y+N279E、W260L+N279E、W260T+N279E、N279E+T280L、N279E+N283W、N279E+N283H、N279E+Y286W、N279E+Y286F、N279E+L288I、N279E+E290A、N279E+L294P、N279E+L294K、N279E+L294I、N279E+L294R、N279E+L294V、N279E+L294H、N279E+S295K、N279E+S295V、N279E+S295P、N279E+S295L、N279E+S295R、N279E+S295A、N279E+S295N、N279E+S295M、N279E+S295I、N279E+T296S、N279E+F298Y、W260Y+T280L、W260L+T280L、W260T+T280L、T280L+N283W、T280L+N283H、T280L+Y286W、T280L+Y286F、T280L+L288I、T280L+E290A、T280L+L294P、T280L+L294K、T280L+L294I、T280L+L294R、T280L+L294V、T280L+L294H、T280L+S295K、T280L+S295V、T280L+S295P、T280L+S295L、T280L+S295R、T280L+S295A、T280L+S295N、T280L+S295M、T280L+S295I、T280L+T296S、T280L+F298Y、W260Y+N283W、W260L+N283W、W260T+N283W、N283W+Y286W、N283W+Y286F、N283W+L288I、N283W+E290A、N283W+L294P、N283W+L294K、N283W+L294I、N283W+L294R、N283W+L294V、N283W+L294H、N283W+S295K、N283W+S295V、N283W+S295P、N283W+S295L、N283W+S295R、N283W+S295A、N283W+S295N、N283W+S295M、N283W+S295I、N283W+T296S、N283W+F298Y、W260Y+N283H、W260L+N283H、W260T+N283H、N283H+Y286W、N283H+Y286F、N283H+L288I、N283H+E290A、N283H+L294P、N283H+L294K、N283H+L294I、N283H+L294R、N283H+L294V、N283H+L294H、N283H+S295K、N283H+S295V、N283H+S295P、N283H+S295L、N283H+S295R、N283H+S295A、N283H+S295N、N283H+S295M、N283H+S295I、N283H+T296S、W260Y+Y286W、W260L+Y286W、W260T+Y286W、Y286W+L288I、Y286W+E290A、Y286W+L294P、Y286W+L294K、Y286W+L294I、Y286W+L294R、Y286W+L294V、Y286W+L294H、Y286W+S295K、Y286W+S295V、Y286W+S295P、Y286W+S295L、Y286W+S295R、Y286W+S295A、Y286W+S295N、Y286W+S295M、Y286W+S295I、Y286W+T296S、Y286W+F298Y、W260Y+Y286F、W260L+Y286F、W260T+Y286F、Y286F+L288I、Y286F+E290A、Y286F+L294P、Y286F+L294K、Y286F8+L294I、Y286F+L294R、Y286F+L294V、Y286F+L294H、Y286F+S295K、Y286F+S295V、Y286F+S295P、Y286F+S295L、Y286F+S295R、Y286F+S295A、Y286F+S295N、Y286F+S295M、Y286F+S295I、Y286F+T296S、Y286F+F298Y、W260Y+L288I、W260L+L288I、W260T+L288I、L288I+E290A、L288I+L294P、L288I+L294K、L288I+L294I、L288I+L294R、L288I+L294V、L288I+L294H、L288I+S295K、L288I+S295V、L288I+S295P、L288I+S295L、L288I+S295R、L288I+S295A、L288I+S295N、L288I+S295M、L288I+S295I、L288I+T296S、L288I+F298Y、W260Y+E290A、W260L+E290A、W260T+E290A、E290A+L294P、E290A+L294K、E290A+L294I、E290A+L294R、E290A+L294V、E290A+L294H、E290A+S295K、E290A+S295V、E290A+S295P、E290A+S295L、E290A+S295R、E290A+S295A、E290A+S295N、E290A+S295M、E290A+S295I、E290A+T296S、E290A+F298Y、W260Y+S294P、W260L+S294P、W260T+S294P、L294P+S295K、L294P+S295V、L294P+S295P、L294P+S295L、L294P+S295R、L294P+S295A、L294P+S295N、L294P+S295M、L294P+S295I、L294P+T296S、L294P+F298Y、W260Y+L294K、W260L+L294K、W260T+L294K、L294K+S295K、L294K+S295V、L294K+S295P、L294K+S295L、L294K+S295R、L294K+S295A、L294K+S295N、L294K+S295M、L294K+S295I、L294K+T296S、L294K+F298Y、W260Y+L294I、W260L+L294I、W260T+L294I、L294I+S295K、L294I+S295V、L294I+S295P、L294I+S295L、L294I+S295R、L294I+S295A、L294I+S295N、L294I+S295M、L294I+S295I、L294I+T296S、L294I+F298Y、W260Y+L294R、W260L+L294R、W260T+L294R、L294R+S295K、L294R+S295V、L294R+S295P、L294R+S295L、L294R+S295R、L294R+S295A、L294R+S295N、L294R+S295M、L294R+S295I、L294R+T296S、L294R+F298Y、W260Y+L294V、W260L+L294V、W260T+L294V、L294V+S295K、L294V+S295V、L294V+S295P、L294V+S295L、L294V+S295R、L294V+S295A、L294V+S295N、L294V+S295M、L294V+S295I、L294V+T296S、L294V+F298Y、W260Y+L294H、W260L+L294H、W260T+L294H、L294H+S295K、L294H+S295V、L294H+S295P、L294H+S295L、L294H+S295R、L294H+S295A、L294H+S295N、L294H+S295M、L294H+S295I、L294H+T296S、L294H+F298Y、W260Y+S295K、W260L+S295K、W260T+S295K、S295K+T296S、S295K+F298Y、W260Y+S295V、W260L+S295V、W260T+S295V、S295V+T296S、S295V+F298Y、W260Y+S295P、W260L+S295P、W260T+S295P、S295P+T296S、S295P+F298Y、W260Y+S295L、W260L+S295L、W260T+S295L、S295L+T296S、S295L+F298Y、W260Y+S295R、W260L+S295R、W260T+S295R、S295R+T296S、S295R+F298Y、W260Y+S295A、W260L+S295A、W260T+S295A、S295A+T296S、S295A+F298Y、W260Y+S295N、W260L+S295N、W260T+S295N、S295N+T296S、S295N+F298Y、W260Y+S295M、W260L+S295M、W260T+S295M、S295M+T296S、S295M+F298Y、W260Y+S295I、W260L+S295I、W260T+S295I、S295I+T296S、S295I+F298Y、W260Y+T296S、W260L+T296S、W260T+T296S、T296S+F298Y、W260Y+F298Y、W260L+F298Y、和W260T+F298Y。
在实施例中，该变体与亲本甘露聚糖酶的氨基酸序列具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
在另一个实施例中，该变体与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、例如至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％、但小于100％的序列同一性。
如上所述，可以如实例中所述确定稳定性，例如洗涤剂内稳定性或热稳定性。
因此，在一个实施例中，当在pH 9.0、10.5和/或10.8下测量时，本发明的变体具有改善的稳定性。特别地，可以在pH 9.0下确定稳定性。
因此，在一个实施例中，该变体选自实例中所示的变体的列表。
稳定性不仅可以在pH 9.0下测定，而且可以在更碱性或更酸性的pH下测定。测量稳定性时的pH值可取决于变体(或酶)需要在其中保持稳定的洗涤剂组合物。因此，本发明还涵盖在其他pH(例如pH 10.8)下的稳定性。因此，在一个实施例中，当在pH 10.8下测量时，本发明的变体具有改善的稳定性。
在一个实施例中，可以在pH 9.0或10.8下测量本发明的变体的改善的稳定性，或者在两个pH即pH 9.0和pH 10.8下都可以看到改善的稳定性。因此在一个实施例中，当在pH9.0和/或pH 10.8下测量稳定性时，该变体与亲本甘露聚糖酶相比具有改善的稳定性。
在一个实施例中，对于在pH 9.0、pH 10.5和/或pH 10.8下的稳定性测量，该变体具有至少为3.0的改善因子。
这些氨基酸改变可以具有微小性质的改变，即，不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或***；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-末端或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一官能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。
保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.Neurath和R.L.Hill,1979,于The Proteins[蛋白质],学术出版社(Academic Press),纽约中描述。常见取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu和Asp/Gly。
可替代地，这些氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，这些氨基酸改变可以改善多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
在另一个实施例中，该变体在对应于如下多肽的位置260的位置处包含取代：SEQID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：W260F、W260L、W260Y、和W260T。
在另一个实施例中，该变体在对应于如下多肽的位置288的位置处包含取代：SEQID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是L288I。
在另一个实施例中，该变体在对应于如下多肽的位置294的位置处包含取代：SEQID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：L294P、L294K、L294I、L294R、L294V、和L294H。
在另一个实施例中，该变体在对应于如下多肽的位置295的位置处包含取代：SEQID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ ID NO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：S295K、S295V、S295P、S295L、S295R、S295A、S295N、S295M、和S295I。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置1的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：A1G和A1V。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置2的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N2E。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置3的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S3P。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置4的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是G4D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置5的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是F5H。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置6的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y6H、Y6M、Y6F、Y6W、和Y6H。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置8的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：S8T、S8P、和S8R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置11的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：T11K和T11R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置13的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Y13F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置14的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：D14S和D14K。
在另一个实施例中，该变体在对应于如下多肽的位置18的位置处包含取代或由其组成：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQID NO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N18V和N18R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置30的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是A30T。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置32的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y32F和Y32W。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置33的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是K33Q。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置34的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D34G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置35的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Q35L。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置37的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是T37P。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置41的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：E41V和E41N。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置45的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N45G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置47的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：G47S和G47A。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置57的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D57N。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置59的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是G59Q。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置60的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Q60R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置63的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：K63R和K63Q。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置65的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D65E。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置70的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是R70K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置71的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N71S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置74的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S74K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置77的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：E77T和E77N。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置78的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D78G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置80的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是H80K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置82的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：V82R、V82I、和V82S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置83的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：A83P和A83S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置93的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y93Q和Y93A。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置95的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S95D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置97的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是A97R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置98的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S98D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置100的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N100Y。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置104的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：D104A和D104G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置108的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是E108S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置111的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：S111A、S111K、和S111R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置114的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：I114Q、I114M、和I114W。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置116的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是K116R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置118的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D118K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置119的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是T119R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置131的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S131T。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置133的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：E133R和E133Q。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置135的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D135P。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置136的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是A136P。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置139的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：D139R和D139A。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置142的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：K142R、K142M、K142S、和K142V。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置143的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Q143R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置150的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N150R、N150T、和N150S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置169的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Q169A、Q169R、和Q169K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置172的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是H172R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置174的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y174R、Y174L、Y174W、和Y174F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置176的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是R176Q。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置177的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：E177S和E177Y。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置180的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N180R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置183的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：P183T和P183G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置184的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Q184E和Q184K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置185的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是R185G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置196的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y196W或Y196F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置200的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N200T。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置202的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S202R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置203的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Q203T。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置205的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是R205K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置210的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：R210M、R210G、和R210L。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置213的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N213V和N213D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置228的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是T228S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置229的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是N229D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置234的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：E234F和E234Y。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置235的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：A235R和A235K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置241的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S241C。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置243的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Q243E和Q243K。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置244的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：R244K和R244V。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置250的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是A250G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置254的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是K254Y。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置257的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：G257W、G257E、G257A、和G257G。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置260的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是W260F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置262的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是Y262F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置266的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是S266A。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置268的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是D268N。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置270的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是A270D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置184的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N272M和N272T。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置273的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N273E和N273D。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置276的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：A276E、A276D,和A276W。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置279的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N279D和N279E。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置280的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是T280L。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置283的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：N283H和N283W。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置286的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：Y286W和Y286F。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置288的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是L288I。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置290的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是E290A。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置294的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：L294R、L294V、L294P、L294H、L294K、和L294I。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置295的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代选自由以下组成的组：S295I、S295K、S295A、S295M、S295N、S295V、S295P、S295L、和S295R。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置296的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是T296S。
在另一个实施例中，该第二取代是在对应于如下多肽的位置298的位置处的取代：SEQ ID NO:2的多肽或者与SEQ ID NO:2的多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％同一性的具有甘露聚糖酶活性的多肽，并且另外与SEQ IDNO:2的甘露聚糖酶相比，该变体具有改善的稳定性。在一个实施例中，该取代是F298Y。
可以根据本领域中已知的程序，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells,1989,Science[科学]244:1081-1085)来鉴定多肽中的必需氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每一残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的甘露聚糖酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见，Hilton等人,1996,J.Biol.Chem.[生物化学杂志]271:4699-4708。酶或其他生物学相互作用的活性部位还可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contract site)氨基酸进行突变。参见例如，de Vos等人,1992,Science[科学]255:306-312；Smith等人,1992,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]224:899-904；Wlodaver等人,1992,FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]309:59-64。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。
这些变体可以由250至300个，例如，260至300个、270至300个、285至300个氨基酸组成。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改善的比活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改善的储存条件下的稳定性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改善的热活性。
在一个实施例中，与亲本酶相比，该变体具有改善的热稳定性。
在一个可替代的方面，本发明涉及一种亲本甘露聚糖酶的分离的甘露聚糖酶变体，其中该变体包含至少两个取代，该至少两个取代在对应于选自3、37、47、77、82、83、93、98、116、135、136、241、257、和258的组的位置的任何两个或更多个位置上，其中根据SEQ IDNO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ IDNO:2的多肽具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
在一个具体实施例中，该变体包含选自下组的至少两个取代：S3P、T37P、G47A、G47S、E77T、V82I、V82R、A83P、Y93Q、Y93C、Y93A、Y93F、Y93I、Y93R、S98P、K116R、D135P、A136P、S241C、G257W、G257E、G257L、G257A、G257S、G257Y、G257F、和P258Q。
与亲本甘露聚糖酶相比，此类可替代的变体已显示具有改善的稳定性。
亲本甘露聚糖酶
该亲本甘露聚糖酶可以是(a)与SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少58％，例如至少65％序列同一性的多肽；(b)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸在低严格条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、(ii)(i)的全长互补序列杂交；或(c)由如下多核苷酸编码的多肽，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少58％，例如至少65％序列同一性。
在一方面，该亲本甘露聚糖酶与具有甘露聚糖酶活性的SEQ ID NO:1的成熟多肽具有至少58％，例如至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个方面，该亲本甘露聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的成熟多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸。
在一方面，该亲本甘露聚糖酶与具有甘露聚糖酶活性的SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。在一个方面，该亲本甘露聚糖酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达20个氨基酸，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20个氨基酸。
在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成。在另一方面，该亲本包含SEQ ID NO:1的成熟多肽或由其组成。
在另一方面，该亲本是SEQ ID NO:2的多肽的、包含至少250个氨基酸残基例如至少270个氨基酸残基以及至少290个氨基酸残基的一个片段。
在另一个实施例中，该亲本是SEQ ID NO:2的多肽的等位基因变体。
在另一方面，该亲本是由如下多核苷酸编码，该多核苷酸在非常低严格条件、低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件或非常高严格条件下与(i)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列、或(ii)(i)或(ii)的全长互补序列杂交(Sambrook等人,1989,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆实验指南],第二版,冷泉港(ColdSpring Harbor),纽约)。
可以使用SEQ ID NO:3的多核苷酸或其子序列、连同SEQ ID NO:2的多肽或其片段来设计核酸探针以根据本领域熟知的方法来鉴别并克隆对来自不同属或物种的菌株的亲本进行编码的DNA。特别地，可以遵循标准DNA印迹程序，使用此类探针来与感兴趣的细胞的基因组DNA或cDNA杂交，以便鉴定和分离其中的相应基因。此类探针可明显短于完整序列，但是长度应为至少15，如至少25、至少35、或至少70个核苷酸。优选地，该核酸探针长度为至少100个核苷酸，例如长度为至少200个核苷酸、至少300个核苷酸、至少400个核苷酸、至少500个核苷酸、至少600个核苷酸、至少700个核苷酸、至少800个核苷酸、或至少900个核苷酸。DNA和RNA探针两者都可使用。典型地将探针进行标记(例如，用32P、3H、35S、生物素、或抗生物素蛋白)，用于检测相应的基因。此类探针涵盖于本发明中。
可以针对与上文所述的探针杂交并编码亲本的DNA来筛选由此类其他菌株制备的基因组DNA或cDNA文库。来自此类其他菌株的基因组DNA或其他DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其他分离技术来分离。可将来自文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝化纤维素或其他适合的运载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列杂交的克隆或DNA，在DNA印迹中使用该运载体材料。
出于本发明的目的，杂交表示多核苷酸与对应于以下的标记的核酸探针杂交：(i)SEQ ID NO:3；(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；(iii)其全长互补序列；或(iv)其子序列；杂交是在非常低的至非常高的严格条件下进行。可以使用例如X-射线胶片或本领域已知的任何其他检测手段来检测在这些条件下核酸探针杂交的分子。
在一个方面，该核酸探针是SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列。在另一个方面，核酸探针是编码以下的多核苷酸：SEQ ID NO:1的多肽；其成熟多肽；或其片段。在另一个方面，核酸探针是SEQ ID NO:3。
在另一个实施例中，该亲本由如下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少58％，例如至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该亲本可以是融合多肽或可切割融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。还可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中在翻译后产生融合多肽(Cooper等人,1993,EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]12:2575-2583；Dawson等人,1994,Science[科学]266:776-779)。
融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不限于在以下文献中披露的位点：Martin等人,2003,J.Ind.Microbiol.Biotechnol.[工业微生物生物技术杂志]3:568-576；Svetina等人,2000,J.Biotechnol.[生物技术杂志]76:245-251；Rasmussen-Wilson等人,1997,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]63:3488-3493；Ward等人,1995,Biotechnology[生物技术]13:498-503；和Contreras等人,1991,Biotechnology[生物技术]9:378-381；Eaton等人,1986,Biochemistry[生物化学]25:505-512；Collins-Racie等人,1995，Biotechnology[生物技术]13:982-987；Carter等人,1989,Proteins:Structure,Function,and Genetics[蛋白质：结构、功能以及遗传学]6:240-248；以及Stevens,2003,Drug Discovery World[世界药物发现]4:35-48。
该亲本可以从任何属的微生物中获得。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从……获得”应当意指由多核苷酸编码的亲本是由该来源或由其中已经***来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一个方面，该亲本是胞外分泌的。
该亲本可以是细菌甘露聚糖酶。例如，该亲本可以是***多肽，如芽孢杆菌属(Bacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)或链霉菌属(Streptomyces)甘露聚糖酶；或者革兰氏阴性细菌多肽，如弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)或脲原体属(Ureaplasma)甘露聚糖酶。
在一个方面，该亲本是嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、或苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)甘露聚糖酶。
在另一方面，该亲本是类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、化脓链球菌、***链球菌或马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)甘露聚糖酶。
在另一方面，该亲本是不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、或浅青紫链霉菌(Streptomyces lividans)甘露聚糖酶。
在另一方面，该亲本是博戈里亚芽孢杆菌(Bacillus bogoriensis)甘露聚糖酶，例如SEQ ID NO:1的甘露聚糖酶或其成熟多肽。
应理解的是对于前述的种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学的等同物(equivalent)，例如无性型(anamorph)，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。
这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(CentraalbureauVoorSchimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。
可以使用以上探针，鉴定亲本并从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物获得该亲本，或从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)直接获得DNA样品。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可通过类似地筛选另一种微生物或混合DNA样品的基因组DNA或cDNA文库来获得编码亲本的多核苷酸。一旦已经用一种或多种探针检测到编码亲本的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的技术来分离或克隆该多核苷酸(参见例如，Sambrook等人，1989，同上)。
变体的制备
本发明还涉及用于获得一种具有甘露聚糖酶活性的变体的方法，这些方法包括：(a)向亲本甘露聚糖酶引入至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，其中该变体具有甘露聚糖酶活性；以及(b)回收该变体。
可以使用本领域已知的任何诱变程序来制备变体，如定点诱变、合成基因构建、半合成基因构建、随机诱变、改组等。
定点诱变是在编码该亲本的多核苷酸中的一个或多个限定位点处引入一个或多个(例如，若干个)突变的技术。
通过涉及使用包含所希望的突变的寡核苷酸引物的PCR可以体外实现定点诱变。也可以通过盒式诱变进行体外定点诱变，所述盒式诱变涉及由限制酶在包括编码亲本的多核苷酸的质粒中的位点处切割并且随后将包含突变的寡核苷酸连接在多核苷酸中。通常，消化质粒和寡核苷酸的限制性酶是相同的，从而允许质粒和***物的粘性末端彼此连接。参见例如，Scherer和Davis,1979,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]76:4949-4955；和Barton等人,1990,Nucleic Acids Res.[核酸研究]18:7349-4966。
还可以通过本领域中已知的方法在体内实现定点诱变。参见例如，美国专利申请公布号2004/0171154；Storici等人,2001,Nature Biotechnol.[自然生物技术]19:773-776；Kren等人,1998,Nat.Med.[自然医学]4:285-290；以及Calissano和Macino,1996,Fungal Genet.Newslett.[真菌遗传学时事通讯]43:15-16。
可以在本发明中使用任何定点诱变程序。存在可用于制备变体的许多可商购的试剂盒。
合成基因构建需要设计的多核苷酸分子的体外合成以编码感兴趣的多肽。基因合成可以利用多种技术来进行，如由Tian等人(2004,Nature[自然]432:1050-1054)所述的基于多路微芯片的技术、以及其中在光可编程的微流芯片上合成并组装寡核苷酸的类似技术。
使用已知的诱变、重组和/或改组方法、随后进行一个相关的筛选程序可以做出单或多氨基酸取代、缺失和/或***并对其进行测试，这些相关的筛选程序例如由Reidhaar-Olson和Sauer,1988,Science[科学]241:53-57；Bowie和Sauer,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625。其他可以使用的方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人,1991,Biochemistry[生物化学]30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)以及区域定向诱变(Derbyshire等人，1986，Gene[基因]46：145；Ner等人,1988,DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性(Ness等人,1999,Nature Biotechnology[自然生物技术]17:893-896)。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。
通过组合合成基因构建、和/或定点诱变、和/或随机诱变、和/或改组的多方面来实现半合成基因构建。半合成构建典型地是利用合成的多核苷酸片段的过程结合PCR技术。因此，基因的限定区域可以从头合成，而其他区域可以使用位点特异性诱变引物来扩增，而还有其他区域可以进行易错PCR或非易错PCR扩增。然后可以对多核苷酸子序列进行改组。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的变体的分离的多核苷酸。因此，在一个方面，本发明涉及编码变体的多核苷酸，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
核酸构建体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列上的多核苷酸的核酸构建体，该一个或多个控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在适合的宿主细胞中表达。因此，在一个方面，本发明涉及编码变体的多核苷酸，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，像至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该控制序列指导编码序列在合适的宿主细胞中在与控制序列相容的条件下的表达。
可以按多种方式来操纵多核苷酸以提供变体的表达。取决于表达载体，在多核苷酸***载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
控制序列可以是启动子，即由宿主细胞识别用于表达该多核苷酸的多核苷酸。启动子包含介导变体的表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变型、截短型和杂合型启动子，并且可以是从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(Agaisse和Lereclus,1994,Molecular Microbiology[分子微生物学]13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(Egon等人,1988,Gene[基因]69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因(Villa-Kamaroff等人,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:3727-3731)以及tac启动子(DeBoer等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]80:21-25)。其他启动子描述于Gilbert等人,1980,Scientific American[科学美国人]242:74-94的“Usefulproteins from recombinant bacteria[来自重组细菌的有用蛋白质]”；和Sambrook等人,1989，见上文中。串联启动子的实例公开于WO 99/43835中。
控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子序列被可操作地连接至编码变体的多核苷酸的3’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区域的实例是从以下获得的：苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue等人,1995,Journal of Bacteriology[细菌学杂志]177:3465-3471)。
控制序列也可以是前导子，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。前导序列可操作地连接至编码该变体的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。
该控制序列还可以是多腺苷酸化序列，即被可操作地连接至该变体编码序列的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别成将多腺苷酸残基添加到所转录的mRNA上的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
丝状真菌宿主细胞的优选多聚腺苷酸化从针对以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸酯合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉-α葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、和尖孢镰孢菌胰蛋白酶样蛋白酶。
酵母宿主细胞的有用的多聚腺苷酸化序列由Guo和Sherman,1995,Mol.CellularBiol.[分子细胞生物学]15:5983-5990描述。
控制序列还可以是信号肽编码区，该信号肽编码区编码与变体的N-末端连接的信号肽，并且指导变体进入细胞的分泌通路。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地含有信号肽编码序列，该信号肽编码序列在翻译阅读框中与编码变体的编码序列的区段天然地连接在一起。可替代地，编码序列的5’-端可包含对于编码序列为外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以简单地替代天然信号肽编码序列，以便增强变体的分泌。然而，可以使用指导表达的变体进入宿主细胞的分泌通路的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。另外的信号肽由Simonen和Palva,1993,Microbiological Reviews[微生物评论]57:109-137描述。
所述控制序列还可以是编码位于变体的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，前肽序列定位成紧邻变体的N-末端并且信号肽序列定位成紧邻前肽序列的N-末端。
还令人希望的可以是添加相对于宿主细胞的生长来调节变体的表达的调节序列。调节***的实例是响应于化学或物理刺激而引起基因的表达开启或关闭的那些，包括调控化合物的存在。原核***中的调节***包括lac、tac和trp操纵子***。在酵母中，可以使用ADH2***或GAL1***。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子、以及米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核***中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码该变体的多核苷酸将与该调节序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含编码本发明的变体的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。因此，在一个方面，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸、启动子、和转录和翻译终止信号的重组表达载体，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处***或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该用于表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以包含用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同包含待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。
载体优选地包含允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标志。选择性标志是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。
细菌选择性标志的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标志。酵母宿主细胞的适合的标志包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标志包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草胺膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)，连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
载体优选地包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或用于借助同源或非同源重组整合至基因组中的任何其他载体元件。可替代地，该载体可包含用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当包含足够数目的核酸，如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与对应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。
为了自主复制，载体还可以另外包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。
可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸***宿主细胞中以增加变体的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标志基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标志基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。
用于连接以上所述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见例如，Sambrook等人,1989,同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些重组宿主细胞包含编码本发明的变体的、可操作地连接至一个或多个控制序列的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的变体的产生。因此，在一个方面，本发明涉及包含编码变体的多核苷酸的重组宿主细胞，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该一个或多个控制序列指导如下变体的产生，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
宿主细胞可以是在变体的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。***包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属和链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于似马链球菌、酿脓链球菌、***链球菌和马链球菌兽疫亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌、以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，Chang和Cohen，1979，Mol.Gen.Genet.[分子遗传学与基因组学]168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，Young和Spizizen,1961,J.Bacteriol.[细菌学杂志]81:823-829，或Dubnau和Davidoff-Abelson,1971,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]56:209-221)、电穿孔(参见例如，Shigekawa和Dower,1988,Biotechniques[生物技术]6:742-751)、或轭合(参见例如，Koehler和Thorne,1987,J.Bacteriol.[细菌学杂志]169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可以通过以下方式来实现：原生质体转化(参见例如，Hanahan，1983，J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]166:557-580)或电穿孔(参见例如，Dower等人，1988，Nucleic Acids Res.[核酸研究]16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可以通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，Gong等人,2004,Folia Microbiol.(Praha)[叶线形微生物学(布拉格)]49:399-405)、轭合(参见例如，Mazodier等人,1989,J.Bacteriol.[细菌学杂志]171:3583-3585)、或转导(参见例如，Burke等人,2001,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可以通过以下来实现：电穿孔(参见例如，Choi等人,2006,J.Microbiol.Methods[微生物学方法杂志]64:391-397)或轭合(参见例如，Pinedo和Smets,2005,Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可以通过以下来实现：天然感受态(natural competence)(参见例如，Perry和Kuramitsu,1981,Infect.Immun.[感染与免疫]32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，Catt和Jollick，1991，Microbios[微生物学]68:189-207)、电穿孔(参见，例如，Buckley等人，1999，Appl.Environ.Microbiol.[应用与环境微生物学]65:3800-3804)、或轭合(参见，例如，Clewell，1981，Microbiol.Rev.[微生物学评论]45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝***孢子真菌(如由Hawksworth等人在以下文献中所定义：Ainsworth and Bisby’s Dictionary of The Fungi[Ainsworth和Bisby氏真菌字典]，第8版，1995，国际应用生物科学中心(CAB International)，英国剑桥大学出版社(UniversityPress,Cambridge,UK))。
真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如在此使用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可在将来变化，出于本发明的目的，酵母应当如Biology and Activities of Yeast[酵母的生物学与活性](Skinner,Passmore和Davenport编，Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9[应用细菌学学会专题论文集系列9],1980)中所描述的那样定义。
真菌细胞可以通过以下过程转化，该过程涉及原生质体形成、原生质体转化以及以本身已知的方式再生细胞壁。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适程序描述于以下文献中：EP 238023，Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]81:1470-1474以及Christensen等人，1988，Bio/Technology[生物/技术]6:1419-1422。用于转化镰孢属物种的合适方法由Malardier等人，1989，Gene[基因]78:147-156和WO 96/00787描述。可以使用由以下文献描述的程序转化酵母：Becker和Guarente，Abelson、J.N.和Simon,M.I.编辑，Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology[酵母遗传学与分子生物学指南]，Methods in Enzymology[酶学方法]，第194卷，第182-187页，纽约学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.,New York)；Ito等人，1983，J.Bacteriol.[细菌学杂志]153:163；以及Hinnen等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]75:1920。
产生方法
本发明还涉及产生变体的方法，这些方法包括：(a)在适合该变体的表达的条件下培养本发明的宿主细胞；以及(b)回收该变体。因此，在一个方面，本发明涉及产生变体的方法，这些方法包括以下步骤：(a)培养包含多核苷酸的宿主细胞，该多核苷酸编码包含至少两个取代的变体，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，像至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，该多核苷酸可操作地连接至一个或多个控制序列，该控制序列在适合表达变体的条件下指导变体的产生；以及(b)回收该变体。
使用本领域已知的方法在适合于产生变体的营养介质中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许变体表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。使用本领域中已知的程序，培养发生在包含碳和氮来源及无机盐的适合的营养介质中。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)的目录中)制备。如果变体被分泌到营养介质中，则变体可以直接从培养基中回收。如果变体没有分泌，则它可以从细胞裂解液中回收。
使用本领域已知的对这些变体特异的方法可以检测该变体，例如，如实例2所述的甘露聚糖酶测定。这些检测方法包括但不限于：特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该变体的活性。
可以使用本领域已知的方法回收该变体。例如，可以通过多种常规程序从营养介质中回收该变体，这些常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。
可以通过本领域中已知的多种程序来纯化变体以获得基本上纯的变体，这些程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、色谱聚焦、以及尺寸排阻色谱)、电泳程序(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(参见例如，Protein Purification[蛋白质纯化]，Janson和Ryden编辑，VCH出版社(VCH Publishers),纽约,1989)。
在可替代的方面，没有回收变体，而是将表达变体的本发明的宿主细胞用作变体的来源。
方法或用途用于改善动物饲料的营养价值的方法
本发明进一步涉及用于改善包含基于植物的材料的动物饲料的营养价值的方法，该方法包括向饲料中添加甘露聚糖酶变体。
术语改善动物饲料的营养价值意指提高饲料中营养素的可利用性。营养价值具体是指改善饲料中包含***木聚糖的部分(例如，如半纤维素)的溶解和降解，从而导致营养素从胚乳细胞中的释放增加，所述胚乳具有由高度顽固性半纤维素组成的细胞壁。因此，***木聚糖低聚物释放的增加表明细胞壁的破坏，并且结果是饲料的营养价值得到改善，导致生长速率和/或体重增加和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)增加。此外，***木聚糖低聚物释放可以直接抑或通过后肠中的细菌发酵改善这些组分本身的利用，从而导致短链脂肪酸的产生，所述短链脂肪酸可以在后肠中容易地被吸收并用于能量代谢。
本发明的组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽变体的组合物。因此，本发明涉及包含变体的组合物，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ IDNO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。优选地，这些组合物富含此类变体。术语“富含”意指组合物的α-淀粉酶活性已经增加，例如，富集因子为1.1。
在一个实施例中，本发明涉及组合物，该组合物包含含有至少两个取代的变体，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，并涉及蛋白酶，例如，SEQ ID NO:4或其变体的蛋白酶。该蛋白酶变体可以是SEQ ID NO:4的变体或与其具有至少70％序列同一性的任何蛋白酶，其包含选自下组取代的一个或多个取代：Y161A、R164S、和A188P；或者包含选自下组的一个或多个取代的变体：S9E、N42R、N74D、V199I、Q200L、Y203W、S253D、N255W、和L256E。
组合物可以包含多肽变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。可替代地，该组合物可以包含多种酶活性，如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。一种或多种额外的酶可以通过例如属于以下属或种的微生物产生：曲霉属，例如棘孢曲霉、泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，例如杆孢状镰孢、禾谷镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢或镶片镰孢；腐质霉属，例如特异腐质霉或疏棉状腐质霉；或木霉属，例如哈次木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉或绿色木霉。
可以根据本领域已知的方法来制备组合物，并且这些组合物可以处于液体或干组合物的形式。例如，组合物可以呈颗粒或微颗粒的形式。可以根据本领域已知的方法将多肽变体稳定化。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。因此，本发明还涉及包含任选地呈非尘化颗粒、稳定的液体或受保护的酶的形式的本发明的变体的洗涤剂添加剂。因此，本发明涉及包含变体的洗涤剂添加剂，该变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，任选地，其中该洗涤剂添加剂呈非尘化颗粒、稳定化液体或受保护的酶的形式。
在一个方面，本发明涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含与一种或多种另外的清洁组合物组分组合的本发明的多肽变体。因此，本发明涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含含有至少两个取代的变体，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，像至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性，该变体与一种或多种另外的清洁组合物组分组合。
另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。
对于纺织品护理(如衣物洗涤)，组分的选择可以包括以下考虑：有待清洁的纺织品的类型、污渍的类型和/或程度、进行清洁时的温度、以及洗涤剂产品的配制。尽管根据具体的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。
因此，本发明还涉及作为清洁组合物的组合物。
根据本发明的组合物可以进一步包含洗涤剂组分，如表面活性剂、漂白剂、分散剂聚合物(如磺化聚合物)、络合剂、漂白催化剂(如锰漂白催化剂)、晶体生长抑制剂、和/或织物调色剂。
在一个实施例中，组合物是无磷酸盐的组合物。
本发明的洗涤剂组合物可以例如针对ADW(自动餐具洗涤)组合物，该组合物包含与一种或多种另外的ADW组合物组分组合的本发明的酶。另外的组分的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。因此，在一个方面，本发明涉及手动或自动餐具洗涤剂组合物，该组合物包含本发明的变体和任选的表面活性剂。
例如，可以将本发明的洗涤剂组合物配制成手洗或机洗洗涤剂组合物，包括适于预处理带有污渍的织物的洗衣用添加剂组合物和漂洗中添加的织物软化剂组合物，或配制成用于在一般性的家居硬表面的清洁操作中使用的洗涤剂组合物，或配制成在手或机洗碗操作中使用的洗涤剂组合物。因此，在一个方面，本发明涉及手动或自动衣物洗涤剂组合物，该组合物包含根据本发明的变体。
在特定的方面，本发明提供了包含本发明的多肽的洗涤剂浓缩物/添加剂。洗涤剂添加剂、连同洗涤剂组合物可以包含一种或多种其他酶，例如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、过氧化物酶、另一种淀粉分解酶，例如α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、CGT酶和/或纤维素酶、另一种甘露聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、角质酶和/或漆酶。
一般而言，选择的一种或多种酶的特性应与所选的洗涤剂相容(即，最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。
蛋白酶：适合的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的那些。优选的是微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。该蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例为枯草杆菌蛋白酶，特别是衍生自芽孢杆菌属的那些，例如枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147以及枯草杆菌蛋白酶168(在WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及在WO89/06270和WO 94/25583中描述的镰孢属蛋白酶。
有用的蛋白酶的实例是如WO 92/19729、WO 98/20115、WO 98/20116和WO 98/34946所描述的变体，特别是在下述位置中的一个或多个处发生取代的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235、以及274。优选的可商购的蛋白酶包括
Figure BDA0002264246020001601
(SEQ ID NO:3)、
Figure BDA0002264246020001603
和(来自(诺维信公司(Novozymes A/S))、
Figure BDA0002264246020001605
MAXACAL、PURAFECT(杰能科国际公司(Genencor International Inc.))。
脂肪酶：适合的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些脂肪酶。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(Humicola)(与嗜热丝孢菌属(Thermomyces)同义)，例如来自如EP 258068和EP 305 216描述的疏棉状腐质霉(H.lanuginosa)(细毛嗜热霉(T.lanuginosus))或来自如WO 96/13580中描述的特异腐质霉(H.insolens)的脂肪酶；假单胞菌属(Pseudomonas)脂肪酶，例如来自产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)、施氏假单胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)、萤光假单胞菌(P.fluorescens)、假单胞菌属物种菌株SD 705(Pseudomonas sp.菌株SD 705)(WO 95/06720和WO 96/27002)、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)(WO 96/12012)；芽孢杆菌属(Bacillus)脂肪酶，例如来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)(Dartois等人(1993),Biochemica et Biophysica Acta[生物化学与生物物理学报],1131:253-360)，嗜热脂肪芽抱杆菌(B.stearothermophilus)(JP 64/744992)或短小芽孢杆菌(B.pumilus)(WO91/16422)。脂肪酶变体的其他实例如在WO 92/05249、WO 94/01541、EP 407225、EP 260 105、WO 95/35381、WO 96/00292、WO 95/30744、WO 94/25578、WO 95/14783、WO 95/22615、WO97/04079以及WO 97/07202中描述的那些。
优选的可商购的脂肪酶包括LIPOLASE<TM>和LIPOLASE ULTRA<TM>(诺维信公司(Novozymes A/S))。
淀粉酶：适合的淀粉酶(α-和/或β-淀粉酶)包含细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属，例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。有用的α-淀粉酶的实例是在WO 94/02597、WO 94/18314、WO 96/23873、以及WO 97/43424中描述的变体，尤其是在以下位置中的一个或多个处具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408、和444。可商购的α-淀粉酶是DURAMYL<TM>、LIQUEZYMETM、TERMAMYL<TM>、NATALASE<TM>、FUNGAMYL<TM>和BAN<TM>(诺维信公司(Novozymes A/S))、Preferenz S100、Preferenz S110、Preferenz S1000(SEQ ID NO:11)、Excellenz S110、Excellenz S1000、Excellenz S2000、RAPIDASE<TM>和PURASTAR<TM>(来自杰能科国际公司(Genencor International Inc.))。
纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌来源或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。适合的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰孢属、梭孢壳属、枝顶孢霉属的纤维素酶，例如，从在US 4,435,307、US 5,648,263、US5,691,178、US 5,776,757以及WO 89/09259中披露的特异腐质霉、嗜热毁丝霉和尖镰孢产生的真菌纤维素酶。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。此类纤维素酶的实例是描述于EP 0 495 257、EP 0 531 372、WO 96/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纤维素酶。其他实例为纤维素酶变体，如在WO 94/07998、EP 0 531 315、US5,457,046、US 5,686,593、US 5,763,254、WO 95/24471、WO 98/12307以及PCT/DK 98/00299中描述的那些。
可商购的纤维素酶包括和
Figure BDA0002264246020001612
(诺维信公司(Novozymes A/S))、
Figure BDA0002264246020001613
和PURADAX
Figure BDA0002264246020001614
(杰能科国际公司(GenencorInternational Inc.))和
Figure BDA0002264246020001615
(花王株式会社(Kao Corporation))。
过氧化物酵/氧化酶：适合的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(例如来自灰盖鬼伞)的过氧化物酶、及其变体，如在WO 93/24618、WO 95/10602、以及WO 98/15257中描述的那些。可商购的过氧化物酶包括(诺维信公司(Novozymes A/S))。
Lechinase/β-葡聚糖酶：适合的lechinase包括细菌或真菌来源的那些。它们可以被化学修饰或蛋白质工程化。有用的β-葡聚糖酶的实例包括WO2015/144824(诺维信公司(Novozymes A/S))以及WO 99/06516(德国汉高公司(Henkel KGAA))中描述的那些。
可以通过添加含有一种或多种酶的单独添加剂、或通过添加含有所有这些酶的组合添加剂而将一种或多种洗涤剂酶包含于洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即单独的或组合的添加剂，可以配制成例如颗粒、液体、浆液等。优选的洗涤剂添加剂配制品是颗粒，特别是无粉尘颗粒；液体，特别是稳定化液体；或浆液。
非尘化颗粒可以例如如在US 4,106,991和4,661,452中所披露而产生，并且可以任选地通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有从16个到50个环氧乙烷单位的乙氧基化壬基酚；其中的醇包含从12至20个碳原子并且其中存在15至80个环氧乙烷单元的乙氧基化的脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。受保护的酶可以根据EP 238 216中披露的方法制备。
本发明的洗涤剂组合物可以呈任何便利的形式，如棒状、片剂、粉、颗粒、糊状或液体。液体洗涤剂可以是水性的，典型地包含至多70％的水和0-30％的有机溶剂，或可以是非水性的。
所述洗涤剂组合物包括一种或多种表面活性剂，表面活性剂可以是非离子型(包括半极性)和/或阴离子型和/或阳离子型和/或两性离子型。表面活性剂典型地以按重量计0.1％至60％的水平存在。
当包含在其中时，洗涤剂通常将包含约1％至约40％的阴离子表面活性剂，例如线性烷基苯磺酸盐、a-烯烃磺酸盐、烷基硫酸盐(脂肪醇硫酸盐)、醇乙氧基硫酸盐、仲烷基磺酸盐、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基或烯基琥珀酸或肥皂。
当包含在所述洗涤剂中时，洗涤剂通常包含从约0.2％到约40％的非离子型表面活性剂，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸单乙醇酰胺、脂肪酸单乙醇酰胺、多羟基烷基脂肪酰胺、或葡糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
洗涤剂可以包含0-65％的洗涤剂助洗剂或络合剂，如MGDA、GLDA、沸石、二磷酸盐、三磷酸盐、膦酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二乙二胺三氨基五乙酸、烷基或烯基琥珀酸、可溶性硅酸盐、或层状硅酸盐(例如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)。
该洗涤剂可以包含一种或多种聚合物。实例为羧甲基纤维素、聚(乙烯基-吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如磺化聚合物、聚丙烯酸酯、马来酸/丙烯酸共聚物、以及甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
洗涤剂可以含有漂白***，其可以包含H2O2源，如过硼酸或过碳酸，其可以与形成过酸的漂白活化剂(如漂白催化剂例，如基于Mn或Co的四乙酰基乙二胺或壬酰氧基苯磺酸盐)组合。可替代地，漂白***可以包含过酸，例如酰胺、亚胺或砜类型的过酸。
可以使用常规稳定剂稳定本发明的洗涤剂组合物的一种或多种酶，这些常规稳定剂例如是多元醇，例如丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物，例如芳香族硼酸酯，或苯基硼酸衍生物，例如4-甲酰苯基硼酸，并且可以如在例如WO 92/19709和WO 92/19708中所描述配制该组合物。
该洗涤剂还可以包含其他的常规洗涤剂成分，像例如织物调理剂，这些织物调理剂包括粘土、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、防腐蚀剂、污垢悬浮剂、抗污物再沉淀剂、染料、杀菌剂、光学增亮剂、水溶助长剂、晦暗抑制剂、或香料。
水溶助剂是如下化合物，所述化合物在水溶液中溶解疏水化合物(或相反地，在非极性环境中溶解极性物质)。典型地，水溶助剂具有亲水和疏水两种特征(所谓的两亲特性，如由表面活性剂已知的)；然而，水溶助剂的分子结构一般不利于自发性自聚集，参见例如通过Hodgdon和Kaler(2007)，Current Opinion in Colloid&Interface Science[胶体和界面科学新见]12:121-128的综述。水溶助剂并不显示临界浓度，高于所述浓度就会发生如对表面活性剂而言所发现的自聚集以及脂质形成胶束、薄层或其他很好地定义的中间相。相反，许多水溶助剂显示连续类型的聚集过程，在所述过程中聚集物的大小随着浓度增加而增长。然而，许多水溶助剂改变了包含极性和非极性特征的物质的***(包括水、油、表面活性剂、和聚合物的混合物)的相行为、稳定性、和胶体特性。水溶助剂常规地在从药学、个人护理、食品到技术应用的各个产业中应用。水溶助剂在洗涤剂组合物中的使用允许例如更浓的表面活性剂配制品(如在通过去除水而压缩液体洗涤剂的过程中)而不引起不希望的现象，如相分离或高黏度。
洗涤剂组合物可以包含按重量计约0-65％，如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％、特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以具体是形成具有Ca和Mg的水溶性络合物的螫合剂。可以利用本领域已知的用于在衣物/ADW/硬表面清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠、层状硅酸盐(如，来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)、以及(羧甲基)菊粉(CMI)、及其组合。
洗涤剂可以包含按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白***。可以利用本领域已知的用于在衣物/ADW/硬表面清洁洗涤剂中使用的任何漂白***。合适的漂白体系组分包括漂白催化剂、光漂白剂、漂白活化剂、过氧化氢源如过碳酸钠、过硼酸钠和过氧化氢―脲(1:1)、预成型过酸及其混合物。合适的预成型过酸包括但不限于过氧羧酸及盐、二过氧二羧酸、过亚氨酸(perimidic acid)及盐、过氧单硫酸及盐(例如过硫酸氢钾(Oxone(R))及其混合物。漂白体系的非限制性实例包括与过酸形成漂白活化剂组合的基于过氧化物的漂白体系，其可以包含例如无机盐，包括碱金属盐例如过硼酸盐的钠盐(通常为单或四水合物)、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过硅酸盐。术语漂白活化剂在本文意指与过氧化氢反应以经由过水解形成过酸的化合物。以此方式形成的过酸构成活化的漂白剂。本文有待使用的适合的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺或酸酐类别的那些。适合的实例是四乙酰乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸盐(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸盐、4-(癸酰基氧基)苯甲酸盐(DOBS或DOBA)、4-(壬酰氧基)苯-1-磺酸盐(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。感兴趣的漂白活化剂的具体家族披露于EP 624154中并且该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋汀)具有以下优点，它是环境友好的。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋汀在存储时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是一种有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。可替代地，漂白***可以包含例如酰胺、酰亚胺或砜类型的过氧酸。漂白***还可以包含过酸，如6-(苯二甲酰亚氨基)过己酸(PAP)。漂白***还可以包括漂白催化剂。在一些实施例中，漂白组分可以是选自下组的有机催化剂，该组由以下组成：具有下式的有机催化剂：
(i)
Figure BDA0002264246020001651
(ii)
Figure BDA0002264246020001652
(iii)及其混合物；
其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自下组，该组由以下组成：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。其他示例性漂白体系描述于例如WO2007/087258、WO2007/087244、WO2007/087259、EP1867708(维生素K)以及WO2007/087242中。适合的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。
优选地，除了漂白催化剂，特别是有机漂白催化剂以外，漂白组分还包含过酸源。过酸源可以选自(a)预形成的过酸；(b)过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐(过氧化氢源)，优选与漂白活化剂组合；和(c)过水解酶以及酯，用于在纺织品或硬表面处理步骤中在水的存在下原位形成过酸。
该洗涤剂可以包含按重量计0-10％(如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％)的聚合物。可以利用本领域中已知的在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油污清洁和/或抑泡特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧酸酯(如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物)、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。
本发明的洗涤剂组合物还可以包含织物调色剂(如染料或色素)，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时这些织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括色素。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。适合的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index，C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物，例如于WO2005/03274、WO2005/03275、WO2005/03276和EP1876226中所描述的(将其通过引用并入本文)。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。适合的调色剂还披露于例如WO 2007/087257和WO2007/087243中。
目前期望在洗涤剂组合物中加入任何酶，特别是本发明的α淀粉酶多肽，添加量相当于每升洗涤液添加0.01mg-100mg酶蛋白，优选每升洗涤液加0.05mg-5mg酶蛋白，特别优选每升洗涤液加0.1mg-1mg酶蛋白。
另外，本发明的α淀粉酶多肽可以掺入WO 2006/002643(将其通过引用并入本文)中所披露的洗涤剂配制品中。
用途
本发明还针对有关用于使用本发明的多肽变体的方法。用途可以是在洗涤剂，特别是衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物。因此，本发明涉及包含至少两个取代的变体的用途，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
因此，本发明提供了本发明的亲本多肽或组合物的多肽变体在家庭或工业清洁过程中的用途。特别地，本发明涉及根据本发明的多肽变体在衣物洗涤、餐具洗涤；例如自动或手动餐具洗涤、硬表面清洁、工业清洁和机构清洁、纺织品退浆、淀粉修饰、淀粉液化、糖化、饲料、烘焙或酿造中的用途。
在一个实施例中，该用途是织物的清洗，例如衣物洗涤。
在另一个实施例中，该用途是陶瓷、塑料或玻璃材料的清洗，例如餐具洗涤。
因此，本发明的多肽变体可以用作洗涤、餐具洗涤和硬表面清洁洗涤剂组合物(在家庭或工业环境中)的组分。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
实例
实例1：位点饱和文库生成
将甘露聚糖酶(SEQ ID NO:3)的基因克隆进枯草芽孢杆菌表达盒并且转化在缺乏碱性蛋白酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶和果胶裂解酶的表达宿主，枯草芽孢杆菌168的衍生物中。通过称为“Mega PCR”方法的方法在甘露聚糖酶基因中每个提到的位置生成位点饱和文库，在正向诱变引物中进行NNS掺杂。NNS是一种众所周知的方法，其中“N”表示四个核苷酸碱基中的任何一个，而“S”表示核苷酸“C”和“G”。
进行了两次PCR反应，其中1)是使用侧翼C-末端反向引物和正向诱变引物生成C-末端片段，并且2)是使用C-末端片段作为反向mega-引物和侧翼N-末端正向引物生成MegaPCR产物以形成全长盒。然后将Mega PCR产物转化进入芽孢杆菌属宿主，其中位点特异性同源重组在该芽孢杆菌属染色体中发生。
在含氯霉素的LB琼脂培养基中生长18-20小时以进行抗生素选择后，挑出转化的菌落并将其接种到含水生长培养基中，即TB-Gly培养基中。生长3天后，通过细胞的初始热裂解进行培养物PCR，随后进行PCR。通过桑格测序(sanger sequencing)证实PCR产物的序列，并在筛选测定中测试所得的变体。用于PCR反应的聚合酶是Phusion DNA聚合酶(获得自赛默飞科学公司(ThermoScientific)，目录号：F530L)。
实例2：通过定点诱变产生变体
将甘露聚糖酶(SEQ ID NO:3)的基因克隆进枯草芽孢杆菌表达盒中并且转化在如实例1中所述的表达宿主，枯草芽孢杆菌中。通过在特异性位点引入突变，进行基于MegaPCR的定点诱变(SDM)以产生甘露聚糖酶基因的变体(如在实例1中所述)。使用20-30个碱基对的单个诱变引物进行SDM，所需的氨基酸变化(取代/缺失/***)位于具有足够侧翼残基(9-15个碱基对)的寡核苷酸中间。涉及两次PCR反应，1)使用侧翼C-末端反向引物和正向诱变引物生成C-末端片段，2)使用C-末端片段作为反向mega-引物和侧翼N-末端正向引物生成Mega PCR产物以形成全长盒。然后将Mega PCR产物转化进入芽孢杆菌属宿主中，其中位点特异性同源重组在该芽孢杆菌属染色体中发生。
在具有适当抗生素的LB琼脂培养基中生长18-20小时后，挑出转化的菌落并将其接种到含水表达培养基中，并用于筛选测定。将来自筛选测定的命中进行培养物PCR，并送去进行序列确认。用于PCR反应的聚合酶是Phusion DNA聚合酶(获得自赛默飞科学公司(ThermoScientific)，目录号：F530L)。
实例3：洗涤剂稳定性测定
测试了如实例1和2所述产生的本发明的变体在pH 9.0和pH 10.5-10.8下的洗涤剂稳定性。通过将变体在洗涤剂中孵育不同的时间段和温度(取决于野生型(WT)或主链的稳定性)(在下表中给出)，并与在4℃孵育相同时间段的对照板上的活性进行比较来进行稳定性测试。在两种不同的洗涤剂(表1中所述的标准O洗涤剂和可商购的洗涤剂艾禾美(Arm&Hammer)(列出为A&H))中进行稳定性测试。
向标准O去污剂中添加蛋白酶，而对于A&H洗涤剂，该洗涤剂中已经存在蛋白酶和蛋白酶抑制剂。
通过使用来自麦格酶公司(Megazyme)的不溶性偶氮-角豆-半乳甘露聚糖底物，使用甘露聚糖酶测定来测量残余活性。将底物与酶在25℃一起孵育20min，伴随在800rpm下振荡。将反应混合物保持静态10min，以允许不溶性底物沉降。通过读取在590nm处上清液的光密度来测量酶活性。通过取应力响应与无应力响应的比率并以％RA表示来计算残余活性。
表1：标准O洗涤剂
化合物 化合物的含量(％w/w)
Na-LAS(直链烷基苯磺酸盐) 5.3
AEOS(烷基乙氧基硫酸盐) 10.7
大豆脂肪酸 1.0
AEO(聚乙氧基化醇) 5.3
TEA(三乙醇胺) 0.4
柠檬酸钠 2.0
CaCl<sub>2</sub> 0.02
水 75.3
通过将CaCl2、MgCl2、以及NaHCO3(Ca2+:Mg2+:HCO3-＝2:1:4.5)添加至测试***中将水硬度调节至12°dH。在洗涤之后，将纺织品用自来水冲洗并干燥。
以下表2和表3示出了从实例3获得的稳定性结果。
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Figure BDA0002264246020002641
Figure BDA0002264246020002651
Figure BDA0002264246020002661
Figure BDA0002264246020002671
Figure BDA0002264246020002681
Figure BDA0002264246020002691
Figure BDA0002264246020002711
Figure BDA0002264246020002721
Figure BDA0002264246020002731
Figure BDA0002264246020002741
Figure BDA0002264246020002751
Figure BDA0002264246020002761
Figure BDA0002264246020002771
Figure BDA0002264246020002791
Figure BDA0002264246020002811
Figure BDA0002264246020002821
Figure BDA0002264246020002831
Figure BDA0002264246020002841
Figure BDA0002264246020002851
Figure BDA0002264246020002861
Figure BDA0002264246020002871
Figure BDA0002264246020002881
Figure BDA0002264246020002911
Figure BDA0002264246020002931
Figure BDA0002264246020002941
Figure BDA0002264246020002951
Figure BDA0002264246020002961
Figure BDA0002264246020002971
Figure BDA0002264246020002981
Figure BDA0002264246020003001
Figure BDA0002264246020003011
Figure BDA0002264246020003021
Figure BDA0002264246020003031
Figure BDA0002264246020003061
实例4：甘露聚糖酶变体的蛋白酶稳定性
测试了如实例1和2中所述产生的本发明的变体在pH 9.0的标准O洗涤剂和pH 7.8的标准A洗涤剂中的蛋白酶稳定性。通过将变体在洗涤剂中并于37℃、40℃或50℃(参见下表)孵育4周并与在-18℃保存相同时间段的对照样品的活性进行比较来进行稳定性测试。
如下表中所公开，向标准O洗涤剂和标准A洗涤剂中添加蛋白酶。
通过使用PAHBAH还原糖法，使用来自麦格酶公司(Megazyme)的角豆-半乳甘露聚糖来测量残余活性。将底物与含有甘露聚糖酶的洗涤剂在50℃孵育30min。通过添加含有PAHBAH和Bi3+的碱性试剂来终止酶促水解反应，该碱性试剂与还原糖反应20分钟。通过读取405nm处的光密度来测量所得的黄颜色。通过取应力响应与无应力响应的比率并以％RA表示来计算残余活性。
表4-在标准O洗涤剂中在pH 9.0和37℃的蛋白酶稳定性(参见表1)。所使用的蛋白酶是具有以下修饰的SEQ ID NO:4的变体：S9E+N42R+N74D+V199I+Q200L+Y203W+S253D+N255W+L256E，其以0.2％(w/w)浓度添加。
表5-在标准A洗涤剂中在pH 7.8、40℃和50℃的蛋白酶稳定性(参见表1)。所使用的蛋白酶是具有以下修饰的SEQ ID NO:4的变体：Y161A+R164S+A188P，其以0.7％(w/w)浓度添加。
本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得显而易见。此类修改也旨在落入所附权利要求书的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。
序列表
<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）
<120> 甘露聚糖酶变体和对其编码的多核苷酸
<130> 14493-WO-PCT
<160> 4
<170> PatentIn 3.5版本
<210> 1
<211> 326
<212> PRT
<213> 博戈里亚芽孢杆菌（Bacillus bogoriensis）
<220>
<221> 成熟肽
<222> (29)..(326)
<400> 1
Met Lys Gln Gln Lys Arg Leu Tyr Ala Arg Leu Leu Thr Leu Leu Phe
-25 -20 -15
Ala Leu Ile Phe Leu Leu Pro His Ser Ala Ala Ala Ala Asn Ser Gly
-10 -5 -1 1
Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ala Asn Gly Asn Pro Phe
5 10 15 20
Val Met Arg Gly Ile Asn His Gly His Ala Trp Tyr Lys Asp Gln Ala
25 30 35
Thr Thr Ala Ile Glu Gly Ile Ala Asn Thr Gly Ala Asn Thr Val Arg
40 45 50
Ile Val Leu Ser Asp Gly Gly Gln Trp Thr Lys Asp Asp Ile His Thr
55 60 65
Val Arg Asn Leu Ile Ser Leu Ala Glu Asp Asn His Leu Val Ala Val
70 75 80
Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Tyr Asp Ser Ile Ala Ser Leu Asn
85 90 95 100
Arg Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Arg Ser Ala Leu Ile Gly Lys
105 110 115
Glu Asp Thr Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp Phe Gly Ser Trp
120 125 130
Glu Gly Asp Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala Ile Pro Arg Leu
135 140 145
Arg Asn Ala Gly Leu Asn His Thr Leu Met Val Asp Ala Ala Gly Trp
150 155 160
Gly Gln Phe Pro Gln Ser Ile His Asp Tyr Gly Arg Glu Val Phe Asn
165 170 175 180
Ala Asp Pro Gln Arg Asn Thr Met Phe Ser Ile His Met Tyr Glu Tyr
185 190 195
Ala Gly Gly Asn Ala Ser Gln Val Arg Thr Asn Ile Asp Arg Val Leu
200 205 210
Asn Gln Asp Leu Ala Leu Val Ile Gly Glu Phe Gly His Arg His Thr
215 220 225
Asn Gly Asp Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr Ser Glu Gln Arg
230 235 240
Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn Gly Pro Glu Trp
245 250 255 260
Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asn Asn Leu Thr Ala
265 270 275
Trp Gly Asn Thr Ile Val Asn Gly Pro Tyr Gly Leu Arg Glu Thr Ser
280 285 290
Arg Leu Ser Thr Val Phe
295
<210> 2
<211> 298
<212> PRT
<213> 博戈里亚芽孢杆菌
<400> 2
Ala Asn Ser Gly Phe Tyr Val Ser Gly Thr Thr Leu Tyr Asp Ala Asn
1 5 10 15
Gly Asn Pro Phe Val Met Arg Gly Ile Asn His Gly His Ala Trp Tyr
20 25 30
Lys Asp Gln Ala Thr Thr Ala Ile Glu Gly Ile Ala Asn Thr Gly Ala
35 40 45
Asn Thr Val Arg Ile Val Leu Ser Asp Gly Gly Gln Trp Thr Lys Asp
50 55 60
Asp Ile His Thr Val Arg Asn Leu Ile Ser Leu Ala Glu Asp Asn His
65 70 75 80
Leu Val Ala Val Leu Glu Val His Asp Ala Thr Gly Tyr Asp Ser Ile
85 90 95
Ala Ser Leu Asn Arg Ala Val Asp Tyr Trp Ile Glu Met Arg Ser Ala
100 105 110
Leu Ile Gly Lys Glu Asp Thr Val Ile Ile Asn Ile Ala Asn Glu Trp
115 120 125
Phe Gly Ser Trp Glu Gly Asp Ala Trp Ala Asp Gly Tyr Lys Gln Ala
130 135 140
Ile Pro Arg Leu Arg Asn Ala Gly Leu Asn His Thr Leu Met Val Asp
145 150 155 160
Ala Ala Gly Trp Gly Gln Phe Pro Gln Ser Ile His Asp Tyr Gly Arg
165 170 175
Glu Val Phe Asn Ala Asp Pro Gln Arg Asn Thr Met Phe Ser Ile His
180 185 190
Met Tyr Glu Tyr Ala Gly Gly Asn Ala Ser Gln Val Arg Thr Asn Ile
195 200 205
Asp Arg Val Leu Asn Gln Asp Leu Ala Leu Val Ile Gly Glu Phe Gly
210 215 220
His Arg His Thr Asn Gly Asp Val Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr
225 230 235 240
Ser Glu Gln Arg Gly Val Gly Trp Leu Ala Trp Ser Trp Lys Gly Asn
245 250 255
Gly Pro Glu Trp Glu Tyr Leu Asp Leu Ser Asn Asp Trp Ala Gly Asn
260 265 270
Asn Leu Thr Ala Trp Gly Asn Thr Ile Val Asn Gly Pro Tyr Gly Leu
275 280 285
Arg Glu Thr Ser Arg Leu Ser Thr Val Phe
290 295
<210> 3
<211> 981
<212> DNA
<213> 博戈里亚芽孢杆菌
<400> 3
atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60
ttgctgcctc attctgcagc cgcggcaaat tccggatttt atgtaagcgg taccactcta 120
tacgatgcca atggaaaccc atttgtaatg agagggatta accatgggca cgcatggtat 180
aaagaccagg caactactgc aattgaaggg attgcaaata ccggtgctaa tacggtccgg 240
attgtgttat ctgatggggg acaatggaca aaagatgaca tccatacagt aagaaacctt 300
atctctttag cggaagataa tcatttggtt gctgttcttg aagttcatga tgctaccggt 360
tatgattcca ttgcttcgct caatcgtgct gttgattatt ggattgaaat gagaagtgct 420
ttaattggaa aggaagatac cgtcattatt aatattgcga atgaatggtt tggttcgtgg 480
gaaggggatg cttgggctga cgggtataaa caagcaatcc cgcgattgcg taacgccggt 540
ctaaaccata ccttgatggt agatgctgcg gggtggggac aatttccaca atcgattcat 600
gattatggaa gagaagtttt taatgctgac cctcaacgaa atacaatgtt ttcgattcat 660
atgtatgaat atgcaggtgg taatgcatcg caagttcgta ctaatattga ccgagttctt 720
aatcaagacc tcgcattagt cattggtgaa tttggacacc gtcatacaaa tggtgacgtc 780
gatgaagcaa cgattatgag ctattctgaa caaagaggag ttgggtggtt ggcgtggtca 840
tggaaaggga acggcccaga atgggagtat ttagaccttt cgaatgattg ggctggaaat 900
aaccttacag cttggggaaa tacaatagtg aatggtccat atggtttaag agaaacttcg 960
agattaagca ccgttttttg a 981
<210> 4
<211> 269
<212> PRT
<213> 枯草芽孢杆菌
<400> 4
Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala
1 5 10 15
His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp
20 25 30
Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser
35 40 45
Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr
50 55 60
His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu
65 70 75 80
Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala
85 90 95
Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala
100 105 110
Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser
115 120 125
Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140
Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser
145 150 155 160
Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln
165 170 175
Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile
180 185 190
Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr
195 200 205
Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala
210 215 220
Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile
225 230 235 240
Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu
245 250 255
Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg
260 265

Claims (35)

1.一种亲本甘露聚糖酶的分离的甘露聚糖酶变体，其中所述变体包含至少两个取代，其中(a)所述第一取代在选自位置260、288、294、或295的氨基酸位置上，并且(b)所述至少第二取代选自所述变体中的任何其他位置，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少58％，例如 至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
2.根据权利要求1所述的变体，其中所述至少第二取代在选自以下位置中的至少一个或多个位置上：1、2、3、4、5、6、8、11、13、14、18、30、32、33、34、35、37、41、45、47、57、59、60、63、65、70、71、74、77、78、80、82、83、93、95、97、98、100、104、108、111、114、116、118、119、131、133、135、136、139、142、143、150、169、172、174、176、177、180、183、184、185、196、200、202、203、205、210、213、228、229、234、235、241、243、244、250、254、257、262、266、268、270、272、273、276、279、280、283、286、290、296、和298，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
3.根据权利要求2所述的变体，其中所述一个或多个位置选自SEQ ID NO:2的多肽的位置14、37、47、77、81、82、83、93、98、116、135、136、241、242、257、和258。
4.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述至少两个取代选自以下位置的组：14+260、14+288、14+294、14+295、37+260、37+288、37+294、37+295、47+260、47+288、47+294、47+295、77+260、77+288、77+294、77+295、81+260、81+288、81+294、81+295、82+260、82+288、82+294、82+295、83+260、83+288、83+294、83+295、93+260、93+288、93+294、93+295、98+260、98+288、98+294、98+295、116+260、116+288、116+294、116+295、135+260、135+288、135+294、135+295、136+260、136+288、136+294、136+295、241+260、241+288、241+294、241+295、242+260、242+288、242+294、242+295、257+260、257+288、257+294、257+295、258+260、258+288、258+294、258+295、260+288，其中根据SEQ ID NO:2进行编号。
5.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述至少第二取代在SEQ ID NO:2的多肽的位置93和136中的一个或两个上。
6.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中至少两个取代选自A1G、A1V、N2E、S3P、G4D、F5H、Y6H、Y6M、Y6F、Y6W、Y6H、S8T、S8P、S8R、T11K、T11R、Y13F、D14S、D14K、N18V、N18R、A30T、Y32F、Y32W、K33Q、D34G、Q35L、T37P、E41V、E41N、N45G、G47S、G47A、D57N、G59Q、Q60R、K63R、K63Q、D65E、R70K、N71S、S74K、E77T、E77N、D78G、H80K、V82R、V82I、V82S、A83P、A83S、Y93Q、Y93A、S95D、A97R、S98P、S98D、N100Y、D104A、D104G、E108S、S111A、S111K、S111R、I114Q、I114M、I114W、K116R、D118K、T119R、S131T、E133R、E133Q、D135P、A136P、D139A、D139R、K142M、K142V、K142S、K142R、Q143R、N150T、N150R、N150S、Q169A、Q169R、Q169K、H172R、Y174R、Y174L、Y174W、Y174F、R176Q、E177S、E177Y、N180R、P183T、P183G、Q184E、Q184K、R185G、Y196W、Y196F、N200T、S202R、Q203T、R205K、R210L、R210G、R210M、N213V、N213D、T228S、N229D、E234F、E234Y、A235K、A235R、S241C、Q243K、Q243E、R244K、R244V、A250G、K254Y、G257W、G257E、G257A、G257G、W260F、W260Y、W260L、W260T、Y262F、S266A、D268N、A270D、N272M、N272T、N273E、N273D、A276E、A276W、A276D、N279D、N279E、T280L、N283W、N283H、Y286W、Y286F、L288I、E290A、L294P、L294K、L294I、L294R、L294V、L294H、S295K、S295V、S295P、S295L、S295R、S295A、S295N、S295M、S295I、T296S、和F298Y。
7.一种亲本甘露聚糖酶的分离的甘露聚糖酶变体，其中该变体包含至少两个取代，该至少两个取代在对应于选自3、37、47、77、82、83、93、98、116、135、136、241、257、和258的组的位置的任何两个或更多个位置上，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，所述变体具有甘露聚糖酶活性并且与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
8.根据权利要求7所述的变体，其中这些取代中的所述至少两个选自以下的组：S3P、T37P、G47A、G47S、E77T、V82I、V82R、A83P、Y93Q、Y93C、Y93A、Y93F、Y93I、Y93R、S98P、K116R、D135P、A136P、S241C、G257W、G257E、G257L、G257A、G257S、G257Y、G257F、和P258Q。
9.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述亲本甘露聚糖酶是与SEQ ID NO:1的成熟多肽或SEQ ID NO:2的多肽具有至少60％，例如至少62％、至少63％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的甘露聚糖酶。
10.根据权利要求9所述的变体，其中所述亲本多肽包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的成熟多肽或者由其组成。
11.根据权利要求9或10中任一项所述的变体，其中所述亲本多肽是SEQ ID NO:1或SEQID NO:2的多肽的片段，其中所述片段具有甘露聚糖酶活性。
12.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体，与所述亲本甘露聚糖酶相比，具有改善的稳定性。
13.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述改善的稳定性是洗涤剂内稳定性或热稳定性。
14.根据前述权利要求中任一项所述的变体，该变体与该亲本多肽的氨基酸序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％同一性、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％，但小于100％序列同一性。
15.根据前述权利要求中任一项所述的变体，其中所述变体由250至300个，例如260至300、270至300、285至300个氨基酸组成。
16.一种组合物，该组合物包含根据前述权利要求中任一项所述的变体。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述组合物进一步包含另外的酶，例如蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶。
18.根据权利要求16和17中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含表面活性剂、漂白***、螯合剂、稳定剂、水溶助剂、助洗剂、共助洗剂、漂白活化剂、聚合物和/或织物调色剂。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含表面活性剂，其中所述表面活性剂选自下组，该组由以下组成：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、非离子表面活性剂、和两性表面活性剂。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物是洗涤剂组合物，例如液体衣物洗涤剂组合物、粉末衣物洗涤剂组合物、液体餐具洗涤剂组合物、或粉末餐具洗涤剂组合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物是液体或粉末衣物洗涤剂组合物。
22.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物是液体或粉末自动餐具洗涤(ADW)洗涤剂组合物。
23.根据权利要求20所述的组合物，其中所述组合物是液体手动餐具洗涤剂组合物。
24.根据权利要求16至23中任一项所述的组合物在家庭或工业清洁过程中的用途。
25.根据权利要求24所述的用途，用于织物清洁，例如衣物洗涤。
26.根据权利要求24所述的用途，用于硬表面清洁，例如餐具洗涤。
27.根据权利要求24所述的用途，用于自动餐具洗涤。
28.一种分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸编码根据权利要求1至15中任一项所述的变体。
29.一种核酸构建体，该核酸构建体包含根据权利要求28所述的多核苷酸。
30.一种表达载体，该表达载体包含根据权利要求28所述的多核苷酸。
31.一种宿主细胞，该宿主细胞包含根据权利要求28所述的多核苷酸。
32.一种产生甘露聚糖酶变体的方法，该方法包括：
a.在适合于表达所述变体的条件下培养根据权利要求31所述的宿主细胞；以及
b.回收所述变体。
33.一种用于获得甘露聚糖酶变体的方法，该方法包括向亲本多肽在对应于位置260、288、294、或295的位置中的至少一个上引入第一取代，和向所述变体中引入选自任何其他位置的至少第二取代，其中根据SEQ ID NO:2进行编号，其中所述变体具有甘露聚糖酶活性；以及回收所述变体。
34.一种使用根据权利要求16至20和22中任一项所述的组合物在自动餐具洗涤机中进行餐具洗涤的方法，该方法包括以下步骤：在所述自动餐具洗涤机中的洗涤剂组合物室内添加所述组合物，和在主洗涤循环期间释放所述组合物。
35.一种使用根据权利要求16至21中任一项所述的组合物在自动衣物洗涤机中进行衣物洗涤的方法，该方法包括以下步骤：在所述自动衣物洗涤机中的洗涤剂组合物室内添加所述组合物，和在主洗涤循环期间释放所述组合物。
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