CN110736837B - 神经元特异性烯醇化酶的胶乳免疫比浊检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了神经元特异性烯醇化酶的胶乳免疫比浊检测试剂盒。该试剂盒包含第一试剂和第二试剂:第一试剂包含缓冲液、盐离子、促凝剂、分散剂、防腐剂、阻断剂;第二试剂包含致敏的胶乳颗粒、缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂。本申请的试剂盒采用的是两株单克隆抗体包被大粒径颗粒,可以减少多抗存在的批间差问题,便于生产工艺的控制;采用大粒径的颗粒可以保证检测的高灵敏度,同时也能兼顾线性和前带问题;该试剂盒成本低,测速快,稳定性好。
Description
技术领域
本公开渉及医学、免疫和体外诊断领域,具体渉及一种用免疫透射比浊法检测神经元特异性烯醇化酶的试剂盒。
背景技术
生物体内广泛存在无氧酵解,烯醇化酶是无氧酵解过程中催化α-磷酸甘油酸转变为磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。根据免疫性质不同检测出自然界存在α、β、γ三种烯醇化酶的亚基,这三种亚基组成了五种同质二聚体烯醇化酶同工酶,包括αα、ββ、γγ、αβ、αγ。
二聚体烯醇化酶γγ和αγ称为NSE或γ-烯醇化酶,主要存在于神经元和神经内分泌细胞中。除此之外,血液中的某些成分如红细胞、血小板也存在部分γ亚基,主要以αγ二聚体形式存在,与NSE有一定的交叉反应,会导致NSE检测结果偏高。
NSE相对分子质量是78KD,半衰期大约24h,等电点是4.7,是一种分子量较大的酸性蛋白酶。NSE占颅内全部可溶性蛋白的1.5%,NSE含量从高到低依次为脑、脊髓和周围神经,周围神经中NSE仅为中枢神经组织含量的1%至10%。
正常情况下难以通过细胞膜及血脑屏障,所以正常人体液中含量极少,当神经细胞损伤,细胞膜通透性增强,NSE容易从细胞膜漏出,使得脑脊液和血液中NSE含量升高。
支气管癌:NSE被公认为是监测小细胞支气管癌的首选标志物,60%-81%的小细胞支气管癌患者NSE升高,NSE与转移部位或者是否为神经***转移没有关系,但与临床分期,即疾病的严重程度有很好的相关性。
化疗期间,首轮治疗开始后24至72小时内,由于肿瘤细胞的分解,NSE浓度有短暂的升高。一周或首轮治疗结束后,NSE含量迅速降低。而治疗无效者,血中NSE持续升高或者不能降低到参考范围以下。在缓解期,80%-96%的患者NSE含量正常。如NSE升高,提示复发。因此,NSE是监测小细胞支气管癌疗效与病程的有效标志物,并能提供有价值的预后信息。
神经母细胞瘤:62%患病儿童血清NSE水平高于30ng/ml病理性NSE升高水平与疾病的临床进展有显著相关性,反之,NSE升高不明显。
胺前体摄取脱羧细胞瘤:有34%的患者血清NSE升高(>12.5ng/ml)。
***瘤:有68%-73%的病人血清NSE水平明显升高。含量与严重程度有关。
其他肿瘤:22%的非肺源性恶性疾病患者NSE高于25ng/ml。脑肿瘤、如神经胶质瘤、脑膜瘤、神经纤维瘤和神经鞘瘤等,偶尔可伴有NSE升高。原发性脑瘤或脑转移性瘤、恶性黑素瘤和褐色素细胞瘤、CNS中NSE升高。有报道14%的原位性和46%的转移性肾肿瘤患者中,NSE升高,并与病变程度有关。
良性病变:血清NSE升高(<12ng/ml)见于良性肺病和中枢***疾病。主要在CSF中升高的疾病为脑血管脑膜炎、弥散性脑炎、脊髓小脑退化、脑缺血、脑梗塞、脑内血肿、蛛网膜下出血、头部损伤、炎症性脑疾病、器质性癫痫、精神***症和克罗伊茨费尔特-雅各布综合征等。
NSE的检测方法包括电化学发光法(罗氏);酶免疫法(康乃格、北京科美等);磁微粒化学发光法(意大利索灵、江苏泽成、深圳新产业等);时间分辨荧光免疫分析法(北京北方生物)。
CN103175964A公开了一种一种神经元特异性烯醇化酶含量检测试剂盒其包含包被神经元特异性烯醇化酶抗体的胶乳颗粒,其中包被粒径为80至240nm。
CN106645700A涉及一种快速诊断神经元特异性烯醇化酶试剂盒及其使用方法,该试剂盒包含表面包被有抗神经元特异性烯醇化酶抗体的纳米金粒子,所述的纳米金粒子为粒径在2nm至50nm的类球形纳米金。
目前主流的检测方法是化学发光法,化学发光法灵敏度很高、特异性强,精密度好,但试剂及配套仪器价格昂贵,检测通量小,不适用于基层医院。因此很有必要开发一种可定量的、适用于普通生化分析仪的NSE试剂。
胶乳免疫比浊检测技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种均相免疫测定法,可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定。NSE可以用此种方法检测,其原理是根据特异性抗体包被致敏的胶乳颗粒,与待测标本中的相应NSE抗原相遇时发生凝集反应出现浊度,通过吸光度检测比较浊度程度与被测物的浓度呈函数关系,通过生成的剂量-反应曲线可测出标本中待测NSE抗原的含量。
目前市场上还没有NSE胶乳免疫比浊试剂,所以该领域需要一种灵敏度高,生产工艺稳定的胶乳免疫比浊试剂来降低检测成本,提高检测速度,促进该项目在基层医院的普及。
发明内容
根据本申请的一些实施方案,提供了一种神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其包含第一试剂和第二试剂。
在一些实施方案中,所述第一试剂包含:
在一些实施方案中,所述第二试剂包含:
在一些实施方案中,胶乳颗粒的平均粒径为大于250nm。
在一些实施方案中,缓冲液选自以下的一种或组合:甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、PIPES缓冲液。
在一些实施方案中,第一试剂和所述第二试剂中的缓冲液是相同的或不同的。
在一些实施方案中,电解质选自以下的一种或组合:氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化锌、氯化钙。
在一些实施方案中,稳定剂选自以下的一种或组合:甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖、果糖、蔗糖。
在一些实施方案中,表面活性剂选自以下的一种或组合:Tween20、Tween80、NP40、thesit、BrijL2。
在一些实施方案中,离散剂选自以下的一种或组合:硫氰酸钾、氯化胆碱。
在一些实施方案中,防腐剂选自以下的一种或组合:叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC300。
在一些实施方案中,阻断剂选自以下的一种或组合:小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清。
在一些实施方案中,单克隆抗体源自以下的一种或组合:鼠、兔、羊、禽。
在一些实施方案中,胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒。
在一些实施方案中,所述胶乳颗粒的表面修饰基团是羧基。
在一些实施方案中,胶乳颗粒的平均粒径是250nm至400nm,具体为:250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400nm及其之间的任意范围。
在具体的实施方案中,胶乳颗粒的平均粒径是300nm;320nm-330nm;330nm-380nm。
在具体的实施方案中,单克隆抗体包含两株单克隆抗体,分别特异于神经元特异性烯醇化酶γ亚基上的两个不同表位(表位的位置分别是271-285和416-433)。
在具体的实施方案中,两株单克隆抗体的物质的量的比是2:1(表位的位置分别是271-285和416-433)。
在一些具体的实施方案中,阻断剂是小鼠IgM。
在一个具体的实施方案中,阻断剂是小鼠抗人IgM单克隆抗体。
在一个具体的实施方案中,阻断剂的浓度为15g/L。
在一些实施方案中,表面活性剂是8g/L至20g/L Tween 20。
在一个具体的实施方案中,提供了一种神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其包含第一试剂和第二试剂;
其中,所述第一试剂包含:
所述第二试剂包含:
苯乙烯胶乳颗粒
所述聚苯乙烯胶乳颗粒的平均粒径为300nm、320nm至330nm、330nm至380nm;
所述抗NSE单克隆抗体包含两株单克隆抗体,其分别特异于神经元特异性烯醇化酶γ亚基上的两个不同表位;两株单克隆抗体的物质的量的比是2:1。
附图说明
图1.神经元特异性烯醇化酶定标曲线。
具体实施方式
实施例1.本申请的试剂盒的制备
1.第一试剂制备过程如下:
第一试剂包含
室温条件下,按照上述进行第一试剂的配制。
2.第二试剂制备过程如下:
将0.5ml直径300nm的聚苯乙烯胶乳溶液(浓度10%)加入4.5ml 0.05M MES(PH6.0)和100μl EDC(碳化二亚胺,浓度5mg/mL),于37℃静置1小时;
单克隆抗体用5ml 0.05M Tris缓冲液(PH7.5)稀释后立即加入到上述缓冲液中,在37℃反应2小时;
加入1ml 0.1M甘氨酸缓冲液(PH7.0)搅拌1小时终止反应;
用20ml 100mM的甘氨酸缓冲液(PH7.0)洗涤,离心去上清,洗涤3次;
用保存缓冲液重悬胶乳颗粒使之分散成白色胶乳悬浮液;
第二试剂中神经元特异性烯醇化酶单克隆抗体包被的聚苯乙烯胶乳颗粒浓度为0.25%(%表示g/100ml);抗体在第二试剂中的浓度是0.065g/L;
其中,所述保存缓冲液的组成:
第二试剂中的单克隆抗体为两种不同的单克隆抗体,其分别识别γ亚基上两个不同的位点。在一个实例中,两种单抗的质量比(或物质的量比)是2:1。
实施例2.对比试剂盒的制备(不同粒径)
按照和实施例1相同的方法制备试剂盒,区别仅在于替换为其它粒径的颗粒(70-100nm;70-90nm;200nm;220nm;330-380nm)。
实施例3.对比试剂盒的制备(抗体比例)
按照和实施例1相同的方法制备试剂盒,区别仅在于将两株单抗的比例调整为1:2和1:1。
测试例1.样本测值与已上市化学发光试剂的比较
按照实施例1的方法制备试剂盒,检测一些随机的血清样本,然后与罗氏化学发光试剂盒的测值进行比较,结果如下。
表1.与罗氏化学发光试剂测值比较
由表1数据可以看出,胶乳试剂与罗氏化学发光试剂盒测值接近,个别血清测值的差异,不影响定性的判断。
测试例2.本申请试剂盒的线性范围
按照实施例1的方法制备试剂盒,筛选1例高值血清,用去离子水按照等差稀释方法检测该试剂盒的线性,结果如下。
表2.试剂盒线性
由表2可以看出,该胶乳试剂盒能达到200ng/ml的线性范围。
测试例3.前带范围检测
按照实施例1的方法制备试剂盒,筛选异常高值样本,用去离子水进行稀释检测,结果如下:
表3.前带范围检测
稀释比例 | 理论浓度ng/ml | 测值ng/ml |
0.0078125 | 7.73 | 7.16 |
0.015625 | 15.45 | 15.10 |
0.03125 | 30.9 | 30.59 |
0.0625 | 61.8 | 62.41 |
0.125 | 123.6 | 123.40 |
0.25 | 247.2 | 241.66 |
0.5 | 494.4 | 262.33 |
0.75 | 741.6 | 244.59 |
1 | 988.8 | 220.73 |
从表3数据可以看出,样本浓度高达988ng/ml时,样本测值依然保持在200ng/ml以上,可以避免假阴性误判问题;且实际临床样本中,超过1000ng/ml的样本极少,试剂性能可满足临床使用。
测试例4.测值精密度
按照实施例1的方法制备试剂盒,选4例不同浓度的样本,各连续检测5次,计算检测的精密度,实验数据如下:
表4.精密度检测
序号 | 样本1ng/ml | 样本2ng/ml | 样本3ng/ml | 样本4ng/ml |
1 | 2.14 | 3.16 | 7.36 | 14.23 |
2 | 1.62 | 3.16 | 6.51 | 14.66 |
3 | 1.82 | 3.43 | 6.99 | 14.95 |
4 | 1.79 | 2.86 | 7.14 | 14.73 |
5 | 1.76 | 2.88 | 7.47 | 14.62 |
均值 | 1.83 | 3.10 | 7.09 | 14.64 |
方差 | 0.19 | 0.24 | 0.38 | 0.26 |
CV | 10.5% | 7.6% | 5.3% | 1.8% |
从结果可以看出,该试剂盒有良好的测值重复性。
测试例5.配制工艺的重现性
按照实施例1的方法分别制备两批试剂盒,两批试剂的配制量完全相同,然后用同一套校准品同时定标,比较两批试剂的差异。结果如下:
表5.实施例1工艺重现性(第一批)
表6.实施例1工艺重现性(第二批)
从以上数据可以看出,实施例1的试剂盒具有良好的工艺重现性,利于产品的稳定生产。然而,实施例2中70至220nm范围粒径的试剂盒在工艺再现性方面较差,统计学上显著低于实施例1的试剂盒(p,0.05)。
测试例6.抗体批间差
实验方法:根据实施例1的方法分别制备三批试剂。三批试剂的第二试剂所使用的抗体为不同的批次,然后选择6例不同浓度的血清样本进行定标,并检测血清样本,比较三批样本的定标及测值差异。
表7.三批试剂定标比较
表8.三批试剂测值比较
样本检测 | 上市试剂盒的测值 | 批次1 | 批次2 | 批次3 |
样本1 | 31.84 | 31.56 | 30.68 | 33.04 |
样本2 | 20.1 | 28.75 | 28.85 | 30.1 |
样本3 | 14.93 | 14.76 | 14.76 | 14.44 |
样本4 | 14.91 | 13.22 | 11.88 | 12.82 |
样本5 | 49.67 | 45.48 | 47.82 | 47.87 |
样本6 | 8.21 | 7.31 | 12.895 | 12.405 |
样本7 | 71.23 | 71.26 | 70.24 | 69.04 |
从结果可以看出,对于实施例1的试剂盒,三批抗体配制的试剂差异很小,而且生产工艺比较稳定,可以确保试剂的稳定生产。
测试例7.加速稳定性
实验方法:根据实施例1配制试剂,取两份试剂放入37℃温箱加速处理,分别加速4天、7天,比较加速前后样本反应吸光度的变化。
表9.加速处理前后样本反应吸光度变化率
从结果可以看出,实施例1的试剂加速37℃持续7天后,吸光度的变化率基本在5%左右,相对比较稳定。
测试例8.粒径对稳定性的影响
根据实施例1和实施例2的配制试剂,取两份试剂放入37℃温箱加速处理7天,比较加速前后样本反应吸光度的变化。
表10.粒径对稳定性的影响
从结果可以看出,在本申请的试剂环境中粒径太小(低于100nm)不能建立反应;中等粒径(200-220nm)虽能建立反应,但不稳定;300nm以上相对稳定,且识别度良好。
测试例9.抗体比例
实施例1和实施例3试剂盒对相同样本测量,比较吸光度变化。
表11.不同比例的两株单抗
结果可见,随着第1株抗体比例的升高,反应吸光度降低,但识别特异性有明显好转。而前两组,虽然吸光度高,但识别上有假阴性和假阳性的误判。
Claims (12)
1.一种神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其包含第一试剂和第二试剂;其中:
所述第一试剂包含:
所述第二试剂包含:
所述胶乳颗粒的平均粒径为300nm至400nm;
所述缓冲液选自以下的一种或组合:甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、MOPS缓冲液、MES缓冲液、Hepes缓冲液、PIPES缓冲液;
所述第一试剂和所述第二试剂中的缓冲液是相同的或不同的;
所述电解质选自以下的一种或组合:氯化钠、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化锌、氯化钙;
所述稳定剂选自以下的一种或组合:甘露糖、葡萄糖、壳聚糖、山梨醇、牛血清白蛋白、海藻糖、果糖、蔗糖;
所述表面活性剂选自以下的一种或组合:Tween20、Tween80、NP40、thesit、BrijL2;
所述离散剂选自以下的一种或组合:硫氰酸钾、氯化胆碱;
所述防腐剂选自以下的一种或组合:叠氮钠、苯酚、对羟基苯甲酸、PC300;
所述阻断剂选自以下的一种或组合:小鼠IgG、小鼠IgM、小鼠血清;
所述单克隆抗体源自以下的一种或组合:鼠、兔、羊、禽;
所述单克隆抗体包含物质的量之比是2:1的第一单克隆抗体和第二单克隆抗体;
第一单克隆抗体特异于神经元特异性烯醇化酶γ亚基的表位271-285;
第二单克隆抗体特异于神经元特异性烯醇化酶γ亚基的表位416-433。
2.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中:
所述胶乳颗粒是聚苯乙烯胶乳颗粒;
所述胶乳颗粒的表面修饰基团是羧基。
3.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述胶乳颗粒的平均粒径是300nm。
4.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述胶乳颗粒的平均粒径是320nm至330nm。
5.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述胶乳颗粒的平均粒径是330nm至380nm。
6.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述第一试剂的pH是7.5。
7.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述第二试剂的pH是8.0。
8.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述阻断剂是小鼠IgM。
9.根据权利要求8所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述阻断剂是小鼠抗人IgM单克隆抗体。
10.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述阻断剂的浓度为15g/L。
11.根据权利要求1所述的神经元特异性烯醇化酶检测试剂盒,其中所述表面活性剂是8g/L至20g/L Tween 20。
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