CN110719912B - 在可见光区能进行光交联的光响应性核苷酸类似物 - Google Patents
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Abstract
本发明提供：式I所示的化合物；通过由该化合物构成的光反应***联剂而能用于核酸的光反应技术的新型的光反应性化合物；及、使用了该光反应性化合物的光反应***联剂。
Description
技术领域
本发明涉及通过可见光区的光而具有光交联(photocrosslinking)能力的光响应性核苷酸类似物(photoresponsive nucleotide analogue)。
背景技术
分子生物学领域的基本技术中包括核酸的连接和核酸的交联。核酸的连接、交联例如与杂交组合而用于基因的导入、碱基序列的检测；或者例如用于基因表达的抑制。因此，核酸的连接技术和交联技术不仅在分子生物学的基础研究中是重要的技术，例如，在医疗领域中的诊断、治疗或治疗药、诊断药等的开发、制造、工业和农业领域中的酶、微生物等的开发、制造中的使用也是极其重要的技术。
作为核酸的光反应技术，有如下技术：使用了5-氰基乙烯基脱氧尿苷的光耦合技术(专利文献1：日本专利第3753938号、专利文献2：日本专利第3753942号)、使用了在碱基位点具有3-乙烯基咔唑结构的修饰核苷的光交联技术(专利文献3：日本专利第4814904号、专利文献4：日本专利第4940311号)。进而，有如下技术：使用了将在碱基位点具有3-乙烯基咔唑结构的修饰核苷的所谓糖部的结构置换为链状烷基酰胺而成的化合物的光交联技术(专利文献5：日本专利第5925383号)。
进而，最近能够构建出利用了核酸的双链形成能力的各种纳米结构体，核酸的连接和交联技术在纳米技术领域也是重要的技术。例如，非专利文献1公开了通过核酸的光交联对由寡聚DNA构成的纳米片赋予耐热性的技术。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第3753938号公报
专利文献2：日本专利第3753942号公报
专利文献3：日本专利第4814904号公报
专利文献4：日本专利第4940311号公报
专利文献5：日本专利第5925383号公报
非专利文献
非专利文献1：J.Photopdy.S.Tech.，2014，27，485
发明内容
发明要解决的问题
由于核酸的光反应技术的重要性，而进一步需求能用于核酸的光反应技术的新型的化合物。本发明的目的在于提供能用于核酸的光反应技术的新型的光反应性化合物、和使用了该光反应性化合物的光反应***联剂。
用于解决问题的方案
本发明人对成为能用于核酸的光反应技术的光反应***联剂的光反应性化合物进行了深入研究，结果发现：具备吡喃并咔唑骨架结构来代替核酸碱基的碱基部分、且具备后述的式I所示的骨架结构来代替核糖和脱氧核糖部分而成的化合物成为这种能用于核酸的光反应技术的光反应***联剂，并完成了本发明。
基于本发明的光反应***联剂具备如下特征：其源自上述的结构，且通过比以往更长的长波长的光照射、例如通过可见光区的光照射而能够进行光交联反应。为此，在希望尽可能避免DNA、细胞的损伤的情况下，基于本发明的光反应***联剂能通过长波长的光照射进行光交联，因此是特别有利的。
虽然本发明的光反应性化合物通过光照射而开始进行光反应，但要强调的意思是：至照射为止一直稳定的化合物响应光照射这样的信号而开始进行反应，有时将光反应性称为光响应性。
因此，本发明包含以下的(1)～(8)。
(1)
一种下式I所示的化合物：
(I)
(其中，式I中，
R1为选自由氢原子、卤素原子、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基和C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
X是下式Is或式IIs所示的基团：
(Is)
(其中，式Is中，
R11和R12各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
na为1或2，
R21和R22各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nb为0或1，
R31和R32各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
R41和R42各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基(oxazaphospholidine group)、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。)
(IIs)
(其中，式IIs中，
R51和R52各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
ne为1、2或3，
R61和R62各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nf为0、1、2或3，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐；))。
(2)根据(1)所述的化合物，其中，X为下式It所示的基团，
(It)
(其中，式It中，
R11和R12各自独立地为式Is中记载的基团，
R31和R32各自独立地为式Is中记载的基团，
R41和R42各自独立地为式Is中记载的基团，
Q1和Q2为式Is中记载的基团。)。
(3)根据(1)所述的化合物，其中，X为下式Iu所示的基团，
(Iu)
(其中，式Iu中，
R42为式Is中记载的基团，
Q1和Q2为式Is中记载的基团。)。
(4)根据(3)所述的化合物，其中，R42为氢原子或甲基。
(5)一种光反应***联剂，其包含(1)～(4)的中任一项所述的化合物。
(6)一种光反应性修饰核酸制造用试剂，其包含(1)～(4)的中任一项所述的化合物。
(7)一种形成光交联的方法，其使用包含(1)～(4)的中任一项所述的化合物的光反应***联剂，在该光反应***联剂与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
(8)一种通过使下式III所示的化合物与下式IV所示的化合物进行脱水缩合来制造下式V所示的化合物的方法，其中，
下式III：
(其中，式III中，
R1为选自由氢原子、卤素原子、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基和C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
R11和R12各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
na为1或2。)
式IV：
(其中，式IV中，
R21和R22各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nb为0或1，
R31和R32各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
R41和R42各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。)
下式V：
(其中，式V中，
R1、R11和R12各自独立地为上述式III中记载的基团，
na为上述式III中记载的整数，
R21、R22、R31、R32、R41、R42、Q1和Q2各自独立地为上述式IV中记载的基团，
nb、nc和nd分别为上述式IV中记载的整数。)。
发明的效果
本发明提供成为能用于核酸的光反应技术的光反应***联剂的新型的化合物。该化合物是基于不具备天然的糖结构和碱基结构的、新型的化学结构的化合物。此外，根据本发明的化合物，由于能够通过比以往的光反应***联剂波长更长的的光照射来形成光交联，因此可以使由光照射导致的对核酸、细胞的不良影响最小化。
附图说明
图1是化合物5的UV-vis光谱。
图2是化合物8的UV-vis光谱。
图3a是示出对胸腺嘧啶进行光交联的操作流程的说明图。
图3b是示出由光照射导致的产物的HPLC分析结果的图。
图3c是示出伴随光照射时间的交联率变化的图。
图3d是示出通过各波长的光照射而得到的产物的HPLC分析结果的图。
图4a是示出对胞嘧啶进行光交联的操作流程的说明图。
图4b是示出基于各光照射时间的产物的HPLC分析结果的图。
图5a是示出使光交联裂解的操作流程的说明图。
图5b是示出基于各光照射时间的裂解产物的HPLC分析结果的图。
图6a是示出通过pc-S而形成光交联的操作流程的说明图。
图6b是示出由光照射导致的产物的HPLC分析结果的图。
图7是对各波长下的光照射时间(秒)和细胞存活率(％)进行比较的图。
具体实施方式
列举具体的实施方式，以下对本发明进行详细地说明。本发明不限定于以下所列举的具体的实施方式。
[化合物的结构]
本发明为下式I所示的化合物：
(I)
式I中，R1为选自由氢原子、卤素原子、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基和C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团。R1优选为氢原子、卤素原子、甲基或乙基，特别优选为氢原子。式I中，R1以如下方式表示：将作为对R1所键合的环的碳原子进行编号的碳位置的、1位、2位、3位、4位的任意位置的碳所键合的氢原子取代而键合。在适合的实施方式中，R1可与3位的碳原子键合。
式I中，X为以下的式Is或式IIs所示的基团：
(Is)
式Is中，R11和R12各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。R11和R12优选各自独立地为氢原子、甲基，特别优选为氢原子。na为表示重复单元的数量的整数，为1或2，优选为1。R11和R12可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。
式Is中，R21和R22各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。R21和R22优选各自独立地为氢原子、甲基，特别优选为氢原子。nb为表示重复单元的数量的整数，为0或1，优选为0。R21和R22可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。
式Is中，R31和R32各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。R31和R32优选各自独立地为氢原子、甲基，特别优选为氢原子。nc为表示重复单元的数量的整数，为0、1、2或3，优选为1。R31和R32可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。nc+nd为0～3的整数，优选为2。
式Is中，R41和R42各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。R41和R42优选各自独立地为氢原子或甲基。nd为表示重复单元的数量的整数，为0、1、2或3，优选为1。R41和R42可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。
式Is中，Q1可以是选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基。
式Is中，Q2可以是选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的三乙胺盐(以下称为TEA盐)、-PH(＝O)OH的1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯盐(以下称为DBU盐)、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基具有以下的结构，
成为上述二烷基的R基和R’基可以分别为C1～C4的烷基。作为这样的2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基，例如可以列举出：2-氰基乙基-N,N-二甲基亚磷酰胺基、2-氰基乙基-N,N-二乙基亚磷酰胺基、2-氰基乙基-N,N-二异丙基亚磷酰胺基。
甲基亚膦酰胺基具有以下的结构，
上述R基和R’基分别可以是氢原子或C1～C4的烷基。
乙基亚膦酰胺基具有以下的结构，
上述R基和R’基分别可以是氢原子或C1～C4的烷基。
氧氮磷杂环戊烷基具有以下的结构。
硫代亚磷酸酯基具有以下的结构。
-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的TEA盐为各自的三乙胺(TEA)的盐。
-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的DBU盐为各自的二氮杂双环十一碳烯(DBU)的盐。
在适合的实施方式中，Q1可以是氢原子。
在适合的实施方式中，Q1可以是通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
在适合的实施方式中，Q1可以是上述的保护基，可以优选为二甲氧基三苯甲基、三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基，可以特别优选为二甲氧基三苯甲基。
在适合的实施方式中，Q2可以是氢原子。
在适合的实施方式中，Q2可以是通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。
在适合的实施方式中，Q2可以是上述的保护基，可以优选为2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基。
(IIs)
式IIs中，R51和R52各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。ne为表示重复单元的数量的整数，为1、2或3。R51和R52可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。
式IIs中，R61和R62各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团。nf为表示重复单元的数量的整数，为1、2或3。R61和R62可以在各自的重复单元中独立地为上述的基团。
式IIs中，Q1可以是上述式Is中记载的Q1。
式IIs中，Q2可以是上述式Is中记载的Q2。
在适合的实施方式中，X可以是下式It所示的基团：
(It)
即，在适合的实施方式中，式Is中，可以设成na为1、nb为0、nc为1、nd为1，可以是式It的结构。
式It中，R11、R12、R31、R32、R41、R42、Q1、Q2可以分别为上述式Is中记载的基团。
在适合的实施方式中，X可以是下式Iu所示的基团：
(Iu)
即，在适合的实施方式中，式Is中，可以设成na为1、nb为0、nc为1、nd为1，进而，R11、R12、R31、R32、R41可以是氢原子，可以是式Iu的结构。
式Iu中，R42、Q1、Q2可以分别为上述式Is中记载的基团。
[修饰核酸]
在适合的实施方式中，可以将Q1设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的，可以将Q2设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。即，上述式I所示的化合物可以是具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物被嵌入序列中而得到的修饰核酸或修饰寡核苷酸。本发明中，有时将如此制备的光响应性修饰核酸和光响应性修饰寡核苷酸统称为光响应性修饰核酸。本发明的修饰核酸中，具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物可以位于序列中的末端，在此情况下成为通过磷酸二酯键而连接的修饰核苷酸或修饰核酸，所述磷酸二酯键是由仅Q1或Q2中任一侧与结合于Q1或Q2的O成为一体所形成的磷酸基而形成的。另外，使用肽核酸代替上述的核酸，而成为具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物被嵌入序列中而得到的光响应性修饰肽核酸。
[化合物的骨架结构]
本发明的化合物具备式I所示的骨架结构，式I中不具有基于天然的核苷和核苷酸应具有的核糖或脱氧核糖的糖结构。进而，本发明的化合物不具有式I中基于天然的核苷和核苷酸应具有的嘌呤碱基或嘧啶碱基的碱基结构。即，本发明的化合物具有不被认为与天然的核苷和核苷酸在结构上完全相似的化学结构。尽管如此，在以单链的修饰核酸的形式形成本发明的化合物时，能够和与其互补的单链核酸形成双螺旋。此外，吡喃并咔唑部分可以通过光反应而形成交联。
[核苷类似物]
在适合的实施方式中，可以将Q1和Q2设为氢原子。即，上述式I所示的化合物可以是具备特征性结构的光响应性人工核苷类似物分子。
[核苷酸类似物]
在适合的实施方式中，可以将Q1设为与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基，可以将Q2设为氢原子。即，上述式I所示的化合物可以是具备特征性结构的光响应性人工核苷酸类似物分子。
[修饰核酸制造用试剂]
在适合的实施方式中，可以将Q1设为上述的保护基，可以将Q2设为与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基、设为通过磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸或上述的保护基，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的。即，上述式I所示的化合物可以是光反应性修饰核酸的制造用试剂(合成用试剂)。
在适合的实施方式中，可以将Q1设为上述的保护基，可以将Q2设为与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基或上述的保护基。众所周知，具备这种结构的化合物可以以核酸合成用的单体的形式使用，可以是能通过公知的DNA合成装置而使用的试剂，例如可以是能够通过亚磷酰胺法和H-膦酸盐法而使用的修饰核酸合成用试剂(修饰核酸合成用单体)。
另外，将Q1设为上述的保护基且将Q2设为通过由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基所形成的磷酸二酯键而连接的核苷酸或核酸而得到的结构是不可称为所谓的单体的结构的、可称为修饰核酸的结构。在此情况下，可以作为用于由此合成并延长链长的制造用试剂(合成用试剂)来使用。
作为这样的光反应性修饰核酸制造用试剂(光反应性修饰核酸合成用试剂)，可以示例出以下那样的单体。
[光反应***联剂]
本发明的化合物中，可以通过使吡喃并咔唑部分进行光反应而形成交联。以单链的修饰核酸的形式形成本发明的化合物时，可以和与其互补的单链核酸形成双螺旋，可以通过使吡喃并咔唑部分进行光反应而形成交联，作为结果，可以形成由双螺旋的一条链向另一条链所形成的链之间的光交联(photocrosslinking)。即，本发明的化合物能够作为光反应***联剂使用。
[光交联的形成]
对于本发明的修饰核酸，在将其以单链核酸的形式使用时，可以和与其互补的单链核酸杂交而形成双螺旋。在形成双螺旋时，对于位于相对于吡喃并咔唑结构部分而在互补链中应形成碱基对的位置的核酸碱基，可以没有特别限制地自由选择。对所形成的双螺旋进行光照射时，可以在形成双螺旋的核酸链之间通过光反应而形成交联。该光交联在位于如下位置的核酸碱基与吡喃并咔唑结构之间形成，所述位置是：相对于从序列中吡喃并咔唑结构部分作为核酸碱基所在的位置起、在序列中距5’末端侧仅1个碱基处的核酸碱基而在互补链中形成碱基对的位置。换言之，该光交联是在从相对于吡喃并咔唑结构部分而在互补链中应形成碱基对的位置的核酸碱基起、在序列中距3’末端侧仅1个碱基处的核酸碱基与吡喃并咔唑结构之间形成的。
[光交联的碱基特异性]
本发明中，作为吡喃并咔唑结构能形成光交联的对象方的碱基为具有嘧啶环的碱基。另一方面，吡喃并咔唑结构与具有嘌呤环的碱基不形成光交联。即，本发明的光交联性的化合物作为天然的核酸碱基具有如下特异性：与胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶形成光交联，另一方面与鸟嘌呤和腺嘌呤不形成光交联。
[光反应***联剂的序列选择性]
本发明的光反应性修饰核酸(光交联性修饰核酸)可以在和具有与修饰核酸互补的碱基序列的序列杂交而形成双螺旋后进行光交联。由此，可以仅对成为目标的特定序列进行光交联反应(Photocrosslinking reaction)。即，本发明的光反应***联剂可以根据期望进行序列设计而赋予非常高的碱基序列选择性。
[光照射的波长]
为了进行光交联而照射的光的波长例如可以是350～600nm的范围、优选为400～600nm的范围、进一步优选为400～550nm的范围、进一步优选为400～500nm的范围、进一步优选为400～450nm的范围。在适合的实施方式中，可以使用处于这种范围的波长的单波长的激光。如此本发明中，通过可见光区的波长的光照射而能够形成光交联。以往的光反应***联剂中，需要比这些范围更短的短波长的光照射。根据本发明，由于能够通过与以往的光反应***联剂相比更长的长波长的光照射而形成光交联，因此能将由光照射导致的对核酸、细胞的不良影响最小化，在这方面是有利的。
[光交联的裂解]
根据本发明的化合物，在形成光交联后，进而通过光照射而能进行光裂解。即，本发明的光反应性的化合物能够实现可逆的光交联，能够作为可逆的光反应***联剂来使用。
如从该光交联的可逆性中所想到的那样，若使用基于本发明的化合物的可逆性光反应***联剂，则能够在生理的条件下对具有特定的碱基序列的核酸进行分离、回收或检测。因此本发明还在于如下方法：使用可逆性光反应***联剂，对具有期望的碱基序列的核酸进行分离、回收或检测。
为了光裂解而照射的光的波长例如可以是300～350nm的范围、优选为300～340nm的范围。在适合的实施方式中，可以使用处于这种范围的波长的单波长的激光。
[光反应的温度]
在适合的实施方式中，为了进行光交联反应，通常在0～50℃、优选在0～40℃、进一步优选在0～30℃、进一步优选在0～20℃、进一步优选在0～10℃、进一步优选在0～5℃的范围的温度下进行光照射。为了进行光裂解反应，通常在55～100℃、优选在60～90℃、进一步优选在60～80℃的范围的温度下进行光照射。
[光反应的条件]
由于基于本发明的光交联和光裂解利用了光反应，因此可以对pH、盐浓度等没有特别限制地、在核酸类等生物体高分子能稳定存在的pH、盐浓度的溶液中通过光照射来进行。
[光反应的时间]
基于本发明的光交联和光裂解极其迅速地进行。例如，若是作为光反应性的化合物已知的补骨脂素需要数小时(350nm光照射)那样的情况下，通过远超过其的长波长的光照射，例如在仅仅10秒～60秒(400nm光照射)内进行光反应而形成光交联。即，若使用本发明的光交联剂，例如可以通过1～120秒或1～60秒的光照射，进行光反应而形成光交联。进而，基于本发明的光交联可以采用上述的波长和温度，例如通过1～120秒或1～60秒的光照射进行光反应而使光交联裂解。
[光响应性人工核苷类似物分子的合成路径]
本发明的光响应性人工核苷类似物分子例如可以按照后述的方案1所示的合成路径来合成。在该方案1中，包括如下步骤：得到化合物1，由此合成化合物4，与胺进行脱水缩合反应而形成酰胺键，得到化合物5。
[通过与胺的脱水缩合而形成酰胺]
即，根据方案1的合成路径，可以由下式VI所示的修饰吡喃并咔唑分子合成下式III所示的羧酸，使其与下式IV所示的胺进行脱水缩合反应，由此制造下式V所示的化合物。
(VI)
(其中，式VI中，R1为式I中记载的基团。)
(III)
(其中，式III中，
R1为式VI中记载的基团，
R11和R12为式Is中记载的基团，
na为1或2。)
(IV)
(其中，式IV中，
R21、R22、R31、R32、R41和R42为式Is中记载的基团，
nb为0或1，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二烷基(C1～C4)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。)
(V)
(其中，式V中，
R1、R11和R12各自独立地为上述式III中记载的基团，
na为上述式III中记载的整数，
R21、R22、R31、R32、R41、R42、Q1和Q2各自独立地为上述式IV中记载的基团，
nb、nc和nd分别为上述式IV中记载的整数。)。
在适合的实施方式中，作为上述式IV所示的化合物，可以使用下式VII所示的化合物：
(VII)
(其中，式VII中，
R21、R22、R31、R32、R41和R42为式Is中记载的基团，
nb为0或1，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数。)
作为上述式IV所示的化合物，使用下式VII所示的化合物时，上述式V所示的化合物可以是下式VIII所示的化合物：
(VIII)
(其中，式VIII中，
R1为式III中记载的基团，
R11和R12为式III中记载的基团，
na为1或2，
R21、R22、R31、R32、R41和R42为式VII中记载的基团，
nb为0或1，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数。)
在适合的实施方式中，作为上述式III的羧酸，可以使用下式IIIa所示的羧酸：
(IIIa)
(其中，式IIIa中，R1为式III中记载的基团。)。
在适合的实施方式中，作为上述式VII的胺，可以使用下式VIIa所示的胺：
(VIIa)
(其中，式VIIa中，R42为式VII中记载的基团，优选R42可以是氢原子或甲基。)
使用式IIIa的羧酸作为上述式III的羧酸、使用式VIIa的胺作为上述式VII的胺时，上述式VIII的化合物可以是下式VIIIa的化合物：
(VIIIa)
(其中，式VIIIa中，
R1为式IIIa中记载的基团，
R42为式VIIa中记载的基团，优选R42可以是氢原子或甲基。)
如上所述，通过与胺的脱水缩合而形成酰胺，由此能够合成式V、式VIII、式VIIIa的化合物。对于方案1的合成路径，在这些式中，尽管示例并说明了Q1和Q2为氢原子的情况，但即使在Q1和Q2不是氢原子的情况下，也能够通过与胺的脱水缩合而形成酰胺，由此制造式V的化合物。
上述的本发明的合成路径的步骤少且简便，能够期待高的总收率，在这点上是优异的。进而，与以往的光交联剂的合成法相比，合成路径中不包括基于氯化氢的活化步骤等需要注意操作和熟练操作的步骤，在这点上是有利的。即，在以往的光反应性的修饰核苷分子的合成中，由于在其结构中具有脱氧核糖或核糖，因此与上述本发明的合成路径相比，合成路径中的步骤多且复杂，总收率低。在以往的光反应性的修饰核苷分子的合成中，由于在其结构中具有脱氧核糖或核糖，因此为了进行糖的羟基保护和活化，包括基于氯化氢的活化步骤等需要注意操作和熟练操作的步骤。因此，本发明的化合物在上述合成的简便性和总收率的高度方面也是优异的。另外，本发明还有上述优异的合成方法(制造方法)。
[修饰核酸合成用单体和修饰核酸的合成]
使用通过上述的合成路径而得到的光响应性人工核苷类似物分子(式VIII、式VIIIa的化合物)，使用后述的方案1所述的方法或本领域技术人员公知的方法，可以得到用于获得本发明的修饰核酸的合成用单体(制造用试剂)。本发明的修饰核酸的合成用单体的结构如上所述，若利用亚磷酰胺法和H-膦酸盐法等公知的方法将其用作核酸合成试剂，则可以得到光响应性人工核苷类似物分子(式VIII、式VIIIa的化合物)被嵌入序列中而成的核酸或寡核苷酸(本发明的修饰核酸)或肽核酸。由此，本发明的修饰核酸合成单体在亚磷酰胺法和H-膦酸盐法等公知的方法中能用作核酸合成试剂，在这点上是优异的。
实施例
以下列举实施例对本发明进行详细地说明。本发明不限定于以下示例的实施例。
[pc-D亚磷酰胺的合成]
按照以下的方案1所示的6个阶段的合成路径，合成具有D-苏氨醇结构的光响应性人工核苷类似物分子(化合物5)(有时称为核苷类似物或光反应性元素)，进而进行了修饰核酸合成用单体(化合物7)的合成。
方案1：
(1)化合物2的合成
依据非专利文献(Synthesis of fused pyranocarbazolones with biologicalinterest,A.Vronteli et al.,Commemorative Issue in Honor of Prof.MichaelOrfanopoulos on the occasion of his outstanding contributions to organicsynthetic chemistry,Volume2015,Issue3,pp.111-123)，由2-羟基咔唑(化合物1)合成了吡喃并咔唑(化合物2)。
(2)化合物3的合成
在投入有化合物2(4.7g)和氢氧化钠(2.4g)的烧瓶中投入乙腈(1000ml)，在室温下搅拌1小时后，滴加溴代乙酸乙酯(6.67g)，进而在室温下搅拌1小时。利用Nutsche过滤器对残留的氢氧化钠通过吸引过滤而去除，利用旋转蒸发仪将滤液浓缩。将得到的化合物3(固体)直接用于接下来的工序。使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(300MHz，CDCL3)：8.14-7.21(m，6H，ArH)、7.88(d，1H，O＝C-CH＝CH)、6.34(d，1H，O＝C-CH＝CH)、4.99(s，2H，CH2CO)、4.24(q，2H，CH3CH2)、1.27(t，3H，CH3)
(3)化合物4的合成
将在之前的工序中得到的化合物3溶解于THF(1000ml)中。将氢氧化钠(0.9g)溶解于水(50ml)中而得到的水溶液滴加至之前的THF溶液中，在室温下搅拌3小时。反应结束后，用稀盐酸将反应液中和至pH6～7。用旋转蒸发仪将反应液浓缩，通过使用了乙酸乙酯的分液操作将目标物萃取到有机相。利用旋转蒸发仪将有机层浓缩，得到了化合物4(固体)。将得到的化合物4直接用于接下来的工序。使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(300MHz，DMSO)：8.48-7.30(m，6H，Ar-H)、8.18(d，1H，O＝C-CH＝CH)、6.35(d，1H，O＝C-CH＝CH)、5.30(s，2H，CH2CO)
(4)化合物5(苏氨醇骨架型吡喃并咔唑核苷类似物：pc-D)的合成
将前工序中得到的化合物4、1-羟基苯并***(2.7g)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.8g)、D-苏氨醇(2.1g)投入烧瓶中，氮气置换后溶解于DMF(100ml)中，在室温下搅拌2小时。边搅拌反应混合物边添加饱和碳酸氢钠水溶液。用带有玻璃滤器的过滤器吸引过滤生成的沉淀物。用蒸馏水和己烷清洗沉淀物后，进行干燥而得到了化合物5(固体)。通过分光光度计测定得到的化合物5的UV-vis光谱(图1)，基于250～400nm处表现出的特征性吸收峰，确认了具有吡喃并咔唑结构。另外，使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(300MHz，DMSO)：8.48-7.29(m，6H，Ar-H)、8.19(d，1H，O＝C-CH＝CH)、8.03(d，1H，NHCO)、6.34(d，1H，O＝C-CH＝CH)、5.17(s，2H，CH2CO)、4.75(br，1H，CH2OH)、4.68(br，1H，CHOH)、3.91(br，1H，NHCH)、3.64(m，1H，CH2OH)、3.51(m，1H，CH2OH)、1.03(d，3H，CH3)
(5)化合物6的合成
将化合物5(4.6g)、4-二甲基氨基吡啶(0.3g)投入烧瓶中，氮气置换后加入吡啶(55ml)，边在冰水浴中冷却边使其溶解。添加4,4’-二甲氧基三苯甲基氯(8.3g)，在冰水浴中搅拌1小时使其反应。利用旋转蒸发仪对反应混合物进行浓缩，通过急骤层析对浓缩物进行纯化而得到了化合物6。使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(300MHz，CDCL3)：8.13-7.03(m，11H，Ar-H)、7.85(d，1H，O＝C-CH＝CH)、6.95-6.69(m，8H，MeO-Ar-H)、6.33(d，1H，O＝C-CH＝CH)、6.29(d，1H，NHCO)、4.96(s，2H，CH2CO)、3.88(m，1H，NCH)、3.88(m，1H，CHOH)、3.77(s，6H，OCH3)、3.25-3.12(m，2H，CH2-ODMTr)、2.52(m，1H，CHOH)、0.93(d，3H，CH3)
(6)化合物7(pc-D亚磷酰胺)的合成
将化合物6(7.2g)、5-苄硫基-1H-四唑(0.2g)投入烧瓶中，氮气置换后加入乙腈(160ml)，在冰水浴中使其溶解。加入2-氰基乙基N,N,N’,N’-四异丙基亚磷酰胺(5.3g)，在室温下搅拌2小时。利用旋转蒸发仪将反应混合物浓缩，通过急骤层析对浓缩物进行纯化而得到了化合物7。使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(600MHz，CDCL3)：8.12-7.18(m，11H，Ar-H)、7.86(d，1H，O＝C-CH＝CH)、7.12-6.71(m，8H，MeO-Ar-H)、6.34(d，1H，O＝C-CH＝CH)、5.87(d，1H，NHCO)、4.93(s，2H，CH2CO)、4.22(m，1H，CHOP)、4.12(q，2H，NC-CH2-CH2)、4.07(m，1H，NHCH)、3.77(s，6H，OCH3)、3.00(m，2H，CH2O-DMTr)、2.10-2.00(m，2H，N-CH-(CH3)2)、1.26(t，2H，NC-CH2)、1.06-0.43(m，12H，N-CH-(CH3)2)、0.93(d，3H，CH3)
[包含光反应性元素(pc-D)的寡聚DNA的合成]
依据通常的氰基乙基亚磷酰胺基法，利用DNA自动合成机合成了包含光反应性元素(有时称为核酸光反应性元素)的寡聚DNA。仅将化合物7的固相缩合反应的反应时间设定为999秒。利用三苯甲基监测器的化合物7的偶联收率为98％以上。使用28质量％氨水溶液进行从固相的去除/脱保护后，进行通过反相HPLC的纯化而得到了包含目标核酸光反应性元素的寡聚DNA(5’-TGCAXCCGT-3’、X为核酸光反应性元素(pc-D))。寡聚DNA的鉴定通过MALDI-TOF MS解析来进行。([(M+H)+]；Calcd.2827.80，Found2828.94)。
将DNA序列的一部分进行变更并输入DNA自动合成机中，除此以外按照与上述同样的操作得到了包含核酸光反应性元素的寡聚DNA(5’-TGCGXCCGT-3’、X为核酸光反应性元素(pc-D))。
[pc-S亚磷酰胺和含有pc-S的DNA的合成]
按照以下的方案2所示的6个阶段的合成路径(到化合物4为止与pc-D同样)合成光响应性人工核苷类似物(化合物8)(pc-S)，所述光响应性人工核苷类似物(化合物8)(pc-S)相当于在上述合成的pc-D中、将苏氨醇变更为丝氨醇(2-氨基-1,3-丙二醇)而得到的结构。进而进行了修饰核酸合成用单体(化合物10)的合成。
方案2：
(1)化合物8(丝氨醇骨架型吡喃并咔唑核苷类似物：pc-S)的合成
将D-苏氨醇变更为丝氨醇并进行与合成化合物5的方法同样的操作，合成了化合物8。利用分光光度计测定得到的化合物8的UV-vis光谱(图2)，基于250～400nm处表现出的特征性吸收峰，确认了具有吡喃并咔唑结构。另外，使用得到的化合物来实施NMR测定，确定各峰的归属，确认了化合物的结构。
1H-NMR(300MHz，DMSO)：8.54-7.26(m，6H，Ar-H)，8.21(d，1H，O＝C-CH＝CH)，8.03(d，1H，NHCO)，6.34(d，1H，O＝C-CH＝CH)，5.11(s，2H，CH2CO)，4.73(br，2H，CH2OH)，3.75(br，1H，NHCH)，3.43(m，4H，CH2OH)
(2)化合物9和化合物10(pc-S亚磷酰胺)的合成
利用与合成方案1的化合物6和化合物7的方法同样的方法实施了化合物9和化合物10(pc-S亚磷酰胺)的合成。
[包含光反应性元素(pc-S)的寡聚DNA的合成]
使用化合物10，通过与pc-D亚磷酰胺同样的操作，得到了包含核酸光反应性元素的寡聚DNA(5’-TGCAXCCGT-3’、X为核酸光反应性元素(pc-S))。
[pc-D的光反应性的评价]
在包含前述pc-D的寡聚DNA[以下称为ODN(Y·pc-D)、Y为A(腺嘌呤)或G(鸟嘌呤)]与互补寡聚DNA[以下称为ODN(Z)、Z为T(胸腺嘧啶)或C(胞嘧啶)]的等量混合液(在50mM二甲胂酸钠缓冲液(Na-Cacodylate buffer)(pH7.4)中5μM，100mM NaCl)中添加作为内标物的脱氧尿苷(25μM)，在4℃下进行了光照射(400nm、9500mW/cm2)。通过HPLC(洗脱液：乙腈/50mM甲酸铵、1～20％乙腈/10分钟、流速：0.2mL/分钟)对该溶液进行分析，由此评价了光反应性。
(1)以胸腺嘧啶为对象的光交联反应
图3a是示出该操作流程的说明图。在光交联对象为胸腺嘧啶(T)的ODN(A·pc-D)(5’-TGCAXCCGT-3’)中，将本发明的核苷类似物(pc-D)作为改良型光反应性元素导入序列中的X的位置。
图3b是示出使用ODN(A·pc-D)和作为互补的寡聚DNA的ODN(T)(5’-ACGGGTGCA-3’)、使用U-VIX制的UV-LED照射装置(OmniCure(注册商标)LX405S)照射400nm的光后、通过HPLC进行分析而得到的结果的图。纵轴方向上排列的图分别对应于光照射时间(0秒、1秒、5秒、10秒、30秒)，横轴表示保留时间(分钟)。在光照射前(0秒)的时间点存在的ODN(A·pc-D)和ODN(T)的峰由于光照射而减少，同时出现了ODN(A·pc-D)与ODN(T)交联而成的光二聚体(ODN(pc-D/T))的峰。伴随光照射时间的增加，(ODN(pc-D/T))的峰面积增大，确认进行了光交联反应。图3c是示出伴随光照射时间的交联率变化的图。图3c的横轴为光照射时间(秒)，纵轴为转化率(％)。对于该转化率、即由单体变为二聚体时的比例，将完全变为二聚体的情况设为转化率100％。本发明的核苷类似物、即ODN(A·pc-D)在照射10秒后显示出高达94％这样的转化率，在1小时后几乎发生了100％交联。
图3d是同样地使用ODN(A·pc-D)和ODN(T)、使用日本分光株式会社制的CRM-FD型照射分光器照射1小时450、500、550nm的光时的HPLC分析结果。对于各自的转化率，450nm处为86％、500nm处为70％、550nm处为38％。
(2)以胞嘧啶为对象的光交联反应
按照与ODN(A·pc-D)同样的操作，使用以C(胞嘧啶)为光交联对象的含有pc-D的寡聚DNA(5’-TGCGXCCGT-3’、以下称为ODN(G·pc-D))和互补寡聚DNA(5’-ACGGGCGCA-3’)、以下称为ODN(C))进行了光交联反应(图4a)。照射30秒400nm的光后，结果利用光交联的转化率为71％(图4b)。
[pc-D的光交联体的光裂解反应]
在60℃下对ODN(A·pc-D)与ODN(T)的混合溶液通过光照射(400nm，60秒)而制备的光二聚体ODN(pc-D/T)溶液进行加热，使用15W的透射仪照射0分钟、5分钟、30分钟的312nm光(图5a)。通过光照射，ODN(pc-D/T)的峰减少，出现了原本的ODN(A·pc-D)和ODN(T)的峰。在照射30分钟后，ODN(pc-D/T)的峰消失，转化率为100％(图5b)。
[pc-S的光反应性的评价]
按照与ODN(A·pc-D)同样的操作，进行了使用T(胸腺嘧啶)为光交联对象的含有pc-S的寡聚DNA(5’-TGCGXCCGT-3’、以下称为ODN(A·pc-S))和作为互补寡聚DNA的ODN(T)的光交联反应(图6a)。
图6b是使用U-VIX制的UV-LED照射装置(OmniCure(注册商标)LX405S)照射400nm的光60秒后，通过HPLC进行分析而得到的结果。在纵轴方向排列的图分别对应于光照射时间(0秒、60秒)，横轴表示保留时间(分钟)。在光照射前(0秒)的时间点存在的ODN(A·pc-S)和ODN(T)的峰由于光照射而减少，同时出现了光二聚体(ODN(pc-S/T))的峰。
[照射光波长对细胞的影响的研究]
为了研究与短波长的光照射相比、长波长的光照射对细胞的损伤少，而进行了以下的实验。
在96孔板中分注5×105细胞/ml的细胞(GFP-HeLa细胞、源自人***的细胞株)100μL，在CO2孵化器中培养48小时。然后，以366nm、400nm或450nm的波长的光进行光照射后，各加入10μL细胞计数试剂盒，在CO2孵化器中显色4小时后，使用微孔板读取器，测定450nm的吸光度，计算出细胞存活率。将该结果汇总示于图7。
[结果]
图7是将各波长下的光照射时间(秒)和细胞存活率(％)进行对比的图。由该结果，在366nm的光照射时即使进行数秒的光照射，细胞存活率也大幅降低，相反在400nm、450nm下即使进行数十秒光照射，细胞存活率也几乎未降低。即，由该结果也明确了，吡喃并咔唑可以在细胞毒性少的长波长的光下进行操作。
产业上的可利用性
本发明提供成为能用于核酸的光反应技术的光反应***联剂的新型的化合物。本发明是产业上具有可利用性的发明。
Claims (7)
1.一种下式I所示的化合物：
(I)
其中，式I中，
R1为选自由氢原子、卤素原子、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基和C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
X为下式It所示的基团，
(It)
其中，式It中，
R11和R12各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
R31和R32各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
R41和R42各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二(C1～C4烷基)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，X为下式Iu所示的基团，
(Iu)
其中，式Iu中，
R42为式It中记载的基团，
Q1和Q2为式It中记载的基团。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，R42为氢原子或甲基。
4.一种光反应***联剂，其包含权利要求1～3中任一项所述的化合物。
5.一种光反应性修饰核酸制造用试剂，其包含权利要求1～3中任一项所述的化合物。
6.一种形成光交联的方法，其使用包含权利要求1～3中任一项所述的化合物的光反应***联剂，在该光反应***联剂与具有嘧啶环的核酸碱基之间形成光交联。
7.一种通过使下式III所示的化合物与下式IV所示的化合物进行脱水缩合来制造下式V所示的化合物的方法，其中，
式III：
其中，式III中，
R1为选自由氢原子、卤素原子、甲基、氟代甲基、乙基、氟代乙基和C1～C3的烷基巯基组成的组中的基团，
R11和R12各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
na为1或2，
式IV：
其中，式IV中，
R21和R22各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nb为0或1，
R31和R32各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nc为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
R41和R42各自独立地为选自由氢原子、C1～C3的烷基和C1～C3的烷氧基组成的组中的基团，
nd为0、1、2或3，nc+nd为0～3的整数，
Q1为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q1的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
三苯甲基、单甲氧基三苯甲基、二甲氧基三苯甲基、三甲氧基三苯甲基、三甲基甲硅烷基、三乙基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基、乙酰基、苯甲酰基；
Q2为选自由以下基团组成的组中的基团：
氢原子；
与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基；
通过磷酸二酯键而连接的核苷酸、核酸或肽核酸，所述磷酸二酯键是由与结合于Q2的O成为一体而形成的磷酸基形成的；及
选自以下的保护基：
2-氰基乙基-N,N-二(C1～C4烷基)亚磷酰胺基、甲基亚膦酰胺基、乙基亚膦酰胺基、氧氮磷杂环戊烷基、硫代亚磷酸酯基、-PH(＝O)OH的TEA盐、-PH(＝O)OH的DBU盐、-PH(＝S)OH的TEA盐、-PH(＝S)OH的DBU盐，
式V：
其中，式V中，
R1、R11和R12各自独立地为上述式III中记载的基团，
na为上述式III中记载的整数，
R21、R22、R31、R32、R41、R42、Q1和Q2各自独立地为上述式IV中记载的基团，
nb、nc和nd分别为上述式IV中记载的整数。
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