CN110716047A - 一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能够在同一小型全自动分析仪平台上配套定量测定尿液微量白蛋白、转铁蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白、免疫球蛋白G和肌酐的肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液微量蛋白检测试剂盒，包括尿液微量蛋白检测试剂盒和肌酐测定试剂盒；所述尿液微量蛋白检测试剂盒包括尿液微量蛋白R1试剂和尿液微量蛋白R2试剂。本发明具有检测质量高、检测快速高效(15分钟出结果)、检测全面***、使用方便价廉的优点，为肾脏病早期筛查检测，提供了一个有用平台，且可广泛应用于基层医院及大医院门诊检验科，并带来较大的社会效益和经济效益。

Description

一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒
技术领域
本发明涉及体外诊断技术免疫及生化检测领域，尤其是涉及一种肾病早筛小型全自动 分析仪配套的尿液检测试剂盒。
背景技术
肾脏病是常见病多发病。全世界超过5亿人患有不同的肾脏疾病。我国普通人群慢性 肾脏病发病率为10％～13％，由此推测我国超过1亿人罹患该病。
慢性肾脏病早期阶段，患者一般没有不适症状，往往被忽视。然而，看似健康的该病 患者死于心脑血管病的风险是正常人的十倍以上。如发展到***，不仅有害健康，甚至会 危及生命，还有两至三成患者首次到医院就诊时，肾功能损害已发展到不可逆阶段。
国际肾脏病学会和国际肾脏病基金联合会呼吁，每个人都应关爱自己“神奇的肾脏”， 及早发现肾脏损害并接受必要治疗，以免引发严重病症。
鉴于当前全球慢性肾脏病的发病率不断上升，而公众对该病的防治知识普遍缺乏，经 国际肾脏病学会和国际肾脏病基金联合会提议，决定从2006年起将每年3月份的第二个星期 四确定为世界肾脏日，目的在于提高人们对慢性肾脏病以及相关心血管疾病和死亡率的认识， 并重视在慢性肾脏病早期检测和预防方面全球的迫切需求。
肾脏病早期筛查的手段和方法不多，B超及影像检查帮助不大，目前常用的方法是测 定尿液中的微量蛋白。尿液微量蛋白测定可反映早期肾病、肾损伤情况。尿中微量蛋白升高 多见于糖尿病、高血压及妊娠子痫等疾病并发肾病的前期。尿液微量蛋白初期检出增高阶段 是肾病发生的早期信号和预兆，此时肾脏损害处在尚可逆转的时期，如及时治疗，可以终止 或逆转肾病的发展进程。尿液微量蛋白联合检测可作为全身性或局部炎症反应的肾功能指标 (如***等原因引起的肾脏早期病变，急性胰腺炎并发症的预测指标，服用对肾功能有影 响药物的了解判断等)，便于早期观察肾功能情况并及早采取治疗措施。
常用于肾病早筛的尿液微量蛋白测定项目有：白蛋白、转铁蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白和免疫球蛋白G，还有为计算比值的生化项目尿液肌酐测定。
白蛋白分子量约为6.7万。正常人尿液微量白蛋白(MA)含量甚微，当肾小球基膜的体积屏障受损时，尿液中MA明显升高。MA检测是临床反映肾小球和心血管***改变的早 期指征。
转铁蛋白分子量约7.7万。尿液转铁蛋白(TRF)检测是反映肾小球基底膜电荷屏障损 伤的可靠指标，TRF较MA更敏感。
β2微球蛋白分子量约3.3万。尿液β2微球蛋白(β2MG)主要与肾小管功能有关。 检测β2MG是辅助诊断近曲小管损伤敏感而特异的指标；尿蛋白/β2MG比值有助于鉴别肾 小球或肾小管病变；用于鉴别上、下***，上***时β2MG明显增加，下*** 时β2MG基本正常；用于判断肾移植的排斥反应；糖尿病、高血压病人早期β2MG与肾功 能损害程度显著相关；恶性肿瘤、自身免疫性疾病肾损害时，β2MG明显增高；重金属中毒 肾损害的流行病调查，β2MG可作为筛选检测项目。
α1微球蛋白分子量约1.18万。尿液α1微球蛋白(α1MG)测定是反映肾小管受损 及其重吸收功能的一项灵敏指标，且优于β2MG。
免疫球蛋白G(IgG)分子量约16万。IgG通常不易通过肾小球滤过膜，尿中排量极微。 检测尿液IgG主要用于鉴别选择性与非选择性肾小球性蛋白尿，判断肾小球受损的严重程度 和预后。
肌酐分子量为113.1。正常人尿肌酐日排出量相当稳定，成年男性日排出量为1.0～1.8g， 女性为0.7～1.0g，而且不受食物蛋白质含量和尿量的影响。因此，可用尿液微量蛋白与肌酐 测定结果进行比值计算，能更为准确地反映肾功能状况。
目前尿液微量蛋白定量测定方法有酶免法、免疫比浊法及胶体金免疫层析法等。酶免 法定量测定CV较大，在医院检验科已不常用；免疫比浊法运用大型自动化仪器，普遍应用 于大医院检验科批量检测尿液微量蛋白；胶体金免疫层析法常应用于基层医院，但定量检测 质量较差；中国发明专利CN105911291A公开了一种尿液微量蛋白检测试剂盒及其检测方法， 在液相芯片检测仪上同时联合检测尿液七种微量蛋白，提高了检测灵敏度和检测速度，适合 大医院高通量检测尿液微量蛋白，但对基层医院及大医院门诊不适用。
发明内容
本发明的目的是为了提供一种能够在同一小型全自动分析仪平台上进行尿液微量白 蛋白、转铁蛋白、β2微球蛋白、α1微球蛋白、免疫球蛋白G和肌酐定量测定的肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液微量蛋白检测试剂盒，可广泛应用于基层医院及大医院门诊检 验科，并带来较大的社会效益和经济效益。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，包括尿液微量蛋白检测试 剂盒和肌酐测定试剂盒；
所述尿液微量蛋白检测试剂盒包括尿液微量蛋白R1试剂和尿液微量蛋白R2试剂；
所述尿液微量蛋白R1试剂包括以下组分：聚乙二醇6000、PBS缓冲液、表面活性剂及防腐 剂，以PBS缓冲液质量为基准计，尿液微量蛋白R1试剂中，聚乙二醇6000含量为1～5％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％，；
所述尿液微量蛋白R2试剂通过以下方法制得：
(1)将羧基乳胶微球加入到MES缓冲液或PBS缓冲液中，加入EDC溶液和NHS溶液，搅 拌均匀得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，搅拌均匀后离心取离心固体物，将离心固体物用PBS缓冲液重悬，得羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在羧基乳胶微球活化溶液中加入尿液微量蛋白抗体，混合均匀后进行孵育反应，反应后 于反应产物中加入牛血清转铁蛋白溶液，再进行孵育反应，离心取离心固体物，用PBS缓冲 液重悬，再次离心取离心固体物，加入乳胶微球保存液，即得尿液微量蛋白R2试剂；
所述肌酐试剂盒包括肌酐R1试剂和肌酐R2试剂；
所述肌酐R1试剂包括以下组分：PBS缓冲液、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂及防腐剂，以PBS缓冲液质量为基准计，肌酐R1试剂中，肌酸酶 含量为0～0.05％，肌氨酸氧化酶含量为0～0.05％，过氧化氢酶含量为0～0.05％，抗坏血酸氧化 酶含量为0～0.05％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％；
所述肌酐R2试剂包括以下组分：PBS缓冲液、肌酐酶、过氧化物酶、亚铁***、4-氨基安 替比林、表面活性剂及防腐剂，以PBS缓冲液质量为基准计，肌酐R2试剂中，肌酐酶含量为0～0.05％，过氧化物酶含量为0～0.05％，亚铁***含量为0～0.05％，4-氨基安替比林含量 为0～0.05％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％。
作为优选，尿液微量蛋白R1试剂中，所述PBS缓冲液pH为6.5～8.5，浓度为50mmol/mL，所述表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100、聚醚中的至少一种，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种。
作为优选，步骤(1)中，所述MES缓冲液pH为5.0～6.0，浓度为50～200mmol/mL， 所述PBS缓冲液pH为6.5～7.5，浓度100～200mmol/mL；羧基乳胶微球溶液中羧基乳胶微的 浓度为0.02～0.1％。
作为优选，作为优选，步骤(2)中，EDC溶液浓度为0.02～0.1％，NHS溶液浓度为0.05～0.2％；羧基乳胶微球溶液中羧基乳胶微浓度为0.05～0.5％；PBS缓冲液浓度为20～200 mmol/mL，pH为6.5～8.5。
作为优选，步骤(3)中，所述尿液微量蛋白抗体为尿液微量转铁蛋白、转铁蛋白、 β2-微球蛋白、α1-微球蛋白及免疫球蛋白G。
作为优选，步骤(3)中，按10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入0.5～2.0mg尿液微量蛋白抗体的标准，在羧基乳胶微球溶液中加入尿液微量蛋白抗体，室温孵育反应2～4h。
作为优选，步骤(3)中，牛血清转铁蛋白溶液的质量浓度为5％，按1mL反应产物加200μL牛血清转铁蛋白溶液的标准，在反应产物中加入牛血清转铁蛋白溶液，再室温孵育反应1～2h；PBS缓冲液浓度为20～200mmol/mL，pH为6.5～8.5。
作为优选，所述乳胶微球保存液包括以下组分：pH为6.5～8.5、浓度为50～200mmol/mL 的PBS缓冲液、防腐剂及稳定剂，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中防腐剂含量为 0.05～0.1％，稳定剂含量为0.1～0.5％。
作为优选，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种，稳定剂 为酪蛋白、牛血清转铁蛋白、明胶、甘露醇、蔗糖、葡聚糖中的至少一种。
作为优选，肌酐R1试剂和肌酐R2试剂中，PBS缓冲液pH为8.0～8.2，浓度为50mmol/mL；表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100、聚醚中的至少一种，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)能基于同一个小型全自动分析仪平台上，配套定量测定的尿液微量转铁蛋白、转铁蛋白、 β2微球蛋白、α1微球蛋白、免疫球蛋白G和肌酐，且本试剂盒的使用，使得尿液微量蛋白和肌酐在检测中能够采用乳胶增强和散射比浊的方法，从而大大提高了检测灵敏度，适合 基层医院及大医院门诊的需要；
(2)本发明提供的尿液微量转铁蛋白定量测定试剂盒测定线性范围6.26-400.8mg/L，线性相 关系数为r＝0.9986，灵敏度为3.1mg/L；精密度平均为3.64％，准确度平均回收率为100.72％； 与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9820)；尿液转铁蛋白定量测定试剂盒测定 线性范围0.789-50.49mg/L，线性相关系数为r＝0.9990，灵敏度为0.088mg/L，精密度平均为 4.57％，准确度平均回收率为100.94％；与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9720)；尿液β2微球蛋白定量测定试剂盒测定线性范围0.311-19.93mg/L，线性相关系 数为r＝0.9979，灵敏度为0.0479mg/L，精密度平均为3.31％，准确度平均回收率为101.96％， 与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9641)；尿液α1微球蛋白定量测定试剂盒 测定线性范围3.119-199.6mg/L，线性相关系数为r＝0.9979，灵敏度为0.1433mg/L，精密度平 均为3.455％，准确度平均回收率为101.86％，与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9689)；尿液免疫球蛋白G定量测定试剂盒测定线性范围1.567-100.28mg/L，线性相关 系数为r＝0.9986，灵敏度为0.0352mg/L，精密度平均为4.99％，准确度平均回收率为101.63％， 与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9724)；尿液肌酐定量测定试剂盒测定线性 范围31.361-2007.1umol/L，线性相关系数为r＝0.9998，灵敏度为3.574umol/L，精密度平均为 3.08％，准确度平均回收率为101.85％，与日立全自动生化分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9818)。
(3)按照高质量、快速高效(15分钟出结果)、全面***、小型全自动及方便价廉设计要求，为肾脏病早期筛查检测，提供了一个有用平台，可广泛应用于基层医院及大医院门诊检验科，并带来较大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1是实施例1中微量白蛋白试剂的线性拟合图。
图2是实施例2中转铁蛋白微量白蛋白试剂的线性拟合图。
图3是实施例3中α1-微球蛋白试剂的线性拟合图。
图4是实施例4中β2-微球蛋白试剂的线性拟合图。
图5是实施例5中免疫球蛋白G试剂的线性拟合图。
图6是实施例6中肌酐试剂的线性拟合图。
图7是实施例1中微量白蛋白试剂的相关性分析散点图。
图8是实施例2中转铁蛋白微量白蛋白试剂的相关性分析散点图。
图9是实施例3中α1-微球蛋白试剂的相关性分析散点图。
图10是实施例4中β2-微球蛋白试剂的相关性分析散点图。
图11是实施例5中免疫球蛋白G试剂的相关性分析散点图。
图12是实施例6中肌酐试剂的相关性分析散点图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的描述。
实施例1
微量转铁蛋白测定试剂盒制备
配制微量转铁蛋白R1试剂：在pH为7.4，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓 冲液质量为基准，加入1.5％的聚乙二醇6000，0.05％的表面活性剂(吐温20)，0.05％的防腐剂(Proclin300)，混合均匀后用0.4um的膜过滤，得R1试剂；
制备微量转铁蛋白R2试剂：
(1)将羧基乳胶微球加入到pH为5.0，浓度为50mmol/mL的MES缓冲液中，使羧基乳胶 微球的浓度为1.0％，得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，EDC的浓度为0.05％(质量)，NHS 的浓度为0.1％(质量)，室温搅拌15分钟，离心取离心固体物，将离心固体物用pH为7.5， 浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，得乳胶微球浓度为0.5％的羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入2.0mg转铁蛋白抗体，将乳胶微球和转铁蛋白抗 体充分混匀，室温孵育反应3h，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入浓度为5％(质量)的牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1h，离心取离心固体物，用pH为7.5，浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固体物，加 入乳胶微球保存液，即得R2试剂，R2试剂中羧基乳胶微的浓度为0.05％；乳胶微球保存液 包括以下组分：pH为7.5、浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液、防腐剂(Proclin300)及稳定 剂(蔗糖)，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中防腐剂含量为0.05％，稳定剂含量为 0.1％。
实施例2
转铁蛋白测定试剂盒制备
配制转铁蛋白R1试剂：在pH为7.4，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓冲液 质量为基准，加入1.5％的聚乙二醇6000，0.05％的表面活性剂(吐温20)，0.05％的防腐剂(Proclin300)，混合均匀后用0.4um的膜过滤，得转铁蛋白R1试剂；
制备转铁蛋白R2试剂：
(1)将羧基乳胶微球加入到pH为5.0，浓度为50mmol/mL的MES缓冲液中，使羧基乳胶 微球的浓度为1.0％，得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，EDC的浓度为0.05％(质量)，NHS 的浓度为0.1％(质量)，室温搅拌15分钟，离心取离心固体物，将离心固体物用pH为7.5， 浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，得乳胶微球浓度为0.5％的羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入2.0mg转铁蛋白抗体，将乳胶微球和转铁蛋白抗 体充分混匀，室温孵育反应3h，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入浓度为5％(质量)的牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1h，离心取离心固体物，用pH为7.5，浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固体物，加 入乳胶微球保存液，即得转铁蛋白R2，转铁蛋白R2试剂中羧基乳胶微的浓度为0.05％；乳 胶微球保存液包括以下组分：pH为7.5、浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液、防腐剂 (Proclin300)及稳定剂(蔗糖)，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中防腐剂含量为0.05％， 稳定剂含量为0.1％。
实施例3
α1-微球蛋白测定试剂盒制备
配制α1-微球蛋白R1试剂：在pH为7.4，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓 冲液质量为基准，加入1.5％的聚乙二醇6000，0.05％的表面活性剂(吐温20)，0.05％的防腐 剂(Proclin300)，混合均匀后用0.4um的膜过滤，得α1-微球蛋白R1试剂；
制备α1-微球蛋白R2试剂：
(1)将羧基乳胶微球加入到pH为5.0，浓度为50mmol/mL的MES缓冲液中，使羧基乳胶 微球的浓度为1.0％，得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，EDC的浓度为0.05％(质量)，NHS 的浓度为0.1％(质量)，室温搅拌15分钟，离心取离心固体物，将离心固体物用pH为7.5， 浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，得乳胶微球浓度为0.5％的羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入2.0mgα1-微球蛋白抗体，将乳胶微球和α1-微球蛋白抗体充分混匀，室温孵育反应3h，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入浓度为5％(质量)的牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1h，离心 取离心固体物，用pH为7.5，浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固 体物，加入乳胶微球保存液，即得α1-微球蛋白R2试剂，α1-微球蛋白R2试剂中羧基乳胶 微的浓度为0.05％；乳胶微球保存液包括以下组分：pH为7.5、浓度为100mmol/mL的PBS 缓冲液、防腐剂(Proclin300)及稳定剂(蔗糖)，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中 防腐剂含量为0.05％，稳定剂含量为0.1％。
实施例4
β2-微球蛋白测定试剂盒制备
配制β2-微球蛋白R1试剂：在pH为7.4，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓 冲液质量为基准，加入1.5％的聚乙二醇6000，0.05％的表面活性剂(吐温20)，0.05％的防腐 剂(Proclin300)，混合均匀后用0.4um的膜过滤，得β2-微球蛋白R1试剂；
制备α1-微球蛋白R2试剂：
(1)将羧基乳胶微球加入到pH为5.0，浓度为50mmol/mL的MES缓冲液中，使羧基乳胶 微球的浓度为1.0％，得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，EDC的浓度为0.05％(质量)，NHS 的浓度为0.1％(质量)，室温搅拌15分钟，离心取离心固体物，将离心固体物用pH为7.5， 浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，得乳胶微球浓度为0.5％的羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入2.0mgβ2-微球蛋白抗体，将乳胶微球和β2-微球蛋白抗体充分混匀，室温孵育反应3h，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入浓度为5％(质量)的牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1h，离心 取离心固体物，用pH为7.5，浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固 体物，加入乳胶微球保存液，即得β2-微球蛋白R2试剂，β2-微球蛋白R2试剂中羧基乳胶 微的浓度为0.05％；乳胶微球保存液包括以下组分：pH为7.5、浓度为100mmol/mL的PBS 缓冲液、防腐剂(Proclin300)及稳定剂(蔗糖)，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中 防腐剂含量为0.05％，稳定剂含量为0.1％。
实施例5
免疫球蛋白G测定试剂盒制备
配制免疫球蛋白GR1试剂：在pH为7.4，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓 冲液质量为基准，加入1.5％的聚乙二醇6000，0.05％的表面活性剂(吐温20)，0.05％的防腐 剂(Proclin300)，混合均匀后用0.4um的膜过滤，得免疫球蛋白GR1试剂；
制备免疫球蛋白GR2试剂：
(1)将羧基乳胶微球加入到pH为5.0，浓度为50mmol/mL的MES缓冲液中，使羧基乳胶 微球的浓度为1.0％，得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，EDC的浓度为0.05％(质量)，NHS 的浓度为0.1％(质量)，室温搅拌15分钟，离心取离心固体物，将离心固体物用pH为7.5， 浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，得乳胶微球浓度为0.5％的羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入2.0mg免疫球蛋白G抗体，将乳胶微球和免疫球 蛋白G抗体充分混匀，室温孵育反应3h，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入浓度为5％(质量)的牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1h，离心 取离心固体物，用pH为7.5，浓度为100mmol/mL的PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固 体物，加入乳胶微球保存液，即得免疫球蛋白GR2试剂，免疫球蛋白GR2试剂中羧基乳胶 微的浓度为0.05％；乳胶微球保存液包括以下组分：pH为7.5、浓度为100mmol/mL的PBS 缓冲液、防腐剂(Proclin300)及稳定剂(蔗糖)，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中 防腐剂含量为0.05％，稳定剂含量为0.1％。
实施例6
肌酐试剂盒制备
配制肌酐R1试剂：在pH为8.0，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓冲液质量 为基准，加入0.02％的肌酸酶，0.01％的肌氨酸氧化酶，0.05％的过氧化氢酶，0.01％的抗坏血 酸氧化酶，0.02％的表面活性剂(曲拉通-100)，0.02％的防腐剂(KV600)，混合均匀后用0.4um 的膜过滤，即得R1试剂；
配制肌酐R2试剂：在pH为8.2，浓度为50mmol/mL的PBS缓冲液中，以PBS缓冲液质量 为基准，加入0.05％的肌酐酶，0.02％的过氧化物酶，0.05％的亚铁***，0.04％的4-氨基安替比林，0.02％的表面活性剂(曲拉通-100)，0.02％的防腐剂(KV600)，混合均匀后用0.4um 的膜过滤，即得R2试剂。
(一)制备多项校准品的 配制校准品稀释液，加入市购的微量白蛋白、转铁蛋白、α1-微球蛋白、β2-微球蛋白、免 疫球蛋白G的校准品抗原蛋白和肌酐，配制成微量白蛋白浓度为400mg/L，转铁蛋白浓度为 50mg/L、α1-微球蛋白浓度为200mg/L、β2-微球蛋白浓度为20mg/L、免疫球蛋白G浓度为 100mg/L，肌酐浓度为2000umol/L的混合液，将该混合溶液作为样本用对应的对照试剂进行 测定，重复测定10次，取其均值作为该校准品的赋值。
Figure BDA0002246214740000091
(二)制备标准曲线
将上述步骤(一)中的校准品梯度稀释成7个浓度，稀释液作为零浓度校准品，依次用实施 例1～6中的试剂，在小型全自动分析仪设置相应的参数进行定标测定，用理论浓度和测试的 信号值用四参数或线性进行拟合，在仪器内自动得到相应的定标曲线。
实施例1微量白蛋白试剂的理论浓度与信号值如表1所示，线性拟合图如图1所示。
表1实施例1微量白蛋白试剂的理论浓度与信号值
Figure RE-GDA0002303778320000101
实施例2转铁蛋白试剂的理论浓度与信号值如表2所示，线性拟合图如图2所示。
表2实施例2转铁蛋白试剂的理论浓度与信号值
实施例2 理论浓度(mg/L) 信号值
1 50.49 5673
2 25.25 4028.5
3 12.62 2512
4 6.311 1545
5 3.156 879.5
6 1.578 423.5
7 0.789 204
8 0 19.5
实施例3α1-微球蛋白试剂的理论浓度与信号值如表3所示，线性拟合图如图3所示。
表3实施例3α1-微球蛋白试剂的理论浓度与信号值
实施例3 理论浓度(mg/L) 信号值
1 199.6 7673
2 99.80 4428.5
3 49.90 2412
4 24.950 1305
5 12.475 679.5
6 6.238 363.5
7 3.119 184
8 0 12
实施例4β2-微球蛋白试剂的理论浓度与信号值如表4所示，线性拟合图如图4所示。
表4实施例4β2-微球蛋白试剂的理论浓度与信号值
实施例4 理论浓度(mg/L) 信号值
1 19.93 8227
2 9.97 5528.5
3 4.98 3112
4 2.491 1545
5 1.246 679.5
6 0.623 313.5
7 0.311 154
8 0 22.5
实施例5免疫球蛋白G试剂的理论浓度与信号值如表5所示，线性拟合图如图5所示。
表5实施例5免疫球蛋白G试剂的理论浓度与信号值
实施例5 理论浓度(mg/L) 信号值
1 100.28 6392
2 50.14 4728.5
3 25.07 3245
4 12.535 2041
5 6.268 1239.5
6 3.134 723.5
7 1.567 406.5
8 0 36
实施例6肌酐试剂的理论浓度与信号值如表6所示，线性拟合图如图6所示。
表6实施例6肌酐试剂的理论浓度与信号值
实施例6 理论浓度(umol/L) 信号值
1 2007.1 0.7984
2 1003.55 0.3998
3 501.78 0.1986
4 250.888 0.1109
5 125.444 0.0511
6 62.722 0.0272
7 31.361 0.0147
8 0 0.0016
(三)性能评估
分别取实施例1～6中的试剂和对应的标准曲线，对其灵敏度(空白限)、准确度(回收率)、 精密性、线性等性能指标进行评估。
(1)灵敏度(空白限)
评估方法：用空白样本重复测试20次，记录20次测试的信号值，计算其均值(M)和标准偏差(SD)，计算M+2SD的值，并代入拟合的标准曲线，即为其灵敏度(空白限)。
Figure BDA0002246214740000112
(2)准确度(回收率)
评估方法：将一个临床样本分成三份，每份体积100ul，用赋值的校准品作为加入样本，在第 一份样本中加入10ul的PBS，第二份样本中加入5ul的PBS和5ul的校准品，在第三份样本 中加入10ul的校准品。混匀后测试这三份回收样本，每个重复测试三次，计算其测试结果均 值，与加入的理论浓度比较，计算其回收率。
Figure BDA0002246214740000122
Figure BDA0002246214740000131
(3)精密性
评估方法：分别用高低两个不同浓度的样本重复测试10次，计算10次测试结果的变异次数 (CV)。
Figure BDA0002246214740000132
(4)线性
评估方法：用赋值的校准品对倍稀释作为样本进行测试，测试结果与稀释倍数进行线性拟合， 计算其相关系数r。
Figure BDA0002246214740000142
Figure BDA0002246214740000151
(四)与对照试剂相关性评估
收集50例临床样本，用对照试剂和本发明实施例1～6制备的试剂分别在相应的仪器上进行测 定，将两组测定结果进行相关性分析。以对照试剂测试结果为横坐标，本发明试剂的测量值 为纵坐标，绘制散点图，实施例1～实施例6的相关性分析散点图分别如图7～12所示。
从上述所有结果可知，经方法学实验比对，本发明提供的尿液微量白蛋白定量测定试 剂盒测定线性范围6.26-400.8mg/L，线性相关系数为r＝0.9986，灵敏度为3.1mg/L；精密度平 均为3.64％，准确度平均回收率为100.72％；与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9820)；尿液转铁蛋白定量测定试剂盒测定线性范围0.789-50.49mg/L，线性相关系数为 r＝0.9990，灵敏度为0.088mg/L，精密度平均为4.57％，准确度平均回收率为100.94％；与西门 子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9720)；尿液β2微球蛋白定量测定试剂盒测定线 性范围0.311-19.93mg/L，线性相关系数为r＝0.9979，灵敏度为0.0479mg/L，精密度平均为 3.31％，准确度平均回收率为101.96％，与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9641)；尿液α1微球蛋白定量测定试剂盒测定线性范围3.119-199.6mg/L，线性相关系 数为r＝0.9979，灵敏度为0.1433mg/L，精密度平均为3.455％，准确度平均回收率为101.86％， 与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关(r＝0.9689)；尿液免疫球蛋白G定量测定试剂盒 测定线性范围1.567-100.28mg/L，线性相关系数为r＝0.9986，灵敏度为0.0352mg/L，精密度 平均为4.99％，准确度平均回收率为101.63％，与西门子特定蛋白分析仪测定结果高度相关 (r＝0.9724)；尿液肌酐定量测定试剂盒测定线性范围31.361-2007.1umol/L，线性相关系数为 r＝0.9998，灵敏度为3.574umol/L，精密度平均为3.08％，准确度平均回收率为101.85％，与 日立全自动生化分析仪测定结果高度相关(r＝0.9818)。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限 制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (10)

1.一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，包括尿液微量蛋白检测试剂盒和肌酐测定试剂盒；
所述尿液微量蛋白检测试剂盒包括尿液微量蛋白R1试剂和尿液微量蛋白R2试剂；
所述尿液微量蛋白R1试剂包括以下组分：聚乙二醇6000、PBS缓冲液、表面活性剂及防腐剂，以PBS缓冲液质量为基准计，尿液微量蛋白R1试剂中，聚乙二醇6000含量为1～5％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％，；所述尿液微量蛋白R2试剂通过以下方法制得：
(1)将羧基乳胶微球加入到MES缓冲液或PBS缓冲液中，加入EDC溶液和NHS溶液，搅拌均匀得羧基乳胶微球溶液；
(2)在羧基乳胶微球溶液加入EDC溶液和NHS溶液，搅拌均匀后离心取离心固体物，将离心固体物用PBS缓冲液重悬，得羧基乳胶微球活化溶液；
(3)在羧基乳胶微球活化溶液中加入尿液微量蛋白抗体，混合均匀后进行孵育反应，反应后于反应产物中加入牛血清白蛋白溶液，再进行孵育反应，离心取离心固体物，用PBS缓冲液重悬，再次离心取离心固体物，加入乳胶微球保存液，即得尿液微量蛋白R2试剂；
所述肌酐试剂盒包括肌酐R1试剂和肌酐R2试剂；
所述肌酐R1试剂包括以下组分：PBS缓冲液、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、过氧化氢酶、抗坏血酸氧化酶、表面活性剂及防腐剂，以PBS缓冲液质量为基准计，肌酐R1试剂中，肌酸酶含量为0～0.05％，肌氨酸氧化酶含量为0～0.05％，过氧化氢酶含量为0～0.05％，抗坏血酸氧化酶含量为0～0.05％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％；
所述肌酐R2试剂包括以下组分：PBS缓冲液、肌酐酶、过氧化物酶、亚铁***、4-氨基安替比林、表面活性剂及防腐剂，以PBS缓冲液质量为基准计，肌酐R2试剂中，肌酐酶含量为0～0.05％，过氧化物酶含量为0～0.05％，亚铁***含量为0～0.05％，4-氨基安替比林含量为0～0.05％，表面活性剂含量为0.02～0.1％，防腐剂含量为0.02～0.2％。
2.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，尿液微量蛋白R1试剂中，所述PBS缓冲液pH为6.5～8.5，浓度为50mmol/mL，所述表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100、聚醚中的至少一种，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，步骤(1)中，所述MES缓冲液pH为5.0～6.0，浓度为50～200mmol/mL，所述PBS缓冲液pH为6.5～7.5，浓度100～200mmol/mL；羧基乳胶微球溶液中羧基乳胶微的浓度为0.02～0.1％。
4.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，步骤(2)中，EDC溶液浓度为0.02～0.1％，NHS溶液浓度为0.05～0.2％；羧基乳胶微球溶液中羧基乳胶微浓度为0.05～0.5％；PBS缓冲液浓度为20～200mmol/mL，pH为6.5～8.5。
5.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，步骤(3)中，所述尿液微量蛋白抗体为尿液微量白蛋白、转铁蛋白、β2-微球蛋白、α1-微球蛋白及免疫球蛋白G。
6.根据权利要求1或6所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，步骤(3)中，按10mg羧基乳胶微球活化溶液中加入0.5～2.0mg尿液微量蛋白抗体的标准，在羧基乳胶微球溶液中加入尿液微量蛋白抗体，室温孵育反应2～4h。
7.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，步骤(3)中，牛血清白蛋白溶液的质量浓度为5％，按1mL反应产物加200μL牛血清白蛋白溶液的标准，在反应产物中加入牛血清白蛋白溶液，再室温孵育反应1～2h；PBS缓冲液浓度为20～200mmol/mL，pH为6.5～8.5。
8.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，所述乳胶微球保存液包括以下组分：pH为6.5～8.5、浓度为50～200mmol/mL的PBS缓冲液、防腐剂及稳定剂，以PBS缓冲液质量计，乳胶微球保存液中防腐剂含量为0.05～0.1％，稳定剂含量为0.1～0.5％。
9.根据权利要求8所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种，稳定剂为酪蛋白、牛血清白蛋白、明胶、甘露醇、蔗糖、葡聚糖中的至少一种。
10.根据权利要求1所述的一种肾病早筛小型全自动分析仪配套的尿液检测试剂盒，其特征在于，肌酐R1试剂和肌酐R2试剂中，PBS缓冲液pH为8.0～8.2，浓度为50mmol/mL；表面活性剂为吐温-20、曲拉通-100、聚醚中的至少一种，所述防腐剂为叠氮钠、对羟基苯甲酸、Proclin300中的至少一种。
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