CN110713450A - 一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法 - Google Patents

一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法。该方法包括以下步骤：S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，得到红球藻酸溶液；S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，得到一次破壁液；S3：向一次破壁液中加入提取溶剂后，再进行二次破壁，得到二次破壁液；S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；S5：将上层液进行超临界萃取提纯，即得到虾青素。

Description

一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法
技术领域
本发明涉及虾青素提取技术领域，具体涉及一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法。
背景技术
虾青素最早发现于虾蟹的外壳中，是目前自然界发现的最强大的天然抗氧化素。与其他抗氧化素相比，虾青素兼具脂溶性及水溶性，因此更易于被人体吸收。虾青素的抗氧化能力，是维生素C的6000倍；维生素E的500-1000倍；是辅酶Q10的800倍。因此虾青素被应用为保健品在市场发售，尤其是在抗衰老领域的表现，虾青素被称为“超级维生素E”。
虾青素是人类对抗衰老、对抗疾病的重要补充剂，它清除自由基，提高人体免疫力，能够穿透血脑屏障等人体主要屏障，是唯一能够达到人体全身各处细胞的一种抗氧化剂。由于它超强的抗氧化性，为人类解决某些常见慢性病，如心脑血管病、糖尿病、动脉硬化、关节炎等开启了全新的篇章。它被国际医学和营养学界称为“红色奇迹”，它的发现和应用对于人类健康有着难以估量的意义和光明的未来。
虾青素分子式为C40H52O4，由于两端的羟基（-OH)旋光性原因，虾青素具有左旋、内消旋、右旋这3种异构型态，其中人工合成虾青素为3种结构虾青素的混合物（左旋占25%、右旋占25%，内消旋50%左右），极少抗氧化活性，与鲑鱼等养殖生物体内的虾青素截然不同。酵母菌源的虾青素是100%右旋，有部分抗氧化活性；上述两种来源虾青素主要用在非食用动物和物资的着色上。只有藻源的虾青素是100%左旋结构，具有最强的生物学活性。
目前，虾青素的来源大部分为人工合成，除人工化学合成方法之外，天然虾青素的生物来源一般有3种：水产品加工工业的废弃物、红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)和微藻（雨生红球藻）。其中，废弃物中虾青素含量较低，且提取费用较高，不适于进行大规模生产。天然的红发夫酵母中虾青素平均含量也仅为0.40%。相比之下，雨生红球藻中虾青素含量却高达1.5%～3.0%，因此被看作是天然虾青素的“浓缩品”。
雨生红球藻被公认为自然界中生产天然虾青素的最好生物，因此，利用这种微藻提取虾青素无疑具有广阔的发展前景，已成为国际上天然虾青素生产的研究热点。
在虾青素的提取工艺中，其提取率与其破壁程度密切相关，目前大部分破壁处理均为单一的试剂破壁、研磨破壁或者超声破壁，无法对红球藻粉末进行较好的破壁分离，直接影响后续的提取效率；同时提取后的虾青素活性和提取过程中所受的温度和光照有着密切关系，一般温度大于55℃其活性就会降低，同时其活性也随着光照时长的增加而降低，这就会出现高提取率、低活性的情况发生，导致高活性的虾青素提取率不高，这样，就会增大较大的提取成本，以及虾青素的质量。
发明内容
本发明的目的在于，针对上述现有技术的不足，提出一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，通过二次破壁、低温、避光提取工艺来实现高提取率、高活性的虾青素提取方法。
本发明提出一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，包括以下步骤：
S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，pH为5.0-6.5，得到红球藻酸溶液；
S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，得到一次破壁液；
S3：向一次破壁液中加入提取溶剂后，再进行二次破壁，得到二次破壁液；
S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；
S5：将上层液进行超临界萃取提纯，即得到虾青素。
进一步地，S1中的所述酸性稳定剂为25-35%浓度的乙酸，所述雨生红球藻粉末与酸性稳定剂的投料质量比为1:15-20。
进一步地，S2中所述一次破壁处理采用的为锆珠研磨。
进一步地，锆珠研磨同时采用三种尺寸的锆珠进行研磨，分别为0.04-0.06mm、0.08-0.10mm和0.14-0.16mm，雨生红球藻粉末与三种尺寸的锆珠质量比为18-26：1：2：3。
进一步地，S3中所述酶解剂的添加量为3000-4500U/ml，所述酶解剂包括果胶酶和纤维素酶，所述果胶酶和纤维素酶的活力比为1.2-1.8:1（U:U），酶解时间为2-3h，酶解温度为35-45℃，酶解pH通过乙酸控制在5.0-5.5。
本发明采用的酶解剂为果胶酶和纤维素酶组合的复合酶系，由于雨生红球藻的细胞壁是有纤维素蛋白和果胶组成的网状结构，所以采用复合酶系可以有效瓦解植物细胞壁，提高生物细胞壁和细胞膜的通透性，加速细胞内容物的流出，特别是在一次破壁后的加入使用，可以对物理破损后的破损物质进行快速瓦解，由于研磨后无法使每个细胞破碎，但是雨生红球藻的大部分结构均被破坏，所以这时加入响应的酶进行酶解，可以事半功倍，不仅加大了整体溶出率，同时也为后序二次破壁提供了更加容易的破碎环境，进一步的保证了整体的溶出率。
进一步地，S3中的提取溶剂包含无水乙醇和二氯甲烷，其体积比为6-8：3，所述提取溶剂的投入量为余生红球藻粉末质量的20-25倍。
进一步地，S3中二次破壁处理为超声处理。
进一步地，超声处理功率为150-200W，超声时间为5.5-6.5min。
进一步地，S5中的超临界萃取的萃取温度为40-50℃，压力为35-36MPa；分离温度为30-40℃，压力为7-8MPa。
进一步地，S5中的超临界萃取还需加入所述雨生红球藻粉末质量10-15倍量的乙酸。
进一步地，S1-S5中的操作均为避光操作，并且整个操作过程应在50℃一下进行。
本发明的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法的有益效果包括：
（1）、本发明采用了二次破壁联用处理，即通过物理研磨使细胞组织分离，并达到一定的细胞膜壁分离的程度；再通过超声处理，借助超声波的空化作用，对离散的细胞或者一次破壁不完全的细胞进行再一次的破坏，使虾青素溶出充分，增强了后续溶剂的提取效果，进而提高了虾青素的提取率；
（2）、通过三种尺寸的锆珠同时进行研磨，大大的降低了，锆珠的研磨间隙，对余生红球藻粉末的细胞破损更加彻底，并为二次超声处理提供了较大规模的游离细胞；
（3）、由于虾青素在酸性条件下较为稳定，所以在破壁前和破壁过程中采用酸性稳定剂的加入，能够较好的保证虾青素的活性；
（4）、通过乙醇与二氯甲烷的混合提取，不仅能够利用二氯甲烷对虾青素的高溶出性，同时也可通过乙醇替代一部分二氯甲烷，以便降低溶剂的毒性，也保证了一定的高溶出性；
（5）、通过超临界CO2流体萃取，能够快速的实现虾青素的纯化，并且能够保证一定程度的纯度；
（6）、本发明的提取过程均在50℃以下，并且避光操作，进一步的保证了虾青素在提取过程中不受环境的影响，降低其活性；
（7）、本申请的一系列提取步骤能够保证较高的虾青素提取率和活性，所以，在提取过程中不必要多次萃取，分离。
附图说明
图1为本发明得到的虾青素高效液相色谱图谱。
具体实施方式
为下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外，本领域技术人员对本发明所做的各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所要求保护的范围内。本发明实施例中的配比均为以重量计。
实施例1
S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，得到红球藻酸溶液，所述酸性稳定剂为30%浓度的乙酸，所述雨生红球藻粉末与酸性稳定剂的投料质量比为1:15；
S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，pH为5.0，得到一次破壁液，即采用锆珠研磨处理，锆珠研磨同时采用三种尺寸的锆珠进行研磨，分别为0.04mm、0.08mm和0.14mm，雨生红球藻粉末与三种尺寸的锆珠质量比为18：1：2：3；
S3：向一次破壁液中加入酶解剂和提取溶剂后，提取溶剂包含无水乙醇和二氯甲烷，其体积比为6：3，所述提取溶剂的投入量为余生红球藻粉末质量的20倍，再进行二次破壁，即采用超声处理，超声处理功率为150W，超声时间为5.5min，得到二次破壁液；
酶解剂的添加量为3000U/ml，酶解剂包括果胶酶和纤维素酶，果胶酶和纤维素酶的活力比为1.2:1（U:U），酶解时间为2h，酶解温度为35℃，酶解pH通过乙酸控制在5.0。
S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；
S5：将上层液进行超临界萃取提纯，超临界萃取的萃取温度为40℃，压力为35MPa；分离温度为30℃，压力为7MPa，超临界萃取还需加入所述雨生红球藻粉末质量10倍量的乙酸，即得到虾青素。
以上操作均为避光操作，本发明具体实施例采用的为红外灯下处理，并且整个操作过程应在50℃以下进行。
实施例2
S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，得到红球藻酸溶液，所述酸性稳定剂为30%浓度的乙酸，所述雨生红球藻粉末与酸性稳定剂的投料质量比为1:18；
S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，pH为5.8，得到一次破壁液，即采用锆珠研磨处理，锆珠研磨同时采用三种尺寸的锆珠进行研磨，分别为0.05mm、0.10mm和0.15mm，雨生红球藻粉末与三种尺寸的锆珠质量比为22：1：2：3；
S3：向一次破壁液中加入酶解剂和提取溶剂后，提取溶剂包含无水乙醇和二氯甲烷，其体积比为7：3，所述提取溶剂的投入量为余生红球藻粉末质量的23倍，再进行二次破壁，即采用超声处理，超声处理功率为180W，超声时间为6min，得到二次破壁液；
酶解剂的添加量为4000U/ml，酶解剂包括果胶酶和纤维素酶，果胶酶和纤维素酶的活力比为1.5:1（U:U），酶解时间为2.5h，酶解温度为40℃，酶解pH通过乙酸控制在5.2。
S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；
S5：将上层液进行超临界萃取提纯，超临界萃取的萃取温度为45℃，压力为36MPa；分离温度为35℃，压力为8MPa，超临界萃取还需加入所述雨生红球藻粉末质量13倍量的乙酸，即得到虾青素。
以上操作均为避光操作，本发明具体实施例采用的为红外灯下处理，并且整个操作过程应在50℃以下进行。
实施例3
S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，pH为6.5，得到红球藻酸溶液，所述酸性稳定剂为30%浓度的乙酸，所述雨生红球藻粉末与酸性稳定剂的投料质量比为1: 20；
S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，得到一次破壁液，即采用锆珠研磨处理，锆珠研磨同时采用三种尺寸的锆珠进行研磨，分别为0.06mm、0.10mm和0.16mm，雨生红球藻粉末与三种尺寸的锆珠质量比为26：1：2：3；
S3：向一次破壁液中加入酶解剂和提取溶剂后，提取溶剂包含无水乙醇和二氯甲烷，其体积比为8：3，所述提取溶剂的投入量为余生红球藻粉末质量的25倍，再进行二次破壁，即采用超声处理，超声处理功率为200W，超声时间为6.5min，得到二次破壁液；
酶解剂的添加量为4500U/ml，酶解剂包括果胶酶和纤维素酶，果胶酶和纤维素酶的活力比为1.8:1（U:U），酶解时间为3h，酶解温度为45℃，酶解pH通过乙酸控制在5.5。
S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；
S5：将上层液进行超临界萃取提纯，超临界萃取的萃取温度为50℃，压力为36MPa；分离温度为40℃，压力为8MPa，超临界萃取还需加入所述雨生红球藻粉末质量15倍量的乙酸，即得到虾青素。
以上操作均为避光操作，本发明具体实施例采用的为红外灯下处理，并且整个操作过程应在50℃以下进行。
评价：
取上述实施例1、实施例2和实施例3的制得的虾青素提取率、纯度及其活性物质进行检测对比评价（采用高效液相色谱仪检测，图谱见图1）。并附加传统提取技术一并对比。传统工艺1为单一研磨，后接试剂溶出旋蒸提取，处理过程未进行光照和温度的处理；传统工艺2为单一超声，后接试剂溶出旋蒸提取，处理过程未进行光照和温度的处理，测试评价结果如表1。
表1
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由以上表1可知，本发明制得的虾青素提取量、纯度和左旋占有率均要高于传统提取工艺，并具有较明显的提高和优化，充分说明本发明较优异的进步。
以上对本发明的实施例进行了示例性说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依据本发明申请范围的均等变化与改进等，均应归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：取雨生红球藻粉末，并加入酸性稳定剂，pH为5.0-6.5，得到红球藻酸溶液；
S2：将红球藻溶液进行一次破壁处理，得到一次破壁液；
S3：向一次破壁液中加入酶解剂和提取溶剂后，再进行二次破壁，得到二次破壁液；
S4：将二次破壁液过滤后，静置分层处理，取上层液；
S5：将上层液进行超临界萃取提纯，即得到虾青素。
2.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S1中的所述酸性稳定剂为25-35%浓度的乙酸，所述雨生红球藻粉末与酸性稳定剂的投料质量比为1:15-20。
3.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S2中所述一次破壁处理采用的为锆珠研磨；锆珠研磨同时采用三种尺寸的锆珠进行研磨，分别为0.04-0.06mm、0.08-0.10mm和0.14-0.16mm，雨生红球藻粉末与三种尺寸的锆珠质量比为18-26：1：2：3。
4.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S3中所述酶解剂的添加量为3000-4500U/ml，所述酶解剂包括果胶酶和纤维素酶，所述果胶酶和纤维素酶的活力比为1.2-1.8:1（U:U），酶解时间为2-3h，酶解温度为35-45℃，酶解pH通过乙酸控制在5.0-5.5。
5.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S3中的提取溶剂包含无水乙醇和二氯甲烷，其体积比为6-8：3，所述提取溶剂的投入量为余生红球藻粉末质量的20-25倍。
6.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S3中二次破壁处理为超声处理。
7.如权利要求6所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：超声处理功率为150-200W，超声时间为5.5-6.5min。
8.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S5中的超临界萃取的萃取温度为40-50℃，压力为35-36MPa；分离温度为30-40℃，压力为7-8MPa。
9.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S5中的超临界萃取还需加入所述雨生红球藻粉末质量10-15倍量的乙酸。
10.如权利要求1所述的一种基于雨生红球藻的虾青素提取方法，其特征在于：S1-S5中的操作均为避光操作，并且整个操作过程应在50℃以下进行。
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