CN110709700A - 评估细胞表面糖基化的方法 - Google Patents

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Abstract

本文提供了通过评估释放的表面聚糖的样品并确定样品中聚糖的存在、不存在或水平来评估细胞表面聚糖例如N‑聚糖的方法。还提供了通过评估细胞组合物的细胞表面聚糖谱并将所述谱与参考样品进行比较来测定和/或评价所述细胞组合物的方法。还提供了用于制造和/或培养多种细胞组合物的方法，所述多种细胞组合物具有低变异性的一致的表面聚糖表达。

Description

评估细胞表面糖基化的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月14日提交的标题为“评估细胞表面糖基化的方法(METHODSFOR ASSESSING CELL SURFACE GLYCOSYLATION)”的美国临时专利申请62/485,897和2017年6月5日提交的标题为“评估细胞表面糖基化的方法(METHODS FOR ASSESSING CELLSURFACE GLYCOSYLATION)”的美国临时申请号62/515,515的优先权权益，将每个美国临时专利申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2018年4月13日创建的名为735042008540SeqList.TXT的文件提供，其大小为37,188字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本文提供了通过评估释放的表面聚糖的样品并确定样品中聚糖的存在、不存在或水平来评估细胞表面聚糖例如N-聚糖的方法。还提供了通过评估细胞组合物的细胞表面聚糖谱并将所述谱与参考样品进行比较来测定和/或评价所述细胞组合物的方法。还提供了用于制造和/或培养多种细胞组合物的方法，所述多种细胞组合物具有低变异性的一致的表面聚糖表达。
背景技术
聚糖是细胞的主要组分之一。几乎所有人膜蛋白以及许多细胞内蛋白都通过共价添加聚糖被共翻译修饰和翻译后修饰。特别地，N-聚糖是对蛋白质的翻译后修饰，可能对结构和功能具有深远的影响。在细胞水平上，糖基化与细胞信号传导、粘附、归巢特性和其他功能活性有关。本领域中存在对测量和鉴定在细胞表面上表达的聚糖(例如，N-聚糖)的另外的方法的需求。
发明内容
本文提供了评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括：(a)将包含多种细胞的测试组合物在从测试组合物的细胞表面释放一种或多种聚糖的条件下孵育，其中产生了包含一种或多种细胞表面聚糖的样品；并且(b)确定样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估样品的细胞表面聚糖谱。
本文还提供了评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括确定样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估样品的细胞表面聚糖谱，其中所述样品包含在释放一种或多种聚糖的条件下孵育包含多种细胞的测试组合物之后从测试组合物中存在的细胞表面释放的一种或多种聚糖。
在任何所提供方法的一些实施方案中，聚糖是N-聚糖。在任何所提供方法的特定实施方案中，测试细胞组合物中的细胞包含整个或完整细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，细胞是活细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，在孵育之前不对测试细胞组合物进行均质化或声处理；和/或在孵育之前不将测试细胞组合物与蛋白酶一起孵育，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶；和/或在孵育之前或期间不将在测试细胞组合物中的细胞与提取一种或多种细胞表面或膜蛋白的药剂接触，任选地其中所述药剂是洗涤剂或蛋白酶，任选胰蛋白酶；和/或在孵育期间少于10％的细胞被裂解和/或破裂。
在任何所提供方法的特定实施方案中，测试细胞组合物包含不超过5x106个细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，测试细胞组合物包含在1x106个与5x106个之间的细胞，包含端值。在任何所提供方法的某些实施方案中，测试细胞组合物具有不超过1x108个细胞/mL的浓度。在任何所提供方法的特定实施方案中，测试细胞组合物具有以下的浓度：在1x105个细胞/mL与1x108个细胞/mL之间(包含端值)、在1x106个细胞/mL与5x107个细胞/mL之间(包含端值)、或在5x106个细胞/mL与2.5x107个细胞/mL之间(包含端值)。在任何所提供方法的一些实施方案中，孵育是在N-糖苷酶的存在下进行。在任何所提供方法的某些实施方案中，N-糖苷酶是肽N-糖苷酶(PNGase)F。在任何所提供方法的特定实施方案中，PNGase F是重组的。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种聚糖是一种或多种N-聚糖，并且其中所述方法包括：(i)将来自测试组合物的1x106个与5x106个之间的细胞在从测试组合物的细胞表面释放所述一种或多种N-聚糖的条件下与重组PNGase F一起孵育；(ii)将所述一种或多种N-聚糖用可检测的标记(任选地荧光标记)进行标记；并且(iii)确定经标记的N-聚糖的存在、不存在或水平，从而评估样品的细胞表面聚糖谱。
在任何所提供方法的某些实施方案中，测试细胞组合物包含约1x106个至2.5x 106个细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，测试细胞组合物具有在1x106个细胞/mL与5x107个细胞/mL之间的浓度。在任何所提供方法的一些实施方案中，PNGase F包含脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的PGNase F或其具有酶促活性的部分或突变体。在任何所提供方法的某些实施方案中，PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其具有酶促活性的部分或突变体，或展现与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或是其具有酶促活性的部分。在任何所提供方法的特定实施方案中，PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。在任何所提供方法的一些实施方案中，PNGase F包含标签，任选地亲和标签。在任何所提供方法的某些实施方案中，标签是聚组氨酸(His标签)。
在任何所提供方法的特定实施方案中，PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％纯的；和/或PNGase F包含少于或少于约10％、少于或少于约8％、少于或少于约5％、少于或少于约2％的非PNGase F蛋白质污染物；和/或PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％同质的，任选地如通过SDS-PAGE和蛋白质染色(任选地考马斯蓝染色)所确定。
在任何所提供方法的一些实施方案中，N-糖苷酶(任选地PNGase F)是处于在35℃与39℃之间(任选地约37℃)的温度下孵育不超过12小时之后从一种或多种天然或非变性糖蛋白和/或从细胞组合物的细胞释放一种或多种N-聚糖的酶促有效量。在任何所提供方法的某些实施方案中，酶促有效量是在25℃与39℃之间或在35℃与39℃之间(每个都包含端值)(任选地约37℃)的温度下孵育不超过15分钟至3小时或30分钟至2小时之后用以释放一种或多种N-聚糖的量。在任何所提供方法的特定实施方案中，酶促有效量的PNGase F释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于一种或多种糖蛋白上和/或存在于细胞组合物的表面上的N-聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，孵育条件足以实现释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于测试细胞组合物的表面上的N-聚糖。
在任何所提供方法的某些实施方案中，N-糖苷酶(任选地PNGase F)的量为1单位至5000单位、1单位至1000单位、1单位至500单位、1单位至250单位、1单位至100单位、1单位至50单位、1单位至25单位、25单位至5000单位、25单位至1000单位、25单位至500单位、25单位至250单位、25单位至100单位、25单位至50单位、50单位至5000单位、50单位至1000单位、50单位至500单位、50单位至250单位、50单位至100单位、100单位至5000单位、100单位至1000单位、100单位至500单位、100单位至250单位、250单位至5000单位、250单位至1000单位、250单位至500单位、500单位至5000单位、500单位至1000单位、或1000单位至5000单位，每个都包含端值。在任何所提供方法的特定实施方案中，N-糖苷酶(任选地PNGase F)的量为大于或大于约或者为或为约1单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、50单位、100单位、250单位、500单位、1000单位、2500单位或5000单位。根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中一个单位是N-糖苷酶(任选地PNGase F)足以在37℃下在30分钟内催化1纳摩尔变性核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的量。在任何所提供方法的一些实施方案中，500单位是N-糖苷酶(任选地PNGase F)足以在37℃或室温下催化在1XPBS中孵育5-10分钟的10μg核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的量。
在任何所提供方法的某些实施方案中，对测试组合物的孵育是持续在或在约5分钟与12小时之间、30分钟与6小时之间或1小时与3小时之间(每个都包含端值)的时间量。在任何所提供方法的特定实施方案中，对测试组合物的孵育是持续至少或至少约或者为或为约5分钟、约10分钟、约15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。在任何所提供方法的一些实施方案中，对测试组合物的孵育是持续约30分钟。在任何所提供方法的某些实施方案中，对测试组合物的孵育是在25℃与39℃之间或在35℃与39℃之间的温度下。在任何所提供方法的特定实施方案中，对测试组合物的孵育是在约37℃的温度下。在任何所提供方法的一些实施方案中，对测试组合物的孵育是在约37℃的温度下持续约30分钟。
在任何所提供方法的某些实施方案中，在确定样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平之前，所述方法还包括用可检测标记(任选地荧光标记)对来自样品的聚糖进行标记。在任何所提供方法的特定实施方案中，标记是荧光标记，并且荧光标记是或包括2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。在任何所提供方法的一些实施方案中，荧光标记包括喹啉基荧光团。在任何所提供方法的某些实施方案中，荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团。在任何所提供方法的特定实施方案中，荧光标记包括碱性叔胺。在任何所提供方法的一些实施方案中，荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和叔胺。
在任何所提供方法的某些实施方案中，在确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平之前，对样品进行聚糖纯化或富集。在任何所提供方法的特定实施方案中，聚糖纯化或富集通过固相萃取(SPE)进行。
在任何所提供方法的一些实施方案中，确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在或水平包括对样品进行质谱。在任何所提供方法的某些实施方案中，质谱是电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-MS)和基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)。在任何所提供方法的特定实施方案中，质谱是MALDI-MS。
在任何所提供方法的一些实施方案中，确定聚糖的存在、不存在或水平包括对样品进行液相色谱(LC)，随后进行质谱。在任何所提供方法的某些实施方案中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)或超效液相色谱(UPLC)。在任何所提供方法的特定实施方案中，液相色谱是超效液相色谱(UPLC)。在任何所提供方法的一些实施方案中，液相色谱和质谱是联机进行的。在任何所提供方法的某些实施方案中，液相色谱选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水性相互作用色谱(HILIC)。在任何所提供方法的特定实施方案中，液相色谱是亲水性相互作用色谱(HILIC)。
在任何所提供方法的一些实施方案中，质谱包括电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱或声波喷雾电离质谱。在任何所提供方法的一些实施方案中，质谱包括ESI-MS。在任何所提供方法的特定实施方案中，质谱包括串联质谱(MS/MS)。在任何所提供方法的某些实施方案中，质谱包括串联ESI质谱(ESI-MS/MS)。
在任何所提供方法的某些实施方案中，执行质谱的质谱仪包含四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。在任何所提供方法的特定实施方案中，质谱仪包含离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。在任何所提供方法的一些实施方案中，质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。
在任何所提供方法的某些实施方案中，对所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的确定包括针对分支、单糖之间的连接和/或单糖的位置分析一种或多种聚糖结构。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
在任何所提供方法的某些实施方案中，对样品中存在的聚糖的存在、不存在或水平的确定包括确定至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖的存在、不存在或水平。在任何所提供方法的特定实施方案中，将样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为是否至少100amol、至少500amol、至少1fmol、至少5fmol、或至少10fmol的所述聚糖种类存在于样品中。在任何所提供方法的一些实施方案中，将样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为聚糖种类是否构成样品中的总聚糖的至少0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、或0.01％。在任何所提供方法的某些实施方案中，聚糖的所述种类是N-聚糖的种类。
在任何所提供方法的特定实施方案中，测试细胞组合物是或包含至少一部分的源细胞组合物，所述至少一部分的源细胞组合物包含所述多种细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，细胞包含哺乳动物细胞，或者测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞包含人细胞，或者测试细胞组合物包含人细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞包含干细胞，或者测试细胞组合物包含干细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在任何所提供方法的某些实施方案中，测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，细胞包含免疫细胞，或者测试细胞组合物包含免疫细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。
在任何所提供方法的一些实施方案中，测试细胞组合物包含：通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中分离的细胞；和/或用编码重组蛋白的病毒载体转导的细胞；和/或在一种或多种测试剂，任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育的细胞；和/或在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增的细胞；和/或冷冻保存的细胞和/或包含冷冻保护剂的细胞；和/或任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下，配制用于给予至受试者的细胞。
在任何所提供方法的某些实施方案中，测试剂是用于调节测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增的候选物。在任何所提供方法的特定实施方案中，刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一个或多个组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一个或多个共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在任何所提供方法的一些实施方案中，刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。在任何所提供方法的某些实施方案中，一级药剂特异性地结合CD3和/或共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。在任何所提供方法的特定实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段以及抗CD28抗体或其抗原结合片段。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。在任何所提供方法的某些实施方案中，固体支持物是或包含珠。
在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞表达重组受体或者测试组合物包含表达重组受体的细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。在任何所提供方法的一些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在任何所提供的方法的某些实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。
在任何所提供方法的一些实施方案中，靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AIMAGE Al、HLA-A2NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、***受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。在任何所提供方法的特定实施方案中，重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在任何所提供方法的某些实施方案中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在某些实施方案中，所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、***受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、***特异性抗原、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
本文提供了测定细胞组合物的方法，所述方法包括：(a)根据本文提供的方法评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱；并且(b)比较样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱。本文提供了测定细胞组合物的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面谱进行比较，其中样品的细胞表面聚糖谱是根据或已经根据本文提供的任何方法中的方法从包含多种细胞的测试细胞组合物确定。
在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞表面聚糖谱包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地不同种类的N-聚糖。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞表面聚糖谱包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，细胞表面聚糖谱包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞表面聚糖谱包含表E1中的聚糖或其亚组。在任何所提供方法的特定实施方案中，参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。在任何所提供方法的一些实施方案中，只有当组合物的细胞表面聚糖谱与参考样品基本上相同和/或只有当样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟参考样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差不超过25％、不超过20％或不超过10％的时候，才将细胞组合物释放用于治疗受试者。在任何所提供方法的某些实施方案中，靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，参考样品是来自不同细胞组合物的细胞表面聚糖谱。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述不同的细胞组合物来自用于生产测试细胞组合物或源细胞组合物的制造过程的不同阶段，从所述源细胞组合物已经衍生或获得所述测试组合物，其中所述制造过程的所述阶段任选地是所述制造过程的先前阶段。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述制造过程包含一个或多个阶段，所述一个或多个阶段选自：通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中选择细胞；和/或将重组核酸(任选地编码重组蛋白的病毒载体)引入细胞；和/或在一种或多种测试剂，任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制细胞用于给予至受试者。
在任何所提供方法的一些实施方案中，在测试组合物与参考样品之间的聚糖谱的差异表明在制造过程中的不同阶段生产的细胞中在细胞中存在一个或多个差异。在任何所提供方法的某些实施方案中，如果组合物的细胞表面聚糖谱与参考样品基本上不同，和/或如果样品中存在的靶聚糖或一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟参考样品中存在的靶聚糖或一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高，则聚糖谱的差异存在。在任何所提供方法的特定实施方案中，靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一个或多个差异与细胞的功能活性或表型相关。在任何所提供方法的特定实施方案中，功能活性或表型包含细胞表面标记的掩蔽、代谢活性、分化状态、增殖或扩增能力、激活状态、细胞溶解活性、信号传导活性、粘附特性或归巢特性中的一种或多种。任何所提供方法的一些实施方案还包含调节或改变制造细胞组合物的过程。在任何所提供方法的某些实施方案中，参考标准品包括在由所述过程生产的多种组合物中一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
本文提供了用于制造细胞组合物的方法，所述方法包括将包含多种细胞的输入组合物与一种或多种药剂和/或在一种或多种条件下孵育和/或接触，从而产生细胞组合物，其中所述细胞组合物包含在遗传上、在表型上和/或在功能上与来自输入组合物的一种或多种细胞不同的一种或多种细胞，并且其中所述细胞组合物包含含有细胞表面聚糖谱的一种或多种细胞，所述细胞表面聚糖谱包含一种或多种靶聚糖，和/或在所述细胞表面聚糖谱中的所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过25％，其中所述细胞表面聚糖谱包含从所述细胞组合物中的细胞的表面释放的聚糖。在任何所提供方法的一些实施方案中，根据本文提供的任何方法确定所述细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖。
在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，在孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：细胞洗涤、稀释、分离、选择、分开、培养、刺激、引入重组核酸、冷冻保存、配制和/或包装。在任何所提供方法的一些实施方案中，在孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括一个或多个步骤，所述一个或多个步骤选自：通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中选择细胞；和/或将重组核酸(任选地编码重组蛋白的病毒载体)引入细胞；和/或在一种或多种药剂，任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下，配制细胞用于给予至受试者。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一种或多种测试剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种测试剂或条件包括刺激条件、肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子和/或重组核酸(任选地编码重组蛋白的病毒载体)。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述药剂调节细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增。
在任何所提供方法的某些实施方案中，刺激条件包括与刺激剂一起孵育，所述刺激剂能够激活TCR复合物的一个或多个组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一个或多个共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。在任何所提供方法的特定实施方案中，刺激剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。在任何所提供方法的一些实施方案中，一级药剂特异性地结合CD3和/或共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
在任何所提供方法的某些实施方案中，刺激剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。在任何所提供方法的一些实施方案中，固体支持物是或包含珠。在任何所提供方法的某些实施方案中，刺激条件包括存在一种或多种细胞因子，任选地IL-2、IL-15和/或IL-7。
在任何所提供方法的特定实施方案中，参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。在任何所提供方法的一些实施方案中，参考样品包括通过将源组合物与一种或多种药剂和/或在一种或多种条件下的孵育和/或接触产生的多种组合物中一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。在任何所提供方法的某些实施方案中，包含一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％。在任何所提供方法的特定实施方案中，靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
本文提供了用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括：(a)评估来自测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物；并且(b)将所述样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，所述参考样品包含一种或多种靶聚糖。
本文还提供了用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，其中所述样品来自测试细胞组合物，所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物。在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞表面聚糖谱包含在样品中一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平。在任何所提供方法的特定实施方案中，根据本文提供的任何方法中的方法确定细胞表面聚糖谱。
在任何所提供方法的一些实施方案中，参考样品源自除了没有在一种或多种测试剂或条件的存在下或者在一种或多种替代性测试剂或条件的存在下处理之外在与测试细胞组合物或源组合物相同或基本上相同的条件下孵育或处理过的组合物。在任何所提供方法的某些实施方案中，参考样品包括在一种或多种测试剂或条件的存在下孵育或处理过的多种组合物中的一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种测试剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种测试剂或条件包括来自测试化合物文库的一种或多种化合物。在任何所提供方法的某些实施方案中，靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种靶聚糖包含在细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述方法包括如果比较表明样品的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种与参考样品基本上相同，和/或如果比较表明包含一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％，则选择一种或多种测试剂或条件用于孵育或处理细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述方法包括如果比较表明样品的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种与参考样品基本上不同，和/或如果比较表明包含一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则用一种或多种另外的测试剂或条件重复所述方法。
在任何所提供方法的特定实施方案中，测试剂是用于调节测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、激活和/或扩增的候选物。在任何所提供方法的某些实施方案中，测试细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，重组核酸编码重组蛋白，任选地重组受体。在任何所提供方法的特定实施方案中，重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
在任何所提供方法的某些实施方案中，重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在任何所提供的方法的特定实施方案中，靶抗原是肿瘤抗原。在任何所提供方法的某些实施方案中，靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、***受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。在任何所提供方法的一些实施方案中，重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在任何所提供方法的某些实施方案中，重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
在特定实施方案中，靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFRvIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、***受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、***特异性抗原、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞包含哺乳动物细胞，或者测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，细胞包含人细胞，或者测试细胞组合物包含人细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞包含干细胞，或者测试细胞组合物包含干细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。在任何所提供方法的一些实施方案中，组合物或测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。
在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞包含免疫细胞，或者测试细胞组合物包含免疫细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，细胞是原代细胞。
特定实施方案提供了检测细胞组合物中一种或多种物质的存在、不存在、身份和/或水平的方法，所述方法包括：(a)根据本文提供的任何方法评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述多种细胞来自或源自一种细胞类型；并且(b)鉴定在细胞表面聚糖谱中的不是由所述细胞类型的细胞合成和/或表达的一种或多种非天然聚糖。在某些实施方案中，所述细胞类型是人的。在一些实施方案中，所述细胞类型是免疫细胞。在特定实施方案中，所述细胞类型是T细胞。
在某些实施方案中，通过在一种物质的存在下培养和/或孵育多种细胞来生产测试细胞组合物，在所述物质中包含含有一种或多种非天然聚糖的至少一种蛋白质。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是白蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、胰岛素或胰岛素样肽、转铁蛋白或超氧化物歧化酶。在特定实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组蛋白。在某些实施方案中，所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质存在于血清中。在一些实施方案中，血清是胎牛血清(FBS)、牛犊血清(BCS)、新生牛血清(NBCS)、马血清、山羊血清、羔羊血清、驴血清或猪血清。
在特定实施方案中，所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质(i)不是由来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞产生和/或(ii)不是在来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞的表面上表达。在某些实施方案中，所述一种或多种非天然聚糖包含非人聚糖。在一些实施方案中，对所述一种或多种非天然聚糖的鉴定包括将表面聚糖谱与参考聚糖谱进行比较，其中所述参考样品是来自含有所述一种或多种非天然聚糖的来源的聚糖谱。在特定实施方案中，参考聚糖谱由参考样品产生，所述参考样品包含尚未与所述多种细胞接触、孵育和/或暴露于所述多种细胞的物质。在一些实施方案中，参考聚糖谱由参考样品产生，所述参考样品包含培养基、血清或其组分、或者来自蛋白质或其重组蛋白，所述培养基、血清或其组分、或者所述蛋白质或其重组蛋白尚未与所述多种细胞接触、孵育和/或暴露于所述多种细胞。
附图说明
图1A和1B描绘了用于产生表面N-聚糖谱的示例性方法。图1A描绘了用于对细胞表面N-聚糖绘图的示例性方法的概述。在所述方法中，将含有整个完整细胞的组合物与PNGaseF一起孵育以释放N-聚糖。除去细胞并对样品进行固相萃取(SPE)，随后使用亲水性相互作用色谱(HILIC)液相色谱(LC)将聚糖分离，并通过如下进行检测：荧光(WatersACQUITY I-Class)和正电喷雾电离(ESI)质谱(MS)(Q-ExactiveTM HF)(ThermoScientific)以用于相对定量和鉴定。图1B显示了通过免疫亲和力和流式细胞术(靶向)进行的传统靶向分析方法与本文提供的示例性方法(无偏)的比较。
图2显示了在PNGase F酶处理来自含有表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的细胞的CD8+T细胞组合物的整个完整细胞之后释放的N-聚糖的表面N-聚糖图。具体地，图2描绘了使用HILIC液相色谱分离并通过荧光检测(HILIC-FLR)的N-聚糖的带注释的色谱图。
图3A和3B显示了表面N-聚糖谱的示例性读数。图3A显示了PNGase F从含有表达抗CD19 CAR的CD4+/CD8+T细胞的组合物中释放的N-聚糖的HILIC-FLR。图3B显示了来自与图3A相同的细胞组合物的总离子色谱图(TIC)。
图4A-C显示了在PNGase F处理后从整个完整CD3+激活的T细胞中释放的N-聚糖的HILIC-LC和串联MS所产生的色谱图。图4A显示了PNGase F从激活的CD3+T细胞组合物中释放的N-聚糖的HILIC-FLR色谱图。图4B显示了使用5ppm质量公差在+3电荷状态从示例性N-聚糖A3S3F(理论质量为1113.0933)的串联MS的第一阶段产生的提取离子色谱图(XIC)。图4C显示了由串联MS的第二阶段产生的另外的示例性N-聚糖A3S4F(理论质量为1210.4614)的MS/MS碎片化。图4C中的虚线框指示不同的n-乙酰葡糖胺残基连接。
图5A-5C显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自样品的对应于表面N-聚糖的峰的叠加，所述样品从在含有表达抗CD19 CAR的细胞的治疗性细胞组合物的不同生产阶段收集的细胞组合物中取得。显示了以下细胞的CD4+和CD8+T细胞组合物的表面N-聚糖图：通过对来自白细胞分离术样品的细胞进行基于免疫亲和力的选择获得的细胞，用编码抗CD19CAR的病毒载体激活和转导的细胞，以及被转导、扩增和收获作为冷冻保存的药物产品的细胞。图5A显示了来自CD4+和CD8+T细胞组合物的样品中的高甘露糖N-聚糖的叠加。在CD4+和CD8+两者的叠加图上，其中X轴标记有箭头，顶线展示了冷冻保存的药物产品的N-聚糖谱，中线展示了被激活和转导的细胞的N-聚糖谱，并且底线显示了从基于免疫亲和力的选择获得的细胞的N-聚糖谱。图5B显示了来自CD4+和CD8+T细胞组合物的样品中的平分型N-聚糖的叠加。在CD4+和CD8+两者的叠加图上，其中X轴标记有箭头，顶线展示了冷冻保存的药物产品的N-聚糖谱，中线展示了被激活和转导的细胞的N-聚糖谱，并且底线显示了从基于免疫亲和力的选择获得的细胞的N-聚糖谱。图5C显示了来自CD4+和CD8+T细胞组合物的样品中的聚乳糖胺N-聚糖的叠加。在CD4+和CD8+两者的叠加图上，其中X轴标记有箭头，顶线显示了从基于免疫亲和力的选择获得的细胞的N-聚糖谱，中线展示了冷冻保存的药物产品的N-聚糖谱，并且底线展示了被激活和转导的细胞的N-聚糖谱。
图6显示了在含有表达抗CD19 CAR的细胞的细胞组合物的不同生产阶段收集的细胞组合物的表面N-连接聚糖谱的比较：单核细胞(顶部)；CD3+T细胞(中间)；和激活的CD3+T细胞(底部)。针对聚糖种类量增加(++或+)、相当(n)或减少(-)加以注释来突出显示示例性差异。实线表示与A2S1FB和A2S2FB N-聚糖对应的峰。与双触角/杂合体和N-乙酰乳糖胺重复N-聚糖对应的色谱图区域用虚线表示。
图7显示了通过对来自不同表达CAR的T细胞组合物的表面N-聚糖样品进行的荧光检测和质谱可视化的表面N-聚糖图，所述表达CAR的T细胞组合物包括表达抗CD19 CAR的CD4+和CD8+T细胞组合物、表达替代性抗CD19CAR的T细胞组合物、或表达识别替代性靶抗原的CAR的T细胞组合物。
图8显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自通过示例性或替代性工程化过程生产的含有抗CD19 CAR+T细胞的CD4+T细胞组合物的表面N-聚糖谱。显示了来自以下的表面N-聚糖谱：通过替代性工程化过程生产的表达抗CD19 CAR的CD4+T细胞组合物(顶图)，通过示例性工程化过程生产的从来自同一个体受试者的细胞工程化的表达抗CD19 CAR的CD4+T细胞组合物(中间图)，以及通过替代性工程化过程生产的从不同个体受试者的细胞工程化的表达抗CD19 CAR的T细胞组合物(底图)。箭头指示与特定N-聚糖相关的峰；“B”表示平分型N-聚糖，并且“SL”表示唾液酸化路易斯X N-聚糖。
图9图10显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自三个示例性的不同的表达抗CD19 CAR的CD8+T细胞组合物的表面N-聚糖谱，所述表达抗CD19CAR的CD8+T细胞组合物通过基本上相同的过程产生，但是在培育细胞所涉及的两种条件有所不同。箭头指示与平分型N-聚糖相关的峰。
图10显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自三个示例性的不同的表达抗CD19CAR的CD4+T细胞组合物的表面N-聚糖谱，所述表达抗CD19CAR的CD4+T细胞组合物通过基本上相同的过程产生，但是在培育细胞所涉及的两种条件有所不同。箭头指示与平分型N-聚糖相关的峰。
图11显示了通过对来自不同的表达抗CD19 CAR的CD8+T细胞组合物的表面N-聚糖样品进行的荧光检测和质谱可视化的表面N-聚糖谱。显示了从来自健康受试者(顶图和中间图)和来自患有CD10相关疾病的受试者(底图)的细胞生产的表达抗CD19 CAR的CD8+T细胞组合物的表面N-聚糖谱。箭头指示与特定N-聚糖相关的峰；“B”表示平分型N-聚糖，并且“SL”表示唾液酸化路易斯X N-聚糖。
图12显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自不同T细胞组合物的表面N-聚糖谱，所述T细胞组合物含有表达具有替代性靶抗原的CAR的T细胞。显示了从来自健康受试者(顶图和底图)和来自患有与靶抗原相关的疾病的受试者(中间图)的细胞生产的表达CAR的T细胞组合物的表面N-聚糖谱。箭头指示与特定N-聚糖相关的峰；“B”表示平分型N-聚糖，并且“SL”表示唾液酸化路易斯X N-聚糖。
图13显示了通过荧光检测和质谱可视化的来自胎牛血清样品的表面N-聚糖谱(FBS；顶图)以及通过两种不同的工程化过程生产的从来自同一个体受试者的细胞工程化的表达CD4+抗CD19 CAR的CD4+T细胞组合物的表面N-聚糖谱(中间图和底图)。箭头指示与FBS N-聚糖相关的峰；“AG”指示与非人α-gal N-聚糖相关的峰，并且“NGNA”指示与非人N-羟乙酰神经氨酸(NGNA)N-聚糖相关的峰。
具体实施方式
本文提供了通过确定含有从或已经从组合物中的细胞表面释放的聚糖的样品中的聚糖的存在、不存在或存在的聚糖的水平来评估在细胞表面上表达和/或暴露的聚糖(即表面聚糖)的方法。在一些实施方案中，所提供的方法包括用于从组合物中的细胞表面释放聚糖(例如N-聚糖)的一个或多个步骤。在某些实施方案中，本文提供的方法提供了通过一种或多种合适的技术(例如液相色谱和质谱中的一种或多种)检测已经从细胞表面释放的聚糖的步骤。在一些实施方案中，本文提供的方法允许对细胞组合物的表面聚糖表达谱进行高度敏感和准确的评估或分析。
在特定实施方案中，可以通过本文提供的方法评估和/或分析细胞群体或组合物的表面聚糖。在某些实施方案中，所述方法提供了在适合于从细胞表面释放聚糖的条件下孵育细胞的步骤。在某些实施方案中，条件包括使细胞与药剂接触、用药剂处理细胞、和/或将细胞与药剂一起孵育，所述药剂促进和/或催化聚糖从细胞表面的释放，例如通过从在细胞表面存在、表达和/或暴露的蛋白质或其他部分中除去完整的聚糖。在某些实施方案中，本文提供的方法还包括用于衍生化和/或标记聚糖以增强或增加鉴定、测量和/或检测聚糖的灵敏度和/或准确度的步骤。在特定实施方案中，所提供的方法包括如下步骤：通过液相色谱和质谱的组合技术检测聚糖(例如标记的聚糖)，从而允许高度准确和灵敏地测量在释放的表面聚糖的样品中存在的单独聚糖的存在、身份和水平。
本文还提供了通过评估细胞组合物的细胞表面聚糖谱并将其与参考样品进行比较来测定细胞组合物的方法。例如，在一些实施方案中，如与不同细胞的组合物相比，相对于不同聚糖种类、聚糖类型和/或聚糖家族的表面表达水平，细胞组合物(例如治疗性细胞组合物)可能具有不同的聚糖表达谱。因此，在一些实施方案中，可以通过评估多种细胞组合物来产生参考标准品。在一些实施方案中，这样的参考标准品可以用作细胞组合物的质量控制和/或用于细胞组合物的释放测定，或者用于监测或控制细胞组合物的制造或培养。
此外，本文提供了产生关于表面聚糖表达具有低变异性的多种细胞组合物(例如治疗性细胞组合物和/或含有工程化细胞的组合物)的方法。在一些实施方案中，不同聚糖种类、聚糖类型和/或聚糖家族在细胞表面上的水平和/或表达可能有助于细胞生理学或功能的不同方面或至少与细胞生理学或功能的不同方面相关。因此，在一些实施方案中，期望生产关于表面聚糖表达具有高度相似度的细胞组合物。
特定实施方案设想细胞疗法以及特别是过继T细胞疗法代表了用于治疗、减轻和/或改善各种疾病(如癌症)的一种强大的技术。可用于评估治疗性或药物细胞组合物的当前分析工具包括经由流式细胞术检查细胞表面或内部标记。在一些实施方案中，本文提供的方法补充和/或增强了用于评价细胞组合物的当前方法，所述当前方法代表了可靠地评价治疗性或药物细胞组合物以及在制造或开发过程的不同阶段的细胞的特征的方法和技术。在特定实施方案中，本文提供了可用于释放细胞表面N-连接的聚糖和可用于检测、鉴定和/或定量一种或多种单独的N-聚糖种类的无偏方法(例如，由图1A-1B例示的方法)。
在某些实施方案中，本文提供的方法提供了有关在细胞表面表达的单独的聚糖种类的存在、不存在、身份、相对量和水平的信息。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法适合于产生细胞组合物的聚糖表达谱。在特定实施方案中，与用于监测细胞中的表面聚糖表达的现有方法相比，本文提供的方法以更高的分辨率和准确度产生此类谱。例如，在一些实施方案中，与现有方法相比，本文提供的方法检测以更低量存在于样品中的单独聚糖种类，从而允许检测和/或监测比通过可用技术允许的更多的存在于细胞组合物中的单独的聚糖。
在一些实施方案中，本文提供的方法提供了一个或多个步骤，由此聚糖从细胞表面例如从在细胞表面上表达和/或定位的蛋白质中直接释放。这与许多现有方法形成对比，所述现有方法依赖于在从其各自的糖缀合物释放聚糖的步骤之前裂解细胞和/或纯化蛋白质(例如膜蛋白)的先前步骤。在一些实施方案中，当前要求保护的方法的一个优点是通过刺激表面聚糖从完整细胞的释放，仅收集表面暴露的聚糖。聚糖，包括O-聚糖和N-聚糖，也存在于细胞内部，例如在高尔基体中加工的新生多肽上表达，或作为信号传导分子的添加或修饰。因此，通过涉及裂解细胞和/或获得细胞匀浆的步骤的其他方法收集的聚糖可能含有内部和外部定位的聚糖的混合物，或者至少包括在表面上不表达的聚糖的一些级分。相比之下，本文提供的方法的特定实施方案收集在表面上表达的独特的聚糖库。
在一些实施方案中，与例如涉及裂解细胞的方法相反，直接从细胞表面释放聚糖的额外优点是即使在已经去除聚糖之后细胞仍保持完整。因此，在一些实施方案中，在已经去除聚糖之后，可以使用另外的技术进一步分析来自相同组合物的细胞。在一些实施方案中，在去除表面聚糖之后，将细胞处理以进行进一步分析(例如微阵列或蛋白质组学)。
在特定实施方案中，本文提供的方法去除表面聚糖，而不使细胞表面暴露于蛋白酶(如胰蛋白酶)。在特定实施方案中，避免使用蛋白酶来去除表面聚糖的一个优点是表面暴露的蛋白质保持完整。在一些实施方案中，这可以允许对细胞进行进一步分析，例如通过流式细胞术，其中表面聚糖的去除可能暴露出另外的靶标供分选，或者允许表面暴露的蛋白质得以分离和进一步分析。例如，酶促释放与天冬酰胺的氮附接的N-聚糖，从而将天冬酰胺转化为天冬氨酸。在某些实施方案中，避免蛋白酶去除表面聚糖的另一个优点是可以通过选择适当的药剂或条件来选择性地去除特定聚糖。例如，可以选择一种药剂，所述药剂选择性地释放N-聚糖同时使O-聚糖附接在细胞表面，这是可能通过消化表面蛋白无法实现的一种选择性。
在某些实施方案中，本文提供的方法提供了以通过现有方法无法实现的高度准确度和灵敏度检测表面聚糖表达的手段。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法提供了评估细胞组合物(包括治疗性和药物细胞组合物)的生理学和功能性的手段。
在一些方面，所提供的方法允许表征任何细胞制剂或组合物的细胞表面糖组。因为糖基化已经牵涉于细胞信号传导、粘附、归巢特性和其他功能活性或特性，所以可以预期细胞表面糖组的差异可以提供有用的工具用于分析和评估细胞组合物之间和之中的功能差异。在一些方面，所述方法可以用于评估细胞疗法的特征，所述细胞疗法例如为嵌合抗原受体(CAR+)T细胞疗法，包括涉及在输注至受试者中之前的多个离体加工步骤的细胞疗法。在一些方面，涉及将细胞疗法工程化的各种过程，包括但不限于细胞分离、选择、冷冻保存、刺激、激活、转导、扩增和/或配制，可影响或改变治疗性细胞组合物的一个或多个特征。
然而，在一些实施方案中，当前用于研究和评价细胞组合物(包括治疗性细胞组合物)的分析工具主要限于经由流式细胞术对细胞表面或内部标记进行靶向检查。作为替代物，所提供的方法允许产生稳健的聚糖图，包括高分辨率色谱以及在一些情况下与高分辨率质谱组合以允许详细表征和鉴定表面N-聚糖。在一些实施方案中，本文的方法提供了无偏技术来表征、研究和/或评价细胞组合物，包括治疗性细胞组合物，包括在不同细胞组合物之间和之中的不同过程或特征的影响。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.评估细胞表面聚糖表达谱
本文提供了鉴定、定量和/或分析在细胞表面上表达的聚糖(例如N-聚糖)的方法。在某些实施方案中，以高分辨率和灵敏度检测了单独的聚糖种类的存在、不存在和相对丰度。在某些实施方案中，所述方法包括改善聚糖检测的程序和/或修改。在某些实施方案中，可以通过能够鉴定和/或定量单独的聚糖种类的量的技术来进行聚糖的检测。在某些实施方案中，一个聚糖种类包括具有与其他聚糖种类结构不同的相同结构的聚糖。在特定实施方案中，所述技术是质谱技术和/或液相色谱(LC)技术，如高效液相色谱(HPLC)或超效液相色谱(UPLC)。
A.处理细胞
在某些实施方案中，在适合于从组合物的细胞表面去除、释放或脱离聚糖(例如N-聚糖)的条件下孵育、培养或处理细胞的组合物。在某些实施方案中，将细胞的组合物用药剂处理、与药剂一起孵育和/或与药剂接触以从细胞表面去除、分开或脱离聚糖(例如N-聚糖)。在特定实施方案中，细胞是完整的，即在用药剂处理之前细胞不被裂解或均质化。在某些实施方案中，细胞是活细胞。在一些实施方案中，用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不破坏细胞膜和/或使细胞膜破裂。在一些实施方案中，细胞是活细胞，并且用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不会杀死细胞。在某些实施方案中，细胞是活细胞，并且用药剂处理细胞、将细胞与药剂一起孵育和/或使细胞与药剂接触不诱导细胞死亡，例如细胞的凋亡或坏死。
在一些实施方案中，在聚糖消化之前洗涤和/或冲洗细胞。在一些实施方案中，通过从细胞中去除培养基(例如细胞培养基)和/或添加溶液(如新鲜溶液，例如先前未曾接触细胞或暴露于细胞的溶液)来洗涤和/或冲洗细胞。在一些实施方案中，溶液是缓冲液和/或培养基。用于洗涤和/或漂洗细胞的合适缓冲液是已知的，并且包括不裂解细胞和/或不另外杀死活细胞的那些。在一些方面，合适的溶液包括但不限于盐水溶液、柠檬酸盐缓冲液、达尔伯克氏(Dulbecco's)磷酸盐缓冲盐水(DPBS)，厄尔氏(Earle's)平衡盐溶液(EBSS)、盖伊氏(Gey’s)平衡盐溶液、汉克氏(Hanks’)平衡盐溶液(HBSS)、HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸)缓冲液、Krebs-Heneseleit缓冲溶液、Krebs-Ringer溶液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、磷酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲盐水(PBS)、林格液(Ringer solution)、Tris缓冲液、Trizma缓冲液、台氏液(Tyrode’s solution)、或其修改或变化。在特定方面，合适的培养基是或包括，但不限于，BME、DMEMF12、DMEMF12、DMEM、DMEM高葡萄糖、F-12、F-12K、ES QualifiedDMEM、GMEM、IDIM、伊斯科夫(Iscove’s)改良的DMEM、McCoy’s 5A、MEM、RPMI、StemXvivo、Xvivo、或其变化或修改。
在一些实施方案中，漂洗或洗涤包括离心。在一些方面，将细胞转移到容器(例如小瓶或管中)并以低速(例如不损害或杀死细胞的速度)离心。在一些实施方案中，离心使细胞沉淀。在某些实施方案中，在离心之后，将上清液从细胞沉淀中去除。在特定实施方案中，离心进行持续、持续约、或持续少于60分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟、90秒、60秒、30秒、或15秒。在某些实施方案中，以、以约、或以小于16,000xg、12,000xg、10,000xg、8,000xg、6,000xg、5,000xg、4,000xg、3,000xg、2,000xg、1,000xg、800xg、600xg、500xg、400xg、300xg、200xg、100xg、或50xg进行离心。在某些实施方案中，将细胞以或以约500xg离心持续或持续约3分钟。在特定实施方案中，将细胞以或以约300xg离心持续或持续约3分钟。在离心之后，可以除去上清液，并且可以添加新鲜溶液和/或使其与细胞接触。任选地，可以例如通过涡旋或移液混合来破坏或搅动沉淀，以使细胞分散到溶液中。
在一些实施方案中，在聚糖消化之前，将细胞在溶液(例如新鲜溶液)中冲洗，例如用合适的缓冲液或培养基冲洗一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、或超过十次。
在一些实施方案中，在聚糖消化之前将细胞用酶处理和/或与酶一起孵育。在一些实施方案中，将细胞用酶处理以去除或消化细胞外多核苷酸，例如RNA和DNA分子。在某些实施方案中，所述酶是核酸酶。在特定实施方案中，所述酶是全能核酸酶(benzonase)。
在一些实施方案中，在适合于从细胞表面去除、释放或脱离聚糖(例如N-聚糖)的条件下孵育、培养或处理的细胞组合物是测试细胞组合物或测试组合物。在特定实施方案中，测试细胞组合物或测试组合物是来自源组合物的细胞群体和/或多种细胞。在一些情况下，测试组合物是源组合物的样品，例如已经从含有较大细胞组合物的源组合物中移除。在此类实施方案中，测试细胞组合物中的细胞与源组合物相同或基本上相同，除了测试组合物通常含有较小体积和/或数量或绝对数量的细胞之外。在一些实施方案中，测试细胞组合物的大小足以执行所提供的方法，并且基本上不会干扰或影响源组合物的特征。在特定实施方案中，源组合物是治疗性细胞组合物，或者是处于制造治疗性细胞组合物的过程中的某一阶段或步骤的细胞组合物。
在某些实施方案中，用诸如N-糖苷酶(例如PNGase F)等药剂处理的细胞组合物(例如测试细胞组合物)含有1x103个与1x1012个之间的细胞、1x104个与1x108个之间的细胞、1x105个与1x107个之间的细胞、1x106个与1x107个之间的细胞、或1x106个与5x106个之间的细胞。在一些实施方案中，细胞组合物(例如测试细胞组合物)含有至少或至少约1x103个细胞、至少或至少约5x103个细胞、至少或至少约1x104个细胞、至少或至少约5x104个细胞、至少或至少约1x105个细胞、至少或至少约5x105个细胞、至少或至少约6x105个细胞、至少或至少约7x105个细胞、至少或至少约8x105个细胞、至少或至少约9x105个细胞、至少或至少约1x106个细胞、至少或至少约2x106个细胞、至少或至少约3x106个细胞、至少或至少约4x106个细胞、至少或至少约5x106个细胞、至少或至少约6x106个细胞、至少或至少约7x106个细胞、至少或至少约8x106个细胞、约9x106个细胞、至少或至少约1x107个细胞、至少或至少约5x107个细胞、至少或至少约1x108个细胞、至少或至少约5x108个细胞、至少或至少约1x109个细胞、至少或至少约1x1010个细胞、至少或至少约1x1011个细胞、或至少或至少约1x1012个细胞。在某些实施方案中，细胞组合物(例如测试细胞组合物)含有1x106个与5x106个之间的细胞。在特定实施方案中，细胞组合物(例如测试细胞组合物)含有1x106个与2.5x106个之间的细胞。
在一些实施方案中，与药剂(如N-糖苷酶(例如PNGase F))一起孵育的细胞组合物(例如测试细胞组合物)具有以下的浓度：在1x103个细胞/mL与1x1012个细胞/mL之间、在1x104个细胞/mL与1x108个细胞/mL之间、在1x105个细胞/mL与1x107个细胞/mL之间、或在1x106个细胞/mL与1x107个细胞/mL之间。在特定实施方案中，细胞组合物(例如测试细胞组合物)具有以下的浓度：至少或至少约5x104个细胞/mL、至少或至少约1x105个细胞/mL、至少或至少约5x105个细胞/mL、至少或至少约6x105个细胞/mL、至少或至少约1x106个细胞/mL、至少或至少约5x106个细胞/mL、至少或至少约5x106个细胞/mL、至少或至少约6x106个细胞/mL、至少或至少约7x106个细胞/mL、至少或至少约8x106个细胞/mL、至少或至少约9x106个细胞/mL、至少或至少约1x107个细胞/mL、至少或至少约1.25x107个细胞/mL、至少或至少约2.5x107个细胞/mL、至少或至少约5x107个细胞/mL、至少或至少约1x108个细胞/mL、至少或至少约5x108个细胞/mL、至少或至少约1x109个细胞/mL、至少或至少约1x1010个细胞/mL、至少或至少约1x1011个细胞/mL、或至少或至少约1x1012个细胞/mL。在一些实施方案中，组合物(例如测试细胞组合物)具有在5x106个细胞/mL与2.5x107个细胞/mL之间的细胞浓度。在某些实施方案中，细胞组合物(例如测试细胞组合物)具有在5x106个细胞/mL与1.25x107个细胞/mL之间的浓度。在某些实施方案中，组合物(例如测试细胞组合物)具有至少或至少约或约5x106个细胞/mL的浓度。在特定实施方案中，组合物(例如测试细胞组合物)具有至少或至少约或约1.25x107个细胞/mL的浓度。在一些实施方案中，组合物(例如测试细胞组合物)具有至少或至少约或约2.5x107个细胞/mL的浓度。
在一些实施方案中，所述孵育、培养或处理在以下的总体积中进行：从或从约0.005mL至50mL、0.005mL至25mL、0.005mL至10mL、0.005mL至5mL、0.005mL至1mL、0.005mL至0.5mL、0.005mL至0.05mL、0.05mL至50mL、0.05mL至35mL、0.05mL至10mL、0.05mL至5mL、0.05mL至1mL、0.05mL至0.5mL、0.5mL至50mL、0.5mL至25mL、0.5mL至10mL、0.5mL至5mL、0.5mL至1mL、1mL至50mL、1mL至25mL、1mL至10mL、1mL至5mL、5mL至50mL、5mL至25mL、5mL至10mL、10mL至50mL、10mL至25mL或25mL至50mL。在一些实施方案中，所述孵育、培养或处理在以下的总体积中进行：至少或至少约0.005mL、0.01mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、1mL、2.0mL、5mL、10mL、20mL、30mL、40mL或50mL。
1.药剂，例如N-糖苷酶
在一些实施方案中，将细胞组合物用药剂(例如N-糖苷酶，例如PNGase F)处理、与药剂(例如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育和/或与药剂(例如N-糖苷酶，例如PNGase F)接触，导致聚糖(例如N-聚糖)从表面暴露的糖缀合物中去除、分开和/或脱离。在一些实施方案中，糖缀合物是蛋白质，例如糖蛋白。在特定实施方案中，将细胞组合物用药剂处理、与药剂接触和/或与药剂一起孵育导致聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离。在特定实施方案中，释放的、去除的和/或脱离的N-聚糖是完整的。在一些实施方案中，聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离不损害、消化和/或以其他方式改变聚糖的结构。在特定实施方案中，聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离不损害、消化和/或以其他方式改变已经释放聚糖的部分(例如蛋白质)的结构。在一些实施方案中，聚糖从表面暴露的蛋白质中去除、分开和/或脱离导致天冬酰胺转化为天冬氨酸，但不以其他方式损害、消化和/或改变已经释放聚糖的蛋白质的结构。
在某些实施方案中，所述药剂从糖缀合物(例如表面暴露的糖蛋白)中除去聚糖。在一些实施方案中，所述聚糖是多糖。在某些实施方案中，聚糖是支链聚糖、直链聚糖、N-连接的聚糖、O-连接的聚糖、或其组合。在某些实施方案中，所述药剂从糖缀合物中去除N-聚糖。在特定实施方案中，N-聚糖在天冬酰胺(Asn)残基处通过N-糖苷键共价附接至蛋白质(最常见的是N-乙酰葡糖胺至天冬酰胺(GlcNAcβ1-Asn))。在某些实施方案中，N-聚糖经由Asn-Xxx-(Ser,Thr)基序(其中Xxx可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸)中的N-乙酰葡糖胺(“GlcNAc”)残基附接至天冬酰胺。
在某些实施方案中，所有N-聚糖共享一个共同核心糖序列，即Manα1-6(Manα1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ1-Asn-X-Ser/Thr。在特定实施方案中，N-聚糖可以分为三种类型：(1)寡甘露糖，其中仅甘露糖残基附接至所述核心；(2)复合N-聚糖，其中由N-乙酰葡糖胺基转移酶(GlcNAcT)引发的“触角”附接至所述核心；以及(3)杂合体，其中仅甘露糖残基附接至所述核心的Manα1-6臂，并且一个或两个触角位于Manα1-3臂上。在一些实施方案中，N-聚糖包括具有高甘露糖含量的N-聚糖，即，高甘露糖N-聚糖、平分型和/或唾液酸化路易斯X N-聚糖、或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在一些实施方案中，各种N-连接的聚糖家族的例子包括但不限于，(a)A2家族(二唾液酸化、双触角N-连接的寡糖；包括A1聚糖(单唾液酸化、双触角N-连接的寡糖)、NA2聚糖(去唾液酸-双触角N-连接的寡糖)、NGA2聚糖(去唾液酸-、去半乳糖-双触角N-连接的寡糖)；M3N2聚糖等)；(b)A2F家族(具有核心岩藻糖的双唾液酸化、双触角N-连接的寡糖；包括A1F聚糖(具有核心岩藻糖的单唾液酸化、双触角N-连接的寡糖)、NA2F聚糖(具有核心岩藻糖的去唾液酸-双触角N-连接的寡糖)、NGA2F聚糖(具有核心岩藻糖的去唾液酸-、去半乳糖-双触角N-连接的寡糖)等)；(c)A3家族(例如，在非还原性末端半乳糖基残基上完全唾液酸化，但在a2,3和a2,6连接的唾液酸残基的分布以及半乳糖之一的连接上不同的聚糖；包括NA3(衍生自A3聚糖的去唾液酸三触角N-连接的寡糖)和NGA3聚糖(衍生自NA3聚糖的去半乳糖-三触角N-连接的寡糖)等)；(d)A4家族(衍生自四触角N-连接的寡糖的聚糖；包括NA4聚糖(去唾液酸-四触角N-连接的寡糖)；NGA4聚糖(衍生自NA4聚糖的去唾液酸-、去半乳糖-四触角N-连接的寡糖)；等)；以及(e)寡甘露糖家族聚糖(例如，Man-5、Man-6、Man-7、Man-8、Man-9等聚糖)。N-聚糖的例子包括但不限于不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
在一些实施方案中，药剂是促进聚糖(例如N-聚糖)从糖缀合物(例如糖蛋白)中去除、分开和/或脱离的任何药剂。在某些实施方案中，药剂从糖缀合物中化学地去除聚糖，例如但不限于肼解或碱性β-消除。
在某些实施方案中，药剂是酶。在特定实施方案中，药剂是从糖缀合物中特异性去除、分开和/或脱离N-或O-连接聚糖的酶。在某些实施方案中，药剂是酰胺酶。在一些实施方案中，药剂是或包括糖苷酶，例如N-糖苷酶。在特定实施方案中，药剂是或包括内切糖苷酶H(Endo H)、内切糖苷酶F(EndoF)、N-糖苷酶A(PNGase A)或N-糖苷酶F(PNGase F)或其组合。在一些实施方案中，药剂是或包括肽-N4-(N-乙酰-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶类别的酰胺酶。在特定实施方案中，药剂是或包括PNGase F。
在一些实施方案中，药剂是从具有N-连接的碳水化合物的蛋白质和肽中释放或能够释放全长寡糖的酶。在一些实施方案中，药剂是从具有N-连接的碳水化合物的蛋白质和肽中释放或能够释放全长寡糖的PNGase F。在某些实施方案中，药剂不是或不包括内切糖苷酶，如Endo F、Endo H和Endo D。在一些实施方案中，内切糖苷酶(如Endo F、Endo H和Endo D)不从糖蛋白中释放全长寡糖和/或不切割所有常见类别的N-连接寡糖。
在某些实施方案中，药剂不是蛋白酶。在一些实施方案中，药剂不包括蛋白酶。在特定实施方案中，药剂不是丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或天冬酰胺肽裂解酶。在某些实施方案中，药剂不是并且不包括内切肽酶，例如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和弹性蛋白酶。在特定实施方案中，药剂不是并且不包括胰蛋白酶。
在特定实施方案中，药剂选择性地和/或特异性地从糖缀合物(例如表面暴露的蛋白质或糖蛋白)中去除、分开和/或脱离N-聚糖。在某些实施方案中，药剂对N-聚糖的去除、分开和/或脱离比对非N-聚糖的聚糖的去除、分开和/或脱离具有更大的活性。在某些实施方案中，药剂对N-聚糖的去除、分开和/或脱离比对非N-聚糖的聚糖的去除、分开和/或脱离具有大至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、或至少1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、或1,000倍的活性。在某些实施方案中，药剂是或包括PNGase F。
PNGase F
在特定实施方案中，在适合于从细胞表面去除、释放或脱离聚糖的条件下孵育包括将细胞与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育。在特定实施方案中，药剂是或包括PNGase F。PNGase F是肽-N4-(N-乙酰-β-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶类别的酰胺酶。在一些实施方案中，PNGase F是从天冬酰胺释放N-聚糖的细菌酶。在特定实施方案中，PNGase F从天冬酰胺释放整个(即完整的)N-聚糖。在某些实施方案中，PNGase F去除与天冬酰胺附接的寡甘露糖、杂合体和复合N-聚糖。在特定实施方案中，PNGase F释放与天冬酰胺的氮附接的N-聚糖，从而将天冬酰胺转化为天冬氨酸。在某些实施方案中，切割发生在与天冬酰胺残基相邻的碳水化合物的位置。在特定实施方案中，药剂是或包括展现出肽-N-(N-乙酰-β-N-葡糖胺基)天冬酰胺酰胺酶活性的酶。在某些实施方案中，将细胞组合物用药剂处理、与药剂接触或与药剂一起孵育，所述药剂是或包括PNGase F。
在某些实施方案中，药剂是或包括PNGase F多肽或其一部分。在一些实施方案中，药剂是源自细菌或从杏仁乳剂纯化的PNGase F。在特定实施方案中，药剂是从源自细菌的PNGase F。在一些实施方案中，细菌是脑膜炎脓毒性黄杆菌。在一些实施方案中，脑膜炎脓毒性黄杆菌也称为脑膜炎脓毒性伊丽莎白菌(Elizabethkingia meningosepticum)。在某些实施方案中，药剂含有SEQ ID NO:1所示的全部或部分氨基酸序列。在特定实施方案中，一部分PNGase F多肽是或含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少210个、至少220个、至少230个、至少240个、至少250个、至少260个、至少270个、至少280个、至少290个、至少300个、至少310个、至少320个、至少330个、至少340个、或至少350个连续氨基酸。在一些实施方案中，药剂与SEQ ID NO:1所示的全部或部分PNGase F氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或至少99.5％同源性。
在一些实施方案中，PNGase F是或包括高纯度的PNGase F制剂。在一些实施方案中，PNGase F是或包括不含蛋白酶的PNGase F制剂。在某些实施方案中，PNGase F是或包括不含Endo H、EndoF和/或PNGase A活性的PNGase F制剂。在特定实施方案中，PNGase F是或包括不含内毒素的PNGase F制剂。在一些实施方案中，PNGase F是或包括为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、或至少99.99％纯的PNGase F。在特定实施方案中，PNGase F是具有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.5％、少于0.1％、少于0.01％、或少于0.001％非PNGase F蛋白污染物的制剂。在一些实施方案中，PNGase F制剂是基本上同质的。在一些实施方案中，PNGase F是或包括为至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、或至少99.99％同质的PNGase F。
在一些实施方案中，PNGase F的纯度和/或同质性是或可以通过任何合适的手段进行评估，所述任何合适的手段包括但不限于十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、凝胶渗透色谱(GPC)、尺寸排阻色谱(SEC)、液相色谱(LC)、高效液相色谱(HPLC)、质谱、圆二色性(SD)、核磁共振(NMR)和荧光光谱(荧光测定法)。在一些实施方案中，通过SDS-PAGE和蛋白质染色(例如通过考马斯蓝染色)来评估或确定纯度和/或同质性。
在某些实施方案中，PNGase F并非源自、获得自或纯化自杏仁乳剂。
在一些实施方案中，PNGase F或其突变体或部分是快速作用的PNGase F，例如具有在以下时间内切割或释放一种或多种N-聚糖的活性的PNGase F：少于24小时，例如通常少于12小时，例如在15分钟与4小时之间，例如通常不超过15分钟、不超过30分钟、不超过60分钟、不超过2小时、不超过3小时或不超过4小时。
在一些实施方案中，以如下量提供PNGase F或其突变体或部分，所述量是实现从一种或多种糖蛋白释放一种或多种N-聚糖的酶促有效量。在一些实施方案中，所述活性可有效从一种或多种糖蛋白中释放或切割一种或多种N-聚糖，所述糖蛋白是例如当纯化时或当在细胞表面上表达时例如以其天然结构存在的天然或非变性蛋白质。在特定实施方案中，PNGase F的量是在某一时间段和温度(其通常是细胞组合物的大部分细胞保持存活和/或不受孵育不利影响的时间和温度)内展现出从一种或多种糖蛋白中释放一种或多种N-聚糖的活性(酶促活性)的量。在一些情况下，所述时间段为不超过12小时、不超过8小时、不超过6小时、不超过4小时、不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、或在任何前述值之间的任何值或范围。在一些实施方案中，所述温度为小于或小于约40℃，例如约10℃、约15℃、约20℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约31℃、约32℃、约33℃、约34℃、约35℃、约36℃、约37℃、约38℃、约39℃、或约40℃、或在任何前述值之间的任何值或范围、。在一些实施方案中，所述温度在或在约10℃与45℃之间、或在24℃与40℃之间、或在35℃与39℃之间。在一些实施方案中，所述温度为或为约37℃。
在一些实施方案中，酶促有效量导致在例如持续所述时间段和在所述温度下的孵育期间一种或多种糖蛋白的实质去糖基化，所述实质去糖基化例如实现释放或去除大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％、约100％、或100％的存在于一种或多种糖蛋白(包括当处于天然或非变性形式时，例如当存在或表达于细胞表面时)上的N-聚糖的活性。
在一些实施方案中，PNGase F酶的活性可以表示为单位。在某些实施方案中，单位是预定义的。在特定实施方案中，单位是在特定条件下在一定量的时间内从一定量的糖蛋白(例如纯化的糖蛋白)中去除一定量的聚糖(例如N-聚糖)所需的PNGase F的量。在一些实施方案中，糖蛋白是变性的糖蛋白。在某些实施方案中，糖蛋白是处于其天然结构的糖蛋白。在一些实施方案中，单位是从所述量的糖蛋白中去除大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％、约100％、或100％的聚糖所需的PNGase F的量。在一些实施方案中，反应体积为约0.1μl、约1μl、约5μl、约10μl、约20μl、约30μl、约40μl、约50μl、约100μl、约200μl、约250μl、约500μl、约1mL、约2mL、约3mL、约4mL、约5mL、或约10mL、或在中间的任何值或范围。在某些实施方案中，糖蛋白的量为约1pmol、约10pmol、约100pmol、约1nmol、约10nmol、约100nmol、约1mmol、约10mmol、约100mmol、约1mol、或在中间的任何值或范围。在一些实施方案中，糖蛋白的量为约1nM、约10nM、约100nM、约1μM、约10μM、约100μM、约1mM、约10mM、约100mM、或约1M(或在中间的任何值或范围)的浓度。
在一些实施方案中，关于PNGase F的活性的单位，糖蛋白是重组糖蛋白。在特定实施方案中，糖蛋白是经纯化的。在一些实施方案中，糖蛋白是丹磺酰(dabsyl)纤维蛋白糖肽。在某些实施方案中，糖蛋白是胎球蛋白。在特定实施方案中，糖蛋白是变性的核糖核酸酶B(RNase B)。在某些实施方案中，单位进一步由孵育条件定义，所述孵育条件包括孵育PNGase和糖蛋白的缓冲液的组成、缓冲液的pH、温度和总体积(即反应体积)。
PNGase F活性的示例性单位包括但不限于被定义为进行以下所需的PNGase F酶的量的单位：在10μl的总反应体积中在37℃下在1小时内从10μg变性RNase B中去除>95％的碳水化合物；在37℃下在pH 7.5下在1分钟内催化从一纳摩尔变性核糖核酸酶B释放N-连接的寡糖；在37℃下在30分钟内催化1nmol的变性RNase B的去糖基化；在37℃下在pH 7.5下催化每分钟从1μmol变性RNase B释放N-连接的寡糖；或在37℃下在pH 7.8下每分钟从1nmol丹磺酰纤维蛋白糖肽中水解碳水化合物。在特定实施方案中，单位是在37℃下在30分钟内催化1nmol变性RNase B的去糖基化所需的PNGase F活性的量。
某些实施方案预期本领域技术人员可以按常规方式确定以预定义单位表示的PNGase F的量。在特定实施方案中，以单位表示的PNGase F酶的量是通过测量或定量碳水化合物(例如N-聚糖)从糖蛋白(例如纯化的糖蛋白)中的去除、释放、去糖基化和/或羟基化的测定来确定的。在一些实施方案中，通过检测在定义条件下用PNGase处理过的糖蛋白上的N-聚糖的量并且将其与在未经处理的糖蛋白(例如单独的未经处理的糖蛋白库或在用PNGase F处理之前的糖蛋白)上的N-聚糖的量进行比较来测量PNGase F活性。
在一些实施方案中，用于检测糖基化蛋白质上的N-聚糖的方法可以包括染色和基于亲和力的方法。在某些实施方案中，在与PNGase F酶一起孵育后，将糖蛋白在凝胶(例如SDS-PAGE凝胶)上运行，并且任选地对凝胶染色是针对糖蛋白进行染色。在一些实施方案中，将对应于糖基化蛋白的蛋白质条带与对应于未糖基化蛋白的条带进行比较。合适的凝胶染色程序包括但不限于基于高碘酸-希夫(periodic acid-Schiff，PAS)反应的染色剂，其中高碘酸将两个邻位二醇基团氧化以形成醛，其与希夫试剂(Schiff reagent)反应以给出洋红色。在一些实施方案中，发色凝胶染色是用酸性品红进行，所述酸性品红可以在535nm处进行荧光检测。用于凝胶染色的合适方法包括使用可商购的荧光染色剂，所述荧光染色剂利用高碘酸盐氧化来附接荧光酰肼。合适的凝胶染色剂还包括阿尔新蓝和Stains-All，其用于检测蛋白聚糖、糖胺聚糖和带负电荷的糖蛋白。在某些实施方案中，通过PGNaseF酶释放的N-聚糖通过凝集素印迹(例如用凝集素(例如可检测地标记的凝集素)探测的Western印迹)来确定。
在一些实施方案中，N-糖苷酶(例如PNGase F)的酶促有效量为从或从约1单位至5000单位、1单位至1000单位、1单位至500单位、1单位至250单位、1单位至100单位、1单位至50单位、1单位至25单位、25单位至5000单位、25单位至1000单位、25单位至500单位、25单位至250单位、25单位至100单位、25单位至50单位、50单位至5000单位、50单位至1000单位、50单位至500单位、50单位至250单位、50单位至100单位、100单位至5000单位、100单位至1000单位、100单位至500单位、100单位至250单位、250单位至5000单位、250单位至1000单位、250单位至500单位、500单位至5000单位、500单位至1000单位、或1000单位至5000单位(每个都包含端值)。在一些实施方案中，N-糖苷酶(例如PNGase F)的酶促有效量为大于或大于约或者为或为约1单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、50单位、100单位、250单位、500单位、1000单位、2500单位或5000单位。确定N-糖苷酶(例如PNGase F的制剂)的活性和/或比活性的单位在熟练技术人员的水平内。用于评估或确定活性单位的示例性方法如上所述，并且可能取决于N-糖苷酶(例如PNGase F)的特定来源。在一些情形中，一个单位是足以在37℃下在30分钟内催化1纳摩尔变性核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的N-糖苷酶(任选地PNGase F)的量。在其他情形中，500单位是N-糖苷酶(任选地PNGase F)足以在37℃或室温下催化在1XPBS中孵育5-10分钟的10μg核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的量。
在一些实施方案中，PNGase F是重组PGNase F。在某些实施方案中，PNGase F是突变体PNGase F。在一些实施方案中，PNGase F是从脑膜炎脓毒性黄杆菌中克隆的重组PNGase F。在特定实施方案中，PNGase F是从脑膜炎脓毒性黄杆菌的整个PNGase F基因克隆的。在某些实施方案中，脑膜炎脓毒性黄杆菌的整个PNGase F基因是在Tarentino等人,Journal of BiologicalChemistry,265(12):6961-6966(1990)中描述的PNGase F基因。在特定实施方案中，整个PNGase F基因是对指定为Uniprot登录号P21163.2的PNGase F多肽进行编码的PNGase F基因。在一些实施方案中，整个PNGase F基因是对具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的PNGase F多肽进行编码的PNGase F基因。
在特定实施方案中，PNGase F在37℃或室温下在5-10分钟内实现RNase B的完全去糖基化。在一些实施方案中，具有增加和/或快速活性的PNGase F是当将一个单位的PNGase F在37℃或室温下孵育5-10分钟时实现10μg RNase B的完全去糖基化的PNGase F。在特定实施方案中，完全去糖基化通过SDS-PAGE可视化。在特定实施方案中，如通过SDS-PAGE分析并用考马斯亮蓝染色确定，PNGase F的纯度为至少95％或更高。在一些实施方案中，PNGase F在室温或37℃下在几分钟内从血源糖蛋白胎球蛋白的天然形式释放N-聚糖。
在一些实施方案中，PNGase F是当在室温或37℃下与天然糖蛋白一起孵育时能够在几分钟内去除、释放和/或脱离N-聚糖的PNGase F。在特定实施方案中，PNGase F能够在37℃下在2小时内从冷冻的和***固定的石蜡包埋的肝组织切片中去除、释放和/或脱离一定量的N-聚糖，其中所述量的释放的N-聚糖可通过质谱(例如MALDI-MS)检测(参见例如Powers等人Analytical Chemistry,85(20):9799-806(2013))。在某些实施方案中，当将0.1mg/mL的0.2mL溶液应用于切片并在37℃下孵育2小时的时候，PNGase F能够从冷冻的小鼠脑组织切片中去除、释放和/或脱离一定量的N-聚糖，其中所述量的释放的N-聚糖可通过质谱(例如MALDI-MS)检测(参见例如，Powers等人,Biomolecules 5:2554-2572(2015))。
在特定实施方案中，PNGase F将处于天然形式的蛋白质去糖基化。在某些实施方案中，PNGase F从处于天然形式的一种或多种糖蛋白中去除N-聚糖。在一些实施方案中，PNGase F在室温下在几分钟内从处于天然形式的一种或多种糖蛋白中释放、去除和/或脱离聚糖。在某些实施方案中，PNGase F在室温或37℃下在几分钟内从处于天然形式的一种或多种糖蛋白中释放、去除和/或脱离聚糖。在某些实施方案中，PNGase F在约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、或者在5分钟与1小时之间、在1小时与4小时之间、在4小时与6小时之间、或者长于6小时内从处于天然形式的一种或多种糖蛋白中释放、除去和/或脱离至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或约100％的聚糖。
在特定实施方案中，PNGase F是在细胞中表达和纯化的由从PNGase F基因克隆的多核苷酸产生的重组PNGase F。在一些实施方案中，所述细胞是细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、酵母细胞、昆虫细胞、或哺乳动物细胞。在某些实施方案中，PNGase F在大肠杆菌中表达并从其中纯化。在一些实施方案中，PNGase F在细菌菌株BL21 Star(DE3)中表达并从其中纯化。
在一些实施方案中，PNGase F是由克隆到表达载体中、在表达载体中表达并纯化的多核苷酸产生的重组PNGase F。在某些实施方案中，通过常规分子技术将编码PNGase F的多核苷酸掺入含有调节序列的载体构建体中(参见Sambrook等人,Molecular Cloning,第2版,(1989))。在一些实施方案中，载体包括合适的启动子、复制原点、核糖体结合位点、转录终止序列、选择标记和多克隆位点中的一个或多个。在特定实施方案中，编码PNGase F的多核苷酸是具有有效且特异的构建体的质粒，例如T7表达载体。在某些实施方案中，载体含有诱导型启动子。在一些实施方案中，将编码PNGase F的多核苷酸***表达载体中，所述表达载体适合于在对细菌适合的启动子的控制下在细菌中表达。在特定实施方案中，表达载体含有由宿主细菌生物体识别并与编码PGNase F的多核苷酸可操作地连接的诱导型启动子。适合于与细菌宿主一起使用的诱导型启动子包括β-内酰胺酶和乳糖启动子***、***糖启动子***(包括araBAD启动子)、鼠李糖启动子、碱性磷酸酶启动子、色氨酸(trp)启动子***、PLtet0-1和Plac/ara-1启动子、以及杂合启动子(如tac启动子)。在一些实施方案中，其他已知的细菌诱导型启动子和低基础表达启动子是合适的。在某些实施方案中，表达载体含有lacUV5启动子，并允许从T7表达载体(如pET和pQE)由异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)高水平地诱导表达基因产物。
在一些实施方案中，产生PGNase F是将编码PNGase F的多核苷酸克隆到T7表达载体中、在T7表达载体中表达并纯化的过程。T7表达载体包括但不限于可商购的T7载体，如pT7 FLAG 3、pT7 FLAG 1、pT7 MAT 1、pT7 FLAG4、pT7 FLAG 2、pT7 MAT 2、pT7 FLAG-MAT1、pT7 MAT-FLAG 2、pT7MAT-FLAG 1、和pT7 FLAG-MAT 2(Sigma)、GATEWAY pDEST 14、GATEWAY pDEST 15、GATEWAY pDEST 16、GATEWAY pDEST 17、pRSET A、pRSET-BFP、pRSET-CFP、pRSET-EmGFP(Thermo Fisher)、pET 29-b(Novagen)和pQE-T7(Qiagen)。在某些实施方案中，将编码PNGase F的多核苷酸克隆到pET 29-b和/或pQE-T7T7载体中，在pET 29-b和/或pQE-T7T7载体中表达并纯化。
在一些实施方案中，PNGase F含有直接或间接地连接至蛋白质的N和/或C末端的标签或融合结构域，例如亲和或纯化标签。在特定实施方案中，PGNase F是通过这样的过程生产的，其中PNGase F是被克隆到表达载体中、在表达载体中表达并纯化的重组PNGase F。在一些实施方案中，***导致框内N末端或C末端标签和/或融合结构域的序列的添加。在一些实施方案中，标签和/或融合结构域是PNGase F多肽的N末端标签。在特定实施方案中，标签和/或融合结构域是PNGase F多肽的C末端标签。各种合适的多肽标签和/或融合结构域是已知的，并且包括但不限于FITC标签、聚组氨酸(His)、HRP、麦芽糖结合蛋白、Glu-Glu、抗生物素蛋白、谷胱甘肽S转移酶(GST)、蛋白A、蛋白G、免疫球蛋白重链恒定区(Fc)、人血清白蛋白、AviTag、钙调素标签、聚谷氨酸标签、FLAG标签、HA标签、Myc标签和荧光蛋白标签(例如，EGFP)。在特定实施方案中，PNGase F是具有C末端His标签的重组PNGase F。
在某些实施方案中，PGNase F是通过这样的过程生产的，其中用含有编码PNGaseF的多核苷酸的载体转导的细菌细胞被诱导表达PNGase F蛋白。在特定实施方案中，收获并裂解表达PNGase F多肽的细菌细胞，并且纯化PNGase F多肽。在一些实施方案中，对PNGaseF多肽进行纯化。用于在蛋白质纯化中使用的合适技术包括但不限于用硫酸铵、PEG、抗体等或通过热变性沉淀，随后进行离心；色谱步骤，如离子交换、凝胶过滤、反相、羟基磷灰石和亲和色谱；等电聚焦；凝胶电泳；以及这些和其他技术的组合。在一些实施方案中，PNGase F多肽的纯化通过HPLC或FPLC纯化进行。在一些实施方案中，蛋白质通过这样的方法纯化，其中柱通过与重组PGNase F多肽的蛋白质标签(例如C末端his标签)相互作用而结合或保留PGNase F多肽。
在特定实施方案中，药剂是或包括PNGase F，所述PNGase F由从整个PNGase(其是来自脑膜炎脓毒性黄杆菌基因组的完整肽N-糖苷酶F(PNGaseF)基因)克隆、在T7表达载体pET 29-b(Novagen)和pQE-T7(Qiagen)中表达并纯化的多核苷酸产生。在某些实施方案中，编码PNGase F的多核苷酸含有框内C末端组氨酸标签。在一些实施方案中，将编码PNGase FHIS标签构建体的多核苷酸转化到携带在lacUV5启动子控制下的T7 RNA聚合酶基因的细菌菌株BL21 Star(DE3)中，所述lacUV5启动子允许从T7表达载体(如pET和pQE)由异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)高水平地诱导表达基因产物。在特定实施方案中，进行细菌转化和细胞培养生长，通过离心收获细菌细胞，并用含有蛋白酶抑制剂(SigmaFast，不含EDTA)的缓冲液洗涤细胞沉淀。在特定实施方案中，使用Avestin C5高压均化器制备总细胞蛋白裂解物。在一些实施方案中，用于重组PNGase F组氨酸标签蛋白的FPLC纯化方法使用Ni-NTA(Qiagen)和IMAC HisTrap HP(GE Healthcare)柱。在一些实施方案中，将来自IPTG诱导培养物的细菌细胞裂解物加载到柱上，并使PNGase F多肽与C末端His标签结合，并使用在结合缓冲液中的咪唑阶梯梯度进行洗涤和洗脱。在一些实施方案中，将具有C末端的纯化PNGase F透析并存储在PBS缓冲液中。在特定实施方案中，药剂是或包括PNGase，所述PNGase是具有C末端His标签的重组PNGase F或者是与通过在Powers等人AnalyticalChemistry,85(20):9799-806(2013)中描述的方法生产的PNGase F相同的PNGase F。
在一些实施方案中，药剂是或包括PNGase F，其是可商购的PNGase F。可商购的PNGase F包括但不限于PNGase F蛋白质组学等级(目录号P 7367，Sigma)；PNGase F(目录号P0704S和P0704L，New England Biolabs)、PNGase F(目录号V4831、Promega)、N-GLYCANASE(目录号：GKE-5006A、GKE-5006B、GKE-5006D、GKE-5016A、GKE-5016B、GKE-5016D、GKE-5010B、GKE-5016D、GKE-5020B、GKE-5020D、和GKE-5003，ProZyme)、和PNGase F(目录号：E-PNG01，QABio)、RAPID PNGase F(目录号P0710S，New England Biolabs)、PNGASE FPRIME(N-Zyme Scientifics)。在某些实施方案中，PNGase F是PNGASE F PRIME(N-ZymeScientifics)或与其相同。
2.孵育条件
在一些实施方案中，将细胞组合物(例如测试组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)接触、用药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)处理和/或与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，持续约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、约1.5小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、或者在5分钟与1小时之间、在1小时与4小时之间、在4小时与6小时之间、或者长于6小时。在特定实施方案中，将细胞组合物与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育持续在30分钟与60分钟之间的时间量，所述药剂是或包括PGNase F。在某些实施方案中，将细胞组合物与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育持续约30分钟，所述药剂是或包括PGNase F。在某些实施方案中，将细胞组合物与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育持续约60分钟，所述药剂是或包括PGNase F。
在特定实施方案中，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)接触、用药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)处理和/或与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，并且至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的表面暴露的N-聚糖在少于6小时、少于5小时、少于4小时、少于3小时、少于两小时、少于90分钟、少于60分钟、少于45分钟、少于30分钟、少于15分钟、或少于5分钟的时间量内从细胞中去除。在某些实施方案中，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，持续约5分钟、约10分钟、约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟或约60分钟、或者在5分钟与60分钟之间、在5分钟与30分钟之间、在30分钟与60分钟之间、或在15分钟与45分钟之间，并且至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的表面暴露的N-聚糖从细胞中去除。在特定实施方案中，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，持续约30分钟，并且至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的表面暴露的N-聚糖从细胞中去除。在某些实施方案中，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，持续约60分钟，并且至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的表面暴露的N-聚糖从细胞中去除。
在一些实施方案中，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，以在不损害或杀死细胞的条件下从细胞表面去除N-聚糖。在一些实施方案中，孵育持续不超过或约5分钟、不超过或约10分钟、不超过或约15分钟、不超过或约20分钟、不超过或约25分钟、不超过或约30分钟、不超过或约35分钟、不超过或约40分钟、不超过或约45分钟、不超过或约50分钟、不超过或约55分钟、不超过或约60分钟、不超过或约1.5小时、不超过或约2小时、不超过或约3小时、不超过或约4小时、不超过或约5小时、或不超过或约六小时，其中所述组合物中少于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.5％、约0.1％、约0.05％、约0.01％、约0.001％、或约0.0001％的细胞在所述孵育期间死亡、破裂、裂解和/或引发或经历凋亡或坏死。在一些实施方案中，孵育持续如下的时间，所述时间为不超过或为约30分钟或60分钟，或者是在30分钟与60分钟之间(包含端值)的时间量，并且所述组合物中小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.5％、约0.1％、约0.05％、约0.01％、约0.001％、或约0.0001％的细胞在所述孵育期间死亡、破裂、裂解和/或引发或经历凋亡或坏死。
在某些实施方案中，伴随摇摆运动进行与药剂(例如N-糖苷酶)的接触、用药剂(例如N-糖苷酶)处理和/或与药剂(例如N-糖苷酶)一起孵育。在某些实施方案中，摇摆为、为约或为至少25RPM、50RPM、100RPM、150RPM、200RPM、250RPM、300RPM、350RPM、400RPM、450RPM、或500RPM。在一些实施方案中，摇摆为或为约250RPM。在一些实施方案中，在静止条件下进行与药剂(例如N-糖苷酶)接触、用药剂(例如N-糖苷酶)处理和/或与药剂(例如N-糖苷酶)一起孵育。在一些实施方案中，在与药剂接触、用药剂处理和/或与药剂一起孵育期间，将细胞短暂混合和/或涡旋，例如持续、持续约或持续少于30秒、15秒、10秒、5秒、2秒或1秒。在一些实施方案中，在接触、孵育和/或处理期间，将细胞混合或涡旋一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。
在一些实施方案中，在低于10℃的温度下，将细胞组合物(例如测试细胞组合物)与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)接触、用药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)处理和/或与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育。在一些实施方案中，所述温度是在10℃与45℃之间、或在24℃与40℃之间、或在35℃与39℃之间。在一些实施方案中，所述温度为至少或至少约或者为或为约10℃、15℃、20℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、约29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃、或任何前述值之间的任何范围。在某些实施方案中，在约37℃的温度下，将细胞组合物与药剂接触、用药剂处理或与药剂一起孵育，所述药剂是或包括PNGase F。
在特定实施方案中，将细胞组合物与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)接触、用药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)处理或与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，并且在10℃与45℃之间、或在24℃与40℃之间、或在35℃与39℃之间，例如至少或至少约或者为或为约10℃、15℃、20℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、约29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、或40℃(或任何前述值之间的任何范围)的温度下进行孵育之后，至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.9％的表面暴露N-聚糖从细胞中去除。在特定实施方案中，在10℃与45℃之间、或在24℃与40℃之间、或在35℃与39℃之间，例如至少或至少约或者为或为约10℃、15℃、20℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、约29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、或40℃(或任何前述值之间的任何范围)的温度下，将细胞组合物与是或包括PNGase F的药剂一起孵育，并且至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的表面暴露的N-聚糖从细胞中去除。
在一些实施方案中，将细胞组合物与药剂(如N-糖苷酶，例如PNGase F)一起孵育，以在不损害或杀死细胞的条件下从细胞表面去除N-聚糖。在一些实施方案中，所述孵育是在10℃与45℃之间、或在24℃与40℃之间、或在35℃与39℃之间，例如至少或至少约或者为或为约10℃、15℃、20℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、约29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、或40℃(或任何前述值之间的任何范围)的温度下进行，并且所述组合物中小于约20％、约15％、约10％、约5％、约1％、约0.5％、约0.1％、约0.05％、约0.01％、约0.001％或约0.0001％的细胞在所述孵育期间死亡、和/或引发或经历凋亡或坏死。
在一些实施方案中，将细胞组合物与PNGase F一起孵育、用PNGase F处理和/或与PNGase F接触，并且表面表达的N-聚糖从细胞表面释放、去除或脱离。在某些实施方案中，将细胞组合物在或在约37℃下孵育持续约30分钟、持续约60分钟、或持续在30分钟与60分钟之间的时间量。在一些实施方案中，伴随在或在约250RPM下的摇摆进行所述孵育。在一些实施方案中，PNGase F含有融合结构域。在某些实施方案中，融合结构域是C末端His标签。在特定实施方案中，PNGase F是纯度为至少95％的制剂和/或是具有少于5％的非PNGase F蛋白污染物的制剂。在一些实施方案中，在37±2℃的温度下孵育30-60分钟之后，PNGase F展现出从天然或非变性蛋白质中释放N-聚糖的去糖基化活性。在一些实施方案中，将在1x106个与5x106个之间的细胞或在1x106个与2.5x106个之间的细胞的组合物用药剂处理、与药剂接触或与药剂一起孵育，所述药剂是或包括PNGase F。
3.去除细胞
在一些实施方案中，包括将细胞与从在细胞表面上表达的蛋白质去除、释放和/或脱离聚糖(例如N-聚糖)的药剂一起孵育的条件，导致聚糖释放到进行处理、孵育和/或接触的溶液或培养基中。在某些实施方案中，孵育之后组合物的细胞是完整的，例如，细胞没有破裂、裂解、垂死和/或死亡。在特定实施方案中，进行孵育之后将细胞从培养基或溶液中去除。在特定实施方案中，以不破裂、裂解和/或杀死细胞的方式将细胞从培养基或溶液中去除。在一些实施方案中，通过离心(例如低速和/或低g离心)去除细胞，并从含有细胞的沉淀去除上清液。在特定实施方案中，上清液含有在处理、孵育或接触期间从细胞表面去除的聚糖(例如N-聚糖)。
在特定实施方案中，将细胞从含有释放的表面聚糖的样品、溶液或培养基中去除。在某些实施方案中，将聚糖从培养基或溶液中去除和/或分开。在一些实施方案中，将溶液或培养基蒸发。在特定实施方案中，通过真空离心(例如用speedvac)将溶液或培养基蒸发。在特定实施方案中，将聚糖从培养基或溶液中去除和/或分开，并且然后重悬。在一些实施方案中，可以将聚糖重悬于一定体积的缓冲液或溶液中。在一些实施方案中，缓冲液或溶液适合于存储。在某些实施方案中，缓冲液适合与用于检测、鉴定和/或检测聚糖的技术一起使用。在某些实施方案中，缓冲液或溶液适合用于化学反应，例如衍生反应，例如添加可检测的标记。
B.检测聚糖
在一些实施方案中，按照所提供的方法孵育之后，与在细胞表面上表达和/或暴露的蛋白质附接的聚糖(例如N-聚糖)被释放、去除和/或脱离到培养基和/或溶液中。在某些实施方案中，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个、至少十一个、至少十二个、至少十三个、至少十四个、至少十五个、至少十六个、至少十七个、至少十八个、至少十九个、至少二十个、至少二十五个、至少三十个、至少三十五个、至少四十个、至少四十五个、至少五十个、至少五十五个、至少六十个、至少六十五个、至少七十个、至少七十五个、至少八十个、至少八十五个、至少九十个、至少九十五个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个或至少500个或更多个种类的聚糖(例如N-聚糖)进入到培养基或溶液中。在特定实施方案中，聚糖(例如N-聚糖)种类是可检测的聚糖种类。在一些实施方案中，可检测种类是可以在样品内或从由样品生产、产生、制备和/或衍生的制剂中检测、鉴定、测量和/或定量的N-聚糖。
本文提供了用于产生细胞组合物的高分辨率表面N-聚糖图的方法。在一些实施方案中，所述方法包括检测已经从细胞表面(例如从暴露于细胞表面的糖蛋白)去除、释放和/或脱离的N-聚糖的步骤。在特定实施方案中，N-聚糖的检测包括例如通过质谱(MS)或高效液相色谱(HPLC)鉴定和/或定量N-聚糖以产生高分辨率的表面N-聚糖表达谱。在某些实施方案中，本文提供的方法包括用于洗涤、清洁和/或纯化释放的N-聚糖的样品的步骤。在某些实施方案中，本文提供的方法包括将N-聚糖衍生化例如以增加或增强对N-聚糖的检测的步骤。
1.衍生化和纯化
在某些实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)修饰以改善和/或增强对聚糖的检测。在许多情形中，由于不存在可通过液相色谱和/或质谱检测到的强发色团或荧光团或活性部分，聚糖可能不容易被检测到。在一些实施方案中，聚糖的吸光度和荧光反应可能相对较弱或低于检测的阈值。在一些实施方案中，使测定的灵敏度最大化的一种策略是将感兴趣的化合物(即聚糖)转化为对所利用的特定检测方法展现出更好反应的衍生物。在某些实施方案中，衍生化药剂通过最大化衍生分子的灵敏度、产率和/或稳定性来影响(affect或influence)分析的最终灵敏度和准确性。因此，在一些实施方案中，在任何分析或检测程序之前将已经从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)衍生化。
在一些实施方案中，在通过HPLC和/或质谱分析之前将聚糖衍生化。在一些实施方案中，可以通过衍生化步骤来改善和/或增强通过现有技术(例如高效液相色谱(HPLC)和/或光谱或质谱(MS)检测)对N-聚糖检测的灵敏度。
在一些实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)衍生化以允许或改善通过质谱的检测。在某些实施方案中，将聚糖衍生化以允许聚糖更容易接受电荷。在某些实施方案中，能够接受电荷的聚糖和/或衍生聚糖可通过质谱仪检测。在一些实施方案中，通过添加氨基基团(例如叔氨基基团)将聚糖衍生化。
在一些实施方案中，衍生化是或包括将可检测标记添加至聚糖(例如N-聚糖)。在一些实施方案中，所述添加是共价附接。在某些实施方案中，与不含有附接的可检测标记的N-聚糖的检测相比，附接的可检测标记在N-聚糖的检测期间增加信号和/或降低背景噪声。在某些实施方案中，根据本公开文本可以使用多种可检测标记中的任何一种，包括但不限于荧光标记、放射性标记和/或化学发光标记。在某些实施方案中，可检测标记是荧光标记。在某些实施方案中，荧光标记的附接(例如共价附接)不改变N-聚糖在柱(例如适用于HPLC的柱)中的迁移。在特定实施方案中，标记是荧光标记，并且使聚糖与未标记的聚糖相比更容易接受电荷。
在一些实施方案中，释放的聚糖可以直接通过质谱(例如MALDI MS或ESI-MS-MS)进行分析，而无需任何衍生化和/或化学标记。在一些实施方案中，这种无标记的方法适用于聚糖的定性分析。但是，在一些实施方案中，因来自单个蛋白质样品的聚糖之间的电离效率并不相同导致所述聚糖可能非常异质的事实，无标记的方法不同样适用于相对定量。因此，在一些实施方案中，可以使用可以进行定量和定性分析的单个分析平台例如以确定表面N-聚糖表达的谱。荧光检测器仅检测染料本身，因此来自各种聚糖的荧光反应可以用于相对定量。在一些实施方案中，将衍生化或标记试剂用于分析程序。
在一些实施方案中，通过本领域的标准技术进行N-聚糖的衍生化。许多N-聚糖衍生化技术在Ruhaak等人,Analytical and Bioanalytical Chemistry397(8):3457–3481(2010)中进行了描述和综述。在一些实施方案中，通过包括两个或更多个反应步骤的化学反应进行衍生化。在一些实施方案中，通过反应还原胺化、过甲基化、迈克尔加成或酰肼标记进行衍生化。在某些实施方案中，可以使用提供标记反应所需的官能团的各种化合物。在某些实施方案中，通过使用单个反应步骤的化学反应进行衍生化。通过使用单个反应步骤的化学反应将标记添加至聚糖、适合于衍生化和/或将可检测标记共价附接至N-聚糖的标记剂包括含有与胺快速反应的官能团(异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)的药剂。此类标记剂和荧光标记描述于美国专利申请号：US20140242709中。
在某些实施方案中，通过还原胺化标记N-聚糖。在此反应中，含有伯胺基团的标记在缩合反应中与聚糖的醛基团反应，产生亚胺或希夫碱，其被还原剂还原以产生仲胺。在一些实施方案中，反应在含有乙酸、四氢呋喃或甲醇的二甲亚砜中进行。在一些实施方案中，还原胺化导致每个N-聚糖化学计量附接一个标记，从而允许基于荧光或UV-吸光度强度进行直接定量。
已经将各种标记用于聚糖的还原胺化。在一些实施方案中，将荧光标记添加到聚糖中，所述荧光标记是或包括2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。
在特定实施方案中，将N-聚糖用可商购的标记进行标记。标记试剂盒可用于标签2-AB、2-AA和PA(Ludger)以及用于使用APTS(Beckmancoulter)和ANTS(Prozyme)进行标记。在一些实施方案中，标记剂和/或荧光标记是RapiFluor-MS(Waters TechnologiesCorporation)。
在一些实施方案中，标记剂含有荧光部分以及与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)。在一些实施方案中，标记剂含有叔氨基基团或其他MS活性原子、荧光部分、以及与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)中的一个或多个。
在特定实施方案中，标记剂含有荧光部分，所述荧光部分是或包括泛喹酮或苯并噁二唑。在一些实施方案中，标记试剂含有荧光部分，所述荧光部分是香豆素。香豆素的合适例子包括但不限于香豆素7(3-(2,-苯并咪唑基)-7-N,N-二乙基氨基香豆素)；尼罗红衍生物；香豆素4(7-羟基-4-甲基香豆素)；香豆素120(7-氨基-4-甲基香豆素)；香豆素2(7-氨基-4甲基香豆素)；香豆素466(7-二乙基氨基香豆素)；香豆素47(7-二乙基氨基-4-甲基香豆素)；香豆素6H(2,3,5,6-1H,4H-四氢喹嗪并-[9,9a,1-gh]香豆素)；香豆素152A(7-二乙基氨基-4-三氟甲基香豆素)；香豆素152(7-二甲基氨基-4-三氟甲基香豆素)；香豆素151(7-氨基-4-三氟甲基香豆素)；香豆素6H(2,3,5,6-1H,4H-四氢喹嗪并-[9,9a,l-gh]香豆素)；香豆素307(7-乙基氨基-6-甲基-4-三氟甲基香豆素)；香豆素500(7-乙基氨基-4-三氟甲基香豆素)；香豆素314(2,3,5,6-1H,4H-四氢-9-羰乙氧基喹嗪并-[9,9a,1-gh]香豆素)；香豆素510(2,3,5,6-U-4H-四氢-9-(3-吡啶基)-喹嗪并-[9,9a,gh]香豆素)；香豆素30(3-2'-N-甲基苯并咪唑基)-7-N,N-二乙基氨基香豆素)；香豆素552(N-甲基-4-三氟甲基哌啶并-[3,2-g]-香豆素)；香豆素6(3-(2'-苯并噻唑基)-7-二乙基氨基香豆素)。
在一些实施方案中，标记剂含有荧光部分，所述荧光部分是罗丹明。合适的罗丹明包括但不限于：罗丹明110(o-(6-氨基-3-亚氨基-3H-氧杂蒽-9-基)-苯甲酸)；罗丹明19(苯甲酸,2-[6-(乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2,7-二甲基-3H-氧杂蒽-9-基]高氯酸盐)；罗丹明6G(苯甲酸,2-[6-(乙基氨基)-3-(乙基亚氨基)-2,7-二甲基-3H-氧杂蒽-9-基]-乙酯,一盐酸盐)；罗丹明B(2-[6-(二乙基氨基)-3-(二乙基亚氨基)-3H-氧杂蒽-9-基]苯甲酸)。在一些实施方案中，荧光部分是荧光素。荧光素可以包括但不限于Uranin(荧光素二钠)；和荧光素27(2,7-二氯荧光素)。
在某些实施方案中，标记剂包括荧光部分，所述荧光部分是苯基取代的噁唑或呋喃。在一些实施方案中，荧光部分是PPO(2,5-二苯基噁唑)；α-NPO(2-(l-萘基)-5-苯基噁唑)；BBO(2,5-双-(4-联苯基)-噁唑)；和POPOP(1,4-二[2-(5-苯基噁唑基)]苯)。在某些实施方案中，荧光部分包括四联苯。在特定实施方案中，四联苯包括TMQ(TMQ(3,3’,2’,3‘”-四甲基-对四联苯)；BMQ(2,2'”-二甲基-对四联苯)；DMQ(2-甲基-5-叔丁基-对四联苯)；PQP(对四联苯)；聚苯1(对四联苯-4-4'”-二磺酸二钠盐)；聚苯2(对四联苯-4-4'”-二磺酸二钾盐；BiBuQ(4,4'”-双-(2-丁基辛基氧基)-四联苯)；BM-三联苯(2,2"-二甲基-对三联苯)；和FTP(对三联苯)。在一些实施方案中，荧光部分是氮杂喹诺酮或羰苯乙烯基染料(carbostyryl)，包括但不限于羰苯乙烯基染料7(7-氨基-4-甲基羰苯乙烯基)；羰苯乙烯基染料3(7-二甲基氨基-4-甲基喹诺酮-2)；和喹诺酮390(7-二甲基氨基-1-甲基-4-甲氧基-8-氮杂喹诺酮-2)。在一些实施方案中，荧光部分是苯并噁唑、苯并呋喃或苯并噻唑，其中例子包括：DASBTI(2-(对二甲基氨基苯乙烯基)-苯并噻唑基乙基碘化物)；香豆素6(3-(2'-苯并噻唑基)-7-二乙基氨基香豆素)；苯乙烯基染料(Styryl)9M(2-(6-(4-二甲基氨基苯基)-2,4-亚新戊烯基-l,3,5-己三烯基)-3-甲基-苯并噻唑鎓高氯酸盐)；苯乙烯基染料15(2-(6-(9-(2,6,7-四氢-1H,5H-苯并(ij)-喹嗪鎓))-2,4-亚新戊烯基-l,3,5-己三烯基])-3-甲基苯并噻唑鎓高氯酸盐)；苯乙烯基染料14(2-(8-(4-对二甲基氨基苯基V甲基苯并噻唑鎓高氯酸盐)；苯乙烯基染料20(2-(8-(9-(2,3,6,7-四氢-1H,5H-苯并(ij)-喹嗪鎓))-2,4-亚新戊烯基-l,3,5,7-辛三烯基)-3-甲基苯并噻唑鎓高氯酸盐)；呋喃染料(Furan)1(苯并呋喃,2,2'-[l,1'-二苯基]-4,4'-二基-双-四磺酸(四钠盐))；和PBBO(2-(4-联苯基)-6-苯基苯并噁唑～l,3)。
在一些实施方案中，荧光部分是经取代的芪。经取代的芪的例子包括但不限于DPS(4,4'-二苯基芪)；芪染料(Stilbene)1([1,1'-联苯]-4-磺酸,4',4"-1；2-乙烯-二基双-,二钾盐)；和芪染料3(2,2'-([1,1'-联苯]-4,4'-二基二-2,1-乙烯二基)-双-苯磺酸二钠盐)。在一些实施方案中，标记剂含有与胺快速反应的官能团，荧光部分，以及任选地叔氨基基团或其他MS活性原子中的一个或多个。在一些实施方案中，与胺快速反应的官能团是Fluorol 7GA(2-丁基-6-(丁基氨基)-1H苯并[de]异喹啉-l,2(2H)-二酮)。磺酰罗丹明B(乙铵盐(Ethanaminium),N-[(6-二乙基氨基)-9-(2,4-二磺苯基)-3H-氧杂蒽-3-亚基]-N乙基氢氧化物，内盐，钠盐)；和磺酰罗丹明101(8-(2,4-二磺苯基)-2,3,5,6,11,12,14,15-八氢-1H,4H,10H,13H-二喹嗪并[9,9a,1-bc:9',9a',1-hi]氧杂蒽)。
在一些实施方案中，标记剂中的荧光部分是吡咯甲川，例如，吡咯甲川546(l,3,5,7,8-五甲基吡咯甲川二氟硼酸盐复合物)；吡咯甲川556(二钠-l,3,5,7,8-五甲基吡咯亚甲基-2,6-二磺酸盐-二氟硼酸盐复合物)；
(二钠-l,3,5,7,8-五甲基吡咯甲川-2,6-二磺酸盐-二氟硼酸盐
吡咯甲川567(2,6-二乙基-l,3,5,7,8-五甲基吡咯甲川二氟硼酸盐复合物)；吡咯甲川580(2,6-二-正丁基-l,3,5,7,8-五甲基吡咯甲川二氟硼酸盐复合物)；吡咯甲川597(2,6-二-叔丁基-l,3,5,7,8-五甲基吡咯甲川二氟硼酸盐复合物)；和吡咯甲川650(8-氰基-l,2,3,5,6,7-六甲基吡咯甲川二氟硼酸盐复合物)。
在某些实施方案中，标记剂中的荧光部分是芘衍生物，例如N-(l-芘)马来酰亚胺，或荧光黄染料(Pyranine)(8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠)。
在某些实施方案中，标记试剂包含叔氨基基团或其他MS活性原子、以及与胺快速反应的官能团(如异氰酸酯或琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯)。在某些实施方案中，氨基基团或MS活性基团可以增加MS对聚糖的可检测力。在特定实施方案中，荧光部分提供良好的荧光信号；并且反应性官能团给出对所希望的生物分子的快速标记。在某些实施方案中，荧光标记和/或标记试剂包括喹啉基荧光团。在特定实施方案中，荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团。在一些实施方案中，荧光标记和/或所述标记包含碱性叔胺。在特定实施方案中，荧光团包含氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和叔胺。
在一些实施方案中，将聚糖与衍生化或标记试剂接触、用衍生化或标记试剂处理和/或与衍生化或标记试剂一起孵育，持续、持续约、或持续至少1分钟、2分钟、3分钟、5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、55分钟、60分钟、1.5小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、或者在1分钟与1小时之间、在1分钟与30分钟之间、在1分钟与10分钟之间、在5分钟与15分钟之间、或在15分钟与30分钟之间、在1小时与6小时之间、在3小时与12小时之间、或在12小时与48小时之间(包含端值)。在一些实施方案中，在溶剂(例如有机溶剂)的存在下，将聚糖与标记和/或衍生化试剂接触和/或用标记和/或衍生化试剂处理。在一些实施方案中，溶剂是亲水的。在某些实施方案中，溶剂是非质子溶剂。在特定实施方案中，溶剂是酰胺，例如有机酰胺、磺酰胺、磷酰胺或甲酰胺。在一些实施方案中，将标记试剂和/或衍生化试剂在为甲酰胺的溶剂的存在下与聚糖接触、用聚糖处理和/或与聚糖一起孵育。在特定实施方案中，将标记试剂和/或衍生化试剂在二甲基甲酰胺的存在下与聚糖接触、用聚糖处理和/或与聚糖一起孵育。
在一些实施方案中，将聚糖在一定温度下与衍生化或标记试剂接触、用衍生化或标记试剂处理和/或与衍生化或标记试剂一起孵育。在一些实施方案中，所述温度是在10℃与45℃之间、或在24℃与37℃之间、或在23℃与27℃之间。在一些实施方案中，所述温度为至少或至少约或者为或为约10℃、15℃、20℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、或任何前述值之间的任何范围。在某些实施方案中，在室温下，例如在23℃与27℃之间、在24℃与26℃之间、或在或在约24℃、25℃或26℃下，使聚糖与衍生化或标记试剂接触、用衍生化或标记试剂处理或与衍生化或标记试剂一起孵育。
在一些实施方案中，将聚糖与衍生化或标记试剂一起孵育、用衍生化或标记试剂处理和/或与衍生化或标记试剂接触。在一些实施方案中，衍生化或标记试剂是2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。在一些实施方案中，在室温下，例如在23℃与27℃之间、在24℃与26℃之间、或在或在约24℃、25℃或26℃下，将聚糖与衍生化或标记试剂一起孵育，持续或持续约5分钟。
在某些实施方案中，在将聚糖与衍生化和/或标记试剂接触、与衍生化和/或标记试剂一起孵育和/或用衍生化和/或标记试剂处理时发生的衍生化和/或标记反应是通过淬灭反应来终止的。在一些实施方案中，通过添加淬灭剂将反应淬灭。在特定实施方案中，在例如通过色谱和/或质谱技术对聚糖进行任何分析或定量之前，将衍生化和/或标记反应淬灭。淬灭衍生化和标记反应的合适药剂是已知的，并且在一些方面将取决于具体的衍生化或标记反应。在一些方面，衍生化和/或标记试剂是2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)，并且将反应通过添加腈(例如有机腈)淬灭。在一些实施方案中，将反应用乙腈淬灭。
2.纯化聚糖
在特定实施方案中，制备含有聚糖的细胞外溶液的样品进行分析(例如质谱分析)。在一些实施方案中，在分析之前纯化聚糖(例如N-聚糖)的样品。在一些实施方案中，纯化包括能够将N-聚糖从任何实体分开的任何方法，所述实体将或将潜在地破坏、阻碍和/或削弱对N-聚糖的检测。在一些实施方案中，进行纯化步骤以从细胞碎片、去糖基化蛋白质、PNGase F、缓冲液/配制品组分、表面活性剂、标记反应副产物、和/或过量的标记和/或衍生化试剂中去除N-聚糖。在特定实施方案中，在标记的聚糖(例如N-聚糖，例如具有共价附接的可检测标记的聚糖)上进行纯化步骤。在某些实施方案中，通过用于纯化聚糖的任何合适技术进行纯化，所述合适技术包括但不限于固相萃取(SPE)、液-液萃取、凝胶过滤、纸色谱、和沉淀。
在一些实施方案中，纯化是或包括固相萃取(SPE)。在特定实施方案中，SPE是这样的样品制备过程：通过所过程溶解或悬浮于液体混合物中的化合物例如根据它们的物理和/或化学性质与在混合物中的其他化合物分开。在某些实施方案中，在对N-聚糖分析之前进行化学衍生化(例如，添加可检测标记)，并且在检测之前进行SPE以从N-聚糖去除用于衍生化的试剂。在某些实施方案中，将溶解或悬浮于液体混合物中的N-聚糖与混合物中的其他化合物分开。在特定实施方案中，SPE是利用溶解或悬浮于液体(即流动相)中的溶质(例如聚糖)对样品所通过的固体(即固定相)的亲和力来将混合物分离成需要和不需要的组分的过程。在一些实施方案中，需要的组分(即聚糖)被保留在固定相上。在特定实施方案中，不需要的样品组分被保留在固定相上。在某些实施方案中，聚糖(例如N-聚糖)被保留在固定相上，并且将通过固定相的溶液丢弃。在特定实施方案中，不需要的组分被保留在固定相上，并且通过固定相的溶液含有聚糖(例如N-聚糖)并且被收集。在一些实施方案中，固定相保留了聚糖，然后通过以下方式将所述聚糖从固定相中除去：使固相与洗脱剂接触、使洗脱剂通过固相和/或用洗脱剂冲洗固相。
在一些实施方案中，在检测之前将已经经历衍生化的聚糖(例如N-聚糖)纯化。在一些实施方案中，通过固相萃取(SPE)进行纯化。在一些实施方案中，在衍生化过程之后对聚糖进行SPE。在某些实施方案中，通过SPE将来自一个或多个衍生化反应的盐(例如过量的盐)从聚糖(例如N-聚糖)中除去。在某些实施方案中，在衍生化反应之后使聚糖(例如N-聚糖)经历SPE。在一些实施方案中，在例如通过还原胺化反应或酰肼标记将可检测标记添加到聚糖(例如N-聚糖)之后进行SPE。在一些实施方案中，SPE从聚糖样品中除去来自一个或多个衍生化反应的过量标记试剂。
在一些实施方案中，SPE的固相是或包括管柱。在某些实施方案中，固相保留、收集和/或结合聚糖，所述聚糖含有可以用于从水性溶液中吸附聚糖的聚酰胺吸附剂。在一些实施方案中，可以通过使用重力、真空或正压使溶液通过这些管柱。在特定实施方案中，根据N-聚糖和其他材料的疏水性差异，管柱从其他材料(例如盐、部分、试剂和/或细胞碎片)中萃取聚糖。在一些实施方案中，用于制备的SPE材料是C18和炭，两者对聚糖都具有高选择性。
在一些实施方案中，使用可商购的试剂盒进行SPE。在某些实施方案中，根据制造商的说明书进行SPE。用于N-聚糖的SPE的合适试剂盒包括但不限于GLYCOCLEAN H管柱(GKI-4025ProZyme)、ADVANCE BIO N-聚糖去糖基化清除管柱(Agilent)、Ludger Clean T1管柱(LC-T1-A6,Ludger)、GlycoWorks 2-AB N-聚糖试剂盒(Waters)、和GlycoWorksRapiFluor-MS N-聚糖试剂盒(Waters)。
在一些实施方案中，通过亲水性相互作用液相色谱(HILIC)SPE过程进行SPE。在一些实施方案中，通过首先用水调节吸附剂并且然后将其平衡至高乙腈负载条件来进行SPE。在某些实施方案中，将N-聚糖样品用乙腈稀释，并且加载并使用酸性洗涤溶剂洗涤而不含样品基质。在一些实施方案中，将与SPE过程一起使用的柱、管、管柱或孔用水(例如蒸馏水)进行调节。在一些实施方案中，将柱、管、管柱或孔使用有机溶剂(例如乙腈)进行调节。在一些实施方案中，将含有聚糖的样品或溶液加载到柱、管、管柱或孔上。在特定实施方案中，将含有聚糖的柱、管、管柱或孔洗涤和/或冲洗至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。在特定实施方案中，将含有聚糖的柱、管、管柱或孔用溶液洗涤和/或冲洗。在一些实施方案中，溶液是或包括水。在特定实施方案中，溶液是或包括乙腈。在特定实施方案中，溶液是或包括甲酸。在某些实施方案中，将柱、管、管柱或孔在包括水、乙腈和甲酸的溶液中冲洗和/或洗涤。
在一些实施方案中，将聚糖从柱、管、管柱或孔中洗脱出来。在某些实施方案中，用是或包括乙酸铵的溶液洗脱聚糖。在特定实施方案中，用是或包括乙腈的溶液洗脱聚糖。在特定实施方案中，用包括乙酸铵和乙腈的溶液洗脱聚糖。在特定实施方案中，用含有、含有约或含有至少1mM、5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM、400mM、500mM、或1,000mM乙酸铵的溶液洗脱聚糖。在某些实施方案中，用含有、含有约或含有至少0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、或50％乙腈的溶液洗脱聚糖。在特定实施方案中，用含有或含有约200mM乙酸铵和5％乙腈的溶液洗脱聚糖。
在一些实施方案中，通过在氨基丙基HILIC吸附剂与反应副产物之间引入静电排斥并通过增强基质组分的溶解度，洗涤条件实现了最佳的SPE选择性。在特定实施方案中，接下来从HILIC吸附剂中洗脱标记的释放的聚糖。在某些实施方案中，SPE吸附剂具有弱碱性表面、和阴离子交换的能力，就像它具有阳离子排斥的能力一样，并且因此用具有显著离子强度的洗脱剂洗脱标记的聚糖。因此，在一些实施方案中，洗脱缓冲液包含在5％乙腈中的200mM乙酸铵的pH 7溶液。在某些实施方案中，在其洗脱后，标记的聚糖可以用有机溶剂(例如乙腈和二甲基甲酰胺)的混合物稀释，并且通过UPLC或HPLC HILIC柱色谱使用荧光和/或ESI-MS检测直接进行分析。
在一些实施方案中，调节聚糖(例如N-聚糖)在样品、溶液和/或培养基中的量或浓度。在特定实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)在样品、溶液和/或培养基中的量或浓度通过蒸发样品、溶液和/或培养基并将聚糖(例如N-聚糖)重悬于溶液中至所需浓度来调节。在一些实施方案中，将含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基的体积通过蒸发样品、溶液和/或培养基并将聚糖重悬于所需体积的溶液中来调节。在一些实施方案中，通过真空离心蒸发样品、溶液和/或培养基。
在特定实施方案中，在纯化步骤(例如SPE)之前蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在一些实施方案中，在纯化步骤之前通过真空离心蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在一些实施方案中，在纯化步骤之后蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在特定实施方案中，在纯化步骤之后通过真空离心蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在某些实施方案中，在检测(例如通过HPLC和/或MS的检测)之前蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在一些实施方案中，在检测之前，通过真空离心蒸发含有聚糖(例如N-聚糖)的样品、溶液和/或培养基。在一些实施方案中，真空离心允许含有聚糖的样品改变或调节用于不同步骤或程序的体积。例如，在用SPE纯化N-聚糖之前可以增加体积，使得不想要的物质(例如细胞碎片)不堵塞SPE柱或管柱。在此类情形中，可以将含有聚糖的洗出液进行真空离心，并且以较小的体积重悬，例如用于HPLC或质谱分析。
3.对聚糖进行谱分析
提供了通过确定样品中聚糖的存在、不存在或存在的水平来评估细胞表面聚糖(例如N-聚糖)的方法。在特定实施方案中，样品含有已经从存在于细胞组合物(例如测试细胞组合物)中的细胞表面释放、去除或脱离的聚糖。在某些实施方案中，评估和/或分析含有已经从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)的样品，以确定在样品中聚糖的存在、不存在或存在的水平。
在一些实施方案中，可以通过本领域中适合于检测、分析和/或分离聚糖(例如N-聚糖)的任何已知技术来分析或评估分离和/或释放的表面聚糖。例如，在某些实施方案中，使用在以下文献中描述的一种或多种可用方法分析聚糖：Anumula,Anal.Biochem.350(1):1,2006；Klein等人,Anal.Biochem.,179:162,1989；和/或Townsend,R.R.CarbohydrateAnalysis High Performance Liquid Chromatography and CapillaryElectrophoresis.,编辑Z.El Rassi,第181-209页,1995。例如，在一些实施方案中，使用色谱方法、电泳方法、核磁共振方法及其组合中的一种或多种来表征聚糖。示例性的此类方法包括，例如NMR、质谱、液相色谱、二维色谱、SDS-PAGE、抗体染色、凝集素染色、单糖定量、毛细管电泳、荧光团辅助碳水化合物电泳(FACE)、胶束电动色谱(MEKC)、外切糖苷酶或内切糖苷酶处理及其组合。本领域普通技术人员将知道可以用于表征聚糖的其他方法。在某些实施方案中，通过如下技术分析或评估分离的表面聚糖，所述技术是或包括液相色谱、荧光检测和/或质谱。
a.色谱
在一些实施方案中，将液相色谱(LC)(包括高效液相色谱)用于分析样品中存在的聚糖(例如N-聚糖)。各种形式的LC可以用于研究聚糖，包括阴离子交换色谱、反相HPLC、尺寸排阻色谱、高效阴离子交换色谱和正相(NP)色谱(包括NP-HPLC)。亲水性相互作用色谱(HILIC)是可以用部分水性流动相进行的NP-HPLC变体，允许肽、碳水化合物、核酸和许多蛋白质的正相分离。在一些实施方案中，通过LC(例如HPLC或HILIC)或通过包括LC(例如HPLC或HILIC)的方法来检测样品中的聚糖。
在某些实施方案中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)或超效液相色谱(UPLC)。在一些实施方案中，HPLC与传统(“低压”)液相色谱有区别，因为操作压力显著更高，为50-350巴(725-5070psi)，而普通液相色谱通常依靠重力使流动相通过柱。UHPLC在高达1030巴(15,000 psi)的压力下运行。
在一些实施方案中，通过HILIC或通过包括HILIC的方法来检测样品中的聚糖。在一些实施方案中，HILIC是可以用于本文所述的方法中的HPLC形式。HILIC基于分析物与固定相(例如底物)之间的极性相互作用来将分析物分开。极性分析物与极性固定相缔合并被其保留。吸附强度随着分析物极性的增加而增加，并且极性分析物与极性固定相(相对于流动相)之间的相互作用增加洗脱时间。在流动相中使用极性更大的溶剂将减少分析物的保留时间，而疏水性更大的溶剂趋向于增加保留时间。HILIC的洗脱顺序是最小极性至最大极性，与反相HPLC中的相反。在一些实施方案中，HILIC可以在HPLC***上进行。
在特定实施方案中，聚糖通过HILIC或通过包括HILIC的方法检测。在一些实施方案中，各种类型的底物可以与HILIC一起使用，例如对于柱色谱，包括二氧化硅、氨基、酰胺、纤维素、环糊精和聚苯乙烯底物。例如可以用于柱色谱的有用底物的例子包括但不限于：聚磺乙基天冬酰胺(polySulfoethyl Aspartamide)(例如，来自PolyLC)、磺基甜菜碱底物(例如
Figure BDA0002307717810000581
(例如，来自SeQuant))、
Figure BDA0002307717810000582
HS(例如，来自Applied Biosystems)、
Figure BDA0002307717810000583
S(例如，来自Applied Biosystems)、聚氢乙基天冬酰胺(PolyHydroethylAspartamide)(例如，来自PolyLC)、Zorbax 300 SCX(例如，来自Agilent)、
Figure BDA0002307717810000584
(例如，来自PolyLC)、酰胺-80(例如，来自Tosohaas)、TSK
Figure BDA0002307717810000585
酰胺-80(例如，来自Tosohaas)、聚羟乙基A(Polyhydroxyethyl A)(例如，来自PolyLC)、Glyco-Sep-N(例如，来自Oxford GlycoSciences)、和Atlantis HILIC(例如，来自Waters)。优选的柱包括聚磺乙基天冬酰胺(polySulfoethyl Aspartamide)和
Figure BDA0002307717810000586
最优选的柱是聚磺乙基天冬酰胺。可以在所公开的方法中使用的柱包括利用以下官能团中的一个或多个的柱：氨基甲酰基团、磺丙基基团、磺乙基基团(例如，聚(2-磺乙基天冬酰胺))、羟乙基基团(例如，聚(2-羟乙基天冬酰胺))和芳香族磺酸基团。优选的官能团包括磺乙基基团如聚(2-磺乙基天冬酰胺)和磺丙基基团如CH2N(CH3)2CH2CH2CH2SO3。
然后，在一些实施方案中，对经LC分析的聚糖进一步进行质谱分析。可以用于进一步分析聚糖的质谱的例子包括ESI-MS、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、SELDI-MS和MALDI-MS。例如，本文所述的方法可以用于提供LC评估的聚糖进行联机质谱(例如，ESI-MS)和/或进行脱机质谱(例如，MALDI-MS)而无需进一步纯化。
在某些实施方案中，将聚糖用发色团或荧光团标记，从而允许在HILIC中进行灵敏检测。在一些实施方案中，最常用的标记是PA、2-AB和2-AA，但其他标记(如3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶)或其他标记(如含有喹诺酮荧光团和叔胺的标记)也是有用的。在特定实施方案中，将标记有含喹诺酮荧光团和叔胺的标记的聚糖通过HILIC或通过包括HILIC的方法进行检测。由于这些标记中的大多数都具有疏水性特征，因此衍生的聚糖可能会比未标记的天然聚糖显示出稍少的保留。在一些实施方案中，使用配备有氙气灯的检测器进行荧光检测，并且激发和发射单色仪都可以设置为所选标记的最佳波长，以实现高灵敏度。
b.荧光检测
在某些实施方案中，荧光检测与液相色谱和/或质谱技术偶联。在某些实施方案中，将聚糖(例如N-聚糖)与荧光标记附接(例如共价附接)。在特定实施方案中，将荧光标记的聚糖(例如N-聚糖)用液相色谱通过荧光检测进行分析，随后用质谱来分析。在一些实施方案中，液相色谱、质谱和荧光检测的组合是可以用于对样品(例如，从细胞表面释放或脱离的N-聚糖的样品)进行全面聚糖分析的一个分析平台。
在一些实施方案中，HPLC荧光检测具有许多益处，包括高灵敏度、高选择性和可重复性。最先进的荧光检测器的特征在于温度控制单元，即使环境温度波动其也能确保稳定的分析。这些检测器还提供高的灵敏度和验证水平，以支持从常规到超快速LC分析等广泛应用范围的功能。在某些实施方案中，用特征在于温度控制单元的荧光检测器来分析聚糖。
在一些实施方案中，将荧光标记与液相色谱和/或质谱一起使用以检测聚糖。许多有机分子(例如聚糖)在小于210nm的波长处展现出强的UV吸光度，因此允许设置为200nm的检测器在某种程度上充当“通用”检测器。荧光远不及紫外线吸光度常见。因此，在一些实施方案中，给定含有一定量的不需要的物质或杂质的样品，荧光检测只能测量带标签或标记的分子，从而克服了背景或选择性的问题。在一些实施方案中，荧光检测器可以增强聚糖分析的选择性。
在一些实施方案中，将从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)的样品用荧光标记来标记，并且与未标记的聚糖样品相比，检测到更多种类的聚糖。在一些实施方案中，将聚糖样品用荧光标记来标记，并且与未标记的聚糖的样品相比，在样品中检测到多至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、或者至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍种类的聚糖。
在某些实施方案中，从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)的样品用荧光标记来标记，并且以比未标记的聚糖更高的灵敏度检测聚糖。在某些实施方案中，与当N-聚糖未标记时相比，当将N-聚糖标记时检测的灵敏度增加了至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、或者至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍或至少100倍。
在一些实施方案中，将样品中的聚糖用荧光标记选择性地标记，并用与荧光检测偶联的液相色谱评估样品。在一些实施方案中，将聚糖选择性地标记，以致于在样品中仅聚糖含有附接的标记。在某些实施方案中，将聚糖选择性地标记，以致于与非聚糖的样品部分(例如杂质，如蛋白质)相比，至少2倍、5倍、10倍、50倍、100倍、1,000倍、2,000倍、5,000倍、10,000倍、50,000倍、100,000倍、250,000倍、500,000倍、1,000,000倍或更多的聚糖被标记。
c.质谱
在各种实施方案中，方法包括使一部分的聚糖混合物进行质谱技术分析。质谱(MS)最简单的定义是根据其质荷比(m/z)分开的离子的产生和检测。对此类离子的检测产生质谱图，所述质谱图是离子的相对丰度随其m/z比变化的图。用于分析聚糖的两种最广泛使用的MS电离技术是基质辅助激光解吸/电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)；在两种技术中，游离聚糖通常在正离子模式下检测为金属(通常为钠)加合物，并且在负离子模式下检测为去质子化或阴离子加合的物质。能以其质子化或去质子化形式检测聚糖。MALDI和ESI都是软电离技术，即，电离过程几乎不提供过多的能量，并且因此产生很少或不产生聚糖碎片，以致于可以容易地观察到完整的分子离子。然而，不稳定基团(尤其是唾液酸和岩藻糖)的迅速丧失可能发生，并且特别是在定量研究中应当评估其发生的程度。MALDI-MS和ESI-MS均可以用于获得总体聚糖谱。
本发明的方法可以用多种质谱仪器和技术来执行，包括但不限于基质辅助激光解吸/电离质谱飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)、MALDI-TOF-TOF-MS、液相色谱质谱联用(LC-MS)、液相色谱串联质谱联用(LC-MS/MS)、或直接注入式电喷雾电离质谱(ESI-MS)。在一些实施方案中，通过MALDI-MS或ESI-MS分析或通过包括MALDI-MS或ESI-MS分析的方法来检测N-聚糖。
在特定实施方案中，使用高分辨率质谱仪来检测N-聚糖。在一些实施方案中，质谱仪的分辨率大于50amu、25amu、10amu、5amu、1amu、0.5amu或0.1amu。在某些实施方案中，质谱仪的分辨率大于1amu。
在一些实施方案中，进行质谱而无需先前通过液相色谱分离。在特定实施方案中，检测聚糖而无需先前通过液相色谱、然后表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-MS)或基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)分离。在一些实施方案中，检测聚糖而无需先前通过液相色谱、然后MALDI-MS分离。
MALDI是使用激光能量吸收基质从具有最小碎片化的大分子中产生离子的一种电离技术。它已应用于分析生物分子(生物聚合物，如DNA、蛋白质、肽和糖)和大有机分子(如聚合物、树状聚合物和其他大分子)，其当通过更常规的电离方法电离时趋向于易碎且破碎。它的特点与电喷雾电离(ESI)类似，因为尽管MALDI通常产生少得多的多电荷离子，但这两种技术都是以气相获得大分子离子的相对软(低碎片化)的方式。在某些实施方案中，通过MALDI-MS检测样品(例如表面表达的聚糖的样品)中的聚糖。在一些实施方案中，聚糖是N-聚糖。
在某些实施方案中，液相色谱-质谱(LC-MS)是将液相色谱(或HPLC)的物理分离能力与质谱(MS)的质量分析能力组合的一种分析化学技术。在一些实施方案中，因为每种技术的单独能力都协同增强，采用了偶联的色谱-MS(LC-MS)***。尽管液相色谱将具有多种组分的混合物分开，但质谱以高分子特异性和检测灵敏度提供单独组分的结构身份。在一些实施方案中，通过液相色谱(例如HILIC HPLC)、随后质谱检测聚糖。在一些实施方案中，质谱是电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱。
在某些实施方案中，在通过液相色谱分选之后，通过ESI-MS检测聚糖(例如N-聚糖)。在此类实施方案中，通过液相色谱(例如，用荧光检测)分析提供N-聚糖种类的相对丰度的信息，例如，通过计算与单独聚糖对应的曲线下面积，并将其表示为与聚糖对应的所有曲线的总面积的比率或百分比。在某些实施方案中，可以使用标准品来确定样品中存在的聚糖量。在某些实施方案中，LC(例如HILIC)与质谱仪是联机的。在一些实施方案中，质谱仪测量N-聚糖的精确质量，从而允许鉴定与通过LC检测到的峰对应的聚糖。在一些实施方案中，通过LC-MS评估聚糖(例如N-聚糖)的存在、不存在或量。
在特定实施方案中，通过LC-ESI-MS检测已经从细胞表面去除的聚糖(例如N-聚糖)。ESI是用于质谱中以使用电喷雾(其中向液体施加高压以产生气溶胶)产生离子的一种技术。在一些实施方案中，ESI可用于通过克服大分子在电离时破碎的倾向从这些分子中产生离子。ESI与其他大气压电离过程(例如MALDI)不同，因为它可能产生多个带电离子，有效地扩展了分析器的质量范围以适应在蛋白质及其相关多肽片段中观察到的kDa-MDa数量级。
在某些实施方案中，质谱是串联质谱(串联MS或MS/MS)。在特定实施方案中，MALDI-TOF-MS、MALDI-TOF-TOF-MS、LC-MS和/或ESI-MS技术使用串联MS进行和/或使用串联MS技术进行。在特定实施方案中，串联MS涉及超过一个步骤的质量选择或分析，并且通常在步骤之间诱导碎片化。在一些实施方案中，使用和/或采用串联质谱进行聚糖鉴定、定量和/或检测。第一质量分析器(即第一阶段MS)分离出代表了引入到离子源中并且然后从离子源中出现的许多聚糖中的单一聚糖种类的具有特定m/z值的离子。然后将那些离子(例如电离的聚糖粒子)破碎，例如加速进入含有惰性气体如氩气的碰撞池中以诱导离子碎片化。此过程被命名为“碰撞诱导解离”(CID)或“碰撞激活解离”(CAD)。然后，在第2质量分析器(即第二阶段MS)中测量破碎离子(例如电离的聚糖碎片)的m/z值，以获得结构信息。在特定实施方案中，通过串联MS来鉴定、定量和/或检测聚糖。
有几种类型的串联质谱仪，包括三阶段四极杆(TSQ)、3D和线性离子阱、四极杆/飞行时间(QTOF)杂合仪器、四极杆-线性离子阱杂合仪器(QTRAP)和飞行时间-飞行时间(TOF/TOF)仪器。使用3D或线性四极杆离子阱，串联质谱也可以随时间在单个质量分析器中执行，并且在这些仪器中，此过程可以重复超过一次，以产生MSn光谱。这些仪器通过共振激发实现破碎，所述共振激发诱导与能量足够高的捕集阱浴气体(氦气)的碰撞以诱导碎片化。上面提到的其他仪器在碰撞池中采用CID。可以用于破碎分子进行串联MS的其他方法包括电子捕获解离(ECD)、电子转移解离(ETD)、红外多光子解离(IRMPD)和黑体红外辐射解离(BIRD)(9)。
在一些实施方案中，粒子在第一阶段和第二阶段MS之间破碎。在特定实施方案中，碎片化是源内碎片化、碰撞诱导碎片化、碰撞诱导解离、电子捕获解离、电子转移解离、负电子转移解离、电子脱离解离、电荷转移解离、光解离、红外多光子解离、黑体红外辐射解离、表面诱导解离。
在特定实施方案中，MS是串联MALDI-MS(MALDI-MS/MS)或串联ESI-MS(ESI-MS/MS)。在某些实施方案中，通过串联MALDI-MS或串联ESI-MS分析或通过包括串联MALDI-MS或串联ESI-MS分析的方法来定量、检测和/或鉴定N-聚糖。
4.谱和图
本文提供了用于评估和/或分析含有聚糖的样品(例如含有从细胞组合物(例如测试细胞组合物)释放的表面N-聚糖的样品)的方法。在特定实施方案中，通过确定一种或多种聚糖(例如N-聚糖)的存在、不存在、水平、相对丰度和/或量来评估或分析样品。在一些实施方案中，一种或多种聚糖(例如N-聚糖)是在样品中检测到的聚糖的细胞表面谱的一部分。在一些实施方案中，细胞表面谱指示一个或多个不同种类的N-聚糖的存在、不存在、水平、相对丰度和/或量。在一些方面，所述一个或多个不同种类可以包括表E1中列出的任何种类或其亚组。在一些实施方案中，不同聚糖的种类数量大于或大于约5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、300个、400个、500或更多个不同的种类。
在一些方面，所述一个或多种不同种类的N-聚糖包括例如高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
在一些方面，N-聚糖的一个或多个不同种类包括例如不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
在一些实施方案中，对样品评估靶聚糖或一种或多种靶聚糖的存在、不存在、水平、相对丰度和/或量。在某些实施方案中，对至少10个、至少20个、至少25个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少125个、至少150个、至少175个、至少200个、至少225个、至少250个、至少300个、至少400个或超过500个不同聚糖种类评估或分析例如聚糖的存在、不存在、相对水平或量。
在一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖是其在细胞表面上的存在、不存在、水平、相对丰度和/或量与一种或多种功能和/或表型活性相关的那些。在一些情况下，所述一种或多种靶聚糖是与以下活性形式相关或可能影响(affect或impact)或改变以下活性形式的靶聚糖：细胞表面标记的掩蔽、代谢活性、分化状态、增殖或扩增能力、激活状态、细胞溶解活性、信号传导活性、粘附特性或归巢特性。
在一些方面，所述一个或多个不同种类可以包括表E1中列出的任何种类或其亚组。在一些实施方案中，不同聚糖的种类数量大于或大于约5个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、300个、400个、500或更多个不同的种类。
在一些方面，所述一个或多种不同种类的N-聚糖包括例如高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
在一些方面，N-聚糖的一个或多个不同种类包括例如不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。在一些实施方案中，本文提供的方法允许检测聚糖群体内的单独聚糖种类的相对水平。例如，在一些实施方案中，液相色谱每个峰下的面积可以测量并表示为占总体的百分比。这样的分析提供了每个聚糖种类在表面表达的聚糖群体内的相对百分比量。
在某些实施方案中，本文提供的方法有助于检测在样品(例如含有表面表达的N-聚糖的样品)中以非常低的水平存在的聚糖。在某些实施方案中，可以检测和/或定量在聚糖群体内以小于约10％、5％、4％、3％、2％、1.5％、1％、0.75％、0.5％、0.25％、0.1％、0.075％、0.05％、0.025％、0.01％、0.001％、0.0001％、或0.00001％的水平存在的聚糖的水平。在一些实施方案中，可以检测和/或任选地定量构成样品总聚糖的0.1％与10％之间、0.0001％与0.1％之间、0.1％与1％之间、1％与5％之间、0.00001％与1％之间、0.1％与2％之间、或0.1％与1％之间的聚糖的水平。
在一些实施方案中，本文所述的方法允许检测在表面表达的聚糖(例如N-聚糖)的样品内以低水平存在的特定连接。例如，在一些实施方案中，本发明方法允许检测以占表面表达聚糖群体的小于10％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.75％、小于0.5％、小于0.25％、小于0.1％、小于0.075％、小于0.05％、小于0.025％、小于0.01％、小于0.001％、小于0.0001％、或小于0.00001％的水平存在的特定连接。
在某些实施方案中，可以确定谱内的单独聚糖的身份。特定实施方案预期单独的聚糖种类的身份可以容易地例如从分析结果中鉴定，例如通过HPLC、UPLC、外切糖苷酶测序和质谱(MALDI-MS、ESI-MS、ESI-MS/MS、LC-MS、LC-ESI-MS/MS)进行分析。在一些实施方案中，可以通过使用参考数据库来确定一种或多种聚糖的身份。基于从技术(包括但不限于HPLC、UPLC、外切糖苷酶测序和质谱(MALDI-MS、ESI-MS、ESI-MS/MS、LC-MS、LC-ESI-MS/MS)数据)中获得的信息，多种数据库可用于帮助确定聚糖身份和/或聚糖结构。在一些实施方案中，合适的数据库包括但不限于GlycoBase(glycobase.nibrt.ie/glycobase/show_nibrt.action)；Glycosciences(Glycosciences.de)；UniCarbKB(unicarbkb.org)；UniCarbDB(unicarb-db.biomedicine.gu.se)；SugarBindDB(sugarbind.expasy.org)，和Expasy(expasy.org/glycomics)。
在特定实施方案中，本文提供的方法允许分析和/或评估样品中的表面聚糖。在某些实施方案中，本文提供的方法允许检测、鉴定和/或定量在样品中以在约0.1fmol至约1mmol之间的量存在的细胞表面聚糖的水平。在特定实施方案中，通过本文提供的方法可以检测、鉴定和/或定量以至少10amol、至少100amol、至少500amol、至少1fmol、至少5fmol、或至少10fmol的在聚糖样品中存在的聚糖种类的量存在于样品中的聚糖。
C.检测物质
在某些实施方案中，将本文提供的方法用于检测在细胞组合物中和/或在从细胞组合物收集的样品中一种或多种物质(例如残留物质)的存在、不存在、可能存在的一种或多种物质(例如残留物质)的身份或水平。在某些实施方案中，所述物质为任何是或包括一种或多种聚糖的化合物、组分、材料或物质。在特定实施方案中，所述物质是活生物体或由活生物体生产、产生、表达、和/或合成。在某些实施方案中，所述物质是或包括核酸、蛋白质和/或脂质部分。在特定实施方案中，所述物质是或包括一种或多种蛋白质，例如糖蛋白。
在一些实施方案中，用于检测细胞组合物中一种或多种物质的存在、不存在、身份和/或水平的方法是或包括从细胞组合物和/或从收集自细胞组合物的样品产生表面N-聚糖谱。在某些方面，通过以下方式来指示物质(例如残留物质)的存在：鉴定和/或检测例如在表面聚糖谱内对细胞组合物中的细胞是外源的、非天然的和/或不通过细胞组合物中的细胞生产的聚糖。
在某些实施方案中，非天然和/或外源的聚糖对组合物的细胞而言不是天然的，例如，聚糖不由细胞产生、合成和/或生产和/或未附接或结合至由组合物的任何细胞表达和/或合成的蛋白质上。在某些实施方案中，对细胞而言天然的聚糖是由细胞合成的聚糖。在一些方面，聚糖(例如N-聚糖)生物合成发生在ER和高尔基体中，并且在一些方面，包括装配寡糖并在转位到ER中期间转移至蛋白质(如分泌或膜蛋白)的氨基酸残基(例如Asn)。在一些实施方案中，聚糖生物合成是或包括例如通过ER腔中的糖苷酶和糖基转移酶进一步处理，并且在一些方面，在高尔基体中继续。在某些实施方案中，如果聚糖例如在ER或高尔基体处、附近或之内不由细胞和/或不在细胞内合成，则聚糖对细胞而言是非天然的或外源的。
在某些实施方案中，非天然和/或外源聚糖不在来自与组合物的细胞相同的界、门、纲、目、科、属和/或种的细胞表面上产生、表达或以其他方式存在，和/或不与在来自与组合物的细胞相同的界、门、纲、目、科、属和/或种的细胞表面上的蛋白质结合。特定实施方案预期对于给定物种(例如人)，可以按常规方式鉴定外源和/或非天然聚糖。例如，在某些实施方案中，单独内源聚糖的糖基化和身份在不同的界、门、纲、目、科、属和/或种或生物体之间变化。在一些方面，真核细胞享有通过N-糖基化修饰蛋白质的能力。在一些实施方案中，真核细胞中的N-糖基化的第一步骤发生在内质网(ER)中。在某些方面，ER的糖基化机制在所有物种之间是高度保守的，并导致常见Man3GlcNAc2核心结构的生物合成。特定实施方案预期N-聚糖核心的进一步修饰发生在高尔基体装置中，因此糖基化库在物种之间变化。例如，在某些实施方案中，酵母表达在不同连接中具有多达100个甘露糖残基的高甘露糖聚糖结构。在一些实施方案中，在昆虫细胞蛋白上发现的N-聚糖属于代表核心结构的寡甘露糖苷类型，通过添加另外的甘露糖、岩藻糖和半乳糖残基进一步修饰。高等植物甚至合成很大部分的具有两个触角的复合型聚糖，并且非人免疫原性木糖残基以高频率出现。相比之下，动物主要表达多触角复合型N-聚糖，并在聚糖链的最外面位置携带唾液酸。但是，在某些方面，人不合成两个主要哺乳动物聚糖表位，Gala1-3Gal(α-Gal)和N-羟乙酰基神经氨酸(Neu5Gc)。在一些方面，人一般和/或通常具有针对这些结构的抗体。在一些实施方案中，非天然和/或外源聚糖不是哺乳动物聚糖，例如哺乳动物细胞不表达或合成的聚糖。在某些实施方案中，聚糖不是人聚糖，例如不由人细胞如健康人细胞和/或非癌性人细胞和/或非致瘤性人细胞产生的聚糖。
在一些实施方案中，外源和/或非天然聚糖来自与细胞组合物的细胞相同的物种，由与细胞组合物的细胞相同的物种产生和/或合成。例如，特定实施方案预期在同一物种内，不同谱系、组织和/或成熟阶段的细胞可以表达或合成一种或多种不同的聚糖。因此，在一些实施方案中，外源和/或非天然聚糖由与细胞组合物中的细胞相同的物种但不同细胞类型的细胞产生。在一些实施方案中，非天然聚糖由相同物种的细胞但不由免疫细胞表达和/或合成。在特定实施方案中，非天然聚糖由人细胞但不由人免疫细胞表达和/或合成。在一些实施方案中，非天然聚糖由人细胞但不由人T细胞表达和/或合成。
在一些实施方案中，非天然和/或外源聚糖的来源是蛋白质，例如糖蛋白。在特定实施方案中，糖蛋白可以包括但不限于抗体和/或其片段或变体、MHC分子和/或其片段或变体、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体、Fc融合蛋白和/或白细胞介素。在一些实施方案中，糖蛋白存在于溶液、培养基和/或血清中。在一些实施方案中，糖蛋白是重组蛋白。在一些实施方案中，蛋白质不是天然的、不是内源的、和/或不由细胞组合物的细胞表达。
在特定实施方案中，非天然和/或外源蛋白的来源是已经与组合物细胞的一种或多种蛋白质(例如糖蛋白)接触和/或暴露于组合物细胞的一种或多种蛋白质(例如糖蛋白)。在一些实施方案中，在产生、生产和/或工程化细胞组合物的过程期间，所述一种或多种蛋白质已经与细胞接触和/或暴露于细胞。在一些方面，在所述细胞的培养期间和/或在诸如工程化、激活、刺激、转导、转染、培育或扩增细胞例如以生产或工程化细胞组合物期间，所述一种或多种蛋白质已经与细胞一起添加、与细胞接触或与细胞一起孵育。
在一些实施方案中，外源和/或非天然聚糖的来源是血清，例如在血清内发现的一种或多种蛋白质。在一些方面，血清通常用作细胞培养基的补充。在特定方面，将血清用于提供广谱大分子、类脂物质和恒量元素的载体蛋白、附接和扩散因子、低分子量营养素、激素和生长因子中的一种或多种。在某些实施方案中，血清是动物血清。在某些实施方案中，非天然和/或外源聚糖的来源是或包括胎牛血清(FBS)、牛犊血清(BCS)、新生牛血清(NBCS)、马血清、山羊血清、羔羊血清、驴血清或猪血清。在一些方面，动物血清是胎牛血清(FBS)。在一些实施方案中，聚糖的来源是血清和/或在血清中存在的蛋白质(例如糖蛋白)。在一些实施方案中，检测到非天然和/或外源聚糖指示细胞组合物内的残留血清蛋白。
在一些实施方案中，非天然和/或外源聚糖的来源是重组蛋白。在一些方面，可以将重组蛋白作为血清替代物和/或血清替代品的组分添加。在特定实施方案中，外源和/或非天然聚糖的来源是血清替代物和/或血清替代品。在特定实施方案中，定义了血清替代物和/或血清替代品，例如含有已知身份和量的蛋白质(例如重组蛋白)。在一些实施方案中，检测到非天然和/或外源聚糖指示细胞组合物内的残留重组蛋白。
在一些实施方案中，外源和/或非天然聚糖的来源是微生物或病毒。在某些方面，病毒、酵母、霉菌、支原体含有和/或表达糖蛋白。在一些实施方案中，检测到外源和/或非天然糖蛋白指示细胞组合物中微生物的存在。在一些实施方案中，外源和/或非天然聚糖的来源是由与细胞组合物的细胞不同的细胞(例如细胞系的细胞)表达或合成的糖蛋白。在某些实施方案中，检测到外源和/或非天然聚糖指示被其他细胞类型和/或细胞系交叉污染。
在一些实施方案中，例如通过分析从细胞组合物或从细胞组合物获得的样品产生的表面聚糖谱确定的非天然和/或外源聚糖的存在、鉴定和/或定量与细胞组合物中一种或多种物质(例如残留物质)的存在、量和/或身份对应、相关，和/或指示细胞组合物中一种或多种物质(例如残留物质)的存在、量和/或身份。在一些实施方案中，检测到非天然和/或外源聚糖指示细胞组合物内的物质(例如残留物质)。在一些实施方案中，非天然和/或外源聚糖是物质和/或残留物质。在某些实施方案中，所述物质和/或残留物质是含有(例如共价结合至)非天然和/或外源聚糖的蛋白质(例如糖蛋白)。在特定实施方案中，所述物质是或包括微生物或由微生物产生的物质，所述微生物表达和/或合成、和/或能够表达和/或合成非天然和/或外源聚糖。
在一些方面，在细胞样品中存在的物质(例如残留物质)的水平和/或量是通过测量聚糖的量和/或水平(例如通过本文提供的任何方法)来确定的。在一些实施方案中，将聚糖的量或水平定量为样品中占总聚糖的百分比。例如，在一些实施方案中，本文提供的方法允许检测聚糖群体中单独非天然或外源聚糖种类的相对水平。在特定实施方案中，液相色谱的对应于(例如指示)一种或多种非天然聚糖的一个或多个峰下的面积可以测量并表示为占检测到的总聚糖的百分比。这样的分析提供了在检测到的聚糖的总群体中外源和/或非天然聚糖种类的相对百分比量。在某些实施方案中，例如当聚糖的总量已知时，可以计算聚糖的总量或浓度。
在一些实施方案中，将聚糖谱，例如从细胞组合物或从细胞组合物获得的样品产生的表面聚糖谱与参考样品的聚糖谱进行比较。在一些实施方案中，参考样品是或含有溶液、培养基和/或血清中的一种或多种。在某些实施方案中，溶液、培养基和/或血清与或已经与细胞组合物的细胞接触、用或已经用细胞组合物的细胞处理、与或已经与细胞组合物的细胞一起孵育、和/或暴露或已经暴露于细胞组合物的细胞。在某些实施方案中，参考样品是或包括溶液、培养基和/或血清的新鲜样品，例如，在暴露于细胞之前从溶液、培养基或血清中取得或从尚未暴露于细胞的单独等分试样或容器取得的样品。在特定实施方案中，从参考样品产生的聚糖谱中发现的聚糖的存在指示外源和/或非天然聚糖的存在。在某些实施方案中，参考样品中的外源和/或非天然聚糖的存在指示样品的来源是所述物质和/或残留物质、可能是所述物质和/或残留物质、或是所述物质和/或残留物质的候选来源。
特定实施方案预期在一些情形中，可以将外源和/或非天然聚糖掺入细胞组合物的一种或多种细胞的细胞表面聚糖中。在某些情况下，外源和/或非天然聚糖被修饰和/或改变，并被掺入一种或多种细胞的细胞表面聚糖中。因此，在一些实施方案中，在来源(例如溶液、培养基和/或血清)中存在的非天然和/或外源聚糖在其接触细胞组合物或以其他方式暴露于细胞组合物时被修饰。在此类实施方案中，当存在于细胞组合物中时，外源和/或非天然聚糖在来源(例如溶液、培养基和/或血清)中的身份是不同的外源和/或非天然聚糖。因此，在一些情形中，来自特定来源的外源或天然聚糖可能存在于从细胞组合物或从细胞组合物的样品获得的表面聚糖谱中，但不存在于从取自特定来源的参考样品产生的聚糖谱中。在一些实施方案中，可以按常规方式设计和进行对照实验，以鉴定已经掺入细胞的细胞表面聚糖中的非天然和/或外源聚糖。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于验证物质已从细胞冲洗、洗涤或去除掉。在一些方面，本文提供的方法可以用于比较细胞培养条件和/或过程(例如工程化过程)，以优化可能由所述条件或过程产生(例如通过残留蛋白)的物质和/或残留物质的去除。在某些实施方案中，从在过程(例如工程化过程)的不同阶段中取得的样品产生表面聚糖谱，以确定是否在过程的一个或多个阶段中引入了物质。
II.细胞组合物
在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于评估一种或多种细胞组合物的表面聚糖(例如N-聚糖)的表达，以确定或评估在细胞表面上一种或多种聚糖(例如N-聚糖)的存在、不存在或存在的水平，例如根据上述所提供的任何方法。在一些实施方案中，被评估的组合物是测试细胞组合物，所述测试细胞组合物是另一种组合物(如源组合物)的一部分。在一些实施方案中，所提供的方法可以用于评估或分析一种或多种聚糖在组合物细胞表面上的存在、不存在、量、水平和/或相对丰度。
在特定实施方案中，此类信息可以用于评估或评价可能影响细胞的功能和/或表型特征(例如与细胞表面标记的掩蔽、代谢活性、分化状态、增殖或扩增能力、激活状态、细胞溶解活性、信号传导活性、粘附特性或归巢特性中的一种或多种有关)的糖基化变化。在一些方面，可以将关于来自组合物细胞的聚糖谱的信息与参考样品(例如参考标准品或来自参考组合物的其他样品)进行比较，以评价组合物的释放标准，评价例如在一种或多种药剂或条件的存在下孵育后在组合物中发生的变化或差异，和/或评价通过基本相同的方法生产的许多相同组合物之间和之中的相似性和/或差异，或评价来自不同来源和/或通过不同的方法生产或制造的组合物之间和之中的相似性或差异。
在一些实施方案中，有关表面聚糖谱(例如一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平)的信息可以用于筛选细胞组合物上一种或多种测试剂或条件的过程中。在一些实施方案中，此类方法包括在如所述的一种或多种测试剂或条件的存在下孵育输入组合物。在一些实施方案中，将来自细胞组合物或其部分(例如测试细胞组合物)的样品的表面聚糖谱(例如一种或多种表面聚糖的存在、不存在、身份和/或水平)孵育并与参考样品(如参考标准品)进行比较。在一些实施方案中，如果比较表明样品的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种与参考样品(例如参考标准品)基本上相同，和/或如果比较表明包含一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％，则选择一种或多种测试剂或条件来孵育或处理细胞。
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用于评估细胞组合物中的表面聚糖表达(例如一种或多种表面聚糖的存在、不存在、身份和/或水平)，例如来将所述组合物的表面聚糖表达与另一种细胞组合物进行比较。在一些实施方案中，将含有从细胞组合物(例如测试细胞组合物)释放的一种或多种表面聚糖的样品与参考样品和/或与从参考组合物释放的表面聚糖的样品进行比较。
在特定实施方案中，可以评估一种或多种靶聚糖的存在、不存在、相对量(即占总表面聚糖的百分比)或量。在一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖可以是聚糖的种类、家族或组。在一些实施方案中，可以评估或比较表E1中列出的任何聚糖。在一些方面，评估和/或比较至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖。在一些实施方案中，一种或多种靶聚糖是或包含高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。在一些实施方案中，所述一种或多种靶聚糖是或包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
在一些实施方案中，可以将细胞组合物的表面聚糖谱与表达不同重组受体的细胞的组合物进行比较。在某些实施方案中，可以将表面聚糖组合物与不表达重组受体的细胞的组合物进行比较。在一些实施方案中，可以将表面聚糖组合物与通过不同过程产生和/或通过涉及在一种或多种特定药剂或条件的存在下孵育的过程产生的细胞的组合物进行比较。在一些实施方案中，将细胞组合物的表面聚糖谱与来自用于生产细胞组合物的制造过程的不同阶段或步骤的不同细胞组合物进行比较，所述不同阶段或步骤例如为用于生产细胞组合物的制造过程的较早或先前阶段或步骤。
在某些实施方案中，评估细胞组合物的表面聚糖表达谱并将其与参考样品进行比较。在本文所述的一些实施方案中，参考样品也被称为参考标准品。例如，在一些实施方案中，如与不同细胞的组合物相比，相对于不同聚糖种类、聚糖类型和/或聚糖家族的表面表达水平，细胞组合物(例如治疗性细胞组合物)可能具有不同的表面聚糖表达谱。因此，在一些实施方案中，可以通过评估多种细胞组合物来产生参考标准品。在一些实施方案中，这样的参考标准品可以用作细胞组合物的质量控制和/或用于细胞组合物的释放测定，或者用于监测或控制细胞组合物的制造或培养。
在某些实施方案中，通过评估含有相似或相同细胞组合物的几种不同细胞组合物来产生表面聚糖表达的参考标准品。例如，在一些实施方案中，表面聚糖表达谱是从在相同制造过程的不同批次下制造以产生参考标准品的工程化细胞的两种或更多种组合物获得。在一些实施方案中，表面聚糖表达谱是从在制造工程化细胞以产生参考标准品的过程的相同阶段收集的细胞的两种或更多种组合物获得。在一些实施方案中，参考标准品是关于特定聚糖种类的假设参考标准品值或值的范围。在一些实施方案中，假设参考标准品是基于来自相关或相似过程的数据或参考样品。在某些方面，可以共享来自相关过程的数据，以致于可以产生适用于无数不同但相似的过程的参考值范围。在一些实施方案中，参考标准品源自示例性过程，其他测试过程与示例性过程进行比较的。在一些实施方案中，参考标准品是在由所述过程生产的多种组合物中一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
在特定实施方案中，通过计算至少一个种类的聚糖、至少一个家族的N-聚糖、或至少一个类型的N-聚糖的平均值或中值产生参考样品。在某些实施方案中，参考标准品是一个类型的聚糖的中值或平均表达水平。在某些实施方案中，参考标准品是或包括寡甘露糖、复合N-聚糖和/或杂合N-聚糖的平均或中值水平。在某些实施方案中，参考标准品是或包括具有高甘露糖含量的N-聚糖、平分型和/或唾液酸化路易斯X N-聚糖、和/或含N-乙酰乳糖胺的N-聚糖的平均或中值表达水平。在一些实施方案中，参考标准品是A2家族、A2F家族、A3家族、A4家族和寡甘露糖家族聚糖的平均或中值表达水平。在一些实施方案中，参考标准品是至少1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、125个、150个、200个、300个、400个或至少500个聚糖种类的平均或中值表达水平。在一些实施方案中，参考标准品是从至少两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、大于十种、大于二十种或大于五十种细胞组合物的表面聚糖表达谱计算的。
A.细胞
在一些实施方案中，细胞组合物，例如源组合物或其部分，如测试细胞组合物，包含细胞群。可以根据所提供的方法评估含有细胞的任何组合物。在一些实施方案中，细胞群是或包含细胞系或原代细胞。在一些实施方案中，细胞群是或包含原代细胞，如获自受试者(例如人受试者)的原代细胞。在一些实施方案中，细胞群是或包含干细胞，如诱导多能干细胞。在一些实施方案中，细胞组合物，例如源组合物或其部分，如测试细胞组合物，是与制造细胞组合物的过程相关(包括与具有重组核酸的工程化细胞有关)的组合物。在一些实施方案中，细胞组合物是药物组合物。
在某些实施方案中，细胞是或包括真核细胞。在某些实施方案中，细胞组合物的细胞是动物细胞。在一些实施方案中，组合物的细胞是哺乳动物细胞。在某些实施方案中，细胞是小鼠细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞或非人灵长类细胞。在一些实施方案中，细胞是人细胞。
在一些实施方案中，细胞是细胞系的细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、由5V40转化的猴肾CV1系(C057)；人胚肾细胞系293；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞托利细胞(TM4)；猴肾细胞(CVI-76)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT)；大鼠肝癌细胞(HTC)；HIH/3T3细胞，和TRI细胞。对于哺乳动物细胞系的广泛列表，本领域技术人员可以参考美国典型培养物保藏中心目录(ATCC，弗吉尼亚州马纳萨斯(Mamassas,VA))。在一些实施方案中，细胞可以属于多个细胞类型，例如成纤维细胞、成肌细胞、巨噬细胞或上皮细胞。
在特定实施方案中，组合物的细胞是或包括干细胞。在某些实施方案中，细胞组合物的细胞是多能干细胞、多潜能干细胞、寡能干细胞和/或单能干细胞。在特定实施方案中，细胞是诱导的，例如诱导多能干细胞(ipsc)。在特定实施方案中，组合物的细胞是例如正在重新编程(例如朝着多能性)过程中的细胞。在一些实施方案中，细胞是处于分化过程中的干细胞。
在一些实施方案中，组合物的细胞是免疫细胞。在特定实施方案中，细胞组合物含有T细胞、B细胞和/或NK细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞组合物的细胞是CD3+T细胞。在一些实施方案中，细胞是CD4+T细胞。在某些实施方案中，细胞是CD8+T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞和抑制T细胞中的一种或多种。在一些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在某些实施方案中，评估了原代细胞的表面聚糖。在一些实施方案中，细胞组合物含有原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。
在一些实施方案中，组合物的一种或多种细胞是工程化细胞。在一些情况下，所述一种或多种细胞被工程化以含有重组核酸，例如含有异源核酸和/或表达异源蛋白质。在一些实施方案中，重组核酸编码重组蛋白。在一些情况下，重组蛋白可以是期望由重组细胞组合物表达或产生的任何蛋白质。在一些实施方案中，重组蛋白是重组受体。在一些实施方案中，重组核酸是或包括被转入或引入细胞中以表达重组蛋白的病毒载体，例如慢病毒或逆转录病毒载体。
B.示例性工程化细胞
在某些实施方案中，工程化细胞含有编码重组受体的异源多核苷酸。在一些实施方案中，重组受体是嵌合受体或抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在某些实施方案中，如第III部分所述生产、制造和/或产生工程化细胞。
在一些实施方案中，组合物中的全部或部分细胞含有或被工程化以含有工程化受体，如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。在特定实施方案中，组合物中的全部或部分细胞表达工程化受体。在一些实施方案中，含有工程化细胞的组合物富含此类细胞。在某些实施方案中，富集或选择某种类型的细胞，如T细胞或CD8+或CD4 T细胞。在特定实施方案中，细胞组合物是治疗性细胞组合物和/或药物细胞组合物，例如用于过继细胞疗法。
1.嵌合抗原受体(CAR)
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用于评估细胞组合物的表面聚糖表达，所述细胞包括通常表达重组受体的细胞或由其构成，所述重组受体例如为抗原受体，包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR)，以及其他抗原结合受体，如转基因T细胞受体(TCR)。受体还包括其他嵌合受体。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US2013287748、US 20130149337、美国专利号：6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.,3(4):388–398(2013)；Davila等人PLoS ONE 8(4):e61338(2013)；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,24(5):633-39(2012)；Wu等人,Cancer,18(2):160-75(2012)。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR，和国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如任何前述出版物中所披露的CAR，例如WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282、Kochenderfer等人,NatureReviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人,J.Immunother.35(9):689-701(2012)；以及Brentjens等人,Sci Transl Med,.5(177)(2013)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US2013/0149337、美国专利号：7,446,190和美国专利号：8,389,282。嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区域和/或可变轻(VL)链区域，例如scFv抗体片段。
在一些实施方案中，在含有表达靶向抗原的重组受体(例如CAR)的细胞的细胞组合物中评估N-聚糖的表面表达，并且由受体靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，抗原是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞例如肿瘤细胞或致病细胞上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。在一些实施方案中，嵌合受体靶向的抗原包括在通过过继细胞疗法靶向的疾病、病症或细胞类型的情况下表达的抗原。在一些实施方案中，将标记试剂和/或衍生化试剂在为甲酰胺的溶剂的存在下与聚糖接触、用聚糖处理和/或与聚糖一起孵育。所述疾病和病症包括增殖性、肿瘤性和恶性疾病和障碍，包括癌症和肿瘤，包括血液癌、免疫***癌症，如淋巴瘤、白血病和/或骨髓瘤，如B型白血病、T型白血病和骨髓性白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。
在一些实施方案中，表面聚糖从含有表达与抗原结合的重组受体(例如CAR)的细胞的细胞组合物中释放。可以被受体靶向的抗原包括但不限于αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、***受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、***特异性抗原、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、以及病原体特异性或病原体表达的抗原、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，CAR对病毒抗原(如HIV、HCV、HBV等)、细菌抗原和/或寄生虫抗原具特异性。
在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或VH结构域)特异性地识别抗原，如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自特异性地结合CD19的抗体或抗原结合片段，或者是特异性地结合CD19的抗体或抗原结合片段的变体。
在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自FMC63。FMC63通常是指针对表达人源CD19的Nalm-1和-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.,等人(1987).Leucocytetyping III.302)。FMC63抗体包含SEQ ID NO:29所示的CDR H1；SEQ ID NO:30所示的CDRH2；SEQ ID NO:31或45所示的CDR H3；以及SEQ ID NO:26所示的CDR L1；SEQ ID NO:27或46所示的CDR L2；和SEQ ID NO:28或45所示的CDR L3。FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，scFv包含：含有SEQ ID NO:26的CDR L1序列、SEQ ID NO:28的CDR L2序列、和SEQ ID NO:28的CDR L3序列的可变轻链，和/或含有SEQ ID NO:29的CDR H1序列、SEQ IDNO:30的CDR H2序列、和SEQ ID NO:31的CDR H3序列的可变重链，或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的任何前述的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:32所示的FMC63的可变重链区和SEQ ID NO:33所示的FMC63的可变轻链区，或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的任何前述的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:58所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:25至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:34至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv和/或VH结构域源自SJ25C1。SJ25C1是指针对表达人源CD19的Nalm-1和-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.,等人(1987).Leucocytetyping III.302)。SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:38-40分别所示的CDR H1、H2和H3，以及SEQID NO:35-37分别所示的CDR L1、L2和L3序列。SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。在一些实施方案中，svFv包含：含有SEQ ID NO:35所示的CDR L1序列、SEQ ID NO:36所示的CDR L2、和SEQ ID NO:37所示的CDR L3的可变轻链；和/或含有SEQ ID NO:38所示的CDR H1、SEQ IDNO:39所示的CDR H2、和SEQ ID NO:40所示的CDR H3的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的任何前述的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的SJ25C1的可变重链区和SEQ ID NO:42所示的SJ25C1的可变轻链区，或者与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多的序列同一性的任何前述的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:43所示。在一些实施方案中，scFv依次包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv依次包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:44所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:44至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些方面，CAR含有结合或识别(例如特异性地结合)通用标签或通用表位的配体-(例如，抗原-)结合结构域。在一些方面，结合结构域可以结合分子、标签、多肽和/或表位，所述分子、标签、多肽和/或表位可以被连接至识别与疾病或障碍相关的抗原的不同结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)。示例性标签或表位包括染料(例如，荧光素异硫氰酸盐)或生物素。在一些方面，结合分子(例如，抗体或抗原结合片段)与标签连接，所述标签识别与具有表达对所述标签特异的CAR的工程化细胞的疾病或障碍相关的抗原(例如，肿瘤抗原)，以实现所述工程化细胞的细胞毒性或其他效应功能。在一些方面，CAR对与疾病或障碍相关的抗原的特异性由标记的结合分子(例如，抗体)提供，并且不同的标记的结合分子可以用于靶向不同的抗原。对通用标签或通用表位特异的示例性CAR包括例如在U.S.9,233,125、WO 2016/030414，Urbanska等人,(2012)Cancer Res 72:1844-1852，以及Tamada等人,(2012).Clin Cancer Res 18:6436-6445中所描述的那些。
在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，例如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性地识别作为主要组织相容性复合物(MHC)-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(例如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体的部分(例如抗原受体)在细胞上表达。所述抗原受体包括功能性非T细胞受体(TCR)抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，含有针对肽-MHC复合物展现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。在一些实施方案中，CAR是TCR样CAR，并且抗原是加工过的肽抗原，如细胞内蛋白的肽抗原，其与TCR一样在MHC分子的背景下在细胞表面上被识别。在一些实施方案中，在一些方面，对TCR样CAR的MHC-肽复合物具有特异性的细胞外抗原结合结构域通过接头和/或一个或多个跨膜结构域与一个或多个细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，此类分子通常可以通过天然抗原受体(如TCR)模拟或接近信号，并且任选地通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号。
提及“主要组织相容性复合物”(MHC)是指含有多态性肽结合位点或结合沟的蛋白质，通常是糖蛋白，在一些情况下，所述蛋白质可以与多肽的肽抗原(包括由细胞机构加工的肽抗原)复合。在一些情况下，MHC分子可以在细胞表面上展示或表达，包括作为与肽的复合物，即MHC-肽复合物，用于呈现具有由T细胞上的抗原受体(例如TCR或TCR样抗体)可识别的构象的抗原。通常，MHC I类分子是异二聚体，其具有跨越α链的膜，在一些情况下具有三个α结构域和非共价缔合的β2微球蛋白。通常，MHC II类分子由两种跨膜糖蛋白α和β组成，两者通常都跨越膜。MHC分子可以包括MHC的有效部分，其含有抗原结合位点或用于结合肽的位点以及由适当抗原受体识别所需的序列。在一些实施方案中，MHC I类分子将源自胞质溶胶的肽递送至细胞表面，其中MHC-肽复合物由T细胞(例如通常CD8+T细胞，但在一些情况下是CD4+T细胞)识别。在一些实施方案中，MHC II类分子将源自囊泡***的肽递送至细胞表面，其中所述肽通常由CD4+T细胞识别。通常，MHC分子由一组连锁基因座编码，其在小鼠中统称为H-2并且在人中统称为人白细胞抗原(HLA)。因此，通常人MHC也以可称为人白细胞抗原(HLA)。
术语“MHC-肽复合物”或“肽-MHC复合物”或其变体是指肽抗原与MHC分子的复合物或缔合物，例如通常通过所述肽在MHC分子的结合沟或裂缝中的非共价相互作用来形成。在一些实施方案中，MHC-肽复合物存在或展示于细胞表面上。在一些实施方案中，MHC-肽复合物可由抗原受体(例如TCR、TCR样CAR或其抗原结合部分)特异性地识别。
在一些实施方案中，多肽的肽(例如肽抗原或表位)可以与MHC分子缔合，例如用于由抗原受体识别。通常，所述肽源自或基于较长生物分子(例如多肽或蛋白质)的片段。在一些实施方案中，所述肽的长度通常为约8至约24个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度为或为约9至22个氨基酸，用于在MHC II类复合物中识别。在一些实施方案中，肽的长度为或为约8至13个氨基酸，用于在MHC I类复合物中识别。在一些实施方案中，在识别MHC分子(例如MHC-肽复合物)背景中的肽后，抗原受体(例如TCR或TCR样CAR)产生或触发激活信号至T细胞，诱导T细胞应答，如T细胞增殖、细胞因子产生、细胞毒性T细胞应答或其他应答。
在一些实施方案中，TCR样抗体或抗原结合部分是已知的或可通过已知方法产生(参见例如美国公开申请号US 2002/0150914；US 2003/0223994；US 2004/0191260；US2006/0034850；US 2007/00992530；US20090226474；US20090304679；和国际申请公开号WO03/068201)。
在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过用有效量的含有特定MHC-肽复合物的免疫原对宿主进行免疫来产生。在一些情况下，MHC-肽复合物的肽是能够结合至MHC的抗原的表位，例如肿瘤抗原，例如通用肿瘤抗原、骨髓瘤抗原或如下文所述的其他抗原。在一些实施方案中，然后向宿主给予有效量的免疫原以用于引发免疫应答，其中所述免疫原保持其三维形式持续一段足以引发针对所述肽在所述MHC分子的结合沟中的三维呈递的免疫应答的时间。然后测定从宿主收集的血清以确定是否产生了识别MHC分子结合沟中的肽的三维呈现的所需抗体。在一些实施方案中，可以评估所产生的抗体以确认所述抗体可以区分MHC-肽复合物与单独的MHC分子、单独的目标肽以及MHC与无关肽的复合物。然后可以分离所希望的抗体。
在一些实施方案中，特异性地结合至MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以通过采用抗体文库展示方法(例如噬菌体抗体文库)来产生。在一些实施方案中，可以产生突变体Fab、scFv或其他抗体形式的噬菌体展示文库，例如，其中所述文库的成员在一个或多个CDR的一个或多个残基处发生突变。参见例如,美国专利申请公开号US 20020150914、US 20140294841；以及Cohen CJ.等人(2003)J Mol.Recogn.16:324-332。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体(heteroconjugate antibody)、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如，含有具有不同特异性的两个抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab’)2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。
所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；双抗体；线性抗体；可变重链(VH)区、单链抗体分子(如scFv)和单一结构域VH单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，所述抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，如scFv。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可以使用来自结合所述抗原的抗体的VH或VL结构域来分离，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、VHH或VNAR。
抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，抗体片段是scFv。
“人源化”抗体是这样的抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基源自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基源自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指所述非人抗体的变体，其经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，衍生出CDR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
在一些实施方案中，重组受体例如CAR的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区(如铰链区，例如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/或Fc区的至少一部分。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。示例性间隔子(例如铰链区)包括在国际专利申请公开号WO 2014031687中描述的那些。在一些例子中，间隔子的长度为或为约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子具有少于250个氨基酸的长度、少于200个氨基酸的长度、少于150个氨基酸的长度、少于100个氨基酸的长度、少于75个氨基酸的长度、少于50个氨基酸的长度、少于25个氨基酸的长度、少于20个氨基酸的长度、少于15个氨基酸的长度、少于12个氨基酸的长度、或少于10个氨基酸的长度。在一些实施方案中，间隔子具有从或从约10至250个氨基酸的长度、10至150个氨基酸的长度、10至100个氨基酸的长度、10至50个氨基酸的长度、10至25个氨基酸的长度、10至15个氨基酸的长度、15至250个氨基酸的长度、15至150个氨基酸的长度、15至100个氨基酸的长度、15至50个氨基酸的长度、15至25个氨基酸的长度、25至250个氨基酸的长度、25至100个氨基酸的长度、25至50个氨基酸的长度、50至250个氨基酸的长度、50至150个氨基酸的长度、50至100个氨基酸的长度、100至250个氨基酸的长度、100至150个氨基酸的长度、或150至250个氨基酸的长度。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人Clin.Cancer Res.,19:3153(2013)；国际专利申请公开号WO 2014031687、美国专利号8,822,647或公开的申请号US2014/0271635。
在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些实施方案中，间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:2所示)，并且由SEQ ID NO:3所示的序列编码。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:4所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5所示的序列。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:6所示的序列。在一些实施方案中，间隔子具有展现与SEQ ID NO:2、4、5或6中的任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
这个抗原识别结构域通常连接至一种或多种细胞内信号传导组分(如通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)模拟激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)。因此，在一些实施方案中，抗原结合组分(例如，抗体)被连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括衍生自T细胞受体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD 16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD137、CD154的α、β或ζ链的那些跨膜区(即至少包含它们的一个或多个跨膜区)。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域。
细胞内信号传导结构域包括通过天然抗原受体模拟或接近信号、通过这种受体与共刺激受体组合模拟或接近信号和/或仅通过共刺激受体模拟或接近信号的那些。在一些实施方案中，短的寡肽或多肽接头(例如，长度在2与10个之间的氨基酸的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)存在并形成CAR的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间的连接。
受体例如CAR通常包括至少一种细胞内信号传导组分或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如CAR)还包括一种或多种另外的分子(例如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能，例如细胞溶解活性或T辅助活性，例如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如条件是所述截短部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包括共受体的那些细胞质序列，所述共受体在自然环境中与此类受体协同作用以启动抗原受体接合后的信号转导。
在某些实施方案中，方法提供了表达一种或多种重组抗原受体的工程化细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以包括用重组受体(例如嵌合抗原受体)基因工程化的细胞。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的细胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级细胞质信号传导序列)以及以非抗原依赖性方式作用以提供刺激或共刺激信号的那些序列(次级细胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的例子包括源自以下项的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的细胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一CAR同时包括激活和共刺激组分。
在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013)，如识别除了与疾病或病症相关和/或对所述疾病或病症具有特异性的抗原以外的抗原的CAR，由此通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR在细胞质部分中包含一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和激活结构域，例如初级激活结构域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，CAR或其他抗原受体还包括标记，例如细胞表面标记，其可以用于确认细胞表达受体的转导或工程化，所述受体例如细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割的接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如已公开专利申请号WO 2014031687中所披露的任何一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如，tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:19至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，单一启动子可以指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码参与调节代谢途径的分子和编码重组受体)，所述基因由编码自切割肽(例如2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。因此，所述ORF编码单个多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或之后被加工成单个蛋白质。在一些情况下，所述肽(如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，deFelipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知许多2A元件。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自***病毒的2A序列(F2A，例如SEQ ID NO:24)、来自马鼻炎A病毒的2A序列(E2A，例如SEQ ID NO:23)、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的2A序列(T2A，例如SEQ ID NO:7或20)和来自猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1的2A序列(P2A，例如SEQID NO:21或22)，如美国专利公开号20070116690中所述。示例性T2A接头序列包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:7至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，标记是并非在T细胞上天然发现或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子(例如，非自身蛋白)，即没有被细胞过继转移到其中的宿主的免疫***识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，标记是转导标记或替代标记。转导标记或替代标记可用于检测已经引入多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记的核酸序列可操作地连接，任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或引起核糖体跳跃的肽(例如2A序列，例如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞***。
示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:8或19中列出的示例性tEGFR序列)或***特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002307717810000901
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记例如替代标记包括CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)、或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的荧光蛋白变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割的接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:8或19所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8或19至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记不提供治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或原本发挥一定所需作用的分子，如在体内细胞将遇到的配体，如共刺激或免疫检查点分子，以增强和/或减弱所述细胞在过继转移和遇到配体时的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，例如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，受体含有衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如CD28细胞外部分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
例如，在一些实施方案中，CAR含有抗体例如抗体片段、跨膜结构域(其是CD28的跨膜部分或其功能变体或含有CD28跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体例如抗体片段，跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)，以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子，如Ig铰链，例如IgG4铰链)的一部分的间隔子如仅含铰链的间隔子。
在一些实施方案中，重组受体例如CAR的跨膜结构域是或包括人CD28(例如登录号P01747.1)的跨膜结构域或其变体，如包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或展现出与SEQID NO:9至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高或者约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的一种或多种细胞内信号传导组分含有人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如在天然CD28蛋白的位置186-187具有LL至GG取代的结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:11或12中所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:11或12至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB(例如登录号Q07011.1)的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或展现出与SEQ IDNO:13至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ的亚型3(登录号P20963.2)的112个AA的细胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:14、15或16所示的氨基酸序列或展现与SEQ ID NO:14、15或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，所述间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQ IDNO:2中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，所述间隔子是或含有任选地与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，如IgG4衍生的铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:5中所列出。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4中所列出。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分的间隔子，如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28源跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、CD28源细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28源跨膜结构域、4-1BB源细胞内信号传导结构域和CD3ζ源信号传导结构域。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子进一步包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列(例如在编码CAR的序列的下游)。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:7所示的T2A核糖体跳跃元件或展现出与SEQ ID NO:7至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以将截短的EGFR(EGFRt)表达为非免疫原性选择表位(例如通过引入编码被T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体，以表达来自相同构建体的两种蛋白质)，然后所述非免疫原性选择表位可用作检测此类细胞的标记(参见例如美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，序列编码SEQ ID NO:8中所示的tEGFR序列或展现与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
由给予受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性结合以下分子，所述分子在被治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与被治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或对被治疗的疾病或病症或其细胞具特异性。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，细胞表达CAR，所述CAR特异性地结合由疾病或病症的细胞或组织表达的或与疾病或病症相关的抗原。
2.TCR
在某些实施方案中，通过本文提供的方法评估含有表达重组受体的工程化细胞的细胞组合物的聚糖(例如N-聚糖)的表面表达。在一些实施方案中，在表达T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分的工程化细胞(如T细胞)中评估表面聚糖的表达。
在某些实施方案中，本文提供的方法可以用于评估表达重组T细胞受体的细胞组合物的表面聚糖谱，即表面聚糖的表达。在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且其能够特异性结合至与MHC分子结合的肽。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR一般在结构上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，发现TCR在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上，在此处它通常负责识别与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或其抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合(如与MHC-肽复合物结合)。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区(CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者是在给定TCR可变区的用于所述肽-MHC复合物的加工肽部分的抗原识别和/或用于与其相互作用的三个CDR中最重要的CDR。在一些情境下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情境下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情境下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)Clinical Microbiology Reviews,8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短细胞质尾(参见，例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997)。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短细胞质尾。在一些实施方案中，TCR与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR链的细胞外部分(例如，α链或β链)可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，例如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定域或Cα，通常基于Kabat编号的位置117至259，或β链恒定结构域或Cβ，通常基于Kabat的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，其中可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，由此连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可在每条α和β链中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有细胞质尾。在一些情况下，结构允许TCR与其他分子(如CD3和其亚基)缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将所述蛋白质锚定在细胞膜中并与所述CD3信号传导装置或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者其可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体，所述链是通过例如一个或多个二硫键连接。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα,β链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是易于获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞分离的编码TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞，例如细胞毒性T细胞)、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以根据对TCR序列的了解以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者分离，包括存在于PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+T细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如通过在从人获得的样品(如T细胞)中进行RT-PCR。在一些实施方案中，scTv文库可以从原初Vα和Vβ文库组装，其中扩增的产物被克隆或组装以通过接头分开。取决于受试者和细胞的来源，所述文库可以是HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，TCR经受定向进化，如通过诱变例如所述α或β链。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰选择的TCR。在一些实施方案中，可以选择抗原特异性T细胞，如通过筛选以评估针对所述肽的CTL活性。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对所述抗原的特定亲和力或亲合力。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已经修饰或工程化的。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性如具有较高的对特定MHC-肽复合物的亲和力的TCR。在一些实施方案中，通过展示方法来实现定向进化，所述展示方法包括但不限于酵母展示(Holler等人，(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl AcadSci U S A,97,5387-92)、噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23,349-54)、或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示途径涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所需改变的特性(如对所需靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目标TCR的靶多肽的肽是已知的或可以由熟练技术人员容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目标靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用本领域技术人员已知的计算机预测模型鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(Singh和Raghava(2001)Bioinformatics17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,409(1):75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的约39％-46％中表达，并因此代表用于制备TCR或其他MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是本领域技术人员已知的。用于预测MHC I类结合位点的此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR bindingsites.BIOINFORMATICS 17(12):1236-12372001)和SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,第409(1)卷:75-93 2007)。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白质或其突变形式(其中一种或多种特性(如结合特征)已经被改变)。在一些实施方案中，TCR可以来源于各种动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，所述TCR呈在细胞的表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于细胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR)可以与在T细胞的表面上产生活性TCR的信号传导结构域连接。在一些实施方案中，TCR在细胞的表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一多肽和所述第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，所述链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链(含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序)和TCRβ链(包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序)，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用本领域技术人员已知的方法产生scTCR。参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C.和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO 96/13593、WO96/18105、WO 99/60120、WO 99/18129、WO 03/020763、WO 2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J.Mol.Biol.256,859(1996).在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有经由肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成的第一区段、由对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成的第二区段(融合至对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端)和将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端的接头序列。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将所述第一区段的C末端连接至所述第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接所述第一和第二TCR区段的接头可以是能够形成单多肽链同时保留TCR结合特异性的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中所述氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，所述第一区段和所述第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，所述接头具有足够的长度以跨越所述第一区段的C末端与所述第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长以阻断或减少所述scTCR与所述靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从或从约10个至45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26个至41个氨基酸残基，例如29个、30个、31个或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ IDNO:17)。在一些实施方案中，所述接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:18)
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键。
在含有引入的链间二硫键的dTCR或scTCR的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，用形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸取代另一残基，如取代丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成引入的二硫键。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO2006/000830中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段对靶抗原以平衡结合常数展现出亲和力，所述平衡结合常数是在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过PCR、克隆或其他合适的方法扩增，并且克隆到合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕罗奥图)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，可以使用标准重组DNA技术来制备重组表达载体。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列，如转录和翻译起始和终止密码子，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其可操作地连接至编码TCR或抗原结合部分(或其他MHC-肽结合分子)的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还考虑了熟练技术人员已知的其他启动子。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目标TCR的T细胞克隆分离的总cDNA进行PCR扩增，并将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将所述α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如慢病毒)载体中。
3.多靶向
在一些实施方案中，在含有为多靶向策略而设计的细胞的细胞组合物中评估表面聚糖表达。在一些实施方案中，细胞组合物含有设计用于多靶向策略的细胞，例如在细胞上表达两种或更多种基因工程化受体的细胞，每个受体识别相同或不同的抗原并且通常每个包含不同的细胞内信号传导组分。此类多靶向策略描述于例如以下文献中：国际专利申请公开号WO 2014055668A1(描述激活和共刺激CAR的组合，例如，靶向单独存在于脱靶(例如正常细胞)上，但仅一起存在于待治疗疾病或病症的细胞上的两种不同抗原)和Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013)(描述了表达激活和抑制性CAR的细胞，例如其中激活CAR结合同时在正常或非患病细胞和待治疗疾病或病症的细胞上表达的一种抗原，并且抑制性CAR结合仅在正常细胞或不希望治疗的细胞上表达的另一种抗原的那些细胞)。
例如，在一些实施方案中，从含有如下细胞的细胞组合物中释放并分析表面聚糖，所述细胞包含表达第一基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)的受体，其通常在特异性结合至由第一受体识别的抗原(例如第一抗原)后，能够诱导激活信号至所述细胞。在一些实施方案中，细胞还包括第二基因工程化抗原受体(例如，CAR或TCR)，例如嵌合共刺激受体，所述受体通常在特异性结合至由第二受体识别的第二抗原后，能够将共刺激信号诱导至免疫细胞。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是相同的。在一些实施方案中，第一抗原与第二抗原是不同的。
在一些实施方案中，第一和/或第二基因工程化抗原受体(例如CAR或TCR)能够诱导激活信号至所述细胞。在一些实施方案中，受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，由第一受体诱导的激活涉及信号转导或细胞中蛋白质表达的变化，导致启动免疫应答(例如ITAM磷酸化)和/或启动ITAM介导的信号转导级联、形成免疫突触和/或所结合受体(例如CD4或CD8等)附近的分子的聚簇、激活一种或多种转录因子(例如NF-κB和/或AP-1)、和/或诱导因子(例如细胞因子)的基因表达、增殖和/或存活。
在一些实施方案中，第一和/或第二受体包括共刺激受体(如CD28、CD137(4-1BB)、OX40和/或ICOS)的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，第一和第二受体包括不同的共刺激受体的细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，第一受体含有CD28共刺激信号传导区域，并且第二受体含有4-1BB共刺激信号传导区域，或反之亦然。
在一些实施方案中，第一受体和/或第二受体包括含有ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域和共刺激受体的细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，第一受体含有包含ITAM或ITAM样基序的细胞内信号传导结构域，并且第二受体含有共刺激受体的细胞内信号传导结构域。与在相同细胞中诱导的激活信号组合的共刺激信号是导致免疫应答的共刺激信号，所述免疫应答是例如稳健且持续的免疫应答，如增加的基因表达、细胞因子和其他因子的分泌、以及T细胞介导的效应子功能(如细胞杀伤)。
在一些实施方案中，单独的第一受体的连接和单独的第二受体的连接都不会诱导稳健的免疫应答。在一些方面，如果仅连接一个受体，则细胞变得耐受抗原或对抗原无反应，或被抑制，和/或不被诱导增殖或分泌因子或实现效应子功能。然而，在一些此类实施方案中，在连接多个受体时，如在遇到表达第一和第二抗原的细胞时，实现所需应答，如完全免疫激活或刺激，例如如通过一种或多种细胞因子的分泌、增殖、持久性和/或执行免疫效应子功能(如靶细胞的细胞毒性杀伤)所指示的。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的结合激活细胞或诱导反应，但是第二抑制性受体与其抗原的结合诱导了抑制或减弱所述反应的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR或iCAR的组合。例如，可以使用这种策略，其中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些实施方案中，多靶向策略用于以下情况：其中与特定疾病或病症相关的抗原在未患病细胞上表达和/或在工程化细胞本身上表达，所述表达为瞬时表达(例如，在与基因工程化相关的刺激后)或永久表达。在此类情况下，通过需要连接两个分开的和单独特异性抗原受体，可以改善特异性、选择性和/或功效。
在一些实施方案中，多种抗原(例如第一和第二抗原)在所靶向的细胞、组织或疾病或病症上(例如在癌细胞上)表达。在一些方面，细胞、组织、疾病或病症是多发性骨髓瘤或多发性骨髓瘤细胞。在一些实施方案中，多种抗原中的一种或多种通常也在不需要用细胞疗法靶向的细胞(例如正常或未患病细胞或组织，和/或工程化细胞本身)上表达。在此类实施方案中，通过需要连接多个受体以实现细胞的反应，实现特异性和/或功效。
III.制造或制备细胞组合物的过程
在特定实施方案中，本文提供的方法可以用于评估在制造或产生工程化细胞的过程的各个阶段中一种或多种组合物的聚糖(例如N-聚糖)的表面表达。在特定实施方案中，所述过程可以用于制造或产生表达重组受体(例如CAR或TCR)的工程化细胞，如本文(如第III部分)中所述。在一些实施方案中，所述过程包括细胞的分离、分开、选择、培育(例如刺激细胞，例如以诱导其增殖和/或活化)、转导和/或转染、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤。在某些实施方案中，在一种或多种细胞组合物中评估表面聚糖表达，所述一种或多种细胞组合物是在细胞的分离、分开、选择、培育(例如刺激细胞，例如以诱导其增殖和/或活化)、转导和/或转染、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤之前、与其相连或在其之后获得。在特定实施方案中，可以在制造或产生工程化细胞的过程中的任何阶段中或任何阶段之间收集细胞。在一些实施方案中，可以将细胞存储(例如冷冻保存)供以后对表面聚糖进行分析，或者可以在释放表面聚糖的条件下直接孵育。
在一些实施方案中，分析了从细胞表面释放的聚糖(例如N-聚糖)，所述细胞来自在产生或制造工程化细胞的过程中的各个步骤中取得的细胞组合物。在一些实施方案中，组合物包括含有PBMC的细胞组合物。在某些实施方案中，组合物包括含有选择的CD4+或CD8+T细胞的细胞组合物。在一些实施方案中，细胞组合物包括含有激活的T细胞组合物的细胞组合物。在某些实施方案中，T细胞组合物含有用编码重组受体的载体激活和转导或转染的细胞。在特定实施方案中，细胞组合物含有扩增的重组受体表达细胞。
在某些实施方案中，聚糖(例如N-聚糖)的表面表达是从在产生或制造工程化细胞的过程中的各个步骤中取得的细胞组合物的细胞中评估的。在一些实施方案中，细胞组合物包括含有大量PBMC的组合物。在某些实施方案中，细胞组合物包括含有解冻的冷冻保存的细胞组合物的组合物，所述细胞组合物含有选择的CD4+或CD8+T细胞，所述选择的CD4+或CD8+T细胞是通过基于免疫亲和力的选择而选择的。在一些实施方案中，组合物包括含有在37℃下在IL-2、IL-15和/或IL-7的存在下与抗CD3/抗CD28珠一起孵育18-24小时的T细胞的组合物。在某些实施方案中，细胞组合物包括含有用编码CAR的慢病毒载体转导的激活T细胞的组合物。在某些实施方案中，细胞组合物包括含有解冻的冷冻保存过的细胞组合物的组合物，所述解冻的冷冻保存过的细胞组合物含有在冷冻保存之前在IL-2、IL-15和/或IL-17细胞因子的存在下进行扩增的CAR表达细胞。在一些实施方案中，细胞组合物是解冻的冷冻保存过的药物产品。
在特定实施方案中，本文提供的方法可以用于评估细胞的聚糖(例如N-聚糖)的表面表达，所述细胞来自在产生或制造工程化细胞的过程期间收集的组合物。在一些实施方案中，细胞组合物由在进行细胞的分离、分开、选择、培育、激活、转导和/或转染、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤之前的阶段的细胞构成。在某些实施方案中，细胞组合物由在细胞的分离、分开、选择、培育、激活、转导和/或转染、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤之后的细胞构成。在某些实施方案中，细胞组合物由经历细胞的分离、分开、选择、培育、激活、转导和/或转染、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制的步骤的细胞构成。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于评估来自在产生或制造工程化细胞的过程期间收集的组合物的细胞的聚糖(例如N-聚糖)表面表达，例如以将所述聚糖表面表达与不同细胞组合物的聚糖表面表达进行比较。在一些实施方案中，表面聚糖组合物是从过程中的一个步骤中或经历过程中的一个步骤的细胞组合物获得，并且将所述聚糖的表达与在过程中的先前步骤中或经历过程中的先前步骤的细胞组合物的表面聚糖表达进行比较。在某些实施方案中，表面聚糖表达是从过程中的一个步骤中或经历过程中的一个步骤的细胞组合物获得，并且将所述表面聚糖表达与在所述过程下游的步骤中或经历所述过程下游的步骤的细胞组合物的表面聚糖表达进行比较。在一些实施方案中，表面聚糖表达是从过程中的一个步骤中或经历过程中的一个步骤的细胞组合物获得，并且将所述表面聚糖表达与已经完成所述过程的细胞组合物的表面聚糖表达进行比较。在特定实施方案中，表面聚糖表达是从过程中的一个步骤中或经历过程中的一个步骤的细胞组合物获得，并且将所述表面聚糖表达与尚未经历所述过程的细胞组合物的表面聚糖表达进行比较。
在特定实施方案中，本文提供的方法可以用于评估细胞的聚糖(例如N-聚糖)的表面表达，所述细胞来自已经完成产生或制造工程化细胞的过程的组合物。在一些实施方案中，细胞组合物已经完成相同的过程并表达相同的一种或多种重组受体。在某些实施方案中，细胞组合物已经完成相同的过程并表达不同的一种或多种重组受体。在一些实施方案中，在已经完成相同的过程并表达相同的一种或多种重组受体的两种或更多种细胞组合物之间比较表面聚糖表达。
特定实施方案考虑可能希望不同的细胞组合物表达相同的重组受体并且已经经历相同的过程以具有相似的表面聚糖表达。在一些实施方案中，测量和/或评估表达相同的重组受体并且已经经历相同的过程的多种细胞组合物的表面聚糖表达。在一些实施方案中，所述方法可以用于释放测定中，以在释放细胞组合物(例如治疗性组合物)用于给予至受试者之前确认细胞组合物的一致性和/或基本同质性。在一些实施方案中，将来自细胞组合物的样品中的表面聚糖谱(例如一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平)与参考标准品进行比较，所述参考标准品是或指示释放规范、标记要求和/或汇编规范。
在一些实施方案中，参考标准品包含在由所述过程生产的多种组合物中一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。在特定实施方案中，针对多种细胞组合物计算一种或多种靶聚糖(例如聚糖种类、家族和/或组)的表达测量值的平均值、中值和/或方差。在一些实施方案中，将在根据所提供的方法从细胞组合物(例如测试细胞组合物)释放的样品中一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平与一种或多种靶聚糖的这种平均值或中值进行比较。
在一些实施方案中，只有当组合物的细胞表面聚糖谱与参考样品基本上相同和/或只有当样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟参考样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差不超过25％、不超过20％或不超过10％的时候，才将细胞组合物释放用于治疗受试者。
在一些实施方案中，如果一种或多种聚糖种类、家族和/或组的表达的方差大于阈值，则调节、改变和/或变化用于制造或产生工程化细胞的过程的一个或多个步骤的一个或多个参数。在一些实施方案中，所述阈值是一种或多种聚糖种类、家族和/或组的表达的测量值的±50％、±33％、±25％、±20％、±15％、±10％、±7.5％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、±0.1％、±0.05％、或±0.01％的变异。在某些实施方案中，表达的测量值是一种或多种聚糖种类、家族和/或组的相对量，即，一种或多种聚糖种类、家族和/或组的表达占总表面聚糖表达的百分比。可以改变以改善表面聚糖表达的一致性和/或降低表面聚糖表达的变异的参数的例子包括孵育的时间设定和/或持续时间、细胞制剂的浓度、试剂的添加或去除、以及试剂的浓度。
在一些实施方案中，所提供的方法在与含有工程化细胞的细胞组合物的制备或制造相关生产的一种或多种组合物上进行。在一些实施方案中，制造过程包括一个或多个阶段或步骤，所述一个或多个阶段或步骤产生：通过白细胞分离术或单采术从生物样品分离的细胞或含有通过白细胞分离术或单采术从生物样品分离的细胞的细胞组合物；通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中选择的细胞；引入了重组核酸(任选地编码重组蛋白的病毒载体)的细胞；在一种或多种测试剂(任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子)的存在下孵育的细胞；在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增的细胞；在冷冻保护剂的存在下冷冻保存的细胞；和/或任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下，配制用于给予至受试者的细胞。
1.制备用于基因工程化的细胞
可以通过本文提供的方法评估聚糖表面表达的细胞是表达重组受体的工程化细胞。在某些实施方案中，可以通过本文提供的方法从收集自基因工程化过程各个阶段的细胞的一种或多种组合物评估表面聚糖表达。
基因工程通常包括将编码重组或工程化组分的核酸例如通过逆转录病毒转导、转染或转化而引入含有细胞的组合物中。在一些实施方案中，在逆转录病毒转导、转染或转化开始之前收集的细胞的组合物中评估表面聚糖。在某些实施方案中，在逆转录病毒转导、转染或转化过程之后立即收集的细胞的组合物中评估表面聚糖。在特定实施方案中，在逆转录病毒转导、转染或转化的一个或多个阶段收集的细胞的组合物中评估表面聚糖。
在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
细胞通常是真核细胞(如哺乳动物细胞)，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫***的细胞，如先天免疫或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞，如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些。在一些实施方案中，细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群、CD4+T细胞、CD8+T细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，细胞是多能和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在冷冻保存之前或之后将它们重新引入同一受试者体内。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(如干细胞记忆T(TSCM)、中枢记忆T(TCM)，效应记忆T(TEM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助细胞T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。
在一些实施方案中，细胞包括经由基因工程化引入的一个或多个核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体如CAR的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如从受试者获得或来源于受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其给予细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。
在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞分离术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、***、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、***、骨、***、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。
在一些例子中，来自受试者的循环血液的细胞例如通过单采术或白细胞分离术获得。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记，例如表面蛋白、细胞内标记或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记的用于分离的方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包括基于细胞的一种或多种标记(通常为细胞表面标记)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过和与此类标记特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记进行分离。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。
例如，可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，M-450CD3/CD28 TCell Expander)阳性选择CD3+,CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过阳性选择针对特定细胞群富集或者通过阴性选择针对特定细胞群耗尽来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人Blood.1:72-82(2012)；Wang等人J Immunother.35(9):689-701(2012)。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依次进行。在一些方面，用于制备CD8+T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中枢记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002307717810001121
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。
在一些方面，将待分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应粒子或微粒，如顺磁珠(例如像
Figure BDA0002307717810001122
或
Figure BDA0002307717810001123
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，粒子)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性结合。
在一些实施方案中，磁性粒子或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性粒子包括在Molday,美国专利号4,452,773和在欧洲专利说明书EP 452342B(将其通过引用特此并入)中描述的那些。胶体大小的粒子，如在Owen美国专利号4,795,698以及Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些是其他例子。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性粒子或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。
在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化粒子的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步加工或经受另外的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应粒子被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁性粒子通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性粒子。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性粒子与生物素化的一抗或二抗结合使用。
在一些实施方案中，磁响应粒子保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，所述粒子保持附着于所述细胞以用于给予患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应粒子。从细胞中去除可磁化粒子的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化粒子或抗体。在一些实施方案中，可磁化粒子是可生物降解的。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)。磁激活细胞分选(MACS)***能够高纯度选择附着有磁化粒子的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化粒子的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群中耗尽。
在某些实施方案中，使用这样的***、装置或设备进行分离或分开，所述***、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述***用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，所述***是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US20110003380A1中所述的***。
在一些实施方案中，所述***或装置在集成或独立***中和/或以自动或可编程方式进行分离、加工、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述***或设备包括与所述***或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。
在一些方面，使用CliniMACS***(Miltenyi Biotec)进行所述分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌***中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述***以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述***的受控流动和细胞的连续悬浮。
在一些方面，CliniMACS***使用抗体偶联的可磁化粒子，其在无菌无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性粒子标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的粒子。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述***自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。
在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy***(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy***配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy***还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，将外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy***还可以包括集成的细胞培养室，其实现细胞培养方案，例如像细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可以允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见例如，Klebanoff等人J Immunother.35(9):651-660(2012)，Terakura等人Blood.1:72–82(2012)，以及Wang等人J Immunother.35(9):689-701(2012)。
在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群，其中针对多种细胞表面标记染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，通过制备规模(FACS)分类收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群。在某些实施方案中，通过使用微机电***(MEMS)芯片结合基于FACS的检测***来收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群(参见例如，WO 2010/033140，Cho等人Lab Chip 10,1567-1573(2010)；和Godin等人JBiophoton.1(5):355–376(2008))。在两种情况下，细胞可以用多种标记来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞亚组。
在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记具特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞在流体流中载携，如通过荧光激活细胞分选(FACS)，包括制备规模(FACS)和/或微机电***(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测***组合。此类方法允许基于多种标记同时进行阳性和阴性选择。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，冷冻保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将所述细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后将其用培养基1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1°/分钟的速率冷冻至-80°℃并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在存在刺激条件或刺激剂的情况下孵育所述组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：在群体中诱导细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露和/或引发细胞用于遗传工程化(如用于引入重组抗原受体)。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或药剂包括一种或多种药剂(例如配体)，其能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括能够刺激共刺激受体(例如抗CD28)的一种或多种药剂(例如配体)。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支持物如珠和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法还可以包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/mL的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。
在一些方面，根据多种技术进行孵育，所述技术例如为在以下文献中所述的那些：授予Riddell等人的美国专利号6,040,1 77，Klebanoff等人J Immunother.35(9):651-660(2012)，Terakura等人Blood.1:72-82(2012)，和/或Wang等人J Immunother.35(9):689-701(2012)。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞(如非***外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群含有至少约5、10、20或40种或更多种PBMC饲养细胞，以使初始群体中的每种T淋巴细胞进行扩增)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，所述非***饲养细胞可以包含γ照射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用在约3000至3600拉德范围内的γ射线来照射所述PBMC以防止细胞***。在一些方面，在添加所述T细胞群之前将所述饲养细胞添加到培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。任选地，孵育可以还包括添加非***的EBV变换的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，针对巨细胞病毒抗原来产生抗原特异性T细胞系或克隆。
2.用于基因工程的载体和方法
用于引入基因工程化组分例如重组受体(例如CAR或TCR)的各种方法是熟知的。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，在基因工程化过程之前、期间或之后立即收集的细胞的组合物中评估表面聚糖表达。在一些实施方案中，在引入基因工程化组分的过程的相应阶段的细胞组合物之中评估并比较表面聚糖表达。在一些实施方案中，所述组合物被工程化或已经被工程化以表达相同的重组受体，但是通过不同的引入遗传物质的方法。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激所述细胞，如通过将其与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激进行组合，然后转导激活的细胞，并且在培养物中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒粒子(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移至细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Koste等人Gene Therapy doi:10.1038/gt.2014.25(2014)；Carlens等人ExpHematol.,28(10):1137-46(2000)；Alonso-Camino等人Mol Ther Nucl Acids,2,e93(2013)；Park等人,Trends Biotechnol.,11月29日(11):550-557(2011)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自于任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了多种说明性逆转录病毒***(例如美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman,BioTechniques,7:980-990(1989)；Miller,A.D.Human GeneTherapy,1:5-14(1990)；Scarpa等人Virology,180:849-852(1991)；Burns等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:8033-8037(1993)；以及Boris-Lawrie和Temin,Cur.Opin.Genet.Develop.,3:102-109(1993)。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如Wang等人,J.Immunother.,35(9):689-701(2012)；Cooper等人Blood.101:1637–1644(2003)；Verhoeyen等人,MethodsMol Biol.,506:97-114(2009)；以及Cavalieri等人,Blood.,102(2):497-505(2003)中。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Chicaybam等人,PLoS ONE 8(3):e60298(2013)和Van Tedeloo等人Gene Therapy 7(16):1431-1437(2000))。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如，Manuri等人Hum Gene Ther 21(4):427-437(2010)；Sharma等人Molec Ther Nucl Acids2,e74(2013)；和Huang等人Methods Mol Biol 506:115-126(2009))。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如在国际专利申请公开号WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。
在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见，例如，Cheadle等人,Methods Mol Biol.907:645-66(2012)；或Barrett等人,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer AnnualReview of Medicine,第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。
在一些方面，进一步工程化细胞以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的用于引入的核酸(例如基因)包括如通过促进所转移细胞的活力和/或功能改善疗法功效的那些；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记如以在体内评估存活或定位的基因；例如通过使细胞对体内阴性选择易感来提高安全性的基因，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human Gene Therapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US 91/08442和PCT/US 94/05601的公开案，所述公开案描述了使用源自融合显性的阳性选择标记与阴性选择标记的双功能可选融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
3.组合物和配制品
在一些实施方案中，将细胞(如具有重组受体的基因工程化细胞(例如CAR-T细胞)作为组合物(包括药物组合物和配制品，如包括以给定剂量或其分数给予的细胞数量的单位剂型组合物)提供。药物组合物和配制品通常包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，组合物包括至少一种另外的治疗剂。
在一些实施方案中，出于细胞疗法的目的，产生或制造细胞组合物。在一些实施方案中，细胞组合物是药物组合物或配制品。此类组合物可以根据所提供的方法使用，例如，以评估其释放用于在预防或治疗疾病、病症和障碍中、或在检测、诊断和预后方法中使用。
术语“药物配制品”是指这样的制剂，其处于使得其中所含活性成分的生物活性有效的形式，并且不含对给予配制品的受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于比较由相同工程化细胞构成但具有不同的药物配制品的细胞组合物的表面聚糖表达。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。在特定实施方案中，本文提供的方法可以用于比较由相同工程化细胞构成但具有不同的药学上可接受的载体的细胞组合物的表面聚糖表达。
在一些实施方案中，用药学上可接受的载体配制T细胞疗法(如工程化T细胞(例如CAR T细胞))。在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物重量的约0.001％至约4％的量存在。制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞预防或治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，包括其中活性与细胞互补和/或各自的活性不会互相造成不良影响的一种或多种活性成分。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱、长春新碱等。
在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组合物来递送。
可以将细胞配制用于使用标准给予技术、配制品和/或设备进行给予。提供了用于储存和给予所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，给予可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且给予至同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射给予，包括导管给药、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外给药。当给予治疗组合物(例如，含有遗传修饰的免疫应答细胞的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。
配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂给予的那些。在一些实施方案中，肠胃外给予药剂或细胞群。如本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、***和腹膜内给予。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者给予药剂或细胞群。
在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至所选pH)提供。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，例如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物也可以是冻干的。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂、颜料等，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以参考标准文本来制备合适的制剂。
可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。防止微生物的作用可以通过不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等)来确保。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。
用于体内给予的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。
对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、给予药剂或细胞用于预防性目的还是治疗性目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应、以及主治医师的决断。在一些实施方案中，组合物适合一次或在一系列治疗中给予至受试者。
IV.定义
除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
如本文所用的，单数形式“一种/个(a/an)”和“所述(the)”包括复数种/个指示物，除非上下文另外明确说明。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。应理解，本文所述的方面和变化包括“由方面和变化组成”和/或“基本上由方面和变化组成”。
贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应被解释为对所要求保护的主题的范围的僵硬限制。因此，应当认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及所述范围内的各个数值。例如，在提供一系列值的情况下，应当理解，在所述范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所述范围内的任何其他所述或中间值包含在所要求保护的主题内。这些更小范围的上限和下限可以独立地被包括在更小范围之内，并且也被涵盖在所要求保护地主题之内，服从于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述的范围包括一个或两个限制时，排除了那些被包括的限制的任一个或两者的范围也被包括在所要求保护的主题之内。无论范围的广度如何，这都适用。
如本文所用术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的通常误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，涉及“约X”的描述包括“X”的描述。在某些实施方案中，“约”陈述值是指在陈述值的±25％、±20％、±10％、±5％、±1％、±0.1％、或±0.01％内的值。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阳性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上与已知呈所述标记阳性的细胞的水平相似，和/或所述水平基本上高于已知呈所述标记阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指特定标记(通常为表面标记)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知呈所述标记阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知呈所述标记阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用，术语“载体”是指这样的核酸分子，它传播与其连接的另一个核酸。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
V.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括：
将包含多种细胞的测试组合物在从所述测试组合物中的细胞表面释放一种或多种聚糖的条件下孵育，其中产生了包含一种或多种细胞表面聚糖的样品；并且
确定所述样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱。
2.一种评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括确定样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱，其中所述样品包含在释放一种或多种聚糖的条件下孵育包含多种细胞的测试组合物之后从所述测试组合物中存在的细胞表面释放的所述一种或多种聚糖。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的方法，其中所述聚糖是N-聚糖。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物中的细胞包含整个或完整细胞。
5.根据实施方案1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是活细胞。
6.根据实施方案1-5中任一项所述的方法，其中：
在所述孵育之前不对所述测试细胞组合物进行均质化或声处理；和/或
在所述孵育之前不将所述测试细胞组合物与蛋白酶一起孵育，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶；和/或
在所述孵育之前或期间不将在所述测试细胞组合物中的细胞与提取一种或多种细胞表面蛋白或膜蛋白的药剂接触，任选地其中所述药剂是洗涤剂或蛋白酶，任选胰蛋白酶；和/或
在所述孵育期间少于10％的所述细胞被裂解和/或破裂。
7.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含不超过5x 106个细胞。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含在1x106个与5x106个之间的细胞，包含端值。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有不超过1x108个细胞/mL的浓度。
10.根据实施方案1-9中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有以下的浓度：在1x105个细胞/mL与1x108个细胞/mL之间(包含端值)、在1x106个细胞/mL与5x107个细胞/mL之间(包含端值)、或在5x106个细胞/mL与2.5x107个细胞/mL之间(包含端值)。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述孵育是在N-糖苷酶的存在下进行。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述N-糖苷酶是肽N-糖苷酶(PNGase)F。
13.根据实施方案12所述的方法，其中所述PNGase F是重组的。
14.根据实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖是一种或多种N-聚糖，并且其中所述方法包括：
将来自所述测试组合物的1x106个与5x106个之间的细胞在从所述测试组合物的所述细胞表面释放所述一种或多种N-聚糖的条件下与重组PNGase F一起孵育；
将所述一种或多种N-聚糖用可检测标记、任选地荧光标记进行标记；并且
确定经标记的N-聚糖的存在、不存在或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含约1x106个至2.5x106个细胞。
16.根据实施方案13或实施方案14所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有在1x106个细胞/mL与5x107个细胞/mL之间的浓度。
17.根据实施方案12-16中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的PGNase F或其具有酶促活性的部分或突变体。
18.根据实施方案12-17中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其具有酶促活性的部分或突变体，或展现与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或是其具有酶促活性的部分。
19.根据实施方案12-18中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
20.根据实施方案12-19中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含标签，任选地亲和标签。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述标签是聚组氨酸(His标签)。
22.根据实施方案12-21中任一项所述的方法，其中：
所述PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％纯的；和/或
所述PNGase F包含少于或少于约10％、少于或少于约8％、少于或少于约5％、少于或少于约2％的非PNGase F蛋白质污染物；和/或
所述PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％同质的，任选地如通过SDS-PAGE和蛋白质染色、任选地考马斯蓝染色所确定。
23.根据实施方案11-22中任一项所述的方法，其中所述N-糖苷酶、任选地PNGaseF是处于在35°℃与39°℃之间、任选地约37°℃的温度下孵育不超过12小时之后从一种或多种天然或非变性糖蛋白和/或从所述细胞组合物的所述细胞释放所述一种或多种N-聚糖的酶促有效量。
24.根据实施方案23所述的方法，其中所述酶促有效量是在如下的温度下孵育不超过15分钟至3小时或30分钟至2小时之后用以释放所述一种或多种N-聚糖的量：在25°℃与39°℃之间或在35°℃与39°℃之间，每个都包含端值，任选地约37°℃。
25.根据实施方案23或实施方案24所述的方法，其中所述酶促有效量的PNGase F释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于所述一种或多种糖蛋白上和/或存在于所述细胞组合物的表面上的N-聚糖。
26.根据实施方案1-25中任一项所述的方法，其中所述孵育的条件足以实现释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于所述测试细胞组合物的表面上的N-聚糖。
27.根据实施方案11-26中任一项所述的方法，其中N-糖苷酶、任选地PNGase F的所述量为1单位至5000单位、1单位至1000单位、1单位至500单位、1单位至250单位、1单位至100单位、1单位至50单位、1单位至25单位、25单位至5000单位、25单位至1000单位、25单位至500单位、25单位至250单位、25单位至100单位、25单位至50单位、50单位至5000单位、50单位至1000单位、50单位至500单位、50单位至250单位、50单位至100单位、100单位至5000单位、100单位至1000单位、100单位至500单位、100单位至250单位、250单位至5000单位、250单位至1000单位、250单位至500单位、500单位至5000单位、500单位至1000单位、或1000单位至5000单位，每个都包含端值。
28.根据实施方案11-27中任一项所述的方法，其中N-糖苷酶、任选地PNGase F的所述量为大于或大于约或者为或为约1单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、50单位、100单位、250单位、500单位、1000单位、2500单位或5000单位。
29.根据实施方案27或实施方案28所述的方法，其中一个单位是足以在37°℃下在30分钟内催化1纳摩尔变性核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的N-糖苷酶、任选地PNGaseF的量。
30.根据实施方案27或实施方案28所述的方法，其中500单位是N-糖苷酶、任选地PNGase F足以在37°℃或室温下催化在1XPBS中孵育5-10分钟的10μg核糖核酸酶B(RNaseB)的去糖基化的量。
31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是持续如下的时间量：在或在约5分钟与12小时之间、30分钟与6小时之间或1小时与3小时之间，每个都包含端值。
32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是持续至少或至少约或者为或为约5分钟、约10分钟、约15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是持续约30分钟。
34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是在25°℃与39°℃之间或在35°℃与39°℃之间的温度下。
35.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是在约37°℃的温度下。
36.根据实施方案1-35中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的所述孵育是在约37°℃的温度下持续约30分钟。
37.根据实施方案1-36中任一项所述的方法，其中在对样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平的所述确定之前，所述方法还包括用可检测标记、任选地荧光标记对来自所述样品的聚糖进行标记。
38.根据实施方案14-37中任一项所述的方法，其中所述标记是荧光标记，并且所述荧光标记是或包括2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。
39.根据实施方案14-38中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括喹啉基荧光团。
40.根据实施方案14-39中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团。
41.根据实施方案14-40中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括碱性叔胺。
42.根据实施方案14-37和39-41中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和叔胺。
43.根据实施方案1-42中任一项所述的方法，其中在确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平之前，对所述样品进行聚糖纯化或富集。
44.根据实施方案43所述的方法，其中聚糖纯化或富集通过固相萃取(SPE)进行。
45.根据实施方案1-44中任一项所述的方法，其中确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份/或水平包括对所述样品进行质谱。
46.根据实施方案45所述的方法，所述质谱是电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-MS)和基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)。
47.根据实施方案45或46所述的方法，其中所述质谱是MALDI-MS。
48.根据实施方案1-47中任一项所述的方法，其中确定聚糖的存在、不存在、身份和/或水平包括对所述样品进行液相色谱(LC)，随后进行质谱。
49.根据实施方案48所述的方法，其中所述液相色谱是高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)或超效液相色谱(UPLC)。
50.根据实施方案48或实施方案49所述的方法，其中所述液相色谱是超效液相色谱(UPLC)。
51.根据实施方案48-50中任一项所述的方法，其中所述液相色谱和质谱是联机进行。
52.根据实施方案48-51中任一项所述的方法，其中所述液相色谱选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水性相互作用色谱(HILIC)。
53.根据实施方案48-52中任一项所述的方法，其中所述液相色谱是亲水性相互作用色谱(HILIC)。
54.根据实施方案45-53中任一项所述的方法，其中所述质谱包括电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱或声波喷雾电离质谱。
55.根据实施方案45-54中任一项所述的方法，其中所述质谱包括ESI-MS。
56.根据实施方案45-55中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱(MS/MS)。
57.根据实施方案45-56中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联ESI-质谱(ESI-MS/MS)。
58.根据实施方案45-57中任一项所述的方法，其中执行所述质谱的质谱仪包含四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述质谱仪包含离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。
60.根据实施方案45-59中任一项所述的方法，其中所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。
61.根据实施方案1-60中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的所述确定包括针对分支、单糖之间的连接和/或单糖的位置分析一种或多种聚糖结构。
62.根据实施方案1-61中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
63.根据实施方案1-62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中对所述样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平的所述确定包括确定至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖的存在、不存在、身份和/或水平。
65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中将所述样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为是否至少100amol、至少500amol、至少1fmol、至少5fmol、或至少10fmol的所述聚糖种类存在于所述样品中。
66.根据实施方案1-65中任一项所述的方法，其中将所述样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为聚糖种类是否构成所述样品中的总聚糖的至少0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、或0.01％。
67.根据实施方案62-65中任一项所述的方法，其中聚糖的所述种类是N-聚糖的种类。
68.根据实施方案1-67中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物是或包含至少一部分的源细胞组合物，所述至少一部分的源细胞组合物包含所述多种细胞。
69.根据实施方案1-68中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞或者所述测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。
70.根据实施方案1-69中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞或者所述测试细胞组合物包含人细胞。
71.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述细胞包含干细胞或者所述测试细胞组合物包含干细胞。
72.根据实施方案71所述的方法，其中所述干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
73.根据实施方案1-70中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。
74.根据实施方案1-70和73中任一项所述的方法，其中：
所述细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者
所述测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。
75.根据实施方案1-74中任一项所述的方法，其中所述细胞包含免疫细胞，或者所述测试细胞组合物包含免疫细胞。
76.根据实施方案75所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
77.根据实施方案1-76中任一项所述的方法，其中所述细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者所述测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。
78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含：
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中分离的细胞；和/或
用编码重组蛋白的病毒载体转导的细胞；和/或
在一种或多种测试剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育的细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增的细胞；和/或
冷冻保存的细胞和/或包含冷冻保护剂的细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制用于给予至受试者的细胞。
79.根据实施方案78所述的方法，其中所述测试剂是用于调节所述测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增的候选物。
80.根据实施方案78或实施方案79所述的方法，其中所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
81.根据实施方案80的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述一级药剂特异性地结合CD3，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
83.根据实施方案80-82中任一项所述的方法，其中刺激试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段以及抗CD28抗体或其抗原结合片段。
84.根据实施方案80-83中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
85.根据实施方案84所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
86.根据实施方案1-85中任一项所述的方法，其中所述细胞表达重组受体或者所述测试组合物包含表达重组受体的细胞。
87.根据实施方案86所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
88.根据实施方案86或实施方案87所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
90.根据实施方案88或实施方案89所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
91.根据实施方案88-90中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、***受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
92.根据实施方案88-91中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
93.根据实施方案88-92中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
94.一种测定细胞组合物的方法，所述方法包括：
根据实施方案1-91中任一项所述的方法，评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱；并且
将所述样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较。
95.一种测定细胞组合物的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面谱进行比较，其中所述样品的细胞表面聚糖谱是或已经根据实施方案1-93中任一项所述的方法从包含多种细胞的测试细胞组合物确定。
96.根据实施方案94或实施方案95所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地不同种类的N-聚糖。
97.根据实施方案94-96中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
98.根据实施方案94-97所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
99.根据实施方案94-98中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包括表E1中的聚糖或其亚组。
100.根据实施方案94-99中任一项所述的方法，其中所述参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。
101.根据实施方案94-100中任一项所述的方法，其中只有当所述组合物的细胞表面聚糖谱与所述参考样品基本上相同和/或只有当所述样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟所述参考样品中存在的所述靶聚糖或所述多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差不超过25％、不超过20％或不超过10％的时候，才将所述细胞组合物释放用于治疗受试者。
102.根据实施方案101所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖。
103.根据实施方案101或实施方案102所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
104.根据实施方案101-103中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
105.根据实施方案101-104中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
106.根据实施方案101-105中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
107.根据实施方案95-99中任一项所述的方法，其中所述参考样品是来自不同细胞组合物的细胞表面聚糖谱。
108.根据实施方案107所述的方法，其中所述不同的细胞组合物来自用于生产所述测试细胞组合物或源细胞组合物的制造过程的不同阶段，从所述源细胞组合物已经衍生或获得所述测试组合物，其中所述制造过程的所述阶段任选地是所述制造过程的先前阶段。
109.根据实施方案108所述的方法，其中所述制造过程包括选自以下的一个或多个阶段：
通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中选择细胞；和/或
将重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体引入细胞；和/或
在一种或多种测试剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或
在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制细胞用于给予至受试者。
110.根据实施方案107-109中任一项所述的方法，其中在所述测试组合物与所述参考样品之间的聚糖谱的差异表明在所述制造过程中的所述不同阶段生产的细胞中在细胞中存在一个或多个差异。
111.根据实施方案110所述的方法，其中如果所述组合物的细胞表面聚糖谱与所述参考样品基本上不同，和/或如果所述样品中存在的靶聚糖或一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟所述参考样品中存在的所述靶聚糖或所述一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高，则所述聚糖谱的所述差异存在。
112.根据实施方案111所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
113.根据实施方案110或实施方案112所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
114.根据实施方案111-113中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
115.根据实施方案111-114中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
116.根据实施方案111-115中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
117.根据实施方案111-116中任一项所述的方法，其中所述一个或多个差异与所述细胞的功能活性或表型相关。
118.根据实施方案117所述的方法，其中所述功能活性或表型包含细胞表面标记的掩蔽、代谢活性、分化状态、增殖或扩增能力、激活状态、细胞溶解活性、信号传导活性、粘附特性或归巢特性中的一种或多种。
119.根据实施方案111-118中任一项所述的方法，其还包括调节或改变用于制造所述细胞组合物的过程。
120.根据实施方案108-119中任一项所述的方法，其中所述参考标准品包括在由所述过程生产的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
121.一种用于制造细胞组合物的方法，所述方法包括
将包含多种细胞的输入组合物与一种或多种药剂和/或在一种或多种条件下孵育和/或接触，从而产生所述细胞组合物，
其中所述细胞组合物包含在遗传上、在表型上和/或在功能上与来自所述输入组合物的一种或多种细胞不同的一种或多种细胞，并且
其中所述细胞组合物包含含有细胞表面聚糖谱的一种或多种细胞，所述细胞表面聚糖谱包含一种或多种靶聚糖，和/或在所述细胞表面聚糖谱中的所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过25％，其中所述细胞表面聚糖谱包含从所述细胞组合物中的细胞的表面释放的聚糖。
122.根据实施方案121所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖是根据实施方案1-93中任一项所述的方法来确定。
123.根据实施方案121或实施方案122所述的方法，其中所述细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。
124.根据实施方案121-123中任一项所述的方法，其中在所述孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：细胞洗涤、稀释、分离、选择、分开、培养、刺激、引入重组核酸、冷冻保存、配制和/或包装。
125.根据实施方案121-124中任一项所述的方法，其中在孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中分离细胞；和/或
将重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体引入细胞；和/或
在一种或多种药剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或
在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制细胞用于给予至受试者。
126.根据实施方案121-125中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
127.根据实施方案121-126中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂或条件包括刺激条件、肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子、和/或重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体。
128.根据实施方案121-127中任一项所述的方法，其中所述药剂调节所述细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增。
129.实施方案125-127中任一项的方法，其中所述刺激条件包括与刺激剂一起孵育，所述刺激剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
130.根据实施方案129的方法，其中所述刺激剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
131.根据实施方案130所述的方法，其中所述一级药剂特异性地结合CD3，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
132.根据实施方案129-131中任一项所述的方法，其中刺激剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段。
133.根据实施方案129-132中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
134.根据实施方案133所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
135.根据实施方案125-127和129-134中任一项所述的方法，其中所述刺激条件包括存在一种或多种细胞因子，任选地IL-2、IL-15和/或IL-7。
136.根据实施方案121-135中任一项所述的方法，其中所述参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。
137.根据实施方案121-136中任一项所述的方法，其中所述参考样品包括通过将所述源组合物与所述一种或多种药剂和/或在所述一种或多种条件下的孵育和/或接触产生的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
138.根据实施方案121-137中任一项所述的方法，其中包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％。
139.根据实施方案121-138中任一项所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
140.根据实施方案121-139中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
141.根据实施方案121-140中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
142.根据实施方案121-141中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
143.根据实施方案121-142中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
144.一种用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括：
评估来自测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物；并且
将所述样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，所述参考样品包含一种或多种靶聚糖。
145.一种用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，其中所述样品来自测试细胞组合物，所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物。
146.根据实施方案144或实施方案145所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含在所述样品中一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平。
147.根据实施方案145-146中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱是根据实施方案1-93中任一项所述的方法来确定的。
148.根据实施方案144-147中任一项所述的方法，其中所述参考样品源自除了没有在所述一种或多种测试剂或条件的存在下或者在一种或多种替代性测试剂或条件的存在下处理之外在与所述测试细胞组合物或源组合物相同或基本上相同的条件下孵育或处理过的组合物。
149.根据实施方案144-147中任一项所述的方法，其中所述参考样品包括在所述一种或多种测试剂或条件的存在下孵育或处理过的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
150.根据实施方案144-149中任一项所述的方法，其中所述一种或多种测试剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
151.根据实施方案144-150中任一项所述的方法，其中所述一种或多种测试剂或条件包括来自测试化合物文库的一种或多种化合物。
152.根据实施方案144-151中任一项所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
153.根据实施方案144-152中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
154.根据实施方案144-153中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
155.根据实施方案144-154中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
156.根据实施方案144-155中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
157.根据实施方案144-156中任一项所述的方法，所述方法包括如果所述比较表明所述样品的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种与所述参考样品基本上相同，和/或如果所述比较表明包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％，则选择所述一种或多种测试剂或条件用于孵育或处理所述细胞。
158.根据实施方案144-156中任一项所述的方法，所述方法包括如果所述比较表明所述样品的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种与所述参考样品基本上不同，和/或如果所述比较表明包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则用一种或多种另外的测试剂或条件重复所述方法。
159.根据实施方案144-156中任一项所述的方法，其中所述测试剂是用于调节所述测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、激活和/或扩增的候选物。
160.根据实施方案144-159中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。
161.根据实施方案125-160中任一项所述的方法，其中所述重组核酸编码重组蛋白，任选地重组受体。
162.根据实施方案160所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
163.根据实施方案161或实施方案162所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
164.根据实施方案163所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
165.根据实施方案163或实施方案164所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
166.根据实施方案163-165中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自ROR1、B细胞成熟抗原(BCMA)、碳酸酐酶9(CAIX)、tEGFR、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、L1-CAM、CD19、CD20、CD22、间皮素、CEA和乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、存活蛋白、TAG72、B7-H6、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、CA9、GD3、HMW-MAA、CD171、G250/CAIX、HLA-AI MAGE Al、HLA-A2 NY-ESO-1、PSCA、叶酸受体-a、CD44v6、CD44v7/8、avb6整合素、8H9、NCAM、VEGF受体、5T4、胎儿AchR、NKG2D配体、CD44v6、双重抗原、癌症-睾丸抗原、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、PSCA、NKG2D、NY-ESO-1、MART-1、gp100、癌胚胎抗原、ROR1、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、Her2/neu、***受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、c-Met、GD-2、O-乙酰化GD2(OGD2)、CE7、Wilms肿瘤1(WT-1)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CCL-1、CD138、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
167.根据实施方案163-166中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
168.根据实施方案163-167中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
169.根据实施方案121-168中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞或者所述测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。
170.根据实施方案121-169中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞或者所述测试细胞组合物包含人细胞。
171.根据实施方案121-168中任一项所述的方法，其中所述细胞包含干细胞或者所述测试细胞组合物包含干细胞。
172.根据实施方案171所述的方法，其中所述干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
173.根据实施方案121-170中任一项所述的方法，其中所述组合物或所述测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。
174.根据实施方案121-170和1713中任一项所述的方法，其中：
所述细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者
所述测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。
175.根据实施方案121-174中任一项所述的方法，其中所述细胞包含免疫细胞，或者所述测试细胞组合物包含免疫细胞。
176.根据实施方案175所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
177.根据实施方案121-176中任一项所述的方法，其中所述细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者所述测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。
178.根据实施方案1-177中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
179.一种检测细胞组合物中一种或多种物质的存在、不存在、身份和/或水平的方法，所述方法包括：
根据实施方案1-93中任一项所述的方法，评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述多种细胞来自或源自一种细胞类型；并且
鉴定在所述细胞表面聚糖谱中的不是由所述细胞类型的细胞合成和/或表达的一种或多种非天然聚糖。
180.根据实施方案179所述的方法，其中所述细胞类型是人的。
181.根据实施方案179或180所述的方法，其中所述细胞类型是免疫细胞。
182.根据实施方案180或181中任一项所述的方法，其中所述细胞类型是T细胞。
183.根据实施方案179-182中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物通过在所述物质的存在下培养和/或孵育所述多种细胞来生产，所述物质包含含有一种或多种非天然聚糖的至少一种蛋白质。
184.根据实施方案183所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是白蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、胰岛素或胰岛素样肽、转铁蛋白或超氧化物歧化酶。
185.根据实施方案183或184所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是重组蛋白。
186.根据实施方案183-185中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质存在于血清中。
187.根据实施方案186所述的方法，其中所述血清是胎牛血清(FBS)、牛犊血清(BCS)、新生牛血清(NBCS)、马血清、山羊血清、羔羊血清、驴血清或猪血清。
188.根据实施方案179-187中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质(i)不是由来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞产生和/或(ii)不是在来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞的表面上表达。
189.根据实施方案179-188中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖包含非人聚糖。
190.根据实施方案179-189中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种非天然聚糖的所述鉴定包括将所述表面聚糖谱与参考聚糖谱进行比较，其中所述参考样品是来自含有所述一种或多种非天然聚糖的来源的聚糖谱。
191.根据实施方案189或190所述的方法，其中所述参考聚糖谱由参考样品产生，所述参考样品包含尚未与所述多种细胞接触、孵育和/或暴露于所述多种细胞的物质，任选地其中所述物质是或包含培养基、血清或其组分或者是蛋白质或其重组蛋白。
VI.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：对细胞组合物的表面N-连接的聚糖绘图
为了绘制细胞组合物的细胞表面N-连接的聚糖谱，将含有表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞的示例性冷冻保存T细胞组合物单独解冻，在加热至37°℃的细胞培养基中以1:10稀释，并且将1-2.5x106个细胞的样品转移到新鲜管中。
将转移的细胞样品离心并在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤，随后用约198μL PBS重构细胞悬浮液。将约2μL PNGase F PRIME(N-Zyme Scientifics；可获自Bulldog Bio，目录号NZPP050)添加到含有整个完整细胞的细胞悬浮液中，随后伴随轻轻混合在37°℃下孵育30分钟。为了获得释放的表面N-聚糖，将细胞悬浮液离心并将上清液收集到干净的管中，将所述管立即通过真空离心蒸发至干燥。
将干燥后的N-聚糖在30μL水中重构，并添加5μL的标记试剂，所述标记试剂由N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和碱性叔胺构成(GlycoworksTMRapiFluor-MSTM标记，目录号715004793，Waters Corporation，马萨诸塞州)。将样品混合，在室温下孵育约5分钟，随后通过向样品中添加约365μL乙腈来淬灭标记。将样品混合并离心。在进一步分析之前，对样品进行固相萃取(SPE)以进一步清理N-聚糖。用真空离心机将N-聚糖样品蒸发至干燥，并且然后重悬于适当的稀释剂中以用于分析。
使用HILIC液相色谱将聚糖分离，并通过荧光(Waters ACQUITY I-Class)进行检测(HILIC-FLR)，并通过质谱(正电喷雾电离(ESI)，Q-ExactiveTM HF(Thermo Scientific))(即HILIC-ESI-MS)进行相对定量和鉴定。
表E1列出了使用此方法检测的示例性糖的保留时间(RT)、以及单一同位素质量和+2、+3和/或+4电荷状态的质量。
表E1：示例性聚糖的保留时间和质量
Figure BDA0002307717810001471
Figure BDA0002307717810001481
Figure BDA0002307717810001491
在从来自健康人供体的白细胞分离术样品对CD4+和CD8+细胞群进行基于免疫亲和力的富集后，对通过如下过程产生的示例性T细胞组合物实施上述方法，所述过程涉及单独产生源自同一受试者的工程化T细胞的CD4+和CD8+群体。用编码抗CD19 CAR的病毒载体激活并转导所分离的CD4+和CD8+T细胞群，然后对工程化细胞群进行扩增和冷冻保存。抗CD19 CAR含有衍生自鼠类抗体的抗CD19 scFv、Ig源间隔子、人CD28源跨膜结构域、人4-1BB源细胞内信号传导结构域和人CD3ζ源信号传导结构域。来自工程化CD8+T细胞组合物的细胞表面N-聚糖的带注释的HILIC-FLR色谱图描绘于图2A中，并且证明了在组合物中的细胞表面上存在N-聚糖类型的复杂混合物，包括高甘露糖N-聚糖、平分型聚糖和唾液酸化路易斯x聚糖的存在。
在另一个例子中，对通过如下过程产生的替代性示例性抗CD19 CAR T细胞组合物实施所述方法，所述过程涉及从白细胞分离术样品对T细胞(包括CD4+和CD8+细胞)进行基于免疫亲和力的选择，随后用编码抗CD19 CAR的病毒载体进行激活和转导、进行扩增并冷冻保存。CAR含有衍生自鼠类抗体的抗CD19 scFv；包括细胞外区域、跨膜结构域和共刺激区域的CD28区域；以及CD3-ζ细胞内信号传导结构域。通过组合物的HILIC-ESI-MS分析产生的在图3A中的带注释的HILIC-FLR色谱图和图3B中的总离子流色谱图(TIC)类似地展示了含有N-聚糖类型的复杂混合物的N-聚糖谱。
这些结果证实，有可能获得从整个完整细胞表面释放的N-聚糖的高分辨率图，从而证明所述方法可以用于产生细胞组合物的N-聚糖图以表征整个细胞表面糖基化状态。
实施例2：通过HILIC和串联正电喷雾电离质谱(ESI-MS/MS)鉴定聚糖种类
为了确认聚糖的鉴定，采用高分辨率质谱鉴定聚糖，包括通过HILIC解析的同量异位种类。对示例性组合物进行所述分析，所述示例性组合物含有激活的CD3+T细胞，所述CD3+T细胞在用例如包被在磁珠上的抗CD3/抗CD28刺激后被激活。如实施例1中所述，将N-聚糖萃取、标记和处理。除使用串联质谱(MS/MS)之外，基本上如实施例1中所述进行HILIC-ESI-MS。通过HILIC将N-聚糖分离并通过荧光检测(HILIC-FLR)，并且ESI-MS/MS提供相对定量和鉴定。
如图4A所示，带注释的HILIC-FLR色谱图揭示了抗CD3/抗CD28激活的CD3+细胞的细胞表面N-聚糖图是聚糖类型的复杂混合物。
对于串联质谱(MS/MS)，在质谱的第一阶段将粒子通过ESI电离并通过其质荷比分离。图4B描绘了使用5ppm质量公差针对处于+3电荷状态的示例性A3S3F N-聚糖从质谱的第一阶段产生的提取离子色谱图(XIC)。观察到具有相同同位素分布的N-聚糖的多个色谱峰，这与聚糖结构的单糖单位之间可能存在的连接差异是一致的。在第一阶段之后，使聚糖经历碎片化，并且在MS/MS的第二阶段中将所得的碎片分离并进行测量。以15的归一化碰撞能量(NCE)通过高能量碰撞解离(HCD)破碎的示例性N-聚糖A3S4F的MS/MS碎片化示于图4C中。结合第一阶段的高分辨率MS数据，A3S4F的碎片化证实了在规范末端半乳糖残基处以及在同一触角的n-乙酰葡糖胺残基上的唯一位点处存在n-乙酰神经氨酸连接(图4C，框)。这些结果证明，根据通过HILIC-FLR进行的分离和检测，MS/MS结合高分辨率MS数据可以鉴定聚糖结构，包括独特的聚糖结构。
实施例3：比较不同细胞组合物的N-连接的聚糖谱
将实施例1中所述的整个完整细胞的N-聚糖绘图谱用于比较不同细胞组合物中的N-聚糖谱。
A.工程化CD4+和CD8+CAR+T细胞组合物的过程特征对N-聚糖谱的影响
将在生产用嵌合抗原受体(CAR)工程化的T细胞的示例性过程的各个步骤期间获得的细胞组合物进行比较以研究过程对细胞产物中的T细胞表面N-聚糖的影响。所述示例性过程通常涉及分离大量PBMC，随后基于免疫亲和力的选择产生选定的CD4+T细胞和选定的dCD8+T细胞，然后将其冷冻保存。将解冻的选定CD4+和/或CD8+T细胞单独与基于珠的激活试剂一起孵育，并用编码CAR的慢病毒载体进行转导。将转导的细胞在细胞因子的存在下孵育并扩增，并且随后冷冻保存。具体地，分析了以下组合物：(1)含有大量PBMC的细胞组合物，(2)含有通过基于免疫亲和力的选择而选择的选定CD4+或CD8+T细胞的解冻的冷冻保存细胞组合物；(3)含有在37°℃下在IL-2、IL-15和/或IL-7的存在下与抗CD3/抗CD28珠一起孵育18-24小时的选定T细胞的细胞组合物；(4)用编码CAR的慢病毒载体转导的细胞组合物；和(5)含有在冷冻保存之前在IL-2、IL-15和/或IL-17细胞因子的存在下进行扩增的CAR表达细胞的解冻的冷冻保存细胞组合物。使用基本上如实施例1中所述的程序评估来自上述细胞组合物中每一种的整个完整细胞的N-聚糖谱。
大量PBMC展现出包括双触角、三触角和四触角杂合型和复合型糖的高度异质的N-聚糖群体。对T细胞(CD4+和CD8+)的选择降低了聚糖图案的异质性，导致主要为双触角和三触角唾液酸化聚糖，与大多数细胞群相比四触角种类增加。通过抗CD3/抗CD28共刺激激活的CD4+细胞和CD8+细胞保留了双触角和三触角种类，而四触角种类减少了。
比较含有选定CD4+或CD8+T细胞组合物、CAR转导细胞或进一步扩增和冷冻保存的CAR转导细胞的T细胞组合物中的N-聚糖谱，包括高甘露糖N-聚糖、平分型聚糖和唾液酸化路易斯X聚糖的相同N-聚糖混合物存在于每种T细胞组合物中，但以不同的水平存在。图5A-5C提供了比较在细胞组合物中的CD4+和CD8+细胞中的特定高甘露糖N-聚糖(图5A)、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖(图5B)和含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖(图5C)的水平的细胞表面N-聚糖图叠加。这些结果总结在表E2中，表E2列出了在每种CD4+和CD8+组合物中为高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖、和含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖的N-聚糖百分比。
结果总体上显示，与选定的CD4+和CD8+T细胞组合物或CAR转导的细胞组合物相比，在来自含有进一步扩增和冷冻保存的CAR表达细胞的组合物的CD4+和CD8+细胞中表面高甘露糖种类聚糖增加、唾液酸化路易斯X N-聚糖增加、含有表面聚乳糖胺的N-聚糖减少。不希望受理论束缚，据猜测在一些情况下这些结果可能是由于在扩增和/或激活期间细胞组合物中发生的N-聚糖变化所致。在经历进一步扩增和冷冻保存的细胞产物组合物内，在CD4+和CD8+细胞组合物之间也观察到差异，其中相对于CD4+细胞组合物，CD8+细胞组合物在其表面上展现出实质上更多的平分型N-聚糖。
表E2：CD4+和CD8+细胞组合物中N-聚糖的百分比
Figure BDA0002307717810001521
B.过程特征对T细胞组合物的N-聚糖谱的影响
对在CAR+T细胞工程化期间采用的细胞组合物评估过程特征(例如选择和激活)对N-聚糖谱的影响。通过基于免疫亲和力的选择从大量PBMC中选择CD3+T细胞并将其冷冻保存。解冻后，将选定的CD3+T细胞与基于抗CD3/抗CD28珠的激活物一起孵育。具体地，分析了以下组合物：(1)含有外周血单核细胞的细胞组合物，(2)含有通过基于免疫亲和力的选择而选择的选定CD3+T细胞的细胞组合物；和(3)含有与抗CD3/抗CD28珠一起孵育的选定T细胞的细胞组合物。使用基本上如实施例1中所述的程序评估来自上述细胞组合物中每一种的整个完整细胞的N-聚糖谱。
如图6中的示例性HILIC-FLR色谱图所示，在表面N-聚糖(特别是对于表达的双触角/杂合体、平分型核心、和N-乙酰乳糖胺重复N-聚糖)的相对水平上观察到差异。基于在一种或多种其他组合物之间的增加(+或++)或减少(-)程度，在图6中突出显示了示例性的变化区域。这些结果与以下结论一致：处理细胞以产生工程化T细胞的步骤可能影响表面N-聚糖谱。
C.不同CAR-T细胞组合物的N-聚糖谱
将包含表达上述抗CD19 CAR的T细胞的CD4+和CD8+T细胞组合物的表面N-连接聚糖谱与含有表达替代性抗CD19 CAR的T细胞的细胞组合物和含有表达识别替代性靶抗原的CAR的T细胞的细胞组合物的N-聚糖谱进行比较。替代性抗CD19 CAR含有衍生自鼠类抗体的抗CD19 scFv(其不同于上述抗CD19 CAR的抗CD19 scFv)、人CD28的区域(包括细胞外区域、跨膜结构域和共刺激区域)和人CD3ζ细胞内信号传导结构域。识别替代性靶抗原的CAR包含人scFv、间隔子区、CD28跨膜结构域、4-1BB衍生的细胞内共信号传导序列、和CD3ζ衍生的细胞内信号传导结构域。生产每种细胞组合物的过程在各种特征方面也不同，所述特征例如为CD4+和CD8+细胞的存在、数量或比率、和/或用于活化、转导和/或扩增的条件。
使用基本上如实施例1中所述的程序评估来自细胞组合物的整个完整细胞的N-聚糖谱。如图7中所示，每种分析的组合物均展现出独特的细胞表面N-聚糖谱。表E2中总结了每种细胞组合物中示例性N-聚糖类型的百分比。在一些情况下，N-乙酰乳糖胺以存在于聚乳糖胺聚糖中的重复存在。
在含有替代性抗CD19 CAR的组合物中，约1％的细胞表面N-聚糖为平分型N-聚糖。此结果在超过十二种测试组合物中是一致的，所述测试组合物包含使用相似过程生产的表达替代性抗CD19 CAR的细胞。来自含有表达识别替代性靶抗原的CAR的细胞的细胞组合物的N-聚糖谱展示出高水平的平分型N-连接聚糖和唾液酸化路易斯X N-聚糖。
表E3：示例性N-聚糖类型的百分比
Figure BDA0002307717810001531
D.分析通过不同过程产生的工程化细胞的N-聚糖谱
通过与实施例1中所述的基本上相同的方法获得了包含表达上文在实施例3A中所述的示例性抗CD19 CAR的T细胞的三种不同CD4+T细胞组合物的表面N-连接聚糖谱。两种CD4+T细胞组合物从来自同一个体受试者的样品获得，其中一种通过与实施例3A中所述的示例性工程化过程(“示例性过程”)类似的方法生产，并且另一种CD4+T细胞组合物通过示例性替代性工程化过程(“替代性过程”)生产。从替代性方法生产来自另外的受试者样品的第二种CD4+T细胞组合物。
使用本质上如实施例1中所述的程序评估来自细胞组合物的整个完整细胞的N-聚糖谱。如图8中所示，在表面N-聚糖谱的单独的峰之间观察到差异。表E4总结了从CD4+T细胞组合物获得的观察到的平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖含量。
表E4：含有抗CD19 CAR表达细胞的CD4+T细胞组合物中的N-聚糖含量
为了进一步评估在细胞工程化过程期间使用的不同变量是否可能导致不同的表面N-聚糖谱，从获自同一个体受试者的样品产生了含有表达示例性抗CD19 CAR的T细胞的三种CD4+和三种CD8+T细胞组合物。除了它们在与在用于工程化和培养细胞的过程中使用的两个条件有关的方面不同之外，本质上通过基本上相同的工程化过程产生T细胞组合物。如图9和10所示，在CD4+(图9)和CD8+(图10)T细胞组合物中观察到的表面N-聚糖谱看起来是一致的，尽管观察到与平分型聚糖(箭头)对应的特定峰的变化。
E.含有CAR表达细胞的T细胞组合物的N-聚糖表面谱
通过实施例1中所述的方法获得包含表达上面实施例3A中所述的示例性抗CD19CAR或具有替代性靶抗原的CAR的T细胞的T细胞组合物的表面N-连接聚糖谱。从来自健康受试者的样品产生两种组合物，并且一个从患有与靶抗原相关的疾病的受试者(患者)获得。
使用本质上如实施例1中所述的程序评估来自细胞组合物的整个完整细胞的N-聚糖谱。如图11和12中所示，从抗CD19 CAR CD8+T细胞组合物(图11)和替代性CAR T细胞组合物(图12)获得的表面N-聚糖谱的单独的峰(参见箭头)中观察到差异。还观察到平分型与唾液酸化路易斯X N-聚糖含量之间的差异，并将其总结在表E5和E6中。
表E5：含有抗CD19 CAR表达细胞的CD8+T细胞组合物中的N-聚糖含量
Figure BDA0002307717810001551
表E6：含有表达靶向替代性抗原的CAR的细胞的T细胞组合物中的N-聚糖含量
Figure BDA0002307717810001552
结果表明，从不同供体产生的不同CAR T细胞组合物之间可能存在不同程度的表面N-聚糖谱变异性。所述观察结果符合表面N-聚糖谱分析以监测在产生细胞的过程期间的糖基化变化并利用N-聚糖谱作为监测从不同供体和/或使用相同或不同过程产生的细胞组合物的均匀性的参数的实用性。
实施例4：用表面N-聚糖谱分析检测物质
测试了表面N-聚糖谱分析检测来源于各种物质(例如，潜在的残留物质，如细胞组合物中存在的残留蛋白质)的聚糖的能力。此类物质可能包括在将细胞(包括表达重组受体例如CAR的细胞)工程化的过程中使用的血清蛋白、细胞因子或生长因子。
作为物质的一个例子，将胎牛血清(FBS)的样品与PNGase F PRIME一起孵育。将N-聚糖从样品收集并干燥。然后，与实施例1中所述类似，将N-聚糖在水中重构并标记，通过SPE清理，并使用HILIC-ESI-MS进行分析。如图13(顶图)中所示，产生了聚糖谱，其与聚糖谱绘图检测与FBS结合的N-聚糖的能力一致。
由含有表达在实施例3A中所述的示例性抗CD19 CAR的T细胞的CD4+和CD8+T细胞组合物产生N-聚糖谱。对于来自个体受试者的每个样品，通过不同的过程产生两种CAR T细胞组合物，所述过程在用于激活和培养细胞的条件上不同。两种过程都涉及与含有FBS的培养基一起孵育。如实施例1中所述产生表面N-聚糖谱。
来自通过不同过程生产的CD4+CAR T细胞组合物的示例性表面N-聚糖谱显示在图13中。在所有检测的CAR T细胞组合物(箭头)中都检测到来源于FBS的聚糖。检测到的来源于FBS的N-聚糖包括α-Gal(AG)和NGNA表位。这些表位不存在于灵长类动物中，这与非人来源(例如FBS)一致。α-gal表位构成从两种细胞组合物测量的总N-聚糖谱的小于1％。在此实验中，以与从FBS样品中观察到的相同比例在来自CAR T细胞组合物的谱中观察到FBS N-聚糖，这与FBS作为聚糖来源一致。在通过不同过程产生的CAR T细胞组合物中观察到N-聚糖谱中检测到的残留FBS N-聚糖的差异。在通过采用无血清培养基的过程产生的细胞组合物中未观察到非人聚糖。
实施例5：表面N-聚糖水平对T细胞活性的影响
从健康个体受试者产生含有表达CAR的细胞的混合CD4+和CD8+T细胞组合物并将其冷冻保存。将CAR T细胞组合物解冻，冲洗，并且然后用PNGase F(PNGase F Prime)处理30分钟以从细胞或唾液酸酶A 51去除表面聚糖或从细胞去除末端唾液酸残基。作为阴性对照，将细胞用单独的DPBS孵育。
冲洗来自T细胞组合物的细胞，并将每孔2.5x 104个CAR+T细胞与抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠一起孵育(珠刺激)，或与内源性表达CAR的靶抗原的细胞共培养(抗原刺激)。在14-18小时之后，从细胞培养物中收集培养基，并用IFN-γAlphaLISA试剂盒对细胞外IFN-γ进行定量。
如表E7中所示，与对照处理的细胞相比，从CAR T细胞的细胞表面去除N-聚糖或末端唾液酸残基导致在通过抗CD3/抗CD28抗体缀合的珠刺激后的IFN-γ产生增加。去除表面N-聚糖也增加了在与表达靶抗原的细胞共培养后的细胞外IFN-γ水平。这些数据与表面N-聚糖在影响T细胞活性中的作用一致。
表E7：在刺激CAR T细胞组合物后的细胞外IFN-γ水平
Figure BDA0002307717810001561
本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002307717810001591
Figure BDA0002307717810001601
Figure BDA0002307717810001611
序列表
<110> Juno Therapeutics, Inc
KODAMA, Paul K
KOWSKI, Tom
MUJACIC, Mirna
PRENTICE, Kenneth M
<120> 评估细胞表面糖基化的方法
<130> 735042010840
<150> US 62/485,897
<151> 2017-04-14
<150> US 62/515,515
<151> 2017-06-05
<160> 47
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<210> 1
<211> 354
<212> PRT
<213> 脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> PNGASE F
<400> 1
Met Arg Lys Leu Leu Ile Phe Ser Ile Ser Ala Tyr Leu Met Ala Gly
1 5 10 15
Ile Val Ser Cys Lys Gly Val Asp Ser Ala Thr Pro Val Thr Glu Asp
20 25 30
Arg Leu Ala Leu Asn Ala Val Asn Ala Pro Ala Asp Asn Thr Val Asn
35 40 45
Ile Lys Thr Phe Asp Lys Val Lys Asn Ala Phe Gly Asp Gly Leu Ser
50 55 60
Gln Ser Ala Glu Gly Thr Phe Thr Phe Pro Ala Asp Val Thr Thr Val
65 70 75 80
Lys Thr Ile Lys Met Phe Ile Lys Asn Glu Cys Pro Asn Lys Thr Cys
85 90 95
Asp Glu Trp Asp Arg Tyr Ala Asn Val Tyr Val Lys Asn Lys Thr Thr
100 105 110
Gly Glu Trp Tyr Glu Ile Gly Arg Phe Ile Thr Pro Tyr Trp Val Gly
115 120 125
Thr Glu Lys Leu Pro Arg Gly Leu Glu Ile Asp Val Thr Asp Phe Lys
130 135 140
Ser Leu Leu Ser Gly Asn Thr Glu Leu Lys Ile Tyr Thr Glu Thr Trp
145 150 155 160
Leu Ala Lys Gly Arg Glu Tyr Ser Val Asp Phe Asp Ile Val Tyr Gly
165 170 175
Thr Pro Asp Tyr Lys Tyr Ser Ala Val Val Pro Val Ile Gln Tyr Asn
180 185 190
Lys Ser Ser Ile Asp Gly Val Pro Tyr Gly Lys Ala His Thr Leu Gly
195 200 205
Leu Lys Lys Asn Ile Gln Leu Pro Thr Asn Thr Glu Lys Ala Tyr Leu
210 215 220
Arg Thr Thr Ile Ser Gly Trp Gly His Ala Lys Pro Tyr Asp Ala Gly
225 230 235 240
Ser Arg Gly Cys Ala Glu Trp Cys Phe Arg Thr His Thr Ile Ala Ile
245 250 255
Asn Asn Ala Asn Thr Phe Gln His Gln Leu Gly Ala Leu Gly Cys Ser
260 265 270
Ala Asn Pro Ile Asn Asn Gln Ser Pro Gly Asn Trp Ala Pro Asp Arg
275 280 285
Ala Gly Trp Cys Pro Gly Met Ala Val Pro Thr Arg Ile Asp Val Leu
290 295 300
Asn Asn Ser Leu Thr Gly Ser Thr Phe Ser Tyr Glu Tyr Lys Phe Gln
305 310 315 320
Ser Trp Thr Asn Asn Gly Thr Asn Gly Asp Ala Phe Tyr Ala Ile Ser
325 330 335
Ser Phe Val Ile Ala Lys Ser Asn Thr Pro Ile Ser Ala Pro Val Val
340 345 350
Thr Asn
<210> 2
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 间隔子(IgG4铰链)
<400> 2
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 3
<211> 36
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 间隔子(IgG4铰链)
<400> 3
Gly Ala Ala Thr Cys Thr Ala Ala Gly Thr Ala Cys Gly Gly Ala Cys
1 5 10 15
Cys Gly Cys Cys Cys Thr Gly Cys Cys Cys Cys Cys Cys Thr Thr Gly
20 25 30
Cys Cys Cys Thr
35
<210> 4
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 5
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 5
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 6
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 6
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 7
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A序列
<400> 7
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 8
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 截短的EGFR
<400> 8
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 9
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD28 Uniprot登录号P10747的氨基酸153-179
<400> 9
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 10
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> Uniprot登录号P10747的氨基酸114-179
<400> 10
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> Uniprot登录号P10747的氨基酸180-220
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD28(LL至GG)
<400> 12
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 13
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> 4-1BB(登录号Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 13
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD3ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD3ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> 尚未归类的特征
<223> CD3ζ
<400> 16
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 17
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 17
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
20 25 30
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 18
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 19
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 截短的EGFR
<400> 19
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 20
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> T2A序列
<400> 20
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2A序列
<400> 21
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2A序列
<400> 22
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 23
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> E2A序列
<400> 23
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 24
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> F2A序列
<400> 24
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 25
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 25
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 26
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR L1
<400> 26
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR L2
<400> 27
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR L3
<400> 28
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR H1
<400> 29
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR H2
<400> 30
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 CDR H3
<400> 31
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 32
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 VH
<400> 32
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 33
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 VL
<400> 33
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 34
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 scFv
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 35
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR L1
<400> 35
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR L2
<400> 36
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR L3
<400> 37
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR H1
<400> 38
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 39
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR H2
<400> 39
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 CDR H3
<400> 40
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 41
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 VH
<400> 41
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 42
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 VL
<400> 42
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 43
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 接头序列
<400> 43
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 44
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> SJ25C1 scFv
<400> 44
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 45
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 HC-CDR3
<400> 45
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 LC-CDR2
<400> 46
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> FMC63 LC-CDR3
<400> 47
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5

Claims (191)

1.一种评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括：
(a)将包含多种细胞的测试组合物在从所述测试组合物中的细胞表面释放一种或多种聚糖的条件下孵育，其中产生了包含一种或多种细胞表面聚糖的样品；并且
(b)确定所述样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱。
2.一种评估细胞表面聚糖的方法，所述方法包括确定样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱，其中所述样品包含在释放一种或多种聚糖的条件下孵育包含多种细胞的测试组合物之后从所述测试组合物中存在的细胞表面释放的所述一种或多种聚糖。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述聚糖是N-聚糖。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物中的细胞包含整个或完整细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞是活细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中：
在所述孵育之前不对所述测试细胞组合物进行均质化或声处理；和/或
在所述孵育之前不将所述测试细胞组合物与蛋白酶一起孵育，任选地其中所述蛋白酶是胰蛋白酶；和/或
在所述孵育之前或期间不将在所述测试细胞组合物中的细胞与提取一种或多种细胞表面蛋白或膜蛋白的药剂接触，任选地其中所述药剂是洗涤剂或蛋白酶，任选胰蛋白酶；和/或
在所述孵育期间少于10％的所述细胞被裂解和/或破裂。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含不超过5x 106个细胞。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含在1x106个与5x106个之间的细胞，包含端值。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有不超过1x108个细胞/mL的浓度。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有以下的浓度：在1x105个细胞/mL与1x108个细胞/mL之间，包含端值；在1x106个细胞/mL与5x107个细胞/mL之间，包含端值；或在5x106个细胞/mL与2.5x107个细胞/mL之间，包含端值。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述孵育是在N-糖苷酶的存在下进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述N-糖苷酶是肽N-糖苷酶(PNGase)F。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PNGase F是重组的。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖是一种或多种N-聚糖，并且其中所述方法包括：
(i)将来自所述测试组合物的1x106个与5x106个之间的细胞在从所述测试组合物的所述细胞表面释放所述一种或多种N-聚糖的条件下与重组PNGase F一起孵育；
(ii)将所述一种或多种N-聚糖用可检测标记、任选地荧光标记进行标记；并且
(iii)确定经标记的N-聚糖的存在、不存在或水平，从而评估所述样品的细胞表面聚糖谱。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含约1x106个至2.5x 106个细胞。
16.根据权利要求14或权利要求15所述的方法，其中所述测试细胞组合物具有在1x106个细胞/ml与5x107个细胞/ml之间的浓度。
17.根据权利要求12-16中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含脑膜炎脓毒性黄杆菌(Flavobacterium meningosepticum)的PGNase F或其具有酶促活性的部分或突变体。
18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列或其具有酶促活性的部分或突变体，或展现与SEQ ID NO:1至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列或是其具有酶促活性的部分。
19.根据权利要求12-18中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
20.根据权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述PNGase F包含标签，任选地亲和标签。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标签是聚组氨酸(His标签)。
22.根据权利要求12-21中任一项所述的方法，其中：
所述PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％纯的；和/或
所述PNGase F包含少于或少于约10％、少于或少于约8％、少于或少于约5％、少于或少于约2％的非PNGase F蛋白质污染物；和/或
所述PNGase F是大于或大于约90％、大于或大于约92％、大于或大于约95％、或大于或大于约98％同质的，任选地如通过SDS-PAGE和蛋白质染色、任选地考马斯蓝染色所确定。
23.根据权利要求11-22中任一项所述的方法，其中所述N-糖苷酶、任选地PNGase F是处于在35℃与39℃之间、任选地约37℃的温度下孵育不超过12小时之后从一种或多种天然或非变性糖蛋白和/或从所述细胞组合物的所述细胞释放所述一种或多种N-聚糖的酶促有效量。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述酶促有效量是在如下的温度下孵育不超过15分钟至3小时或30分钟至2小时之后用以释放所述一种或多种N-聚糖的量：在25℃与39℃之间或在35℃与39℃之间，每个都包含端值，任选地约37℃。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述酶促有效量的PNGase F释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于所述一种或多种糖蛋白上和/或存在于所述细胞组合物的表面上的N-聚糖。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述孵育的条件足以实现释放大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％、大于95％、大于99％的存在于所述测试细胞组合物的表面上的N-聚糖。
27.根据权利要求11-26中任一项所述的方法，其中N-糖苷酶、任选地PNGaseF的量为1单位至5000单位、1单位至1000单位、1单位至500单位、1单位至250单位、1单位至100单位、1单位至50单位、1单位至25单位、25单位至5000单位、25单位至1000单位、25单位至500单位、25单位至250单位、25单位至100单位、25单位至50单位、50单位至5000单位、50单位至1000单位、50单位至500单位、50单位至250单位、50单位至100单位、100单位至5000单位、100单位至1000单位、100单位至500单位、100单位至250单位、250单位至5000单位、250单位至1000单位、250单位至500单位、500单位至5000单位、500单位至1000单位、或1000单位至5000单位，每个都包含端值。
28.根据权利要求11-27中任一项所述的方法，其中N-糖苷酶、任选地PNGaseF的量为大于或大于约或者为或为约1单位、5单位、10单位、15单位、20单位、25单位、50单位、100单位、250单位、500单位、1000单位、2500单位或5000单位。
29.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中一个单位是N-糖苷酶、任选地PNGase F足以在37℃下在30分钟内催化1纳摩尔变性核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的量。
30.根据权利要求27或权利要求28所述的方法，其中500单位是N-糖苷酶、任选地PNGase F足以在37℃或室温下催化在1XPBS中孵育5-10分钟的10μg核糖核酸酶B(RNase B)的去糖基化的量。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是持续如下的时间量：在或在约5分钟与12小时之间、30分钟与6小时之间或1小时与3小时之间，每个都包含端值。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是持续至少或至少约或者为或为约5分钟、约10分钟、约15分钟、30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是持续约30分钟。
34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是在25℃与39℃之间或在35℃与39℃之间的温度下。
35.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是在约37℃的温度下。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中对所述测试组合物的孵育是在约37℃的温度下持续约30分钟。
37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中，在对样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平的所述确定之前，所述方法还包括用可检测标记、任选地荧光标记对来自所述样品的聚糖进行标记。
38.根据权利要求14-37中任一项所述的方法，其中所述标记是荧光标记，并且所述荧光标记是或包括2-氨基苯甲酰胺(2-AB)、2-氨基苯甲酸(2-AA)、2-氨基吡啶(PA)、2-氨基吖啶酮(AMAC)、2-氨基萘三磺酸(ANTS)、和1-氨基芘-3,6,8-三磺酸(APTS)、3-(乙酰氨基)-6-氨基吖啶(AA-Ac)、6-氨基喹啉(6-AQ)、7-氨基甲基-香豆素(AMC)、2-氨基(6-酰胺基-生物素基)吡啶(BAP)、9-芴基甲氧基羰基(FMOC)-酰肼、1,2-二氨基-4,5-亚甲基二氧基-苯(DMB)、或邻苯二胺(OPD)。
39.根据权利要求14-38中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括喹啉基荧光团。
40.根据权利要求14-39中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团。
41.根据权利要求14-40中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括碱性叔胺。
42.根据权利要求14-37和39-41中任一项所述的方法，其中所述荧光标记包括氨基甲酸酯标记基团、喹诺酮荧光团和叔胺。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中，在确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平之前，对所述样品进行聚糖纯化或富集。
44.根据权利要求43所述的方法，其中聚糖纯化或富集通过固相萃取(SPE)进行。
45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中确定所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份/或水平包括对所述样品进行质谱。
46.根据权利要求45所述的方法，所述质谱是电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱、声波喷雾电离质谱、表面增强激光解吸电离质谱(SELDI-MS)和基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI-MS)。
47.根据权利要求45或46所述的方法，其中所述质谱是MALDI-MS。
48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中确定聚糖的存在、不存在、身份和/或水平包括对所述样品进行液相色谱(LC)，随后进行质谱。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述液相色谱是高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱(UHPLC)或超效液相色谱(UPLC)。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的方法，其中所述液相色谱是超效液相色谱(UPLC)。
51.根据权利要求48-50中任一项所述的方法，其中所述液相色谱和质谱是联机进行的。
52.根据权利要求48-51中任一项所述的方法，其中所述液相色谱选自正相(NP-)、反相(RP)和亲水性相互作用色谱(HILIC)。
53.根据权利要求48-52中任一项所述的方法，其中所述液相色谱是亲水性相互作用色谱(HILIC)。
54.根据权利要求45-53中任一项所述的方法，其中所述质谱包括电喷雾电离质谱(ESI-MS)、涡轮喷雾电离质谱、纳喷雾电离质谱、热喷雾电离质谱或声波喷雾电离质谱。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述质谱包括ESI-MS。
56.根据权利要求45-55中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联质谱(MS/MS)。
57.根据权利要求45-56中任一项所述的方法，其中所述质谱包括串联ESI-质谱(ESI-MS/MS)。
58.根据权利要求45-57中任一项所述的方法，其中执行所述质谱的质谱仪包含四极杆、离子阱、飞行时间(TOF)或傅里叶变换离子回旋共振质量分析器中的一个或多个。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述质谱仪包含离子阱质量分析器，所述离子阱质量分析器是三维四极杆离子阱、圆柱形离子阱、线性四极杆离子阱或轨道阱质量分析器。
60.根据权利要求45-59中任一项所述的方法，其中所述质谱仪是四极杆轨道阱质谱仪。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的确定包括针对分支、单糖之间的连接和/或单糖的位置分析一种或多种聚糖结构。
62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
63.根据权利要求1-62中任一项所述的方法，其中所述一种或多种聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
64.根据权利要求1-63中任一项所述的方法，其中对所述样品中聚糖的存在、不存在、存在的聚糖的身份和/或水平的所述确定包括确定至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖的存在、不存在、身份和/或水平。
65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中将所述样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为是否至少100amol、至少500amol、至少1fmol、至少5fmol、或至少10fmol的所述聚糖种类存在于所述样品中。
66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中将所述样品中聚糖种类的存在或存在的聚糖种类的水平确定为聚糖种类是否构成所述样品中的总聚糖的至少0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、或0.01％。
67.根据权利要求62-66中任一项所述的方法，其中聚糖的所述种类是N-聚糖的种类。
68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物是或包含至少一部分的源细胞组合物，所述至少一部分的源细胞组合物包含所述多种细胞。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞或者所述测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。
70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞或者所述测试细胞组合物包含人细胞。
71.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述细胞包含干细胞或者所述测试细胞组合物包含干细胞。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
73.根据权利要求1-70中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。
74.根据权利要求1-70和73中任一项所述的方法，其中：
所述细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者
所述测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。
75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，其中所述细胞包含免疫细胞，或者所述测试细胞组合物包含免疫细胞。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
77.根据权利要求1-76中任一项所述的方法，其中所述细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者所述测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。
78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含:
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中分离的细胞；和/或
用编码重组蛋白的病毒载体转导的细胞；和/或
在一种或多种测试剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育的细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增的细胞；和/或
冷冻保存的细胞和/或包含冷冻保护剂的细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制用于给予至受试者的细胞。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述测试剂是用于调节所述测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增的候选物。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述刺激条件包括与刺激试剂一起孵育，所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
81.根据权利要求80所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
82.根据权利要求81所述的方法，其中所述一级药剂特异性地结合CD3，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
83.根据权利要求80-82中任一项所述的方法，其中刺激试剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段以及抗CD28抗体或其抗原结合片段。
84.根据权利要求80-83中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
85.根据权利要求84所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中所述细胞表达重组受体或者所述测试组合物包含表达重组受体的细胞。
87.根据权利要求86所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
88.根据权利要求86或权利要求87所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
90.根据权利要求88或权利要求89所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
91.根据权利要求88-90中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、***受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、***特异性抗原、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
92.根据权利要求88-91中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
93.根据权利要求88-92中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
94.一种测定细胞组合物的方法，所述方法包括：
(a)根据权利要求1-93中任一项所述的方法，评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱；并且
(b)将所述样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较。
95.一种测定细胞组合物的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面谱进行比较，其中所述样品的细胞表面聚糖谱是或已经根据权利要求1-93中任一项所述的方法从包含多种细胞的测试细胞组合物确定。
96.根据权利要求94或权利要求95所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地不同种类的N-聚糖。
97.根据权利要求94-96中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
98.根据权利要求94-97中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包括表E1中的聚糖或其亚组。
100.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中所述参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。
101.根据权利要求94-100中任一项所述的方法，其中只有当所述组合物的细胞表面聚糖谱与所述参考样品基本上相同和/或只有当所述样品中存在的靶聚糖或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟所述参考样品中存在的所述靶聚糖或所述多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差不超过25％、不超过20％或不超过10％的时候，才将所述细胞组合物释放用于治疗受试者。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖。
103.根据权利要求101或权利要求102所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
104.根据权利要求101-103中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
105.根据权利要求101-104中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
106.根据权利要求101-105中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
107.根据权利要求94-99中任一项所述的方法，其中所述参考样品是不同的细胞组合物。
108.根据权利要求107所述的方法，其中所述不同的细胞组合物来自用于生产所述测试细胞组合物或源细胞组合物的制造过程的不同阶段，从所述源细胞组合物已经衍生或获得所述测试组合物，其中所述制造过程的所述阶段任选地是所述制造过程的先前阶段。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述制造过程包括选自以下的一个或多个阶段：
通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中选择细胞；和/或
将重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体引入细胞；和/或
在一种或多种测试剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或
在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制细胞用于给予至受试者。
110.根据权利要求107-109中任一项所述的方法，其中在所述测试组合物与所述参考样品之间的聚糖谱的差异表明在所述制造过程中的所述不同阶段生产的细胞中在细胞中存在一个或多个差异。
111.根据权利要求110所述的方法，其中如果所述组合物的细胞表面聚糖谱与所述参考样品基本上不同，和/或如果所述样品中存在的靶聚糖或一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比跟所述参考样品中存在的所述靶聚糖或所述一种或多种靶聚糖中的每一种占总聚糖的百分比相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更高，则所述聚糖谱的所述差异存在。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
113.根据权利要求111或权利要求112所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
114.根据权利要求111-113中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
115.根据权利要求111-114中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
116.根据权利要求111-115中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
117.根据权利要求111-116中任一项所述的方法，其中所述一个或多个差异与所述细胞的功能活性或表型相关。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述功能活性或表型包含细胞表面标记的掩蔽、代谢活性、分化状态、增殖或扩增能力、激活状态、细胞溶解活性、信号传导活性、粘附特性或归巢特性中的一种或多种。
119.根据权利要求111-118中任一项所述的方法，其还包括：调节或改变用于制造所述细胞组合物的过程。
120.根据权利要求108-119中任一项所述的方法，其中所述参考标准品包括在由所述制造过程生产的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
121.一种用于制造细胞组合物的方法，所述方法包括
将包含多种细胞的输入组合物与一种或多种药剂和/或在一种或多种条件下孵育和/或接触，从而产生所述细胞组合物，
其中所述细胞组合物包含在遗传上、在表型上和/或在功能上与来自所述输入组合物的一种或多种细胞不同的一种或多种细胞，并且
其中所述细胞组合物包含含有细胞表面聚糖谱的一种或多种细胞，所述细胞表面聚糖谱包含一种或多种靶聚糖，和/或在所述细胞表面聚糖谱中的所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过25％，其中所述细胞表面聚糖谱包含从所述细胞组合物中的细胞的表面释放的聚糖。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖是根据权利要求1-93中任一项所述的方法来确定的。
123.根据权利要求121或权利要求122所述的方法，其中所述细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中在所述孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：细胞洗涤、稀释、分离、选择、分开、培养、刺激、引入重组核酸、冷冻保存、配制和/或包装。
125.根据权利要求121-124中任一项所述的方法，其中在孵育和/或接触之前、期间或之后，所述方法包括选自以下的一个或多个步骤：
通过白细胞分离术或单采术从生物样品中分离细胞；
通过基于免疫亲和力的方法从生物样品中分离细胞；和/或
将重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体引入细胞；和/或
在一种或多种药剂、任选地一种或多种肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子的存在下孵育细胞；和/或
在一种或多种刺激条件的存在下激活和/或扩增细胞；和/或
在冷冻保护剂的存在下冷冻保存细胞；和/或
任选地在药学上可接受的赋形剂的存在下配制细胞用于给予至受试者。
126.根据权利要求121-125中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
127.根据权利要求121-126中任一项所述的方法，其中所述一种或多种药剂或条件包括刺激条件、肽、蛋白质、多肽、核酸、小分子、和/或重组核酸、任选地编码重组蛋白的病毒载体。
128.根据权利要求121-127中任一项所述的方法，其中所述药剂调节所述细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、细胞内信号传导、激活和/或扩增。
129.根据权利要求125-128中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激条件包括与刺激剂一起孵育，所述刺激剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
130.根据权利要求129所述的方法，其中所述刺激剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合的一级药剂和与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂。
131.根据权利要求130所述的方法，其中所述一级药剂特异性地结合CD3，和/或所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
132.根据权利要求129-131中任一项所述的方法，其中所述刺激剂包含抗CD3抗体或其抗原结合片段和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段。
133.根据权利要求130-132中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和所述二级药剂包含抗体和/或存在于固体支持物的表面上。
134.根据权利要求133所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
135.根据权利要求125-134中任一项所述的方法，其中所述一种或多种刺激条件包括存在一种或多种细胞因子，任选地IL-2、IL-15和/或IL-7。
136.根据权利要求121-135中任一项所述的方法，其中所述参考样品是包含释放规范、标记要求或汇编规范的参考标准品。
137.根据权利要求121-136中任一项所述的方法，其中所述参考样品包括通过将所述源组合物与所述一种或多种药剂和/或在所述一种或多种条件下的孵育和/或接触产生的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
138.根据权利要求121-137中任一项所述的方法，其中包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％。
139.根据权利要求121-138中任一项所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
140.根据权利要求121-139中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
141.根据权利要求121-140中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
142.根据权利要求121-141中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
143.根据权利要求121-142中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
144.一种用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括：
(a)评估来自测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物；并且
(b)将所述样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，所述参考样品包含一种或多种靶聚糖。
145.一种用于对细胞组合物筛选一种或多种测试剂或条件的方法，所述方法包括将样品的细胞表面聚糖谱与参考样品的细胞表面聚糖谱进行比较，其中所述样品来自测试细胞组合物，所述测试细胞组合物是或源自在一种或多种测试剂或条件的存在下已孵育或处理过的源组合物。
146.根据权利要求144或权利要求145所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱包含在所述样品中一种或多种聚糖的存在、不存在、身份和/或水平。
147.根据权利要求145-146中任一项所述的方法，其中所述细胞表面聚糖谱是根据权利要求1-93中任一项所述的方法来确定的。
148.根据权利要求144-147中任一项所述的方法，其中所述参考样品源自除了没有在所述一种或多种测试剂或条件的存在下或者在一种或多种替代性测试剂或条件的存在下处理之外在与所述测试细胞组合物或源组合物相同或基本上相同的条件下孵育或处理过的组合物。
149.根据权利要求144-147中任一项所述的方法，其中所述参考样品包括在所述一种或多种测试剂或条件的存在下孵育或处理过的多种组合物中所述一种或多种靶聚糖的存在、不存在、身份和/或水平的平均值或中值。
150.根据权利要求144-149中任一项所述的方法，其中所述一种或多种测试剂或条件包括血清的存在或浓度；培养的时间；刺激剂的存在或量；刺激剂的类型或范围；氨基酸的存在或量；温度；源组合物的来源或细胞类型；在源组合物中细胞类型的比率或百分比，任选地CD4+/CD8+T细胞比率；珠的存在或量；细胞密度；静态培养；摇动培养；灌注；病毒载体的类型；载体拷贝数量；转导佐剂的存在；冷冻保存中源组合物的细胞密度；重组受体的表达程度；或调节细胞表型的化合物的存在。
151.根据权利要求144-150中任一项所述的方法，其中所述一种或多种测试剂或条件包括来自测试化合物文库的一种或多种化合物。
152.根据权利要求144-151中任一项所述的方法，其中所述靶聚糖包含至少25个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、或至少200个不同种类的聚糖，任选地其中聚糖的所述种类是N-聚糖。
153.根据权利要求144-152中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包括高甘露糖N-聚糖、平分型和唾液酸化路易斯X N-聚糖和/或含有N-乙酰乳糖胺的N-聚糖。
154.根据权利要求144-153中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含不具有还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、不具有还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有一个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个还原端末端半乳糖残基的双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和一个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的岩藻糖基化双触角复合型聚糖、具有两个半乳糖残基和两个N-乙酰神经氨酸残基的双触角复合型聚糖、具有五个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有六个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有七个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、具有八个甘露糖残基的高甘露糖聚糖、和/或具有九个甘露糖残基的高甘露糖聚糖。
155.根据权利要求144-154中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在表E1中存在的聚糖或其亚组。
156.根据权利要求144-155中任一项所述的方法，其中所述一种或多种靶聚糖包含在所述细胞表面聚糖谱中可检测到的聚糖。
157.根据权利要求144-156中任一项所述的方法，所述方法包括如果所述比较表明所述样品的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种与所述参考样品基本上相同，和/或如果所述比较表明包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差不超过或约20％、不超过或约15％、不超过或约10％或不超过或约5％，则选择所述一种或多种测试剂或条件用于孵育或处理所述细胞。
158.根据权利要求144-156中任一项所述的方法，所述方法包括如果所述比较表明所述样品的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种与所述参考样品基本上不同，和/或如果所述比较表明包含所述一种或多种靶聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种跟相对于所述参考样品中存在的总聚糖的细胞表面聚糖谱或所述一种或多种靶聚糖中的每一种相差大于或大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，则用一种或多种另外的测试剂或条件重复所述方法。
159.根据权利要求144-156中任一项所述的方法，其中所述测试剂是用于调节所述测试细胞组合物中的一种或多种细胞的生长、增殖、活力、分化、激活和/或扩增的候选物。
160.根据权利要求144-159中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物包含含有重组核酸的细胞。
161.根据权利要求125-160中任一项所述的方法，其中所述重组核酸编码重组蛋白，任选地重组受体。
162.根据权利要求160所述的方法，其中所述重组受体是或包含嵌合受体和/或重组抗原受体。
163.根据权利要求161或权利要求162所述的方法，其中所述重组受体能够结合靶抗原，所述靶抗原与疾病、障碍或病症的细胞或组织相关，对疾病、障碍或病症的细胞或组织是特异的，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
164.根据权利要求163所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。
165.根据权利要求163或权利要求164所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
166.根据权利要求163-165中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、III型表皮生长因子受体突变(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、***受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPCR5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶***结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达的黑色素瘤抗原(PRAME)、孕酮受体、***特异性抗原、***干细胞抗原(PSCA)、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。
167.根据权利要求163-166中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
168.根据权利要求163-167中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
169.根据权利要求121-168中任一项所述的方法，其中所述细胞包含哺乳动物细胞或者所述测试细胞组合物包含哺乳动物细胞。
170.根据权利要求121-169中任一项所述的方法，其中所述细胞包含人细胞或者所述测试细胞组合物包含人细胞。
171.根据权利要求121-170中任一项所述的方法，其中所述细胞包含干细胞或者所述测试细胞组合物包含干细胞。
172.根据权利要求171所述的方法，其中所述干细胞是诱导多能干细胞(iPSC)。
173.根据权利要求121-170中任一项所述的方法，其中所述组合物或所述测试细胞组合物包含在单采术产物或白细胞分离术产物中存在的细胞或由其衍生的细胞。
174.根据权利要求121-170和173中任一项所述的方法，其中：
所述细胞包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞；或者
所述测试细胞组合物包含免疫细胞、白细胞、外周血单核细胞(PBMC)、淋巴细胞或未分级的T细胞。
175.根据权利要求121-174中任一项所述的方法，其中所述细胞包含免疫细胞，或者所述测试细胞组合物包含免疫细胞。
176.根据权利要求175所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。
177.根据权利要求121-176中任一项所述的方法，其中所述细胞包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞，或者所述测试细胞组合物包含为CD4+和/或CD8+T细胞的T细胞。
178.根据权利要求1-177中任一项所述的方法，其中所述细胞是原代细胞。
179.一种检测细胞组合物中一种或多种物质的存在、不存在、身份和/或水平的方法，所述方法包括：
(a)根据权利要求1-93中任一项所述的方法，评估来自包含多种细胞的测试细胞组合物的样品中的细胞表面聚糖谱，其中所述多种细胞来自或源自一个细胞类型；并且
(b)鉴定在所述细胞表面聚糖谱中的不是由所述细胞类型的细胞合成和/或表达的一种或多种非天然聚糖。
180.根据权利要求179所述的方法，其中所述细胞类型是人的。
181.根据权利要求179或180所述的方法，其中所述细胞类型是免疫细胞。
182.根据权利要求180或181中任一项所述的方法，其中所述细胞类型是T细胞。
183.根据权利要求179-182中任一项所述的方法，其中所述测试细胞组合物通过在物质的存在下培养和/或孵育所述多种细胞来生产，所述物质包含含有一种或多种非天然聚糖的至少一种蛋白质。
184.根据权利要求183所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是白蛋白、生长因子、细胞因子、趋化因子、胰岛素或胰岛素样肽、转铁蛋白或超氧化物歧化酶。
185.根据权利要求183或184所述的方法，其中所述至少一种蛋白质是重组蛋白。
186.根据权利要求183-185中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质存在于血清中。
187.根据权利要求186所述的方法，其中所述血清是胎牛血清(FBS)、牛犊血清(BCS)、新生牛血清(NBCS)、马血清、山羊血清、羔羊血清、驴血清或猪血清。
188.根据权利要求179-187中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖和/或所述至少一种蛋白质(i)不是由来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞产生和/或(ii)不是在来自与所述多种细胞相同的目、科、属或种的细胞的表面上表达。
189.根据权利要求179-188中任一项所述的方法，其中所述一种或多种非天然聚糖包含非人聚糖。
190.根据权利要求179-189中任一项所述的方法，其中对所述一种或多种非天然聚糖的所述鉴定包括将所述表面聚糖谱与参考聚糖谱进行比较，其中所述参考样品是来自含有所述一种或多种非天然聚糖的来源的聚糖谱。
191.根据权利要求189或190所述的方法，其中所述参考聚糖谱由参考样品产生，所述参考样品包含尚未与所述多种细胞接触、孵育和/或暴露于所述多种细胞的物质，任选地其中所述物质是或包含培养基、血清或其成分、或者来自蛋白质或其重组蛋白，所述培养基、血清或其组分、或者所述蛋白质或其重组蛋白尚未与所述多种细胞接触、孵育和/或暴露于所述多种细胞。
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