CN109613244B - 一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域,提供了一种Ag@Pt‑CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用。本发明使用Au NPs@MWCNTs‑SO3H作为基底材料,同时利用Ag@Pt纳米粒子负载氨基化的CuS微球与检测抗体孵化作为信号标记以增强免疫传感器的催化性能,成功构建了Ag@Pt‑CuS标记的免疫传感器,从而实现了对肿瘤标志物CEA、AFP的检测,具备检测限低,灵敏度高,特异性强等优势,对肿瘤的早期检测具有重要的科学意义和应用价值。
Description
技术领域
本发明属于纳米功能材料、免疫分析以及生物传感技术领域,涉及一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用。具体是采用Ag@Pt-CuS为检测抗体标记物,实现了对肿瘤标志物CEA、AFP的灵敏检测。
背景技术
肿瘤是从正常的细胞转化而来的异质增生细胞,可在人体的多个器官和组织出现,在早期的时候不易被人们察觉,由于肿瘤的生长和转移速度极快,当人们察觉时往往为时已晚,这严重损害人们的健康并且危及生命。开发一种灵敏检测相关生物标志物对许多的生物医学和诊断研究方面至关重要。目前来说,肿瘤标志物检测的方法有很多种,如酶联免疫吸附剂测定,荧光免疫分析,放射免疫法等,除了这些技术,电化学免疫传感器由于其灵敏性高、检测限低、检测速度快、操作简便而受到了广泛的关注。
电化学免疫传感器是将免疫分析技术和生物传感技术相结合,用于测量电流、电位的变化来进行分析的。电化学免疫传感器是抗原抗体特异性结合所引起的电化学信号变化反映的,一般分为有标记型免疫传感器和无标记型免疫传感器。有标记型免疫传感器具有灵敏度高、检测限低、特异性高等优点,已广泛应用于多种领域。
Au NPs@MWCNTs-SO3H作为基底材料,不仅可以增大免疫传感器的比表面积而且可以发挥多壁碳纳米管导电性强的特点,提高电极的导电性,其中Au NPs是一种生物亲和性的材料可以结合更多的抗体,同时Au NPs导电性也非常好,可以加快电子的转移和传输。Ag@Pt-CuS作为检测抗体标记物,可以增加免疫传感器的灵敏度并提高其催化性能。CuS作为过渡金属硫化物半导体,具有良好的生物相容性,高电子传输性能和良好的导电性。Ag@Pt纳米粒子具有很强的催化性能,可以进一步提高免疫传感器的灵敏度。本发明采用金纳米粒子负载磺化的多壁碳纳米管作为基底材料,Ag@Pt-CuS作为检测抗体标记物构建的标记型免疫传感器,实现了对肿瘤标志物CEA的检测,具有检测限低,灵敏度高,重复性、选择性和稳定性好等优点,在临床应用中实现了对肿瘤标志物的精确检测。
发明内容
本发明提供了一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法及应用,实现了对肿瘤标志物的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器应用于肿瘤标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案,包括以下步骤。
1.一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面,超纯水清洗干净;
(2)将6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液滴涂于上述电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 °C冰箱中干燥;
(4)继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面的非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,除去未结合的BSA,4 °C冰箱中晾干;
(5)继续滴加6 µL、10pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(6)继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液于电极表面,置于4°C冰箱中孵化40 min,超纯水冲洗、晾干,制得一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器。
2.所述Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液的制备,步骤如下:
(1)Au NPs溶液的制备
将1~3mL、质量分数为1%氯金酸和99 mL超纯水混合,在100°C下回流15min,然后加入1~3 mL、10mg/mL的柠檬酸钠溶液,并保持搅拌10~30 min,制得均匀分散的酒红色Au NPs溶液;
(2)MWCNTs-SO3H的制备
首先将MWCNTs在60°C的真空干燥箱中干燥24h,然后在三口烧瓶中依次加入1gMWCNTs,30mL浓H2SO4和10mL浓HNO3,超声10min分散均匀,后在搅拌下120°C回流20~40min,冷却至室温,过滤;黑色沉淀超纯水洗涤过滤至中性,60°C真空干燥箱干燥8~12 h,制得MWCNTs-SO3H;
(3)Au NPs@MWCNTs-SO3H的制备
将5~15mgMWCNTs-SO3H分散在5~15mL的Au NPs溶液中,超声分散1h,聚四氟乙烯滤膜抽滤,产物于30°C的真空干燥箱中干燥8~ 12h,得到Au NPs@MWCNTs-SO3H。
3.所述检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备,步骤如下:
(1)Ag@Pt纳米粒子的制备
搅拌状态下,将0.05~0.15mL、1mol·L-1的KOH,2~4mL、0.01 mol/L的抗坏血酸和0.05g的PVP加入到2mL的超纯水中,然后将4mL、0.002 mol/L的AgNO3逐滴加入到上述溶液中,随后继续滴加4mL、0.002 mol/L的H2PtCl6,60°C下搅拌1h,产物用体积比为1:1的无水乙醇超纯水混合液离心洗涤三次,超声分散于5mL超纯水中制得Ag@Pt纳米粒子分散液备用;
(2)CuS微球的制备
室温下,将1gPVP溶于40mL超纯水中,后加入0.5g Cu(NO3)▪3H2O混合,继续依次加入20 ~ 40 mL乙二醇和0.2~0.4 g硫脲,连续搅拌1h后,将产物转移至三口烧瓶中,搅拌状态下160°C回流2h,得到黑色悬浮液,自然冷却至室温,离心,无水乙醇洗涤三次,在60°C真空干燥箱干燥8~12h,制得CuS微球;
(3)Ag@Pt-CuS的制备
将0.1gCuS微球和0.1~0.3mLAPTES依次加入到5~15mL无水乙醇中,油浴锅中加热至90°C并保持回流1~3h;冷却至室温,离心,无水乙醇和超纯水洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥制得氨基化的CuS微球;
将3mg氨基化CuS微球加入到3mLAg@Pt纳米粒子分散液中,超声1h,离心,用无水乙醇洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥12h;
(4)检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备
将1~3mL、2mg/mL的Ag@Pt-CuS分散液加入到0.5~1.5mL、10μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2溶液中,恒温振荡箱中震荡孵化12h;离心分离,重新分散至1~3mL的pH=7.38的磷酸缓冲溶液中,制得检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液,4°C保存备用。
4.肿瘤标志物的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL、含10 mmol/L铁***溶液中进行测试;
(2)用计时电流法对肿瘤标志物进行检测,选择-0.4V作为电流测量的检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔0.1 s,运行时间300 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液,记录电流变化。
上述肿瘤标志物选自下列之一:CEA、AFP。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
(1)金纳米粒子负载磺化的多壁碳纳米管Au NPs@MWCNTs-SO3H作为基底材料,不仅可以增大免疫传感器的比表面积而且可以发挥多壁碳纳米管导电性强的特点,提高电极的导电性,其中Au NPs是一种生物亲和性的材料可以结合更多的抗体,同时Au NPs导电性也非常好,可以加快电子的转移和传输。Ag@Pt-CuS作为检测抗体标记物,可以增加免疫传感器的灵敏度并提高其催化性能。CuS作为过渡金属硫化物半导体,具有良好的生物相容性,高电子传输性能和良好的导电性。Ag@Pt纳米粒子具有很强的催化性能,可以进一步提高免疫传感器的灵敏度。本发明采用Au NPs@MWCNTs-SO3H作为基底材料,Ag@Pt-CuS作为检测抗体标记物构建的夹心型免疫传感器,实现了对测定信号放大,提高了肿瘤标志物检测的灵敏度,降低了检测限;
(2)一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器实现了对肿瘤标志物CEA的检测,其线性范围10fg ~ 80 ng/mL,检测限最低3.33fg/mL;实现了对肿瘤标志物AFP的检测,其线性范围50fg ~ 100 ng/mL,检测限最低16.7fg/mL,表明一种基于Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明,但不限于此。
实施例1一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面,超纯水清洗干净;
(2)将6 µL、1.0 mg/mL的Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液滴涂于上述电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、8 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 °C冰箱中干燥;
(4)继续将3 µL、0.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面的非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,除去未结合的BSA,4 °C冰箱中晾干;
(5)继续滴加6 µL、10pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(6)继续滴加6 µL、1.5 mg/mL的检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液于电极表面,置于4°C冰箱中孵化40 min,超纯水冲洗、晾干,制得一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器。
实施例2一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面,超纯水清洗干净;
(2)将6 µL、2.0 mg/mL的Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液滴涂于上述电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 °C冰箱中干燥;
(4)继续将3 µL、1.0 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面的非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,除去未结合的BSA,4 °C冰箱中晾干;
(5)继续滴加6 µL、10pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(6)继续滴加6 µL、2.5 mg/mL的检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液于电极表面,置于4°C冰箱中孵化40 min,超纯水冲洗、晾干,制得一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器。
实施例3一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面,超纯水清洗干净;
(2)将6 µL、3.0 mg/mL的Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液滴涂于上述电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 °C冰箱中干燥;
(4)继续将3 µL、1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面的非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,除去未结合的BSA,4 °C冰箱中晾干;
(5)继续滴加6 µL、10pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(6)继续滴加6 µL、3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液于电极表面,置于4°C冰箱中孵化40 min,超纯水冲洗、晾干,制得一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器。
实施例4所述Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液的制备,步骤如下:
(1)Au NPs溶液的制备
将1mL、质量分数为1%氯金酸和99 mL超纯水混合,在100°C下回流15min,然后加入1 mL、10mg/mL的柠檬酸钠溶液,并保持搅拌10 min,制得均匀分散的酒红色Au NPs溶液;
(2)MWCNTs-SO3H的制备
首先将MWCNTs在60°C的真空干燥箱中干燥24h,然后在三口烧瓶中依次加入1gMWCNTs,30mL浓H2SO4和10mL浓HNO3,超声10min分散均匀,后在搅拌下120°C回流20min,冷却至室温,过滤;黑色沉淀超纯水洗涤过滤至中性,60°C真空干燥箱干燥8h,制得MWCNTs-SO3H;
(3)Au NPs@MWCNTs-SO3H的制备
将5mgMWCNTs-SO3H分散在5mL的Au NPs溶液中,超声分散1h,聚四氟乙烯滤膜抽滤,产物于30°C的真空干燥箱中干燥8h,得到Au NPs@MWCNTs-SO3H。
实施例5所述Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液的制备,步骤如下:
(1)Au NPs溶液的制备
将2mL、质量分数为1%氯金酸和99 mL超纯水混合,在100°C下回流15min,然后加入2 mL、10mg/mL的柠檬酸钠溶液,并保持搅拌20 min,制得均匀分散的酒红色Au NPs溶液;
(2)MWCNTs-SO3H的制备
首先将MWCNTs在60°C的真空干燥箱中干燥24h,然后在三口烧瓶中依次加入1gMWCNTs,30mL浓H2SO4和10mL浓HNO3,超声10min分散均匀,后在搅拌下120°C回流30min,冷却至室温,过滤;黑色沉淀超纯水洗涤过滤至中性,60°C真空干燥箱干燥10h,制得MWCNTs-SO3H;
(3)Au NPs@MWCNTs-SO3H的制备
将10mgMWCNTs-SO3H分散在10mL的Au NPs溶液中,超声分散1h,聚四氟乙烯滤膜抽滤,产物于30°C的真空干燥箱中干燥10h,得到Au NPs@MWCNTs-SO3H。
实施例6所述Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液的制备,步骤如下:
(1)Au NPs溶液的制备
将3mL、质量分数为1%氯金酸和99 mL超纯水混合,在100°C下回流15min,然后加入3 mL、10mg/mL的柠檬酸钠溶液,并保持搅拌30 min,制得均匀分散的酒红色Au NPs溶液;
(2)MWCNTs-SO3H的制备
首先将MWCNTs在60°C的真空干燥箱中干燥24h,然后在三口烧瓶中依次加入1gMWCNTs,30mL浓H2SO4和10mL浓HNO3,超声10min分散均匀,后在搅拌下120°C回流40min,冷却至室温,过滤;黑色沉淀超纯水洗涤过滤至中性,60°C真空干燥箱干燥12 h,制得MWCNTs-SO3H;
(3)Au NPs@MWCNTs-SO3H的制备
将15mgMWCNTs-SO3H分散在15mL的Au NPs溶液中,超声分散1h,聚四氟乙烯滤膜抽滤,产物于30°C的真空干燥箱中干燥12h,得到Au NPs@MWCNTs-SO3H。
实施例7所述检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备,步骤如下:
(1)Ag@Pt纳米粒子的制备
搅拌状态下,将0.05mL、1mol·L-1的KOH,2mL、0.01 mol/L的抗坏血酸和0.05g的PVP加入到2mL的超纯水中,然后将4mL、0.002 mol/L的AgNO3逐滴加入到上述溶液中,随后继续滴加4mL、0.002 mol/L的H2PtCl6,60°C下搅拌1h,产物用体积比为1:1的无水乙醇超纯水混合液离心洗涤三次,超声分散于5mL超纯水中制得Ag@Pt纳米粒子分散液备用;
(2)CuS微球的制备
室温下,将1gPVP溶于40mL超纯水中,后加入0.5g Cu(NO3)▪3H2O混合,继续依次加入20 mL乙二醇和0.2 g硫脲,连续搅拌1h后,将产物转移至三口烧瓶中,搅拌状态下160°C回流2h,得到黑色悬浮液,自然冷却至室温,离心,无水乙醇洗涤三次,在60°C真空干燥箱干燥8h,制得CuS微球;
(3)Ag@Pt-CuS的制备
将0.1gCuS微球和0.1mLAPTES依次加入到5mL无水乙醇中,油浴锅中加热至90°C并保持回流1h;冷却至室温,离心,无水乙醇和超纯水洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥制得氨基化的CuS微球;
将3mg氨基化CuS微球加入到3mLAg@Pt纳米粒子分散液中,超声1h,离心,用无水乙醇洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥12h;
(4)检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备
将1mL、2mg/mL的Ag@Pt-CuS分散液加入到0.5mL、10μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2溶液中,恒温振荡箱中震荡孵化12h;离心分离,重新分散至1mL的pH=7.38的磷酸缓冲溶液中,制得检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液,4°C保存备用。
实施例8所述检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备,步骤如下:
(1)Ag@Pt纳米粒子的制备
搅拌状态下,将0.10mL、1mol·L-1的KOH,3mL、0.01 mol/L的抗坏血酸和0.05g的PVP加入到2mL的超纯水中,然后将4mL、0.002 mol/L的AgNO3逐滴加入到上述溶液中,随后继续滴加4mL、0.002 mol/L的H2PtCl6,60°C下搅拌1h,产物用体积比为1:1的无水乙醇超纯水混合液离心洗涤三次,超声分散于5mL超纯水中制得Ag@Pt纳米粒子分散液备用;
(2)CuS微球的制备
室温下,将1gPVP溶于40mL超纯水中,后加入0.5g Cu(NO3)▪3H2O混合,继续依次加入30 mL乙二醇和0.3 g硫脲,连续搅拌1h后,将产物转移至三口烧瓶中,搅拌状态下160°C回流2h,得到黑色悬浮液,自然冷却至室温,离心,无水乙醇洗涤三次,在60°C真空干燥箱干燥10h,制得CuS微球;
(3)Ag@Pt-CuS的制备
将0.1gCuS微球和0.2mLAPTES依次加入到10mL无水乙醇中,油浴锅中加热至90°C并保持回流2h;冷却至室温,离心,无水乙醇和超纯水洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥制得氨基化的CuS微球;
将3mg氨基化CuS微球加入到3mLAg@Pt纳米粒子分散液中,超声1h,离心,用无水乙醇洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥12h;
(4)检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备
将2mL、2mg/mL的Ag@Pt-CuS分散液加入到1.0mL、10μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2溶液中,恒温振荡箱中震荡孵化12h;离心分离,重新分散至2mL的pH=7.38的磷酸缓冲溶液中,制得检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液,4°C保存备用。
实施例9所述检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备,步骤如下:
(1)Ag@Pt纳米粒子的制备
搅拌状态下,将0.15mL、1mol·L-1的KOH,4mL、0.01 mol/L的抗坏血酸和0.05g的PVP加入到2mL的超纯水中,然后将4mL、0.002 mol/L的AgNO3逐滴加入到上述溶液中,随后继续滴加4mL、0.002 mol/L的H2PtCl6,60°C下搅拌1h,产物用体积比为1:1的无水乙醇超纯水混合液离心洗涤三次,超声分散于5mL超纯水中制得Ag@Pt纳米粒子分散液备用;
(2)CuS微球的制备
室温下,将1gPVP溶于40mL超纯水中,后加入0.5g Cu(NO3)▪3H2O混合,继续依次加入40 mL乙二醇和0.4 g硫脲,连续搅拌1h后,将产物转移至三口烧瓶中,搅拌状态下160°C回流2h,得到黑色悬浮液,自然冷却至室温,离心,无水乙醇洗涤三次,在60°C真空干燥箱干燥12h,制得CuS微球;
(3)Ag@Pt-CuS的制备
将0.1gCuS微球和0.3mLAPTES依次加入到15mL无水乙醇中,油浴锅中加热至90°C并保持回流3h;冷却至室温,离心,无水乙醇和超纯水洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥制得氨基化的CuS微球;
将3mg氨基化CuS微球加入到3mLAg@Pt纳米粒子分散液中,超声1h,离心,用无水乙醇洗涤三次,50°C真空干燥箱中干燥12h;
(4)检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备
将3mL、2mg/mL的Ag@Pt-CuS分散液加入到1.5mL、10μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2溶液中,恒温振荡箱中震荡孵化12h;离心分离,重新分散至3mL的pH=7.38的磷酸缓冲溶液中,制得检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液,4°C保存备用。
实施例10肿瘤标志物CEA的检测,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL,含10 mmol/L铁***的pH为7.38的磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用计时电流法对肿瘤标志物进行检测,选择-0.4V作为电流测量的检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔0.1 s,运行时间300 s;
(3)记录不同浓度下的肿瘤标志物抗原所对应的电流值;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度;
(5)根据所得电流强度与CEA浓度之间的线性关系,绘制工作曲线,测得线性范围为10fg ~ 80 ng/mL,检测限为3.3fg/mL。
实施例11肿瘤标志物AFP的检测
按照实施例10的方法对样品中AFP进行检测,其线性范围为50fg ~ 100 ng/mL,检测限为16.7fg/mL。
Claims (5)
1.一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨成镜面,超纯水清洗干净;
(2)将6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液滴涂于上述电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、8 ~ 12 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4 °C冰箱中干燥;
(4)继续将3 µL、0.5 ~ 1.5 mg/mL、质量分数为1%的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,用以封闭电极表面的非特异性活性位点,超纯水冲洗电极表面,除去未结合的BSA,4°C冰箱中晾干;
(5)继续滴加6 µL、10 pg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(6)继续滴加6 µL、1.5 ~ 3.5 mg/mL的检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液于电极表面,置于4 °C冰箱中孵化40 min,超纯水冲洗、晾干,制得一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器;
所述检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备,步骤如下:
(a)Ag@Pt纳米粒子的制备
搅拌状态下,将0.05 ~ 0.15 mL、1 mol·L-1的KOH,2 ~ 4 mL、0.01 mol/L的抗坏血酸和0.05 g的PVP加入到2 mL的超纯水中,然后将4 mL、0.002 mol/L的AgNO3逐滴加入到上述溶液中,随后继续滴加4 mL、0.002 mol/L的H2PtCl6,60 °C下搅拌1 h,产物用体积比为1:1的无水乙醇超纯水混合液离心洗涤三次,超声分散于5 mL超纯水中制得Ag@Pt纳米粒子分散液备用;
(b)CuS微球的制备
室温下,将1 g PVP溶于40 mL超纯水中,后加入0.5 g Cu(NO3)▪3H2O混合,继续依次加入20 ~ 40 mL乙二醇和0.2 ~ 0.4 g硫脲,连续搅拌1 h后,将产物转移至三口烧瓶中,搅拌状态下160 °C回流2 h,得到黑色悬浮液,自然冷却至室温,离心,无水乙醇洗涤三次,在60°C真空干燥箱干燥8 ~ 12 h,制得CuS微球;
(c)Ag@Pt-CuS的制备
将0.1 g CuS微球和0.1 ~ 0.3 mL APTES依次加入到5 ~ 15 mL无水乙醇中,油浴锅中加热至90 °C并保持回流1 ~ 3 h;冷却至室温,离心,无水乙醇和超纯水洗涤三次,50 °C真空干燥箱中干燥制得氨基化的CuS微球;
将3 mg氨基化CuS微球加入到3 mL Ag@Pt纳米粒子分散液中,超声1 h,离心,用无水乙醇洗涤三次,50 °C真空干燥箱中干燥12 h;
(d)检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液的制备
将1 ~ 3 mL、2 mg/mL的Ag@Pt-CuS分散液加入到0.5 ~ 1.5 mL、10 μg/mL的肿瘤标记物检测抗体Ab2溶液中,恒温振荡箱中震荡孵化12 h;离心分离,重新分散至1 ~ 3 mL的pH=7.38的磷酸缓冲溶液中,制得检测抗体孵化物Ag@Pt-CuS-Ab2溶液,4 °C保存备用。
2.如权利要求1所述的一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,所述Au NPs@MWCNTs-SO3H溶液的制备,步骤如下:
(1)Au NPs溶液的制备
将1 ~ 3 mL、质量分数为1%氯金酸和99 mL超纯水混合,在100 °C下回流15 min,然后加入1 ~ 3 mL、10 mg/mL的柠檬酸钠溶液,并保持搅拌10 ~ 30 min,制得均匀分散的酒红色Au NPs溶液;
(2)MWCNTs-SO3H的制备
首先将MWCNTs在60 °C的真空干燥箱中干燥24 h,然后在三口烧瓶中依次加入1 gMWCNTs,30 mL浓H2SO4和10 mL浓HNO3,超声10 min分散均匀,后在搅拌下120 °C回流20 ~40min,冷却至室温,过滤;黑色沉淀超纯水洗涤过滤至中性,60 °C真空干燥箱干燥8 ~ 12 h,制得MWCNTs-SO3H;
(3)Au NPs@MWCNTs-SO3H的制备
将5 ~ 15 mg MWCNTs-SO3H分散在5 ~ 15 mL的Au NPs溶液中,超声分散1 h,聚四氟乙烯滤膜抽滤,产物于30 °C的真空干燥箱中干燥8 ~ 12 h,得到Au NPs@MWCNTs-SO3H。
3.如权利要求1所述的一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器的制备方法,其特征在于,所述肿瘤标志物选自下列之一:CEA、AFP。
4.如权利要求1所述的制备方法制备的一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用,步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL、含10 mmol/L铁***溶液中进行测试;
(2)用计时电流法对肿瘤标志物进行检测,选择-0.4 V作为电流测量的检测,输入电压为-0.4 V,取样间隔0.1 s,运行时间300 s;
(3)当背景电流趋于稳定后,每隔50 s向10 mL、50 mmol/L的pH=7.38磷酸盐缓冲溶液中注入10 μL、5 mol/L的双氧水溶液,记录电流变化。
5.如权利要求4所述的制备方法制备的一种Ag@Pt-CuS标记的免疫传感器在肿瘤标志物检测中的应用,其特征在于,所述肿瘤标志物选自下列之一:CEA、AFP。
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