CN110702670A - 一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法 - Google Patents

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定。本发明采用ZIF‑8包附SOX与HRP。ZIF‑8具有较大的比表面积和多孔孔道，有益于溶液中反应底物穿过孔道与SOX和HRP反应，并且利于底物在酶周围富集，增加局部的底物浓度。同时ZIF‑8的包裹使SOX与HRP限制在数百纳米范围内，调控了SOX与HRP的间距，SOX催化肌氨酸产生的过氧化氢可以有效传递给HRP进行显色反应，提高反应级联酶反应速率。

Description

一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法
技术领域
本发明涉及一种测定***癌特异靶标肌氨酸的检测方法，具体涉及一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法。本发明属于化学检测领域。
背景技术
***癌是常见的男性恶性肿瘤之一，特别随着中国社会老龄化的加剧，***癌确诊率和死亡率随之升高，因此对***癌患者的早期筛查能显著提高和改善患者的生存率。现有的对***癌诊断方法主要基于***特异抗原（PSA）进行，其检测灵敏度和特异性存在较大问题，假阳性率和假阴性率皆较高，许多患者因此进行了不必要的活检，造成了巨大的痛苦。因此急需一种新的标志物检测方法和有效的筛查手段。
2009年，一项试点研究创建了一种非侵入性方法来识别***癌的存在和发展过程，并表明甘氨酸的代谢物-肌氨酸-可以在患者尿液和血液中检测，可以作为***癌预测的标志物。传统的肌氨酸测定方法有：电化学方法（中国专利：一种用于肌氨酸的电化学检测方法，公开号：CN106596693A。）；电泳法：（中国专利：一种肌氨酸的检测方法，公开号：CN101718746A。）；荧光光谱法：（中国专利：定量检测肌氨酸含量的方法及反应试剂盒，公开号：CN101587076A。）；色谱质谱法（文献：A reproducible and high-throughput HPLC/MSmethod to separate sarcosine fromα- and β- alanine and to quantify sarcosinein human serum and urine. Anal. Chem. 83(2011): 5735-5740）。这些技术的主要缺点仪器成本高，样品制备复杂熟练操作人员要求，不适合日常操作分析，因此急需研发一种灵敏、稳定的肌氨酸的检测方法。
对肌氨酸直接测定比较困难，可以采用肌氨酸氧化酶（Sarcosine Oxidase，SOX）和辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，HRP）这一级联酶，利用催SOX催化肌氨酸生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢，进一步利用HRP催化过氧化氢生成显色反应从而对肌氨酸含量进行测定。然而溶液中SOX与HRP处于无序状态，随机的底物碰撞显著降低了级联反应的催化效率。金属有机框架（MOFs）是一类由无机金属中心（金属离子或金属簇）与有机配体通过自组装相互连接，形成的一类具有周期性网络结构的晶态多孔材料。特别的ZIF-8材料具备较大的比表面积、较好的生物相容性、稳定的化学和物理性能的优点，在载药、催化、生物传感和物质富集及分离测定等领域的应用极具潜力。因此利用ZIF-8材料包裹SOX和HRP，设计一种限域的级联酶的结构，对肌氨酸进行检测具有较高的研究意义和应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明目的在于提供一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法。
本发明目的通过下述方案实现：一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定，具体包括以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.1~0.5 mg SOX和0.2~0.5 mg 的HRP溶解于1 mL 2-甲基咪唑（2-MIM，1 M）水溶液，使SOX与HRP的质量比为1:1~1:5，于室温下混合均匀后孵育10分钟，随后，在混合液中快速加入1 mL醋酸锌或硝酸锌（20 mM）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜，混合液于5000rpm/min离心15 min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr，然后，以转速5000 rpm/min 离心20 min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液；
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置显色反应底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS， 10mM），配置肌氨酸（5-100 µM）溶液，冰浴保存，打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线，依次取10µL肌氨酸溶液，10µL ABTS显色溶液与70µL PBS溶液（pH 7.4），混合均匀，转移至比色皿中，随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
在上述方案基础上，SOX与HRP的更佳质量比为1:3。
在本发明的技术方案中，设计ZIF-8材料包裹肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，肌氨酸氧化酶可以催化肌氨酸生成甘氨酸、甲醛和过氧化氢。进一步地，氧化氢酶可催化过氧化氢氧化2 ,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS）生成蓝绿色的自由基阳离子（ABTS.+）从而实现检测信号的输出。
本发明为一种限域级联酶结构从而对肌氨酸进行测定的方法，通过MOFs材料包裹肌氨酸氧化酶和辣根过氧化物酶，促使SOX和HRP限制在数百纳米的空间内，通过酶促级联反应产生的化学发光信号从而定量肌氨酸的浓度。该方法可调控级联酶的距离，提高级联酶反应速率，具有较高的灵敏度，可快速对血液和尿液中肌氨酸含量进行定量检测。
本发明的优点在于：
（1）本发明采用ZIF-8包附SOX与HRP。ZIF-8具有较大的比表面积和多孔孔道，有益于溶液中反应底物穿过孔道与SOX和HRP反应，并且利于底物在酶周围富集，增加局部的底物浓度；
（2）同时ZIF-8的包裹使SOX与HRP限制在数百纳米范围内，调控了SOX与HRP的间距，SOX催化肌氨酸产生的过氧化氢可以有效传递给HRP进行显色反应，提高反应级联酶反应速率。
附图说明
图1为实施例1中制备的PVP-SOX-HRP@ZIF-8的透射电镜表征图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不限制本发明的范围。
实施例1
一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定，按以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.1 mg SOX和0.2 mg 的HRP溶解于1 mL浓度为1 M的2-甲基咪唑（2-MIM）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1 mL浓度为20 mM的醋酸锌溶液中，混合均匀后，室温机械搅拌过夜。混合液于5000 rpm/min离心15 min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr；然后，以转速5000 rpm/min 离心20 min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液。采用TEM表征所得PVP-SOX-HRP@ZIF-8纳米结构，其尺寸约在130 nm范围。见图1，为本实施例制备的PVP-SOX-HRP@ZIF-8的透射电镜表征图。
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM ABTS溶液，配置5-100 µM肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µL各浓度肌氨酸溶液，分别10µL ABTS显色溶液与70µLPBS溶液（pH 7.4）混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414 nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
实施例2
一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.1 mg SOX和0.3 mg 的HRP溶解于1 mL 浓度为1 M的2-甲基咪唑（2-MIM）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1 mL浓度为20mM的醋酸锌溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000 rpm/min离心15 min得到的沉淀物，采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1hr；然后，以转速5000 rpm/min 离心20 min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液。
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM ABTS溶液，配置5-100 µM肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µL肌氨酸溶液，10µL ABTS显色溶液与70µL PBS溶液（pH 7.4），混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414 nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
实施例 3
一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.2 mg SOX和0.3 mg 的HRP溶解于1 mL浓度为1 M的2-甲基咪唑（2-MIM）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液；随后，在混合液中快速加入1 mL浓度为20 mM的醋酸锌溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000 rpm/min离心15 min得到的沉淀物采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr；然后，以转速5000 rpm/min 离心20 min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液；
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM ABTS溶液，配置5-100 µM肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线；依次取10µL各浓度肌氨酸溶液，分别与10µL ABTS显色溶液和70µL PBS溶液（pH 7.4）混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414 nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
实施例4
一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.2 mg SOX和0.5 mg 的HRP溶解于1 mL 2-甲基咪唑（2-MIM，1 M）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟；随后，在混合液中快速加入1 mL醋酸锌（20 mM）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜；混合液于5000 rpm/min离心15 min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr；然后，以转速5000 rpm/min 离心20min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液；
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM ABTS溶液，配置5-100 µM肌氨酸溶液，冰浴保存；打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线。依次取10µL肌氨酸溶液，10µL ABTS显色溶液与70µL PBS溶液（pH 7.4），混合均匀，转移至比色皿中；随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414 nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
实施例5
一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，与实施例1近似，按以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.1 mg SOX和0.4mg 的HRP溶解于1 mL 2-甲基咪唑（2-MIM，1 M）水溶液，于室温下混合均匀后孵育10分钟。随后，在混合液中快速加入1 mL醋酸锌（20 mM）溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜。混合液于5000 rpm/min离心15 min，采用乙醇清洗2次，并采用含有2% PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr。然后，以转速5000 rpm/min 离心20min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液中（PBS，pH 7.4），即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液。
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM ABTS溶液，配置5-100 µM肌氨酸溶液，冰浴保存。打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线。依次取10µL肌氨酸溶液，10µL ABTS显色溶液与70µL PBS溶液（pH 7.4），混合均匀，转移至比色皿中。随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min， 检测414 nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。

Claims (2)

1.一种基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，其特征在于基于金属有机框架材料包裹肌氨酸氧化酶和过氧化氢酶，从而促使这一对级联酶局限于较小空间内，通过级联反应后采用化学发光的方法对肌氨酸的含量进行测定，包括以下步骤：
（1）ZIF-8包裹SOX和HRP：
称取0.1~0.5 mg SOX和0.2~0.5 mg 的HRP溶解于1 mL浓度为1 M的2-甲基咪唑（2-MIM）水溶液中，使SOX与HRP的质量比例为1:（1~5），于室温下混合均匀后孵育10分钟得混合液，随后，在混合液中快速加入1 mL浓度为20 mM醋酸锌或硝酸锌溶液，混合均匀后，室温机械搅拌过夜，于5000 rpm/min离心15 min得到的沉淀物采用乙醇清洗2次，并采用含有2%PVP（w/w）溶液重旋离心沉淀物，机械搅拌1 hr，然后，以转速5000 rpm/min 离心20 min，收集PVP稳定的SOX-HRP@ZIF-8，将沉淀分散于2 mL磷酸盐缓冲液（PBS）中，pH 7.4，即可得到PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液；
（2）肌氨酸含量测定：
用PBS配置10 mM显色反应底物2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（ABTS），配置5-100 µM的肌氨酸溶液，冰浴保存，打开紫外分光光度计，设置好参数，矫正基线，依次取10µL肌氨酸溶液，10µL ABTS显色溶液与70µL PBS溶液，pH 7.4，混合均匀，转移至比色皿中，随后加入10 µL PVP- SOX-HRP@ZIF-8溶液，混合均匀后，反应10 min，检测414nm处吸光度变化，绘制肌氨酸浓度的标准曲线。
2.根据权利要求1所述基于金属有机框架材料的肌氨酸检测方法，其特征在于：SOX与HRP的质量比为1:3。
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