CN110687293A - 一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于检测胃癌抗原MG7‑Ag的单克隆抗体组合物MG7‑Ab、MGd1‑Ab和CEA37‑Ab。本发明还提供了所述组合物在制备用于检测胃癌抗原MG7‑Ag的试剂盒中的用途；所述试剂盒为ELISA试剂盒或化学发光试剂盒。本发明还提供了上述试剂盒在检测胃癌抗原MG7‑Ag中的应用。本发明利用含有两种不同抗原表位的特异性MG7‑Ag抗体的试剂盒定量检测胃癌抗原MG7‑Ag，其同时具备多抗的高亲和力和单抗有限表位的特异性，检测效率高，检测灵敏度高(化学发光法达到10pg/mL)，并有较高的特异性，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低，对胃癌的诊断具有重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于肿瘤标志物检测领域，具体地，本发明涉及用于检测胃癌抗原MG7-Ag的试剂盒及其使用方法。
背景技术
肿瘤蛋白标记物是肿瘤细胞产生和释放的某种物质，常以抗原、酶、蛋白或肽类激素等代谢产物的形式存在于病人肿瘤细胞组织内或宿主体液、排出物中，根据其生化或免疫特性可以识别或诊断肿瘤。肿瘤蛋白标记物在临床上主要用于对原发肿瘤的发现、肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断肿瘤治疗效果的观察和评价以及肿瘤复发和预后的预测等。近年来，新的肿瘤标记物不断发现、检查手段不断完善和改进，使得其灵敏性和准确性不断提高，为肿瘤患者的早期诊断和早期治疗提供更确切充足的依据。
胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一，目前中国每年胃癌新发病例居全球首位，患病率和死亡率均是世界平均水平的2倍多，约每2～3 分钟就有1名中国人死于胃癌。现在胃癌在中国的死亡率已经仅次于肺癌，是第二大癌症杀手。
中国胃癌在早期诊治方面存在巨大缺失，大部分患者确诊时已经是晚期，导致很多胃癌患者失去了治愈的机会。胃癌的预后与诊治时机密切相关，大部分早期胃癌即可获得根治性治疗，预后良好，5年生存率超过90％以上，而进展期胃癌5年存活率仅为30％～40％。然而目前中国早期胃癌的诊断率还不足10％，早期胃癌手术率低于5％～10％，远低于其它发达国家。目前对胃癌的早期诊断尚缺乏特异性的实验室检测方法，形态学诊断和活检仍是主要检查手段，但这两种检查方法对仪器设备和操作人员的要求较高，且费用昂贵，有一定的痛苦。胃癌肿瘤标志物作为辅助检测手段，由于其具有简便、快捷、无损伤、便于动态监测的特点，可以在临床实验室检测中早期发现、诊断胃癌病人，已成为一个研究的热点领域。目前与胃癌有关的肿瘤标志物检测有多种，但均为非特异肿瘤相关抗原，如CEA，CA-724，CA-199，由于诊断效率低，尚达不到临床要求，需要选择适当的肿瘤标志物进行联合检测才能提高肿瘤的诊断准确率。因此开发出新的胃癌诊断标志物的检测试剂，做到早期筛查，早期诊断，早做干预是大势所趋。
MG7-Ag是通过将低分化胃癌细胞株作为免疫原成功制备胃癌单克隆抗体所识别的抗原，在各种致癌因子的作用下，胃癌组织可大量分泌MG7-Ag 并释放入血液中，MG7-Ag在胃癌中表达率为93.55％。血液中MG7-Ag与组织MG7-Ag表达有良好的相关性，胃癌患者血清中MG7-Ag含量明显高于正常对照者(p<0.05)，通过对胃癌诊断价值进行Meta分析得出，MG7-Ag 在诊断胃癌时敏感度和特异性都比现在的诊断标志物CEA，CA724和CA199 敏感性高，有很高的排除其他疾病的价值。MG7-Ag对胃癌诊断具有较高敏感性，且在癌症病变前血清MG7-Ag含量就有所提高，可作为早期胃癌血液指标。
在免疫试剂产品的实际检测应用中，抗原抗体反应是关键。单克隆抗体是由一种克隆产生的特异性抗体，识别并结合单个特异抗原决定簇位表位。而多克隆抗体是好多种克隆产生的抗体混杂物，识别多个抗原决定簇表位。一般单克隆抗体特异性强，可以永续的生产完全一致的单克隆抗体，因此可以对其特异性进行全面、***地验证，但其亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对低，而且如果所识别的抗原表位被破坏，实验的结果将会受到很大的影响，这也是单抗的缺点之一；而多克隆抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现杂带，交叉反应或背景值偏高的现象，特异性差，并且容易出现假阳。即使是使用相同的抗原制备多抗，不同批次间也会存在差异，因而在特异性、一致性方面有很大的局限。但由于多抗识别多个抗原表位，即使是有少数几个抗原表位被破坏或者抗原构象改变，实验的结果也不会受到影响。
鉴于单抗和多抗各有所长，在免疫试剂产品的研制和应用中，单抗或多抗的使用会根据实际情况进行优化验证，最终确定试剂产品的反应条件和反应模式，但是现有技术中还没有采用两种单克隆抗体组合来检测胃癌的方法。
发明内容
基于此，本发明提供了一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的单克隆抗体组合物。本发明提供的组合物包括两种识别不同的抗原表位的单克隆抗体，使用本发明的组合物制备的试剂盒，可以同时具备多克隆抗体的高亲和力和单克隆抗体的有限表位的特异性，克服了目前普遍存在的MG7-Ag检测灵敏度低，特异性差的问题，可以有效、方便地对胃癌进行早期诊断与干预，以降低肿瘤发病率和癌症死亡率。
一方面，本发明提供了一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的单克隆抗体组合物，所述组合物包括：
由保藏号为CCTCC NO:C2016129的杂交瘤细胞株MG7分泌的MG7-Ab；
由保藏号为CCTCC NO:C2016130的杂交瘤细胞株MGd1分泌的 MGd1-Ab；
和由保藏号为CCTCC NO:C2016125的杂交瘤细胞株CEA-37分泌的 CEA37-Ab。
其中，杂交瘤细胞株MG7的保藏号为CCTCC NO:C2016129，保藏日期：2016年6月23日，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
其中，杂交瘤细胞株MGd1的保藏号为CCTCC NO:C2016130，保藏日期：2016年6月23日，保藏号为CCTCC NO:C2016130，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
其中，杂交瘤细胞株CEA-37的保藏号为CCTCC NO:C2016125保藏日期：2016年6月23日，保藏号为CCTCC NO:C2016125，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
另一方面，本发明提供了所述组合物在制备用于检测胃癌抗原 MG7-Ag的试剂盒中的用途。
优选地，所述试剂盒为ELISA试剂盒或化学发光试剂盒。
再一方面，本发明提供了一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的ELISA 试剂盒，所述试剂盒包括包被MG7-Ab和MGd1-Ab的酶联免疫微孔板、辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab、显色剂、MG7-Ag标准品；
优选地，所述显色剂为显色剂是H2O2和TMB；
在根据本发明的一个实施方案中，所述微孔板是通过包括下述步骤的方法制备的：
a)以包被缓冲液对MG7-Ab和MGd1-Ab进行稀释，得到MG7-Ab 和MGd1-Ab的浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL的稀释液，在微孔板的每孔中加入所述稀释液共100μL，4℃条件下过夜后洗涤，然后拍干或甩干；
b)向经步骤a)处理的微孔板中加入封闭液，每孔加入封闭液200μ L，25℃条件下封闭3小时后洗涤，然后拍干或甩干；
c)将经步骤b)处理的微孔板进行室温干燥处理，真空密封，即得。
在根据本发明的一个实施方案中，MG7-Ab和MGd1-Ab的质量比为 0.5-2.5:1，优选2.0:1；
优选地，在所述步骤a)中，所述包被缓冲液为50mM的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6；更优选地，在步骤a)中，所述MG7-Ab和MGd1-Ab 的最终包被浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL。
在根据本发明的一个实施方案中，所述封闭液为0.1％～1.0％(g/mL) 的酪蛋白钠溶液；优选地，所述封闭液是通过下述方法制备的：称取1.0-10g 酪蛋白钠，将所述酪蛋白钠溶解在1L Tris-HCl缓冲液中，所述Tris-HCl 缓冲液浓度为0.01M、pH为7.2；更优选地，所述Tris-HCl缓冲液是通过下述方法制备的:称取1.21g Tris，以双蒸水加至800mL，然后以浓盐酸调节pH至7.2，最后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱保存。
再另一方面，本发明提供了上述ELISA试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
1)向包被有MG7-Ab和MGd1-Ab的微孔板的微孔中加入样本，同时以加入所述MG7-Ag标准品的微孔作为对照孔，于37℃下孵育2.0小时，洗涤后拍干或甩干；
2)向经步骤1)处理的微孔板中加入辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab，于37℃下孵育0.5小时，洗涤后拍干或甩干；
3)向经步骤2)处理的微孔板中加入H2O2和TMB，避光显色15分钟，加入终止液终止反应，测定吸光度值；
4)根据标准品的吸光度得到标准曲线，再根据所述标准曲线和样本溶液的吸光度计算所述样本中的MG7-Ag的含量。
在根据本发明的一个实施方案中，所述样本为人的血浆。
本发明还提供了上述试剂盒在检测胃癌抗原MG7-Ag中的应用。
另一方面，本发明还提供了一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的化学发光法试剂盒，所述试剂盒包括包被MG7-Ab和MGd1-Ab的化学发光微孔板，辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab、化学发光显色剂鲁米诺、MG7-Ag 标准品。
在根据本发明的一个实施方案中，所述化学发光微孔板是通过包括下述步骤的方法制备的：
①以包被缓冲液对MG7-Ab和MGd1-Ab进行稀释，得到MG7-Ab和 MGd1-Ab的浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL的稀释液，在化学发光微孔板的每孔加入所述稀释液100μL，4℃条件下过夜后洗涤，然后拍干或甩干；
②向经步骤①处理的微孔板中加入封闭液，每孔加入封闭液200μL， 25℃条件下封闭3小时后洗涤，然后拍干或甩干；
③将经步骤②处理的微孔板进行室温干燥处理，真空密封，即得。
在根据本发明的一个实施方案中，MG7-Ab和MGd1-Ab的质量比为0.5-2.5:1，优选2.0:1；
优选地，在所述步骤①中，所述包被缓冲液为：50mM碳酸盐缓冲液， pH值9.6；更优选地，所述MG7-Ab和MGd1-Ab的最终包被浓度为 0.5μg/mL-2.0μg/mL。
在根据本发明的一个实施方案中，所述封闭液为0.1％～1.0％(g/mL) 的酪蛋白钠溶液；优选地，所述封闭液是通过下述方法制备的：称取1.0-10g 酪蛋白钠，将所述酪蛋白钠溶解在1L Tris-HCl缓冲液中，所述Tris-HCl 缓冲液浓度为0.01M、pH为7.2；更优选地，所述Tris-HCl缓冲液是通过下述方法制备的:称取1.21g Tris，以双蒸水加至800mL，然后以浓盐酸调节pH至7.2，最后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱保存。
本发明进一步提供了上述化学发光法试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
Ⅰ)向包被有MG7-Ab和MGd1-Ab的微孔板的微孔中加入样本，同时以加入所述MG7-Ag标准品的微孔作为对照孔，于37℃下孵育2.0小时，洗涤后拍干或甩干；
Ⅱ)向经步骤Ⅰ)处理的微孔板中加入辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab，于37℃下孵育0.5小时，洗涤后拍干或甩干；
Ⅲ)向经步骤Ⅱ)处理的微孔板中加入化学发光显色剂鲁米诺，测定发光强度值；
Ⅳ)根据标准品的发光强度得到标准曲线，再根据所述标准曲线和样本溶液的发光强度计算所述样本中的MG7-Ag的含量。
本发明具有如下有益效果：
本发明利用含有两种不同抗原表位的特异性MG7-Ag抗体的试剂盒定量检测胃癌抗原MG7-Ag，这种采用双株单抗体混合包被技术，具备多抗的高亲和力和单抗有限表位的特异性，检测效率高，检测灵敏度高(化学发光法达到10pg/mL)，并有较高的特异性，无需使用昂贵的实验设备，检测成本低，对胃癌的诊断具有重要的临床价值。
附图说明
图1为根据本发明的ELISA试剂盒绘制的标准曲线；
图2为本发明的ELISA试剂盒的标准曲线和使用一种单抗的ELISA 试剂盒的标准曲线的对比图；
图3为根据本发明的化学发光试剂盒绘制的标准曲线；
图4为本发明的化学发光试剂盒的标准曲线和使用一种单抗的化学发光试剂盒的标准曲线的对比图；
图5为实施例3中采用本发明的试剂盒在胃癌胃炎和正常健康人样本的检测；
图6为实施例4中采用本发明的试剂盒在胃癌病人术前术后的监测和预后评估；
图7为实施例5中采用本发明的试剂盒对胃癌和对照样本血浆中 MG7-Ag含量的检测；
图8为实施例5中采用本发明的试剂盒对MG7-Ag含量检测***构建的ROC曲线。
生物保藏信息
其中，杂交瘤细胞株MG7的保藏号为CCTCC NO:C2016129，保藏日期：2016年6月23日，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
其中，杂交瘤细胞株MGd1的保藏号为CCTCC NO:C2016130，保藏日期：2016年6月23日，保藏号为CCTCC NO:C2016130，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
其中，杂交瘤细胞株CEA-37的保藏号为CCTCC NO:C2016125保藏日期：2016年6月23日，保藏号为CCTCC NO:C2016125，保藏地：中国典型培养物保藏中心，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心邮编：430072；
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本发明，并非用于限制本发明。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。
实施例1 MG7-Ag酶联免疫法试剂盒和MG7-Ag的化学发光试剂盒的制备及其使用
方法
1.1 用于检测胃癌抗原MG7-Ag的ELISA试剂盒
其包括：包被MG7-Ab和MGd1-Ab的酶联免疫微孔板；肿瘤标志物 MG7-Ag标准品溶液，MG7-Ag抗体辣根过氧化酶标记的酶结合物，浓缩洗涤液(20X)，显色液H2O2和TMB，终止液。
1.2 用于检测胃癌抗原MG7-Ag的化学发光试剂盒
其包括：包被MG7-Ab和MGd1-Ab的化学发光微孔板；肿瘤标志物 MG7-Ag标准品溶液，MG7-Ag抗体辣根过氧化酶标记的酶结合物，浓缩洗涤液(20X)，化学发光显色剂。
1.3 酶联免疫法检测试剂盒的制备方法
1.3.1 预包被96孔微孔板
96孔微孔板为可拆卸结合的96孔透明酶联免疫微孔板，96孔微孔板中包被有MG7-Ag单克隆抗体的包被方法如下:
a)用包被缓冲液将MG7-Ag单抗体株1(MGd1-Ab)和单抗体株2 (MGd1-Ab)稀释到工作浓度(最终浓度0.5μg/mL-2μg/mL)，加入到平底微孔板中，每孔100μL，放入4℃过夜，用洗涤液洗涤，拍干；
b)96孔微孔板每孔加入200μL封闭液，25℃封闭3h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；
c)室温过夜干燥，真空密封，存放在2～8℃，即得包被有MG7-Ag 抗体的反应板。
在步骤a)中，MG7-Ab和MGd1-Ab混合的最佳质量配比为2.0:1。
在步骤b)中，封闭液为0.1％～1.0％(g/mL)的酪蛋白钠溶液，其制备方法如下：称取1.0-10g酪蛋白钠溶解在1L pH 7.2浓度为0.01M的 Tris-HCl缓冲液中。pH7.4浓度为0.01M的Tris-HCl缓冲液的制备方法如下:称取1.21g Tris，加双蒸水至800mL，用浓盐酸调pH到7.2，然后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱中。
1.3.2.MG7-Ag标准品
标准品为胃癌抗原MG7-Ag，浓度分别是100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL， 10ng/mL，5ng/mL，2ng/mL和0ng/mL。
1.3.3.浓缩洗涤液(20×)
1.3.4.酶结合物(HRP):为HRP标记的MG7-Ag抗体。
1.3.5.显色剂:包括显色剂A和显色剂B，显色剂A是H2O2，显色剂B 是TMB
1.3.6.终止液:为2M H2SO4溶液。
具体地，该方法包括如下步骤:
1)向包被有MG7-Ab和MGd1-Ab的96孔微孔板的不同孔中分别加入含有胃癌抗原MG7-Ag的样本和MG7-Ag标准品，于37℃下孵育2.0 小时，并洗涤；
2)向洗涤后的平96孔板中加入MG7-Ag抗体HRP酶结合物溶液，于37℃下孵育0.5小时，洗涤，拍干；
3)向洗涤后的96孔微孔板中每孔加入显色剂A和显色剂B避光显色，加入终止液终止反应，测定吸光度值；
4)根据标准曲线得到所述样本中所述MG7-Ag的含量。
在步骤4)中，绘制试剂盒的标准曲线的具体操作步骤如下:
MG7-Ag标准品七个不同浓度梯度，每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。通过双抗体夹心酶联免疫法检测OD反应值，并以此绘制标准曲线。
1.4 化学发光法检测试剂盒的制备方法。
1.4.1.预包被96孔微孔板
96孔微孔板为可拆卸结合的96孔不透明化学发光微孔板，96孔微孔板中包被有MG7-Ag单克隆抗体的包被方法如下:
①用包被缓冲液将MG7-Ag单抗体株1(MGd1-Ab)和单抗体株2 (MGd1-Ab)稀释到工作浓度(最终浓度0.5μg/mL-2μg/mL)，加入到平底微孔板中，每孔100μL，放入4℃过夜，用洗涤液洗涤，拍干；
②96孔微孔板每孔加入200μL封闭液，25℃封闭3h，用洗涤缓冲液洗涤，拍干；
③室温过夜干燥，真空密封，存放在2～8℃，即得包被有MG7-Ag抗体的反应板。
在步骤①中，包被MG7-Ag单抗体株1(MGd1-Ab)和单抗体株2 (MGd1-Ab)混合的最佳质量配比为2.0:1。
在步骤②中，封闭液为0.1％～1.0％(g/mL)的酪蛋白钠溶液，其制备方法如下：称取1.0-10g酪蛋白钠溶解在1L pH 7.2浓度为0.01M的 Tris-HCl缓冲液中。pH7.4浓度为0.01M的Tris-HCl缓冲液的制备方法如下:称取1.21g Tris，加双蒸水至800mL，用浓盐酸调pH到7.2，然后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱中。
1.4.2.MG7-Ag标准品
标准品为胃癌抗原MG7-Ag，浓度分别是100ng/mL，50ng/mL，20ng/mL， 10ng/mL，5ng/mL，2ng/mL和0ng/mL。
1.4.3.浓缩洗涤液(20×)
1.4.4.酶结合物(HRP):为HRP标记的MG7-Ag抗体
1.4.5.显色剂:化学发光显色剂鲁米诺
具体地，该方法包括如下步骤:
Ⅰ)向包被MG7-Ab和MGd1-Ab的96孔微孔板的不同孔中分别加入含有胃癌抗原MG7-Ag的样本和MG7-Ag标准品，于37℃下孵育2.0小时，并洗涤；
Ⅱ)向洗涤后的平96孔板中加入MG7-Ag抗体HRP酶结合物溶液，于37℃下孵育0.5小时，洗涤，拍干；
Ⅲ)向洗涤后的96孔微孔板中每孔加入化学发光显色剂鲁米诺，测定发光强度值；
Ⅳ)根据标准曲线得到所述样本中所述MG7-Ag的含量。
在步骤Ⅳ)中，绘制试剂盒的标准曲线的具体操作步骤如下:
MG7-Ag标准品七个不同浓度梯度，每个浓度作一个平行样，以尽可能减少实验操作误差的干扰。通过化学发光法检测发光强度值，并以此绘制标准曲线。
酶联免疫法和化学发光法对比试验中，使用MG7-Ab和MGd1-Ab单独包被的步骤，除了分别用相同浓度或配比的MG7-Ab和MGd1-Ab单独包被外，其余步骤皆相同。
酶联免疫法三种不同包被条件下标准品浓度及对应的OD反应值如表 1所示。绘制出的试剂盒标准曲线如图1所示，三种不同包被条件下的标准曲线对比如图2所示。
表1为用MG7-Ab和MGd1-Ab抗体混合包被和单独包被检测的酶联免疫法标准曲线数据对比
化学发光法三种不同包被条件下标准品浓度及对应的发光强度值如表 2所示。绘制出的试剂盒标准曲线如图3所示，三种不同包被条件下的标准曲线对比如图4所示。
表2为用两株MG7-Ag抗体混合包被和单独包被检测的化学发光法标准曲线数据对比
由表1和表2数据分析得出，与MG7-Ab和MGd1-Ab单独包被比较， MG7-Ab和MGd1-Ab混合包被无论在酶联免疫法标准曲线的应用，还是在化学发光法标准曲线的应用中都具有明显的优势：MG7-Ab和MGd1-Ab 混合包被具有明显的梯度；MG7-Ab和MGd1-Ab混合包被丰值远大于 MG7-Ab和MGd1-Ab单株抗体包被：酶免2.395对比0.722和0.266，化学发光1679522对比746454和527812。试剂盒的信噪比指标是最大检出值与背景值的比值，是反映试剂盒能检测到的灵敏度的重要指标，比值越大，性能越好。而MG7-Ab和MGd1-Ab单独包被的信噪比也远低于两株混合包被：酶免199.6对比55.5和26.6，化学发光284.2对比94.0和56.5。利用分析软件绘制上述三种条件下的标准曲线如图1-4所示。本试剂盒采用MG7-Ab和MGd1-Ab混合包被，变异系数CV不高于10％，曲线相关系数R2值达到0.99以上，可以满足酶联免疫法和化学发光法试剂盒的实验需求，可信度较高。
实施例2
MG7-Ag酶联免疫法试剂盒的性能分析
2.1 线性分析
用接近线性区间下限的低浓度样本稀释接近线性区间上限的高浓度样本，混合成至少5个稀释浓度(xi)的测试样本，用试剂盒分别测试以上样本，每个稀释浓度测试3次，分别求出每个稀释浓度检测结果的均值 (yi)。以稀释浓度(xi)为自变量，以检测结果均值(yi)为因变量求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数(r)。
结果在试剂盒线性范围为2ng/mL-50ng/mL，线性相关系数r为0.999。
2.2 回收率分析(准确度)
回收率的计算：用待评价***对待回收分析样本和基础样本进行测定，通常对样本进行3次重复测定，计算均值，取其均值进行下述计算:
(1)加入浓度n＝标准液浓度×[标准液加入体积/(样本体积+标准液体积)]
(2)计算回收率：
具体操作：将己知MG7-Ag浓度为100ng/mL的待测物加入血浆基质样本中，使其终浓度为10ng/mL，每次实验设置三个复孔。共重复三次，表中OD为三次实验的平均值酶联免疫法检测后，根据本试剂盒所获得的标准曲线和样本的OD计算样本浓度和回收率结果如表3所示。表中所有 OD和浓度值均为三个复孔的平均值。
表3.MG7-Ag酶联免疫法试剂盒回收率分析结果
回收实验结果表明，回收率在85％～105％之间，平均值为94.63％，回收率较高。
说明本试剂盒具有很好的准确度。
2.3 重复度分析(批内差)
取同一批次的预包被微孔板，以5ng/mL和40ng/mL MG7-Ag标准品作为样本，用试剂盒分别检测样本浓度，以计算同一样本在同一批次不同孔的差异，即评估本试剂盒的重复度(批内差)。每次实验每个批次重复 10孔，批内差计算公式如下，结果如表4所示，
批内差＝SD/Mean x 100％，其中SD为标准差，Mean为浓度平均值。
表4.MG7-Ag酶联免疫法试剂盒重复度分析
| 检验次数 | 平均浓度(ng/mL) | CV(％) |
| 10 | 4.3 | 5.9 |
| 10 | 36.0 | 9.2 |
由此可见，试剂盒的重复度变异系数CV小于10％，重复性能好。
2.4 批间差分析
取不同批次的预包被微孔板，用试剂盒分别检测样本浓度，以计算同一样本在不同批次间的差异，即评估本试剂盒的批间差。
批间差＝SD/Mean x 100％，其中SD为标准差，Mean为浓度平均值。
在此试验中选择2个不同浓度的样本，以5ng/mL MG7-Ag标准品作为样本，以三个不同批次(Lot.201506002，Lot.201507003和Lot.201508004) 的包被了抗体的微孔板，检测样本MG7-Ag浓度，并计算批间差，结果如表5所示。
表5.MG7-Ag酶联免疫法试剂盒批间差分析
由表可知，本试剂盒批内差小于10.0％，批间差小于11.0％，表明试剂盒的精确度较高。
2.5 空白检出限分析
平行测定20孔零标准品的OD值，计算OD值的平均值(Mean)和标准差(SD)，利用试剂盒标准曲线计算出OD值为Mean+2×SD时的浓度值为空白限。
试剂盒的灵敏度为0.6ng/mL。
2.6稳定性分析
取近效期的试剂盒进行检测(试剂盒有效期为一年)，结果全部符合以上的准确度，重复度，线性相关系数要求，如表6所示。
表6.MG7-Ag酶联免疫法试剂盒稳定性分析
通过表6说明试剂盒在效期内所有性能指标都符合并达到要求，试剂盒的稳定较好。
实施例3 MG7-Ag酶联免疫法试剂盒在胃癌，胃炎和正常健康人临床样本中的检测
本实施例中的样本为9例胃癌样本，4例萎缩性胃炎和5例正常健康人血浆样本，所有样本均来自于博尔诚公司，样本复融在室温平衡后，做为待测样本。具体的方法步骤如下:
向微孔板中分别加入MG7-Ag标准品溶液和待测样本溶液。每孔50μL，均做三个复孔。37℃，孵育2.0h用洗涤缓冲液4次，拍干；加入抗体酶结合物，每孔50μL，37℃，孵育0.5h，用洗涤缓冲液4次，拍干；向微孔板中加入显色底物A液和显色底物B液各50μL，37℃避光显色15min；终止: 每孔加入50μL终止液，终止反应；读数:450nm下，利用MULTIPLE FC酶标仪读取吸光度值。利用统计分析软件绘制标准曲线。
结果如图5所示，与正常人和胃炎患者相比，检测的胃癌患者血浆中 MG7-Ag水平显著升高(p<0.05)，说明具有统计学意义。胃癌9例样本中， MG7-Ag的含量在0.1～0.7OD值范围之间，平均OD值为0.27±0.13，而4 例胃炎样本和5例正常人样本则都在0.1OD值附近，平均值则为0.12±0.09 OD值，如按照参考阈值定为非患病组平均值上加两倍标准方差计算的数值，即正常人和胃炎样本对照组，OD平均值上加两倍的标准方差所对应的OD 值作为参考阈值，计算所得结果OD值为0.17，有4例胃癌样本的MG7-Ag OD数值高于设定的阈值，判定为阳性，其余的5例胃癌没有检出，而4份胃炎样本及5份正常人样本的MG7-Ag OD数值均远远低于所设定的参考阈值，判定为阴性。说明试剂盒对胃癌患者的检测具有较好的敏感性和非常高的特异性，对胃癌的预测具有重要临床价值。
实施例4 MG7-Ag酶联免疫法试剂盒在胃癌病人术前术后的监测和预后评估的应
用
肿瘤标志物广泛运用于肿瘤的检测和预后的判断，在本实例中研究胃癌化疗术前术后血浆肿瘤标志对患者预后有着重要的指导意义。本实施例中样本来源于胃癌患者术前和术后的检测和跟踪：从博尔诚公司得到8例胃癌病人术前与术后的血浆样本。利用本发明的MG7-Ag酶联免疫法检测试剂盒来监测手术的预后效果。具体的方法步骤如下：
向微孔板的不同孔中分别加入MG7-Ag标准品溶液和术前、术后血浆待测样本溶液。每孔50μL，均做三个复孔。37℃，孵育2.0h用洗涤缓冲液4 次，拍干；加入检测抗体酶结合物:向微孔板中加每孔50μL，37℃孵育0.5h，用洗涤缓冲液4次，拍干；向微孔板中加入显色底物A液和显色底物B液各50μL，37℃避光显色15min；每孔加入50μL终止液，终止反应；450nm 下，利用MULTIPLE FC酶标仪读取吸光度值。利用统计分析软件绘制标准曲线。
结果如图6所示，以胃癌病人术前样本为研究组，术后样本为对照组，对比两组样本同一病人术前术后血浆中MG7-Ag中的变化以进行病情评估和术后诊疗方案制定的依据。结果显示，胃癌病人在术前MG7-Ag普遍存在高水平表达，而胃癌根治手术后患者血浆中MG7-Ag值都明显低于术前，平均OD值从术前0.1OD值下降为术后的0.06OD值水平，其中3例胃癌患者术前术后MG7-Ag数值下降非常明显，下降率接近100％。由于术后样本为手术治疗4周以后收集，有一例手术治疗后水平没有明显下降，可能预示肿瘤的复发或转移。当然由于试验的个体数量有限，需要一定的数据进行分析验证才更有统计学意义，但也初步说明采用本试剂盒对血浆中MG7-Ag的检测用于胃癌手术疗效及预后情况的评估有一定参考价值和临床意义。
实施例5 MG7-Ag酶联免疫法试剂盒在临床试验中对样本灵敏度和特异性的检测
本实施例中的胃癌样本101例，正常人样本41例，均来源于博尔诚公司。采用实施例中的试剂盒和检测方法，联合并行分析101例胃癌血浆样品和41例正常人样本中MG7-Ag的含量水平。具体的方法步骤如下:
向微孔板中分别加入MG7-Ag标准品溶液和胃癌和正常人待测样本溶液。每孔50μL，均做三个复孔。37℃，孵育2.0h用洗涤缓冲液4次，拍干；加入检测抗体酶结合物：向微孔板中加每孔50μL，37℃孵育0.5h，用洗涤缓冲液4次，拍干；向微孔板中加入显色底物A液和显色底物B液各50μL，37℃避光显色15min；每孔加入50μL终止液，终止反应；450nm下，利用MULTIPLE FC酶标仪读取吸光度值。利用统计分析软件绘制标准曲线。
按照试剂盒操作步骤检测并计算上述101例胃癌病人和41例正常查体人血浆样品中MG7-Ag含量，结果如图7所示，胃癌患者血浆中MG7-Ag 含量明显高于正常对照者(p<0.05)，采用GraphPad Prism5软件获得ROC 曲线，软件logistic回归分析建立的上述预测模型进行检测区分胃癌和正常人的Cut-off值为5ng/mL。样本MG7-Ag含量>5ng/mL为胃癌阳性，<5ng/mL 为阴性。该函数对于胃癌的诊断灵敏度和特异度分别为39.6％和95.1％， AUC为0.70，如图8所示。
比较本发明试剂盒和其它肿瘤标志物对胃癌诊断检测的灵敏性，结果如表7所示，本发明试剂盒的I-IV期总体灵敏度为39.6％，目前已知的其它肿瘤标志物对同批胃癌样本检测阳性率(灵敏度)的结果分别为：CEA为 23.8％，CA-724为22.2％，CA-199为16.8％，CA-125为7.9％，表8结果显示本发明的MG7-Ag酶联免疫法检测试剂盒优于目前用于检测胃癌的其它肿瘤标志物对胃癌的诊断检测，如CA-199，CEA，CA-724，CA-125。
表7.为实施例5中MG7-Ag检测指标
对另外同时通过对I-II期早期样本的检出率的统计分析得出，MG7-Ag 在早期(I-II)期胃癌的诊断中灵敏度为22.2％，也明显优于其它肿瘤标志物的早期(I-II期)检出率，如表8所示。
表8.为实施例3中MG7-Ag与胃癌其它肿瘤标志物检测指标的比较
| MG7 | CA724 | CEA | CA199 | CA125 | |
| 胃癌分期 | 阳性率 | 阳性率 | 阳性率 | 阳性率 | 阳性率 |
| I期 | 13.0％(3/23) | 7.1％(1/14) | 13.0％(3/23) | 8.7％(2/23) | 8.7％(2/23) |
| II期 | 29.0％(9/31) | 22.7％(5/22) | 9.7％(3/31) | 12.9％(4/31) | 0.0％(0/31) |
| I-II期 | 22.2％(12/54) | 16.7％(6/36) | 11.1％(6/54) | 11.1％(6/54) | 3.7％(2/54) |
| I-IV期 | 35.8％(44/123) | 22.2％(16/72) | 19.5％(24/123) | 20.3％(25/123) | 7.3％(9/123) |
实施例6 本发明的MG7-Ag酶联免疫法试剂盒(混合包被)与单独抗体包被制备的
试剂盒在临床样本的性能比较
分别用MG7-Ab和MGd1-Ab抗体混合包被的反应板(如实施例1所示制备)和单独包被的反应板检测20例胃癌血浆样本、20例正常人样本，比较分析三者的性能结果如表9：
表9 混合包被(试剂盒)与单独包被的反应板测试临床样本的结果比较
由表9可知，采用两株单克隆抗体混合包被制备反应板的方式制备的试剂盒，其测试临床样本的灵敏度、特异性也明显优于两株单克隆抗体分别制备的反应板测试的结果。因此，结合本试剂盒的包被方式在临床样本的性能结果和标准曲线的信噪比的优势，可说明本试剂盒优于通用的试剂盒制备方法。
综上所述，本发明所述的方法及试剂盒具有高通量性，较高特异性，检测快速准确等突出优点，对胃癌的诊断具有重要的临床价值。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (8)
1.一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的单克隆抗体组合物，所述组合物包括：
由保藏号为CCTCC NO:C2016129的杂交瘤细胞株MG7分泌的MG7-Ab；
由保藏号为CCTCC NO:C2016130的杂交瘤细胞株MGd1分泌的MGd1-Ab；
和由保藏号为CCTCC NO:C2016125的杂交瘤细胞株CEA-37分泌的CEA37-Ab。
2.如权利要求1所述的组合物在制备用于检测胃癌抗原MG7-Ag的试剂盒中的用途；
优选地，所述试剂盒为ELISA试剂盒或化学发光试剂盒。
3.一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括包被MG7-Ab和MGd1-Ab的酶联免疫微孔板、辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab、显色剂、MG7-Ag标准品；
优选地，所述显色剂为显色剂是H2O2和TMB。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其中，所述微孔板是通过包括下述步骤的方法制备的：
a)以包被缓冲液对MG7-Ab和MGd1-Ab进行稀释，得到MG7-Ab和MGd1-Ab的浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL的稀释液，在微孔板的每孔中加入所述稀释液共100μL，4℃条件下过夜后洗涤，然后拍干或甩干；
b)向经步骤a)处理的微孔板中加入封闭液，每孔加入封闭液200μL，25℃条件下封闭3小时后洗涤，然后拍干或甩干；
c)将经步骤b)处理的微孔板进行室温干燥处理，真空密封，即得；
优选地，所述MG7-Ab和MGd1-Ab的质量比为0.5-2.5:1，优选2.0:1；
优选地，在所述步骤a)中，所述包被缓冲液为50mM的碳酸盐缓冲液，pH值为9.6；
更优选地，在步骤a)中，所述MG7-Ab和MGd1-Ab的最终包被浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL；
优选地，所述封闭液为0.1％～1.0％(g/mL)的酪蛋白钠溶液；优选地，所述封闭液是通过下述方法制备的：称取1.0-10g酪蛋白钠，将所述酪蛋白钠溶解在1L Tris-HCl缓冲液中，所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.01M、pH为7.2；更优选地，所述Tris-HCl缓冲液是通过下述方法制备的：称取1.21g Tris，以双蒸水加至800mL，然后以浓盐酸调节pH至7.2，最后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱保存。
5.如权利要求3或4所述的试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
1)向包被有MG7-Ab和MGd1-Ab的微孔板的微孔中加入样本，同时以加入所述MG7-Ag标准品的微孔作为对照孔，于37℃下孵育2.0小时，洗涤后拍干或甩干；
2)向经步骤1)处理的微孔板中加入辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab，于37℃下孵育0.5小时，洗涤后拍干或甩干；
3)向经步骤2)处理的微孔板中加入H2O2和TMB，避光显色15分钟，加入终止液终止反应，测定吸光度值；
4)根据标准品的吸光度得到标准曲线，再根据所述标准曲线和样本溶液的吸光度计算所述样本中的MG7-Ag的含量；
优选地，所述样本为人的血浆。
6.一种用于检测胃癌抗原MG7-Ag的化学发光法试剂盒，所述试剂盒包括包被MG7-Ab和MGd1-Ab的化学发光微孔板，辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab、化学发光显色剂鲁米诺、MG7-Ag标准品。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其中所述化学发光微孔板是通过包括下述步骤的方法制备的：
①以包被缓冲液对MG7-Ab和MGd1-Ab进行稀释，得到MG7-Ab和MGd1-Ab的浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL的稀释液，在化学发光微孔板的每孔加入所述稀释液100μL，4℃条件下过夜后洗涤，然后拍干或甩干；
②向经步骤①处理的微孔板中加入封闭液，每孔加入封闭液200μL，25℃条件下封闭3小时后洗涤，然后拍干或甩干；
③将经步骤②处理的微孔板进行室温干燥处理，真空密封，即得；
优选地，所述MG7-Ab和MGd1-Ab的质量比为0.5-2.5:1，更优选地为2.0:1；
优选地，在所述步骤①中，所述包被缓冲液为50mM碳酸盐缓冲液，pH值9.6；更优选地，所述MG7-Ab和MGd1-Ab的最终包被浓度为0.5μg/mL-2.0μg/mL；
优选地，所述封闭液为0.1％～1.0％(g/mL)的酪蛋白钠溶液；优选地，所述封闭液是通过下述方法制备的：称取1.0-10g酪蛋白钠，将所述酪蛋白钠溶解在1L Tris-HCl缓冲液中，所述Tris-HCl缓冲液浓度为0.01M、pH为7.2；更优选地，所述Tris-HCl缓冲液是通过下述方法制备的:称取1.21g Tris，以双蒸水加至800mL，然后以浓盐酸调节pH至7.2，最后定容至1000mL，高压灭菌后，贮存于2～8℃冰箱保存。
8.如权利要求6或7所述的试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
Ⅰ)向包被有MG7-Ab和MGd1-Ab的微孔板的微孔中加入样本，同时以加入所述MG7-Ag标准品的微孔作为对照孔，于37℃下孵育2.0小时，洗涤后拍干或甩干；
Ⅱ)向经步骤Ⅰ)处理的微孔板中加入辣根过氧化酶标记的CEA37-Ab，于37℃下孵育0.5小时，洗涤后拍干或甩干；
Ⅲ)向经步骤Ⅱ)处理的微孔板中加入化学发光显色剂鲁米诺，测定发光强度值；
Ⅳ)根据标准品的发光强度得到标准曲线，再根据所述标准曲线和样本溶液的发光强度计算所述样本中的MG7-Ag的含量。
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